JP2023136725A - バイオセンサを用いた酸化還元酵素の電気化学的測定方法及びそれに用いるバイオセンサ - Google Patents

Abstract

【課題】酸化還元酵素の量を電気化学的に測定する方法を提供する。【解決手段】２以上の電極を含む導電部と、導電部に接して配置され、酸化還元酵素の基質及び２種類以上のメディエータを含む試薬層とを有する。メディエータは、第１のメディエータと第２のメディエータを含む。第１のメディエータは基質と酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するためのメディエータである。第２のメディエータは、第１のメディエータから伝達された電子を電極に伝達するためのメディエータである。酸化還元酵素を含む試料を試薬層１５に接触させること、接触後、所定の時間のインキュベートを行うことにより、第２のメディエータに電子を蓄積させること、インキュベート後、電極の間に電圧を印加すること、電圧の印加により発生した電気的信号を測定すること、電気的信号に基づき、酸化還元酵素の量を算出する。【選択図】図３

Description

本開示は、バイオセンサを用いて酸化還元酵素の量を電気化学的に測定する方法、及び該方法に用いるバイオセンサに関する。

バイオセンサは、酵素等の生体物質が配置された検出部と、電極といったトランスデューサ（信号変換デバイス）とを用いた分子計測装置であって、グルコースをはじめとする様々な生体内の分析対象物の測定に用いられる。

バイオセンサを用いてグルコース濃度を計測する方法として、酵素を利用した電気化学計測が一般的に行われている。グルコース濃度を精度よく計測できる方法の一つとして、コットレル式を応用した種々の方法が報告されている（特許文献１～６）。コットレル式は、電極の大きさ及び形状に応じた拡散方程式のひとつである。グルコースセンサ等のバイオセンサの電極の厚みは、電子移動と共に生じる拡散が生じる範囲（～数百μｍ）に比べて小さいことから、電極に電位を印加した時の電流応答は一定ではなく、コットレル式に従って時間の平方根に反比例して減衰（ｔ^-1/2で減衰）していくことが知られている。
特許文献４は、使用者によって測定値に差が生じることを防止しつつ測定するために、電極を有する測定用セル内で分析対象物と試薬（酸化剤及び酵素等）とを混合しこれらを反応させ、その酵素反応が終了するまでインキュベートした後、電極に電圧を印加してコットレル電流を測定する方法を開示する。

一方、コットレル電流（コットレル式に従った減衰）が成立するには、電圧の印加後に物質の濃度変化が実質的にない状態、つまり、酵素反応が実質的に終了している必要がある。このため、特許文献４の方法では一定の反応時間を確保する必要があり、測定までに時間を要するという問題がある。
この問題を解決するために、特許文献６では、コットレル減衰を伴わない電気化学プロセスを用いたグルコースの測定を提案する。コットレル減衰の減衰定数は－０．５（一定）である。特許文献６は、酵素反応が終了しない短い反応（インキュベーション）時間における減衰定数を予め決定し、その減衰定数と過渡減衰を有する出力シグナルとに基づいて、サンプル中の分析対象物の濃度を決定することを開示する。

近年、グルコース以外の生体物質の濃度を電気化学的に計測する方法が報告されている（非特許文献１～７）。非特許文献１～４は、スクロースを酸化還元酵素によりグルコースに変換し、グルコースメータ（ＢＧＭ）等により計測することを開示する。
一方、サンプル中の分析対象物の濃度がグルコースと比べて低濃度又は極低濃度である場合、グルコースを測定する場合と比較して十分な感度が得られないという問題がある。このため、非特許文献５では、感度を向上させるために、電極を修飾する方法や、多数の電子伝達酵素を局在させる方法等が報告されている。非特許文献６及び７では、血中の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の濃度を測定するために、検出酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を使用し、ＧＤＨの応答電流を計測して、分析対象物の濃度をＧＤＨに変換する方法が報告されている。

特開平３－２９３５５６号公報 特許第２６５１２７８号公報 特許第２７０２２８６号公報 特許第２９０１６７８号公報 特許第４０１８７４８号公報 特許第５２４４１１６号公報

Yu Xiang et al., Nature Chemistry, 2012, 3(9): 697-703 Tian Lan et al., Methods Mol Biol. 2015, 1256, 99-109 Naveen K. Singh et al., Biosensors and Bioelectronics, 2021, 180, 113111 Tian Lan et al., Biotechnology Advances, 2016, 34(3) 331-341 Jinhee Lee et al., Electrochemistry, 2015, 83(12) 1085-1090 Yoshihiko Nonaka et al., Electrochemistry, 2012, 80(5) 363-366 Koichi Abe et al., Electrochemistry, 2012, 80(5) 348-352 Nasa Savory et al., Urakami Foundation memoirs, 2014, Vol. 21 136-142

本発明者らは、バイオセンサを用いて生体物質の濃度を電気化学的に測定可能な方法を提供すべく研究を重ねた過程で、非特許文献６～８のように、濃度が低濃度又は極低濃度の分析対象物を、アプタマー等を利用して酸化還元酵素に変換し、酸化還元酵素の量を電気化学的に計測する場合、生じる応答電流が微小であるため十分な感度が得られないという問題を新たに見出した。さらに、本発明者らは、特に、非特許文献６～８で使用されているメディエータは１種類（シングルメディエータ）であり、バイオセンサを用いた測定では十分な感度が得られないという問題があることを見出している。

本開示は、一態様において、酸化還元酵素の量の電気化学的な測定において高い感度で測定可能な方法、及びそれに用いるバイオセンサを提供する。

本開示は、一態様として、バイオセンサを用いて酸化還元酵素の量を電気化学的に測定する方法であって、
前記バイオセンサは、
２以上の電極を含む導電部と、
前記導電部に接して配置され、前記酸化還元酵素の基質及び２種類以上のメディエータを含む試薬層とを有し、
前記メディエータは、第１のメディエータと第２のメディエータとを含み、前記第１のメディエータは前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するためのメディエータであり、前記第２のメディエータは、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するためのメディエータであり、
該方法は、
酸化還元酵素を含む試料を前記試薬層に接触させること、
接触後、所定の時間のインキュベートを行うことにより、前記第２のメディエータに前記電子を蓄積させること、
インキュベート後、前記電極の間に電圧を印加すること、
前記電圧の印加により発生した電気的信号を測定すること、及び
前記電気的信号に基づき、前記酸化還元酵素の量を算出することを含む、方法に関する。

本開示は、その他の態様として、バイオセンサを用いて酸化還元酵素の量を電気化学的に測定する方法であって、
前記バイオセンサは、
２以上の電極を含む導電部と、
前記酸化還元酵素の基質と、２種類以上のメディエータとを含み、前記導電部に接して配置された試薬層とを有し、
前記メディエータは、前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するための第１のメディエータと、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するための第２のメディエータとを含み、
該方法は、
前記酸化還元酵素を含む試料を前記バイオセンサの前記試薬層に接触させること、
接触後、前記電極の間に電圧を印加すること（第１の印加）、
前記第１の印加により発生した電気的信号を測定すること（第１の測定）、
前記第１の測定により得られた電気的信号に基づき、インキュベート時間を算出すること、
算出により得られた時間のインキュベートを行うこと、
インキュベート後、前記電極の間に電圧を印加すること（第２の印加）、
前記第２の印加により発生した電気的信号を測定すること（第２の測定）、及び
第２の測定により得られた電気的信号に基づき、前記酸化還元酵素の量を算出することを含む、測定方法に関する。

本開示は、その他の態様として、酸化還元酵素を電気化学的に測定するためのバイオセンサであって、
２以上の電極を含む導電部と、
前記酸化還元酵素の基質と、２種類以上のメディエータとを含み、前記導電部に接して配置された試薬層とを有し、
前記メディエータは、前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するための第１のメディエータと、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するための第２のメディエータとを含み、
本開示の測定方法に用いるためのバイオセンサに関する。

本開示によれば、一態様において、酸化還元酵素の量の電気化学的な測定において高い感度で測定可能な方法、及びそれに用いるバイオセンサを提供できる。

図１Ａ～Ｅは、本開示の一実施形態におけるバイオセンサの製造方法の一例を示す工程図であって、各工程でのバイオセンサの模式図を示す。 図２は、図１ＥのＩ－Ｉ線断面図である。 図３Ａ～Ｅは、本開示の一実施形態におけるバイオセンサの製造方法の一例を示す工程図であって、各工程でのバイオセンサの模式図を示す。 図４は、図３ＥのＩＩ－ＩＩ線断面図である。 図５は、実験例１の結果の一例を示すグラフである。基質（グルコース）と、メディエータ（１－メトキシ－５－エチルフェナジニウムエチルサルフェート（１－ｍＰＥＳ）及びルテニウム化合物）とを含み、グルコース酸化還元酵素（ＧＤＨ）の終濃度が０～１２．５ｎＭとなるように調製した反応液を用いて、５分間のインキュベートを行うことにより測定可能なＧＤＨの濃度域を評価した結果を示す。 図６は、実験例２の結果の一例を示すグラフである。基質（グルコース）と、メディエータ（１－ｍＰＥＳ及びルテニウム化合物）と、ＧＤＨ（終濃度：０．５６、５．５６又は５５．５６ｎＭ）とを含む反応液を用いて、５、１０又は１５分間のインキュベートを行うことにより、インキュベート（蓄電）時間と応答電流値との関係を評価した結果を示す。 ７は、実験例３の結果の一例を示すグラフである。基質（グルコース、終濃度：２～２００ｍＭ）と、メディエータ（１－ｍＰＥＳ及びルテニウム化合物）と、ＧＤＨとを含む反応液を用いて、５分間のインキュベートを行うことにより、反応液中の基質の濃度と応答電流値との関係を評価した結果を示す。 図８は、実験例４の結果の一例を示すグラフである。基質（グルコース）と、メディエータ（１－ｍＰＥＳ及び／又はルテニウム化合物）と、ＧＤＨ（終濃度：０～１０ｎＭ）とを含む反応液を用いて、５分間のインキュベートを行うことにより、反応液中に存在するメディエータの種類と応答電流値との関係を評価した結果を示す。 図９は、実験例５の結果の一例を示すグラフである。基質（グルコース）と、メディエータ（１－ｍＰＥＳ及びルテニウム化合物）と、ＧＤＨとを含む反応液を用いて、５分間のインキュベートを行うことにより、反応液中の１－ｍＰＥＳの濃度と応答電流値との関係を評価した結果を示す。 図１０は、実験例６の結果の一例を示すグラフである。アデノシンＤＮＡアプタマーを使用して、アプタマーと検体中の分析対象物（アデノシン）との反応により遊離したＧＤＨ標識アプタマー中におけるＧＤＨの酸化還元酵素反応により生じた応答電流値を計測することによって、分析対象物（アデノシン）を検出できることを確認した結果を示す。 図１１は、実験例７の結果の一例を示すグラフである。第１の印加（プレ印加）を行うことにより、測定検体毎にインキュベート（蓄電）時間を決定（算出）し、算出した時間のインキュベートを行い、得られた応答電流値の測定結果を示す。

本発明者らは、バイオセンサを用いて、反応液中の酸化還元酵素の量を高い感度で電気化学的に測定可能な方法を提供すべく研究を重ねた。その研究の過程で、本発明者らは、酸化還元酵素と基質との反応により生じた電子を効率的に受け取り、かつ、受け取った電子を蓄え続けることの両方を１つのメディエータで満足することは困難であり、シングルメディエータでは感度が十分得られないことを確認した。そこで、バイオセンサに配置するメディエータとして、電子の蓄電能力の高いメディエータ（第２のメディエータ）と、酸化還元酵素と基質との反応により生じた電子を速やかに受取りかつ第２のメディエータに伝達可能なメディエータ（第１のメディエータ）とを組み合わせて使用して基質と酸化還元酵素との酸化還元酵素反応を進め、反応により生じた電子を第２のメディエータに蓄電させることで、酸化還元酵素の量を高い感度で電気化学的に測定できるという知見を見出し、その知見に基づき本開示の方法に想到した。

本開示の測定方法と、特許文献１～６に開示されたグルコース測定装置といった一般的なバイオセンサとの違いは以下の通りである。
一般的なバイオセンサでは、測定対象である分析対象物（グルコース）と酸化還元酵素との反応及びそれに伴う電子伝達が円滑に行われるように、試料中の分析対象物（グルコース）の濃度範囲に対して「酸化還元酵素」と「メディエータ」とが充分量備えられている。一般的なグルコースセンサでは、充分量の「酸化還元酵素」と「メディエータ」が配置された電極を備えるセンサにおいて、分析対象物と酸化還元酵素とを反応させ、この反応によりグルコースから遊離した電子がメディエータを介して電極に伝達されることにより生じる応答電流値を測定することで、グルコースの定量が行われる。すなわち、電圧印加時には、分析対象物と酸化還元酵素との酵素反応が実質的に終了している、又は分析対象物の濃度を決定できる程度に酵素反応が進行しており、分析対象物（グルコース）からメディエータへの電子伝達が実質的に終了又は十分に進行している状態にある。
これに対し、本開示の測定方法では、酸化還元酵素が測定対象であり、酸化還元酵素の「基質」と該反応により発生した電子を蓄電するための「メディエータ（第２のメディエータ）」とがバイオセンサに備えられている。そして、本開示の測定方法では、測定対象である酸化還元酵素と基質とを所定の時間反応させ、その反応により生じた電子を第１のメディエータを介して第２のメディエータに蓄電させ、蓄電後に生じる電気的信号（応答電流値）を測定する。すなわち、測定対象である酸化還元酵素と基質との反応は、基質が枯渇しない時間範囲内で、所定の時間だけインキュベートされる。言い換えると、基質のうち一部のみが酸化還元酵素と反応している状態の時間範囲内における、ある所定の時間でインキュベートを終了する。そして、所定の時間における電圧を印加した結果得られた電気的信号に基づき、酸化還元酵素の量を算出する点に、本発明の測定方法は、従来の一般的なバイオセンサを用いた方法との違いを有する。つまり、本開示の測定方法によれば、酸化還元酵素と基質との連続的な反応と、その反応により生じた電子の第１のメディエータによる速やかな受け取りと第２のメディエータへの伝達及び第２のメディエータでの蓄電とを行うことにより、反応液中の酸化還元酵素の量が、例えば、ｐＭオーダー（例えば、１～１０ｐｇ／Ｌ等）といった極低濃度の場合であっても、高い検出感度で測定することができうる。加えて、酸化還元酵素と基質との反応は、時間に依存して進んでいくため、反応量、すなわち電子伝達の量は、酸化還元酵素の量に依存することになるので、インキュベートの時間を所定の時間とすることによって、酸化還元酵素の量を算出することができうる。

［測定方法］
本開示は、一態様において、バイオセンサを用いて酸化還元酵素の量を電気化学的に測定する方法に関する。本開示の測定方法は、一又は複数の実施形態において、後述する第１のメディエータ及び第２のメディエータを含む少なくとも２種類以上のメディエータを備えるバイオセンサを使用し、基質と酸化還元酵素との連続的な反応により生じた電子を第１のメディエータを介して第２のメディエータに蓄電するために所定の時間のインキュベートを行った後、電圧を印加してそれにより生じる電気的信号を測定することを含む。
本開示における「電子を第２のメディエータに蓄電する」ことは、一又は複数の実施形態において、還元型の第２のメディエータが蓄積することともいうことができる。

本開示における「電気化学的測定方法」とは、電気化学的手法を用いた測定方法であって、一又は複数の実施形態において、反応液中の測定対象物（酸化還元酵素）について、その濃度に対応する変化を電極上で電気的信号として変換し、出力する測定が挙げられる。電気化学的手法としては、一又は複数の実施形態において、クロノアンペロメトリー、クロノクーロメトリー及びサイクリックボルタンメトリー等が挙げられる。本開示における電気的信号としては、一又は複数の実施形態において、印加電圧に対する応答電流値、及び印加電圧に対する応答電圧値等が挙げられる。

［バイオセンサ］
本開示の方法で使用されるバイオセンサは、２以上の電極を含む導電部と、導電部に接して配置された試薬層とを有する。試薬層は、酸化還元酵素の基質と２種類以上のメディエータとを含み、該メディエータは、前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するための第１のメディエータと、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するための第２のメディエータとを少なくとも含む。

［酸化還元酵素］
酸化還元酵素としては、一又は複数の実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、コレステロールオキシダーゼ、キノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、Ｄ－フルクトースデヒドロゲナーゼ、Ｄ－グルコシド－３－デヒドロゲナーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ（ＬＯＤ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）及び尿酸デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
酸化還元酵素は、一又は複数の実施形態において、補酵素（触媒サブユニット又は触媒ドメインともいう）として、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ピロロキノリンキノ（ＰＱＱ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドレイン（ＮＡＤＰ）を有していてもよい。補酵素を有する酸化還元酵素としては、一又は複数の実施形態において、ＦＡＤ－ＧＤＨ、ＰＱＱ－ＧＤＨ、ＮＡＤ－ＧＤＨ及びＮＡＤＰ－ＧＤＨ等が挙げられる。
酸化還元酵素としては、一又は複数の実施形態において、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）型ＦＡＤ－ＧＤＨ（フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ又はフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ）等が挙げられる。アスペルギルス・オリゼ型ＦＡＤ－ＧＤＨとしては、一又は複数の実施形態において、特開２０１３－０８３６３４号公報に開示のものが使用できる。当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。

［基質］
基質は、測定対象である酸化還元酵素の種類に応じて適宜決定できる。基質としては、一又は複数の実施形態において、グルコース、コレステロール、ソルビトール、Ｄ－フルクトース、セロビオース、乳酸及び尿酸等が挙げられる。一又は複数の実施形態において、バイオセンサの試薬層には十分量の基質が配置されている。

試薬層における基質の配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）は、基質と酸化還元酵素との反応が律速となることを抑制しつつ反応を進めて測定感度を高める点から、一又は複数の実施形態において、４．４ｎｍｏｌ以上であり、好ましくは８．８ｎｍｏｌ以上、１３．２ｎｍｏｌ以上、１７．６ｎｍｏｌ以上又は２２．０ｎｍｏｌ以上であり、より好ましくは２６．４ｎｍｏｌ以上である。試薬層における基質の配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）の上限は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、２２０ｎｍｏｌ以下、１７６ｎｍｏｌ以下、１３２ｎｍｏｌ以下、８８ｎｍｏｌ以下又は４４ｎｍｏｌ以下である。

試薬層における基質の配合量（インキュベート時の基質の濃度）は、基質と酸化還元酵素との反応が律速となることを抑制しつつ反応を進めて測定感度を高める点から、一又は複数の実施形態において、試薬層に接触させた試料の量に対する含有量として、１０ｍＭ以上であり、好ましくは２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上又は５０ｍＭ以上であり、より好ましくは６０ｍＭ以上である。試薬層における基質の配合量の上限は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、５００ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下又は１００ｍＭ以下である。
インキュベート時の基質の濃度は、一又は複数の実施形態において、測定対象である酸化還元酵素の量に応じて決定することもできる。特に限定されない一又は複数の実施形態において、測定対象である酸化還元酵素の量（試料に含有されると予測される量）が０．０１ｎＭ～６０ｎＭである場合、インキュベート時の基質の濃度は、１０ｍＭ以上であり、好ましくは２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上又は５０ｍＭ以上であり、より好ましくは６０ｍＭ以上である。

試薬層に接触させる試料の量としては、適宜決定することができ、一又は複数の実施形態において、１μＬ～２０μＬ程度である。

［メディエータ］
メディエータは、一又は複数の実施形態において、ルテニウム化合物、１－Ｍｅｔｈｏｘｙ－ＰＥＳ（１－Ｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ、１－ｍＰＥＳ）、１－Ｍｅｔｈｏｘｙ－ＰＭＳ（１－Ｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ、１－ｍＰＭＳ）、フェニレンジアミン化合物、キノン化合物、フェリシアン化合物、Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｑ０（２，３－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌ－ｐ－ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ）、ＡＺＵＲＥ Ａ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（３－ａｍｉｎｏ－７－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎ－５－ｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｐｈｅｎｏｓａｆｒａｎｉｎ（３，７－Ｄｉａｍｉｎｏ－５－ｐｈｅｎｙｌｐｈｅｎａｎｚｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、６－Ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ、及びＴｅｔｒａｔｈｉａｆｕｌｖａｌｅｎｅ等が挙げられる。
ルテニウム化合物としては、一又は複数の実施形態において、酸化型のルテニウム錯体として反応系に存在し、メディエータ（電子伝達体）として機能するルテニウム化合物が使用できる。ルテニウム錯体の配位子の種類はとくに限定されない。ルテニウム化合物としては、一又は複数の実施形態において下記化学式で示される酸化型ルテニウム錯体が挙げられる。
［Ｒｕ（ＮＨ₃）₅Ｘ］ⁿ⁺
Ｘとしては、ＮＨ₃、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、またはＨ₂Ｏが挙げられ、中でもＮＨ₃又はハロゲンイオンが好ましい。ハロゲンイオンとしては、一又は複数の実施形態において、Ｃｌ^-、Ｆ^-、Ｂｒ^-、及びＩ^-が挙げられる。式におけるⁿ⁺は、Ｘの種類により決定される酸化型ルテニウム（ＩＩＩ）錯体の価数を表す。ルテニウム錯体としては、一又は複数の実施形態において、特開２０１８－０１３４００号公報に開示のものが使用できる。当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
フェニレンジアミン化合物としては、一又は複数の実施形態において、Ｎ,Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１,４－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、及びＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１,４－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ等が挙げられる。
キノン化合物としては、一又は複数の実施形態において、１，４－Ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、２－Ｍｅｔｈｙｌ－１，４－Ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ（ＶＫ３）、９，１０－Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅｑｕｉｎｏｎｅ、１，２－Ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、ｐ－Ｘｙｌｏｑｕｉｎｏｎｅ、Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、２，６－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、Ｓｏｄｉｕｍ１，２－Ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ－４－ｓｕｌｆｏｎａｔｅ、１，４－Ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、及びＴｈｙｍｏｑｕｉｎｏｎｅ等が挙げられる。
フェリシアン化合物としては、一又は複数の実施形態において、フェリシアン化カルシウム等が挙げられる。

本開示の測定方法において使用されるメディエータの組み合わせは、一又は複数の実施形態において、酸化還元酵素、及び導電部の電極の材質等に応じて適宜決定することができる。
特に限定されない一又は複数の実施形態における第１のメディエータと第２のメディエータとの組み合わせとしては、１－ｍＰＥＳとルテニウム化合物との組み合わせ、及び１－ｍＰＭＳとルテニウム化合物との組み合わせ等が挙げられる。メディエータの組み合わせにおける特に限定されない一又は複数の実施形態において、第１のメディエータが１－ｍＰＥＳであり、第２のメディエータがルテニウム化合物である組み合わせが挙げられる。

試薬層における第１のメディエータ及び第２のメディエータの配合量は、一又は複数の実施形態において、測定対象である酸化還元酵素の種類、第１のメディエータ及び第２のメディエータの種類及び組み合わせ、並びに導電部の電極の材質等に応じて適宜決定することができる。

試薬層における第１のメディエータの配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）は、酸化還元酵素との反応により生じた電子の伝達が律速となることを抑制して測定感度を高める点から、一又は複数の実施形態において、０．２２ｎｍｏｌ以上又は０．３ｎｍｏｌ以上であり、好ましくは０．３５ｎｍｏｌ以上、０．４４ｎｍｏｌ以上又は２．２ｎｍｏｌ以上である。試薬層における第１のメディエータの配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）は、特に限定されない一又は複数の実施形態において、４４ｎｍｏｌ以上であってもよい。試薬層における第１のメディエータの配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）の上限は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、２２０ｎｍｏｌ以下又は１１０ｎｍｏｌ以下である。
第１のメディエータは第２のメディエータと比べて試薬層における配合量が少量であっても十分な測定感度が得られうるため製造コストを抑制する点からは、試薬層における第１のメディエータの配合量は、４４ｎｍｏｌ以下、２２ｎｍｏｌ以下、１７．６ｎｍｏｌ以下、１３．２ｎｍｏｌ以下、８．８ｎｍｏｌ以下又は４．４ｎｍｏｌ以下である。

試薬層における第１のメディエータの配合量（インキュベート時の第１のメディエータの濃度）は、基質と酸化還元酵素との反応が律速となることを抑制しつつ反応を進めて測定感度を高める点から、一又は複数の実施形態において、試薬層に接触させた試料の量に対する含有量として、０．５ｍＭ以上又は０．７ｍＭ以上であり、好ましくは０．８ｍＭ以上、１ｍＭ以上又は５ｍＭ以上である。試薬層における第１のメディエータの配合量（インキュベート時の第１のメディエータの濃度）は、特に限定されない一又は複数の実施形態において、１００ｍＭ以上であってもよい。試薬層における第１のメディエータの配合量の上限は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、５００ｍＭ以下又は２５０ｍＭ以下である。
第１のメディエータは第２のメディエータと比べて試薬層における配合量が少量であっても十分な測定感度が得られうるため製造コストを抑制する点からは、試薬層における第１のメディエータの配合量は、１００ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下又は１０ｍＭ以下である。

試薬層における第２のメディエータの配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）は、第１のメディエータとの電子伝達が律速となることを抑制しつつ電子を蓄電可能にして測定感度を高める点から、一又は複数の実施形態において、０．４４ｎｍｏｌ以上であり、好ましくは４．４ｎｍｏｌ以上、２２ｎｍｏｌ以上、３０．８ｎｍｏｌ以上又は３５．２ｎｍｏｌ以上であり、より好ましくは３９．６ｎｍｏｌ以上又は４４ｎｍｏｌ以上である。試薬層における第２のメディエータの配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）の上限は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、２２０ｎｍｏｌ以下又は１１０ｎｍｏｌ以下である。

試薬層における第２のメディエータの配合量（インキュベート時の第２のメディエータの濃度）は、第１のメディエータとの電子伝達が律速となることを抑制しつつ電子を蓄電可能にして測定感度を高める点から、一又は複数の実施形態において、試薬層に接触させた試料の量に対する含有量として、１ｍＭ以上であり、好ましくは１０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上又は８０ｍｍＭ以上であり、より好ましくは９０ｍＭ以上又は１００ｍＭ以上である。試薬層における第２のメディエータの配合量の上限は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、５００ｍＭ以下又は２５０ｍＭ以下である。

試薬層は、酸化還元酵素の基質及びメディエータ以外のその他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、緩衝剤、界面活性剤、バインダー等が挙げられる。

緩衝剤としては、一又は複数の実施形態において、リン酸緩衝剤、アミン系緩衝剤及びカルボキシル基を有する緩衝剤等が挙げられる。アミン系緩衝剤としては、一又は複数の実施形態において、Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、及びＡＤＡ等が挙げられる。カルボキシル基を有する緩衝剤としては、一又は複数の実施形態において、クエン酸緩衝剤、リン酸クエン酸緩衝剤、酢酸－酢酸Ｎａ緩衝剤、リンゴ酸－酢酸Ｎａ緩衝剤、マロン酸－酢酸Ｎａ緩衝剤、及びコハク酸－酢酸Ｎａ緩衝剤等が挙げられる。緩衝剤は、１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。緩衝剤のｐＨは、一又は複数の実施形態において、６．０～８．０であり、好ましくは７．３～７．４である。

界面活性剤としては、一又は複数の実施形態において、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（（ｐ－ｔｅｒｔ－Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ）、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｓｏｒｂｉｔａｎ Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、ドデシル硫酸ナトリウム、ペルフルオロオクタンスルホン酸、ステアリン酸ナトリウム、アルキルアミノカルボン酸（またはその塩）、カルボキシベタイン、スルホベタイン及びホスホベタイン等が挙げられる。界面活性剤は、１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。

バインダーとしては、一又は複数の実施形態において、樹脂バインダー及び層状無機化合物等が挙げられる。樹脂バインダーとしては、一又は複数の実施形態において、ブチラール樹脂バインダー、及びポリエステル樹脂バインダー等が挙げられる。層状無機化合物としては、ＷＯ２００５／０４３１４６に記載の層状無機化合物を使用できる。層状無機化合物としては、一又は複数の実施形態において、イオン交換能を有する膨潤性粘土鉱物等が挙げられる。層状無機化合物としては、一又は複数の実施形態において、ベントナイト、スメクタイト、バーミキュライト及び合成フッ素雲母等が挙げられる。バインダーは、１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。

試薬層は、一又は複数の実施形態において、酸化還元酵素を実質的に含有しない。試薬層は、一又は複数の実施形態において、試薬層に含まれる基質と反応する酸化還元酵素を実質的に含有しない。本開示において「実質的に含有しない」とは、試薬層における酸化還元酵素の配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）が、一又は複数の実施形態において、０．１Ｕ未満、０．０５Ｕ未満又は０．０１Ｕ未満である。本開示において、「Ｕ」は、酵素活性の単位であって、至適条件で1分間に１μｍｏｌの基質に作用する酵素量をいう。

［導電部］
導電部は、２以上の電極を含む。電極は、一又は複数の実施形態において、作用極と対極とを含む電極対であってもよいし、作用極と対極と参照極とを含む３電極系の電極対であってもよい。導電部は、一又は複数の実施形態において、さらに検知極を有していてもよい。
電極の材質としては、一又は複数の実施形態において、導電性のある材質が使用できる。導電性のある材質としては、一又は複数の実施形態において、金属材料及び炭素材料等が挙げられる。金属材料としては、一又は複数の実施形態において、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、銀（Ａｇ）、ルテニウム（Ｒｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、及びニッケル（Ｎｉ）合金等が挙げられる。ニッケル合金としては、一又は複数の実施形態において、ニッケル－バナジム合金、ニッケル－タングステン合金、及びニッケル－ルテニウム合金等が挙げられる。炭素材料としては、一又は複数の実施形態において、グラファイト、カーボンナノチューブ、グラフェン、及びメソポーラスカーボン等が挙げられる。

電極は、一又は複数の実施形態において、基材上に金属材料を成膜することによって形成された薄膜電極等が挙げられる。成膜方法としては、一又は複数の実施形態において、スクリーン印刷、物理蒸着（ＰＶＤ、例えばスパッタリング）又は化学蒸着（ＣＶＤ）等が挙げられる。

導電部は、一又は複数の実施形態において、基材上に形成される。基材としては、一又は複数の実施形態において、絶縁性基材が使用できる。絶縁性基材の材質としては、一又は複数の実施形態において、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、ガラス、セラミック及び紙等が挙げられる。熱可塑性樹脂としては、一又は複数の実施形態において、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、及びポリエチレン（ＰＥ）等が挙げられる。熱硬化性樹脂としては、ポリイミド樹脂及びエポキシ樹脂等が挙げられる。

本開示の測定方法は、酸化還元酵素を含む試料を、バイオセンサの試薬層に接触させること、接触後、所定の時間のインキュベートを行うことにより、第１のメディエータを介して試薬層中の第２のメディエータに、酸化還元酵素と基質との反応により生じた電子を蓄積させること、インキュベート後、バイオセンサの導電部の電極の間に電圧を印加すること、電圧の印加により発生した電気的信号を測定すること、及び測定した電気的信号に基づき酸化還元酵素の量を算出することを含む。

本開示における「インキュベートを行うこと」とは、試料中の酸化還元酵素と試薬層中の基質との酸化還元反応を行うことをいい、酸化還元反応により生じた電子を、第１のメディエータを介して第２のメディエータに伝達すること、及び、伝達された（受け取った）電子を第２のメディエータに蓄積（蓄電）することを含みうる。本開示において「インキュベートを行うこと」と「蓄電すること」とを同義で使用する場合がある。

本開示の測定方法における試料の接触後のインキュベート時間としては、一又は複数の実施形態において、１分以上であり、第２のメディエータにより多くの量の電子を蓄積させ、得られる電気的信号を増加させる点から、２分以上、３分以上、４分以上、５分以上、６分以上、７分以上又は１０分以上である。インキュベート時間の上限は、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、試薬層に含まれる基質すべてが酸化還元反応によりすべて電子伝達されるまでの時間等が挙げられる。インキュベート時間の上限の特に限定されない一又は複数の実施形態において、３０分以下、２０分以下又は１５分以下である。

本開示の測定方法におけるインキュベートの時間は、一又は複数の実施形態において、試薬層に含まれる基質が、測定対象である酸化還元酵素との反応によって枯渇しない時間範囲であることが好ましい。よって、本開示の測定方法は、一又は複数の実施形態において、インキュベートの時間を、試薬層に含まれる基質が酸化還元酵素との反応によって枯渇しない範囲の時間に設定することを含んでいてもよい。

本開示の測定方法の一又は複数の実施形態において、接触後のインキュベートは、非印加の状態で行うことが好ましい。本開示の測定方法は、一又は複数の実施形態において、接触後の所定の時間のインキュベートが終了するまで電圧の印加を行わないことが好ましい。

電極間への電圧の印加は、一又は複数の実施形態において、電極（電極対）間に一定の電圧を印加することにより行うことができる。特に限定されない一又は複数の実施形態において、電極への電圧の印加は、対極に対して正の電圧を作用極に印加することにより行うことができる。作用極に印加する電圧としては、一又は複数の実施形態において、対極に対して＋５０ｍＶ～＋５００ｍＶであり、好ましくは＋１００ｍＶ～＋２００ｍＶであり、より好ましくは＋２００ｍＶである。

電気的信号の測定は、一又は複数の実施形態において、酸化還元酵素の量を測定に用いる手法に応じ決定できる。
クロノアンペロメトリーを用いて酸化還元酵素量の算出を行う場合、電気的信号の測定は、一又は複数の実施形態において、電圧印加一定時間後の応答電流値を測定することにより行う。電圧印加一定時間としては、一又は複数の実施形態において、電圧印加後２０秒以下、１５秒以下、１０秒以下、９秒以下、８秒以下、７秒以下、６秒以下、５秒以下、４秒以下、３秒以下、又は２秒以下が挙げられる。
クロノクーロメトリーを用いて酸化還元酵素量の算出を行う場合、電気的信号の測定は、一又は複数の実施形態において、応答電流の積算値を得るため、応答電流値を経時的に測定することにより行う。サイクリックボルタンメトリーを用いて酸化還元酵素量の算出を行う場合、電気的信号の測定は、一又は複数の実施形態において、サイクリックボルタンメトリー波形を得るため、掃引中の電圧に応じた電流値を継続的に測定することにより行う。

電気的信号に基づく酸化還元酵素の量の算出は、一又は複数の実施形態において、クロノアンペロメトリー、クロノクーロメトリー及びサイクリックボルタンメトリー等の方法を用いて行うことができる。クロノアンペロメトリーを用いる場合、一又は複数の実施形態において、応答電流値の積算値と測定対象物（酸化還元酵素）の量（濃度）との関係をあらかじめ検量線などで求めておき、測定された応答電流値の積算値を検量線に当てはめることにより測定対象物の量を算出することができる。

本開示の測定方法は、一又は複数の実施形態において、上記の試料と試薬層との接触直後に、短時間の印加（プレ印加）及びその印加により発生した電気的信号を測定することを含んでいてもよい。プレ印加及びそれにより生じた電気的信号を測定することにより、一又は複数の実施形態において、試料中の酸化還元酵素（測定対象物）の量に応じて、インキュベート（蓄電）時間を変化させることができることから、例えば、測定時間を短縮できる。また、インキュベート（蓄電）後に発生する電気的信号を所定の範囲に収めることができ、測定装置への負荷を減らすことができうる。

よって、本開示の測定方法は、その他の態様として、酸化還元酵素を含む試料をバイオセンサの試薬層に接触させること、接触後、電極の間に電圧を印加すること（第１の印加）、第１の印加により発生した電気的信号を測定すること（第１の測定）、第１の測定により得られた電気的信号に基づき、インキュベート時間を算出すること、算出して得られた時間のインキュベートを行うこと、インキュベート後、前記電極の間に電圧を印加すること（第２の印加）、前記第２の印加により発生した電気的信号を測定すること（第２の測定）、及び第２の測定により得られた電気的信号に基づき、前記酸化還元酵素の量を算出することを含む。

本開示の測定方法における第１の印加（プレ印加）は、一又は複数の実施形態において、試料を試薬層に接触させた直後に行うことができる。第１の印加（プレ印加）は、一又は複数の実施形態において、接触後０．０１秒～１０秒又は０．０１秒～５秒で行うことが好ましい。

本開示の測定方法における第１の測定（プレ測定）における印加時間は、一又は複数の実施形態において、０．０１秒～１０秒又は０．０１秒～５秒程度であることが好ましい。

本開示の測定方法は、第１の測定により得られた電気的信号に基づいて、インキュベート時間を算出することを含む。インキュベート時間の算出（決定）は、一又は複数の実施形態において、予め定めた閾値（電気的信号の値）に基づき行うことができる。閾値は、一又は複数の実施形態において、１つであってもよいし、２以上であってもよい。閾値は、一又は複数の実施形態において、電極の材質及びメディエータの種類に応じて適宜決定することができる。
特に限定されない一又は複数の実施形態において、酸化還元酵素の濃度に応じて閾値を３段階（高濃度、中濃度及び低濃度）に設定した場合、第１の測定により得られた電気的信号（応答電流値）が２０００ｎＡを超えた場合、酸化還元酵素の濃度が高濃度であることからインキュベート時間は１分又は１分以内と決定し、該電気的信号（応答電流値）が１０００ｎＡ以上２０００ｎＡ以下の場合、酸化還元酵素の濃度が中濃度であることからインキュベート時間は１分を超え５分未満（又は例えば３分）と決定し、電気的信号（応答電流値）が１０００ｎＡ未満の場合、酸化還元酵素の濃度が低濃度であることからインキュベート時間は５分又は５分以上と決定することができる。

［酸化還元酵素を含む試料］
本開示の測定方法における酸化還元酵素を含む試料は、一又は複数の実施形態において、酸化還元酵素を含有する検体そのものであってもよく、検体中の成分が酸化還元酵素に変換されたものであってもよい。検体としては、一又は複数の実施形態において、生体試料等が挙げられる。生体試料としては、一又は複数の実施形態において、血液及び尿並びにこれら由来の試料、細胞抽出試料、及び細胞培養液等が挙げられる。酸化還元酵素を含む試料は、一又は複数の実施形態において、酸化還元酵素の量を測定するための試料であって、酸化還元酵素を含む可能性のある試料、及び検体中の成分が変換させることによって酸化還元酵素を含む可能性のある（酸化還元酵素を含むことが疑われる）試料等を含む。

本開示の測定方法は、一又は複数の実施形態において、ホルモン及び低分子化合物等のような分析対象物を酸化還元酵素に変換して「酸化還元酵素を含む試料」を調製することで該分析対象物を高感度で測定することができうる。本開示の測定方法によれば、一又は複数の実施形態において、極微量濃度の分析対象物を、酸化還元酵素に変換することで高い感度で測定することができうる。

分析対象物を酸化還元酵素に変換する方法としては、一又は複数の実施形態において、酸化還元酵素で修飾（標識）されたアプタマーのような分子認識素子を用いた方法が挙げられる。例えば該アプタマー（分子認識素子）が分析対象物と結合することにより酸化還元酵素が遊離、分離、又は活性化される物質を用いることで、分析対象物を酸化還元酵素に変換した測定が可能となりうる。例えば、分析対象物が結合すると磁気ビーズから遊離するように磁気ビーズに固定化された酸化還元酵素修飾分子認識素子を使用すれば、分析対象物に応じた酸化還元酵素を遊離させることができる。

よって、本開示の測定方法は、一又は複数の実施形態において、検体中の分析対象物を酸化還元酵素に変換して、酸化還元酵素を含む試料を調製することを含んでいてもよい。

本開示の測定方法は、一又は複数の実施形態において、検体中の分析対象物を酸化還元酵素に変換可能な物質を含む第２の試薬層を第１の試薬層の上流に配置されたバイオセンサにおいて、検体を第２の試薬層に導入して、酸化還元酵素を含む試料を調製すること、調製させた当該試料を、基質とメディエータとを含む試薬層（第１の試薬層）に接触させることを含んでいてもよい。

分析対象物としては、一又は複数の実施形態において、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、抗原、ホルモン、免疫細胞、稀少細胞、糖、毒素、ウイルス粒子、及び金属等が挙げられる。よって、本開示の測定方法は、一又は複数の実施形態において、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、抗原、ホルモン、免疫細胞、稀少細胞、糖、毒素、ウイルス粒子、及び金属等の定量に用いることができる。本開示の測定方法は、一又は複数の実施形態において、測定に使用するバイオセンサの試薬層に含まれる酸化還元酵素の基質（例えば、グルコース、コレステロール、エタノール、ソルビトール、フルクトース、セロビオース、乳酸及び尿酸等）を対象とする測定（例えば、定量）には用いられない。

よって、本開示は、その他の態様として、バイオセンサを用いて検体中の分析対象物を電気化学的に測定する方法に関する。本態様の方法で使用されるバイオセンサは、２以上の電極を含む導電部と、分析対象物を酸化還元酵素に変換可能な物質を含む第２の試薬層と、前記導電部に接して配置された第１の試薬層とを有し、第１の試薬層及び第２の試薬層は流路内に配置され、第２の試薬層は、第１の試薬層の上流に位置している。第１の試薬層は、前記酸化還元酵素の基質と、２種類以上のメディエータとを含み、メディエータは、前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するための第１のメディエータと、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するための第２のメディエータとを含む。本態様のバイオセンサにおける、電極、基質及びメディエータについては、上述の通りである。

第２の試薬層及び第１の試薬層とは、一又は複数の実施形態において、接して配置されていてもよいし、離間して配置されていてもよい。

本開示の測定方法は、一又は複数の実施形態において、検体として分析対象物を含有する検体を使用し、バイオセンサが、分子認識素子を含む第２の試薬層を備える以外は、上述の測定方法と同様に行うことができる。

［バイオセンサの作製方法］
本開示のバイオセンサは、一又は複数の実施形態において、２以上の電極を含む導電部が形成された基材を準備し、そこに、酸化還元酵素の基質及び２種類以上のメディエータを含む試薬層を載置することにより作製することができる。
試薬層は、２つ以上の電極のうち少なくとも作用極上の一部に載置する。試薬の載置方法は特に制限されないが、例えば、試薬の溶液を電極の一部にスポットし、乾燥させることで行うことができる。より具体的には、試薬層は、例えば、酸化還元酵素、２種類以上のメディエータと、必要に応じて緩衝剤及びバインダーが分散された分散液を調製し、これを電極上に分注して、乾燥させることによって形成できる。

本開示のバイオセンサは、一又は複数の実施形態において、図１Ａ～Ｅに示す手順で作製することができる。但し、本開示において、バイオセンサの作製方法は以下の手順に限定されない。

図１Ａに示すように、基材１０上に、作用極１２、対極１１、参照極及び検知極（１）１３、並びに検知極（２）１４を含む電極系をスパッタリングによって形成する。図１Ａ～Ｅに示すように、検知極（１）１３と検知極（２）１４とを備えることにより、検知極（１）１３と対極１１とで検体が検知極（１）１３に到達したことを検知することができる。さらに、検知極（２）１４と作用極１２で検体が検知極（２）１４に到達したことを検知することができる。これにより、検知極（１）１３で検体が検知された時間と検知極（２）１４で検体が検知された時間とからインキュベート時間を算出することもできる。
つぎに、試薬層を形成する。試薬層１５は、少なくとも作用極１２上の一部に載置すればよく、図１Ｂに示すように、試薬層１５は、検知極（１）１３、対極１１及び作用極１２の一部に接触するように載置してもよい。試薬層１５は、酸化還元酵素の基質及び２種類以上のメディエータを少なくとも含み、必要に応じて緩衝剤及びバインダーが分散された試薬液（分散液）を調製し、これを、検知極（１）１３、対極１１及び作用極１２の上に載置（分注）し、乾燥することにより形成することができる。また、追って形成される流路の末端に位置する部分に、止水部１７を形成してもよい。止水部１７は、一又は複数の実施形態において、止水用ポリマー等の止水剤を塗布して乾燥させることにより形成することができる。これにより、止水部１７に接触した検体をゲル化させることにより、さらに流路の下流に移動することを止めることができる。
つぎに、図１Ｃに示すように、試薬層１５を載置した基材１０上にスペーサー１８を配置する。スペーサー１８は、絶縁層を介して配置してもよい。スペーサー１８は、一又は複数の実施形態において、樹脂製フィルム及びテープ等を用いて形成することができる。スペーサー１８は、止水部１７が形成された側の一端に形成された電極が露出するように配置する。
ついで、図１Ｄに示すように、スペーサー１８の上にカバー１９を配置する。基板１０及びカバー１９によって囲まれた、スペーサー１８の開口部の空間が流路となる。カバー１９は、検体供給部となる貫通孔２０と、通気口となる貫通孔２１とを備え、検体供給部となる貫通孔２０及び通気口となる貫通孔２１は、それぞれ試薬層１５及び止水部１７の上部に位置するように形成する。カバー１９の材質としては、一又は複数の実施形態において、ＰＥＴ等の各種プラスチック等が挙げられる。図２に示すように、基板１０及びカバー１９によって囲まれた空間（流路）２３が形成されており、その空間（流路）２３を、検体供給部となる貫通孔２０に供給された検体が試薬層１５を経て通気口となる貫通孔２１に移動することができる。
最後に、図１Ｅに示すように、カバー１９の検体供給部となる貫通孔２０の周囲を覆うように、Ｏリング型撥水テープ２２を配置する。これにより、検体が貫通孔２０及び流路等の外に流出することを防ぐことができる。

図３Ａ～Ｅ及び図４に、本開示のバイオセンサの作製方法のその他の例を示す。図４は、図３ＥのＩＩ－ＩＩ線断面図である。
本開示のバイオセンサは、一又は複数の実施形態において、図３Ａ～Ｅ及び図４に示すように、試薬層として第１の試薬層１５と第２の試薬層１６とを備えていてもよい。第１の試薬層１５は、酸化還元酵素の基質及び２種類以上のメディエータを少なくとも含み、第２の試薬層１６は、酸化還元酵素で修飾された分子認識素子を含む。本態様のバイオセンサのように、第１の試薬層１５と第２の試薬層１６とを有することにより、一又は複数の実施形態において、第２の試薬層の材質に応じて、検体が第２の試薬層を通過する時間を調整することができ、検体と分子認識素子との反応時間を適宜変更することができる。
また検知極（１）１３と対極１１とで検体が検知極（１）１３に到達したことを検知することができる。さらに、検知極（２）１４と作用極１２とで検体が検知極（２）１４に到達したことを検知することができる。検知極（１）１３で検体が検知された時間と検知極（２）１４で検体が検知された時間からインキュベート時間を算出することもできる。

図３Ｂに示すように、第２の試薬層１６は、検知極（１）１３及び対極１１に接触するように配置されており、第１の試薬層１５は対極１１及び作用極１２の一部に接触するように配置されている。第２の試薬層１６は、酸化還元酵素で修飾された分子認識素子を含浸させた基材を、検知極（１）１３及び対極１１の上に配置することにより、形成することができる。基材としては、一又は複数の実施形態において、ガラスフィルター及びビーズ分離膜等が挙げられる。第１の試薬層１５は、酸化還元酵素の基質及び２種類以上のメディエータを少なくとも含み、必要に応じて緩衝剤及びバインダーが分散された試薬液（分散液）を調製し、これを、検知極（１）１３、対極１１及び作用極１２の上に配置（分注）し、乾燥することにより形成することができる。
本態様のバイオセンサは、第１の試薬層１５及び第２の試薬層１６の２つの試薬層を形成する以外は、図１Ａ～Ｅに示すバイオセンサと同様に作製することができる。

本開示は以下の限定されない一又は複数の実施形態に関しうる。
［Ａ１］ バイオセンサを用いて酸化還元酵素の量を電気化学的に測定する方法であって、
前記バイオセンサは、
２以上の電極を含む導電部と、
前記導電部に接して配置され、前記酸化還元酵素の基質及び２種類以上のメディエータを含む試薬層とを有し、
前記メディエータは、第１のメディエータと第２のメディエータとを含み、前記第１のメディエータは前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するためのメディエータであり、前記第２のメディエータは、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するためのメディエータであり、
該方法は、
酸化還元酵素を含む試料を前記試薬層に接触させること、
接触後、所定の時間のインキュベートを行うことにより、前記第２のメディエータに前記電子電子を蓄積させること、
インキュベート後、前記電極の間に電圧を印加すること、
前記電圧の印加により発生した電気的信号を測定すること、及び
前記電気的信号に基づき、前記酸化還元酵素の量を算出することを含む、方法。
［Ａ２］ 前記インキュベートの時間を、前記試薬層に含まれる基質が前記酸化還元酵素との反応によって枯渇しない範囲の時間に設定することを含む、［Ａ１］記載の方法。
［Ａ３］ 前記試薬層における前記基質の配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）は、４．４ｎｍｏｌ以上である、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載の方法。
［Ａ４］ 前記インキュベートの時間は、１分以上である、［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載の方法。
［Ａ５］ 前記酸化還元酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼであり、前記基質は、グルコースである、［Ａ１］から［Ａ４］のいずれかに記載の方法。
［Ａ６］ 前記第１のメディエータと前記第２のメディエータとの組み合わせは、１－メトキシ－５－エチルフェナジニウムエチルサルフェート（１－ｍＰＥＳ）とルテニウム化合物との組み合わせ、又は１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１－ｍＰＭＳ）とルテニウム化合物との組み合わせである、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれかに記載の方法。
［Ｂ１］ バイオセンサを用いて酸化還元酵素の量を電気化学的に測定する方法であって、
前記バイオセンサは、
２以上の電極を含む導電部と、
前記酸化還元酵素の基質と、２種類以上のメディエータとを含み、前記導電部に接して配置された試薬層とを有し、
前記メディエータは、第１のメディエータと第２のメディエータとを含み、前記第１のメディエータは前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するためのメディエータであり、前記第２のメディエータは、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するためのメディエータであり、
該方法は、
前記酸化還元酵素を含む試料を前記バイオセンサの前記試薬層に接触させること、
接触後、前記電極の間に電圧を印加すること（第１の印加）、
前記第１の印加により発生した電気的信号を測定すること（第１の測定）、
前記第１の測定により得られた電気的信号に基づき、インキュベート時間を算出すること、
算出して得られた時間のインキュベートを行うこと、
インキュベート後、前記電極の間に電圧を印加すること（第２の印加）、
前記第２の印加により発生した電気的信号を測定すること（第２の測定）、及び
第２の測定により得られた電気的信号に基づき、前記酸化還元酵素の量を算出することを含む、測定方法。
［Ｃ１］ 酸化還元酵素を電気化学的に測定するためのバイオセンサであって、
２以上の電極を含む導電部と、
前記酸化還元酵素の基質と、２種類以上のメディエータとを含み、前記導電部に接して配置された試薬層とを有し、
前記メディエータは、第１のメディエータと第２のメディエータとを含み、前記第１のメディエータは前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するためのメディエータであり、前記第２のメディエータは、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するためのメディエータであり、
［Ａ１］から［Ａ６］及び［Ｂ１］のいずれかに記載の測定方法に用いるための、バイオセンサ。
［Ｃ２］ 酸化還元酵素を電気化学的に測定するためのバイオセンサであって、
２以上の電極を含む導電部と、
前記酸化還元酵素の基質と、２種類以上のメディエータとを含み、前記導電部に接して配置された試薬層とを有し、
前記メディエータは、前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するための第１のメディエータと、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するための第２のメディエータとを含む、バイオセンサ。
［Ｃ３］ 前記酸化還元酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼであり、前記基質は、グルコースである、［Ｃ１］又は［Ｃ２］に記載のセンサ。
［Ｃ４］ 前記第１のメディエータと前記第２のメディエータとの組み合わせは、１－メトキシ－５－エチルフェナジニウムエチルサルフェート（１－ｍＰＥＳ）とルテニウム化合物との組み合わせ、又は１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１－ｍＰＭＳ）とルテニウム化合物との組み合わせである、［Ｃ１］から［Ｃ３］のいずれかに記載のセンサ。
［Ｄ１］ バイオセンサを用いて検体中の分析対象物を電気化学的に測定する方法であって、
前記バイオセンサは、
２以上の電極を含む導電部と、
酸化還元酵素で修飾された分子認識素子を含む第２の試薬層と、
前記酸化還元酵素の基質と、２種類以上のメディエータとを含み、前記導電部に接して配置された第１の試薬層とを有し、
前記メディエータは、前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するための第１のメディエータと、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するための第２のメディエータとを含み、
該方法は、
前記検体を前記バイオセンサに導入すること、
所定の時間のインキュベートを行うことにより、前記第２のメディエータに電子を蓄積させること、
インキュベート後、前記電極の間に電圧を印加すること、
前記印加により発生した電気的信号を測定すること、及び
前記測定値に基づき、前記酸化還元酵素の量を算出することを含む、測定方法。
［Ｄ２］ 前記インキュベートの時間を、前記第１の試薬層に含まれる基質が前記酸化還元酵素との反応によって枯渇しない範囲の時間に設定することを含む、［Ｄ１］記載の方法。
［Ｄ３］ 前記第１の試薬層における前記基質の配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）は、４．４ｎｍｏｌである、［Ｄ１］又は［Ｄ２］記載の方法。
［Ｄ４］ 前記インキュベートの時間は、１分以上である、［Ｄ１］から［Ｄ３］のいずれかに記載の方法。
［Ｄ５］ 前記酸化還元酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼであり、前記基質は、グルコースである、［Ｄ１］から［Ｄ４］のいずれかに記載の方法。
［Ｄ６］ 前記第１のメディエータと前記第２のメディエータとの組み合わせは、１－メトキシ－５－エチルフェナジニウムエチルサルフェート（１－ｍＰＥＳ）とルテニウム化合物との組み合わせ、又は１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１－ｍＰＭＳ）とルテニウム化合物との組み合わせである、［Ｄ１］から［Ｄ５］のいずれかに記載の方法。

以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。

実験例では、下記の試薬及び電極を使用した。
［バッファー］
０．５Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．３～７．４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０）
［メディエータ］
ルテニウム化合物（Ｒｕ（ＮＨ₃）₃Ｃｌ₆、株式会社同仁化学研究所社製）
１－ｍＰＥＳ（１－メトキシ－５－エチルフェナジニウムエチルサルフェート、株式会社同仁化学研究所社製）
［ＧＤＨ］
ＦＡＤ－ｄｅｐｅｎｄｅｔ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（商品名：Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ “Ａｍａｎｏ ８”、ＭＷ：１８万、天野エンザイム株式会社製）
［基質］
グルコース
［電極］
ＤＥＰ－ＣＨＩＰ（型名：ＤＥＰ－ＥＲ－Ｎ、丸型金電極、固定化用印刷電極（３電極系）、外寸：１２．５ｍｍ×４ｍｍ×０．３ｍｍ、作用極面積：３．６７ｍｍ²、株式会社バイオデバイステクノロジー製）

［実験例１］
以下の手順で、ＧＤＨを電気化学的に測定した。
＜手順＞
１．ＰＣＲチューブに５０μｌのバッファーを分注
２．１のチューブに、５０μｌの１Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅを分注
３．２のチューブに、５０μｌの５ｍＭ １－ｍＰＥＳを分注
４．３のチューブに、５０μｌの５００ｍＭ Ｒｕ化合物を分注
５．４のチューブに、５０μｌのＧＤＨ溶液を終濃度が０～１２．５ｎＭとなるように分注し、かつ測定器に接続した電極を反応液に浸漬
６．最後のＧＤＨ溶液を分注したタイミングでインキュベート時間の計測開始
７．計測開始から５分経過後、電極に電圧を印加し電気化学測定
印加電圧：２００ｍＶ
計測時間：１５秒
サンプリング間隔：０．１秒
８．測定終了

反応液（６のチューブ）の組成は、以下の通りである。
＜反応液の組成＞
０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．３～７．４）
０．１Ｍ ＮａＣｌ
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
２００ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ
１ｍＭ １－ｍＰＥＳ
１００ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₃Ｃｌ₆
０～１２．５ｎＭ ＧＤＨ

得られた結果を図５Ａ及びＢに示す。図５Ａ及びＢは、印加開始後２秒の応答値のグラフであり、図５Ｂは、低濃度（０～０．８ｎＭ）の範囲を拡大したものである。
図５Ａ及びＢに示すとおり、０．０２４ｎＭ（２４ｐＭ）～１２．５ｎＭの範囲のＧＤＨ濃度を５分間インキュベートして蓄電することにより検出することができた。つまり、５分間のインキュベート（蓄電）により、ｐＭオーダーのＧＤＨを測定できた。
印加後早い時間（例えば、印加から２秒後）で取得した応答値により、直線性の高いＧＤＨの定量ができた。

［実験例２］
以下の手順で、ＧＤＨを電気化学的に測定した。
＜手順＞
１．ＰＣＲチューブに５０μｌのバッファーを分注
２．１のチューブに、５０μｌの１Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅを分注
３．２のチューブに、５０μｌの５ｍＭ １－ｍＰＥＳを分注
４．３のチューブに、５０μｌの５００ｍＭ Ｒｕ化合物を分注
５．４のチューブに、５０μｌのＧＤＨ溶液を終濃度が０．５６、５．５６及び５５．５６ｎＭになるように分注し、かつ測定器に接続した電極を反応液に浸漬
６．最後のＧＤＨ溶液を分注したタイミングで蓄電時間計測開始
７．所定時間（５分、１０分、１５分のいずれか）経過後、電極に電圧を印加し電気化学測定
印加電圧：２００ｍＶ
計測時間：３０秒
サンプリング間隔：０．１秒
８．測定終了

反応液（６のチューブ）の組成は、以下の通りである。
＜反応液の組成＞
０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．３～７．４）
０．１Ｍ ＮａＣｌ
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
２００ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ
１ｍＭ １－ｍＰＥＳ
１００ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₃Ｃｌ₆
０．５６ｎＭ、５．５６ｎＭ、５５．５６ｎＭ ＧＤＨ

得られた結果を図６Ａ～Ｃに示す。図６Ａ～Ｃは、インキュベート時間が５分の応答値を１００としたときの相対値（感度比）を示す。応答値は印加開始後２秒の応答値を使用した。
図６Ａ～Ｃに示すとおり、いずれのＧＤＨ濃度においても、インキュベート時間に依存した応答値の増大が見られた。

［実験例３］
以下の手順で、ＧＤＨを電気化学的に測定した。
＜手順＞
１．ＰＣＲチューブに５０μｌのバッファーを分注
２．１のチューブに、５０μｌのＧｌｕｃｏｓｅを終濃度が２～２００ｍＭとなるように分注
３．２のチューブに、５０μｌの５ｍＭ １－ｍＰＥＳを分注
４．３のチューブに、５０μｌの５００ｍＭ Ｒｕ化合物を分注
５．４のチューブに、５０μｌの５ｎＭ ＧＤＨ溶液を分注し、かつ測定器に接続した電極を反応液に浸漬
６．最後のＧＤＨ溶液を分注したタイミングで蓄電時間計測開始
７．所定時間（５分）経過後、電極に電圧を印加し電気化学測定
印加電圧：２００ｍＶ
計測時間：１０秒
サンプリング間隔：０．１秒
８．測定終了

反応液（６のチューブ）の組成は、以下の通りである。
＜反応液の組成＞
０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．３～７．４）
０．１Ｍ ＮａＣｌ
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
２～２００ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ
１ｍＭ １－ｍＰＥＳ
１００ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₃Ｃｌ₆
１ｎＭ ＧＤＨ

得られた結果を図７に示す。応答値は印加開始後２秒の応答値を使用した。図７に示すとおり、本実験例の条件では、Ｇｌｕｃｏｓｅ濃度（基質濃度）が１０ｍＭ以上において２００ｎＡを超える高い応答電流が得られた。Ｇｌｕｃｏｓｅ濃度（基質濃度）が６０ｍＭ以上（６０～２００ｍＭ）の場合、応答値が変化しなかった（応答値の減少がみられなかった）。つまり、反応液中の基質（Ｇｌｕｃｏｓｅ）濃度が高濃度である場合（例えば、検体である生体試料中に酸化還元酵素反応の基質となる物質が高濃度で含まれている場合）であっても、酵素（ＧＤＨ）がＧｌｕｃｏｓｅによる基質阻害を受けることなく、酵素の濃度を測定できることを確認した。

［実験例４］
以下の手順で、ＧＤＨを電気化学的に測定した。分注は、反応液中のメディエータの濃度が下記表に示す濃度となるように行った。
＜手順＞
１．ＰＣＲチューブに５０μｌのバッファーを分注
２．１のチューブに、５０μｌの１Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅを分注
３．２のチューブに、５０μｌの５ｍＭ １－ｍＰＥＳを分注（１－ｍＰＥＳを含まないものはバッファーを分注）
４．３のチューブに、５０μｌの５００ｍＭ Ｒｕ化合物を分注（Ｒｕ化合物を含まないものはバッファーを分注）
５．４のチューブに、５０μｌのＧＤＨ溶液を終濃度が０～１０ｎＭになるように分注し、かつ測定器に接続した電極を反応液に浸漬
６．最後のＧＤＨ溶液を分注したタイミングで蓄電時間計測開始
７．所定時間（５分）経過後、電極に電圧を印加し電気化学測定
印加電圧：２００ｍＶ
計測時間：１０秒
サンプリング間隔：０．０１秒
８．測定終了

反応液（６のチューブ）の組成は、以下の通りである。
＜反応液の組成＞
０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．３～７．４）
０．１Ｍ ＮａＣｌ
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
２００ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ
１－ｍＰＥＳ及びＲｕ（ＮＨ₃）₃Ｃｌ₆は以下表
０～１０ｎＭ ＧＤＨ

その結果を図８に示す。応答値は印加開始後２．０～２．１秒の応答値の平均値を使用した。図８に示すとおり、１種類のメディエータのみでは十分な応答値を得ることができなかった。特に、ルテニウム化合物のみを使用した場合では、いずれのＧＤＨ濃度でも応答値を得ることができなかった。これは、ルテニウム化合物がＧＤＨから電子をほとんど受取ることができなかったもしくは、受け取った電子を蓄電することができなかったことに起因すると考えられる。
これに対し、２種類のメディエータ（ルテニウム化合物及び１－ｍＰＥＳ）を使用することで、いずれのＧＤＨ濃度でも高い応答値を得ることができた。

［実験例５］
以下の手順で、ＧＤＨを電気化学的に測定した。
＜手順＞
１．ＰＣＲチューブに５０μｌのバッファーを分注
２．１のチューブに、５０μｌの１Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅを分注
３．２のチューブに、５０μｌの５ｍＭ又は５００ｍＭ １－ｍＰＥＳを分注
４．３のチューブに、５０μｌの５００ｍＭ Ｒｕ化合物を分注
５．４のチューブに、５０μｌの５ｎＭ ＧＤＨ溶液を分注し、かつ測定器に接続した電極を反応液に浸漬
６．最後のＧＤＨ溶液を分注したタイミングで蓄電時間計測開始
７．所定時間（５分）経過後、電極に電圧を印加し電気化学測定
印加電圧：２００ｍＶ
計測時間：１０秒
サンプリング間隔：０．０１秒
８．測定終了

反応液（６のチューブ）の組成は、以下の通りである。
＜反応液の組成＞
０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．３～７．４）
０．１Ｍ ＮａＣｌ
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
２００ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ
１ｍＭ又は１００ｍＭ １－ｍＰＥＳ
１００ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₃Ｃｌ₆
１ｎＭ ＧＤＨ

その結果を図９に示す。応答値は印加開始後２．０～２．１秒の応答値の平均値を使用した。図９に示すとおり、１－ｍＰＥＳ（第１のメディエータ）の量を１００ｍＭへ増加させることで、感度（応答値）を２倍以上にすることができた。

［実験例６］
分子認識素子としてＧＤＨで修飾（標識）されたアデノシンＤＮＡアプタマーを用いて、下記の手順で、反応液中のＧＤＨを電気化学的に測定した。
アデノシンＤＮＡアプタマーは、標的分子認識部としてアデノシンを認識し結合可能なアプタマーであって、ＧＤＨで標識され、かつ磁性ビーズに固定化されている。アデノシンＤＮＡアプタマー固定化ビーズは、アデノシンがアプタマーに結合すると、ＧＤＨ標識アプタマーがビーズより遊離する。
＜手順＞
１．ＰＣＲチューブに、１００μｌのアデノシンＤＮＡアプタマー固定化ビーズを分注（終濃度：６ｐｍｏｌ／１００μｌ）
２．集磁し、液を廃棄
３．２のチューブに、アデノシンをバッファーに溶解させたアデノシン溶液を１２０μｌ分注（アデノシン終濃度：０、７．５、１２．５、３７．５、７５、１２５、３７５又は７５０μＭ）
４．５分間反応させた後、集磁（２分間）し、上清を回収
５．ＰＣＲチューブに、５０μｌのバッファーを分注
６．５のチューブに、５０μｌの１Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅを分注
７．６のチューブに、５０μｌの５ｍＭ １－ｍＰＥＳを分注
８．７のチューブに、５０μｌの５００ｍＭ Ｒｕ化合物を分注
９．８のチューブに、５０μｌの４のサンプル（ＧＤＨ標識アプタマーを含む）を分注し、かつ測定器に接続
１０．最後の４のサンプルを分注したタイミングで蓄電時間計測開始
１１．所定時間（５分）経過後、電極に電圧を印加し電気化学測定
印加電圧：２００ｍＶ
計測時間：１０秒
サンプリング間隔：０．０１秒
１２．測定終了

反応液（１０のチューブ）の組成は、以下の通りである。
＜反応液の組成＞
０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．３～７．４）
０．１Ｍ ＮａＣｌ
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
２００ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ
１ｍＭ １－ｍＰＥＳ
１００ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₃Ｃｌ₆
アデノシン濃度に応じて磁性ビーズから遊離したＧＤＨ標識アプタマー

バッファーに代えて血漿に溶解させたアデノシン溶液を使用した以外は、上記の手順で同様に測定を行った。

その結果を図１０に示す。応答値は印加開始後２．０～２．１秒の応答値の平均値を使用した。図１０に示すとおり、血漿とバッファーとで感度に違いは認められるが、測定対象物（アデノシン）濃度に依存した応答電流の増大が確認された。
つまり、アプタマーと分析対象物（アデノシン）の反応により遊離したＧＤＨ修飾アプタマーを用いた対象物濃度の検出ができた。

［実験例７］
以下の手順で、ＧＤＨを電気化学的に測定した。
［デバイスの作製］
ＰＥＴ基材上に、金属をスパッタリングしてトリミングすることにより、対極、作用極及び参照極を有する電極を作製した。得られた電極を用いて、キャピラリー構造を有するデバイスを作製した。
＜手順＞
１．ＰＣＲチューブに５０μｌのバッファーを分注
２．１のチューブに、５０μｌの１Ｍ Ｇｌｕｃｏｓｅを分注
３．２のチューブに、５０μｌの５ｍＭ １－ｍＰＥＳを分注
４．３のチューブに、５０μｌの５００ｍＭ Ｒｕ化合物を分注
５．４のチューブに、５０μｌのＧＤＨを終濃度が０．５６ｎＭ、５．５６ｎＭ、及び５５．５６ｎＭになるように分注
６．分注後速やかに（分注から１０秒後程度）、５のチューブからサンプルの一部を上記のデバイス１個に吸引
７．吸引後速やかに電極に電圧を印加し電気化学測定（第１の印加及び第１の測定）
印加電位：２００ｍＶ
計測時間：５秒
サンプリング間隔：０．１秒
８．５の分注から所定のインキュベート時間（１、３又は５分）経過後、電極に電圧を印加し電気化学測定（第２の印加及び第２の測定）
印加電圧：２００ｍＶ
計測時間：１５秒
サンプリング間隔：０．１秒
９．測定終了

反応液（７及び８のチューブ）の組成は、以下の通りである。
＜反応液の組成＞
０．１Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７．３～７．４）
０．１Ｍ ＮａＣｌ
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０
２００ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ
１ｍＭ １－ｍＰＥＳ
１００ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₃Ｃｌ₆
０．５６、５．５６及び５５．５６ｎＭ ＧＤＨ

その結果の一部を図１１Ａ及びＢに示す。図１１Ａが第１の測定（プレ印加時）の応答電流値の測定結果であり、図１１Ｂが第２の測定時の応答電流値の測定結果である。図１１Ａの応答値は印加開始後０．５秒の応答値を使用し、図１１Ｂの応答値は印加開始後２．０秒の応答値を使用した。
図１１Ａに示すとおり、第１の測定（プレ印加）では、ＧＤＨ濃度が高いサンプルでは電流値が高く、ＧＤＨ濃度が低いサンプルでは電流値が低かった。第１の測定の電流値に応じて、第２の測定におけるインキュベート（蓄電）の時間を変化させた。その結果を図１１Ｂに示す。第１の測定における電流値が高かったサンプル（計測開始後０．５秒の電流値が２０００ｎＡ以上）は、１分間のインキュベート（蓄電）で十分に測定することができた。プレ印加の電流値が１０００ｎＡ以上２０００ｎＡ未満の場合は、３分間のインキュベート（蓄電）で測定することができた。第１の測定の電流値が１０００ｎＡ未満の場合は、５分間のインキュベート（蓄電）することで応答値が検出できる程度であった。
つまり、第１の測定の電流値について予め閾値及び各閾値に対するインキュベート（蓄電）時間を設定し、第１の測定の測定値を閾値と比較してインキュベート（蓄電）時間を変化させことで、より迅速な測定が可能となり、かつデバイスへの負荷低減や、電極構造における対極面積をより小さく設定できうることが示唆された。

［バイオセンサの作製］
バイオセンサは、図３Ａ～Ｅに示すように以下の手順で作製した。
図３Ａに示すように、ＰＥＴ製基板１０（長さ：５０ｍｍ、幅６ｍｍ、厚み、２５０μｍ）を準備し、その一方の表面に、金属をスパッタリングし、それをトリミングすることにより、検知極（１）１３、対極１１、作用極１２、並びに参照極及び検知極（２）１４を形成した。
つぎに、図３Ｂに示すように、電極を形成した基板１０の上に、第１の試薬層１５、第２の試薬層１６及び止水部１７を設けた。第２の試薬層１６は、検知極（１）１３及び対極１１に接触するようにそれらの上に設けた。第１の試薬層１５は、対極１１及び作用極１２の一部に接触するようにそれらの上に設けた。止水部１７は、参照極及び検知極（２）１４の上に設けた。第２の試薬層１６は、酸化還元酵素で修飾された分子認識素子を含有させたガラスフィルターを配置することにより形成した。第２の試薬層１６のフィルターは、直径３ｍｍとした。第１の試薬層１５は、酸化還元酵素の基質、第１及び第２のメディエータ並びに緩衝剤を含む試薬液を配置し乾燥させることで形成した。止水部１７は、止水用ポリマーを配置することにより形成した。
つぎに、図３Ｃに示すように、第２の試薬層１６、第１の試薬層１５及び止水部１７が露出するような開口部を有するスペーサー１８を、第２の試薬層１６、第１の試薬層１５及び止水部１７を形成した基材１０の上に配置した。また、スペーサー１８は、一方の端部（同図の右手側）の電極が露出するように配置した。
つぎに、図３Ｄに示すように、スペーサー１８上に、検体供給部となる貫通孔２０と、通気口となる貫通孔２１とを備えるカバー１９を配置した。基板１０及びカバー１９によって囲まれた、スペーサー１８の開口部の空間が流路となる。流路の高さは１００μｍ程度とした。検体供給部となる貫通孔２０及び通気口となる貫通孔２１は、それぞれ第２の試薬層１６及び止水部１７の上部に位置するように形成した。検体供給部となる貫通孔２０は直径４ｍｍとし、通気口となる貫通孔２１は直径０．５ｍｍとした。
最後に、図３Ｅに示すように、カバー１９の上に、Ｏリング型撥水テープ２２（内径：２ｍｍかつ外径：６ｍｍ）を配置した。撥水テープ２２は、検体供給部となる貫通孔２０の周囲を覆うように配置し、これにより、検体が第２の試薬層１６（フィルター）の外に流出することを防ぐことができる。
図４は、図３ＥにおけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。図４に示すように、基板１０及びカバー１９によって囲まれた空間（流路）２３が形成されており、その空間（流路）２３を、検体供給部となる貫通孔２０に供給された検体が第２の試薬層１６及び第１の試薬層１５を経て通気口となる貫通孔２１に移動することができる。

Claims (8)

1. バイオセンサを用いて酸化還元酵素の量を電気化学的に測定する方法であって、
   前記バイオセンサは、
   ２以上の電極を含む導電部と、
   前記導電部に接して配置され、前記酸化還元酵素の基質及び２種類以上のメディエータを含む試薬層とを有し、
   前記メディエータは、第１のメディエータと第２のメディエータとを含み、前記第１のメディエータは前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するためのメディエータであり、前記第２のメディエータは、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するためのメディエータであり、
   該方法は、
   酸化還元酵素を含む試料を前記試薬層に接触させること、
   接触後、所定の時間のインキュベートを行うことにより、前記第２のメディエータに前記電子を蓄積させること、
   インキュベート後、前記電極の間に電圧を印加すること、
   前記電圧の印加により発生した電気的信号を測定すること、及び
   前記電気的信号に基づき、前記酸化還元酵素の量を算出することを含む、方法。
2. 前記インキュベートの時間を、前記試薬層に含まれる基質が前記酸化還元酵素との反応によって枯渇しない範囲の時間に設定することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記試薬層における前記基質の配合量（試薬層の１ｃｍ³あたり）は、４．４ｎｍｏｌ以上である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記インキュベートの時間は、１分以上である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 前記酸化還元酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼであり、前記基質は、グルコースである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 前記第１のメディエータと前記第２のメディエータとの組み合わせは、１－メトキシ－５－エチルフェナジニウムエチルサルフェート（１－ｍＰＥＳ）とルテニウム化合物との組み合わせ、又は１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１－ｍＰＭＳ）とルテニウム化合物との組み合わせである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 酸化還元酵素を電気化学的に測定するためのバイオセンサであって、
   ２以上の電極を含む導電部と、
   前記酸化還元酵素の基質と、２種類以上のメディエータとを含み、前記導電部に接して配置された試薬層とを有し、
   前記メディエータは、第１のメディエータと第２のメディエータとを含み、前記第１のメディエータは前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するためのメディエータであり、前記第２のメディエータは、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するためのメディエータであり、
   請求項１から６のいずれかに記載の測定方法に用いるための、バイオセンサ。
8. バイオセンサを用いて酸化還元酵素の量を電気化学的に測定する方法であって、
   前記バイオセンサは、
   ２以上の電極を含む導電部と、
   前記酸化還元酵素の基質と、２種類以上のメディエータとを含み、前記導電部に接して配置された試薬層とを有し、
   前記メディエータは、第１のメディエータと第２のメディエータとを含み、前記第１のメディエータは前記基質と前記酸化還元酵素との反応により生じた電子を第２のメディエータに伝達するためのメディエータであり、前記第２のメディエータは、前記第１のメディエータから伝達された電子を前記電極に伝達するためのメディエータであり、
   該方法は、
   前記酸化還元酵素を含む試料を前記バイオセンサの前記試薬層に接触させること、
   接触後、前記電極の間に電圧を印加すること（第１の印加）、
   前記第１の印加により発生した電気的信号を測定すること（第１の測定）、
   前記第１の測定により得られた電気的信号に基づき、インキュベート時間を算出すること、
   算出して得られた時間のインキュベートを行うこと、
   インキュベート後、前記電極の間に電圧を印加すること（第２の印加）、
   前記第２の印加により発生した電気的信号を測定すること（第２の測定）、及び
   第２の測定により得られた電気的信号に基づき、前記酸化還元酵素の量を算出することを含む、測定方法。