CN1875265A - 生物传感器及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能够回避氧对介质的影响、并可迅速且简便地以高精度对试样溶液中的测定对象物进行测定的生物传感器。可以准备具有电极的基板,在所述电极表面上涂布含有介质、表面活性剂、缓冲剂和层状无机化合物的溶剂,形成防止所述介质自然氧化的无机凝胶层,进一步在所述层上形成含有氧化还原酶的酶试剂层,从而制造生物传感器。此生物传感器通过所述无机凝胶层,可以将由测定对象物和氧化还原酶的反应而被还原的介质在不被溶存氧等再氧化的情况下用电化学方法测定。
Description
技术领域
本发明涉及用电化学方法测定试样中的测定对象物的生物传感器。
背景技术
一直以来,广泛使用着不对含特定测定对象物的试样液进行例如试样液的稀释或搅拌等,就能简便且迅速地定量上述测定对象物的生物传感器。这种生物传感器可如下制作(如参照专利文献1):例如在电绝缘性的基板上,通过网板印刷等方法形成具有作用极(也称为测定极)和对极的电极系,在其上形成含有与上述测定对象物发生反应的氧化还原酶和介质(电子传递物质)等的试剂层,由此制作。如果使含有上述测定对象物的试样液与此试剂层相接触,则通过上述氧化还原酶的催化作用,例如上述测定对象物被氧化,而上述介质被还原。通过使用了上述电极系的电化学方法将该被还原的介质(以下称为“还原型介质”)进行再氧化,能够从由此得到的氧化电流值计算出上述试样液中测定对象物的浓度。
但是,当反应氛围中存在氧或试样液中存在溶存氧时,上述还原型介质不仅如上所述那样被电化学再氧化,也被上述氧再氧化。因此,存在着在由电化学的再氧化得到的氧化电流值中产生误差,从而使测定精度降低的问题。
作为回避此问题的方法,考虑到了例如在氮气氛围下进行测定等,但这种方法花费时间且操作也烦杂。并且,也存在着在完全没有氧的条件下,不能使用在酶反应中必需氧的氧化还原酶的问题,适用范围变得非常窄。
专利文献1:日本特开平1-291153号公报
发明内容
因此,本发明的目的在于提供回避了氧对介质的影响、并能够迅速且简便地以高精度来测定试样液中的测定对象物的生物传感器。
为了达成上述目的,本发明的生物传感器的制造方法包括下述工序:准备具有电极的基板,在上述电极表面上形成至少含有介质、表面活性剂、缓冲剂以及层状无机化合物的无机凝胶层。
另外,本发明的生物传感器为通过上述本发明的制造方法制造得到的生物传感器。
本发明人等为了防止由试样中的测定对象物与氧化还原酶的反应而被还原的介质(还原型介质)被自然氧化,对生物传感器进行了锐意研究。通常来说,已知例如由层状无机化合物形成无机凝胶层,但此研究结果发现通过在无机凝胶层中进一步含有表面活性剂和缓冲剂,能够形成发挥防止上述还原型介质的自然氧化效果的无机凝胶层。本发明人等首次发现通过这种方法能够得到上述防止自然氧化的效果。如果通过上述方法形成无机凝胶层,则能够防止用于间接测定试样中测定对象物的上述还原型介质被例如测定氛围中的氧或试样中的溶存氧等再氧化。因此,能够提供消除了上述还原型介质的再氧化导致的测定误差、且测定精度优异的生物传感器。在本发明中,所谓“上述介质的自然氧化”是指例如上述介质被使用生物传感器时的液体试样中的溶存氧、被空气中的水分吸收的氧(如保存时空气中水分吸收空气中的氧)所氧化。
通过在表面活性剂和缓冲剂的存在下形成无机凝胶层来发挥防止氧化的功能,被推测为或许源自以下所示的机理。
例如认为,在涂布含有上述介质、表面活性剂、缓冲剂以及层状无机化合物的分散液而形成的上述无机凝胶层中,形成了上述介质紧密嵌入于上述层状无机化合物的片材中的复合体,从而防止上述介质与液体试样等中所含的溶存氧发生接触。通常,由于试样液中溶存有氧,因此如上所述,通过层状无机化合物将水遮蔽,能够防止上述溶存氧对上述介质的攻击。并且,如上所述,通过进一步存在表面活性剂,层状无机化合物和介质不会聚合而变得不溶,而是成为这些复合体分散的状态,能够形成可充分发挥上述效果的无机凝胶层。
另外,通过上述分散液中含有缓冲剂,能够形成均匀的无机凝胶层,能够进一步提高防止氧化的功能。这是由于上述缓冲剂在形成上述介质和层状无机化合物的复合体时作为粘合剂发挥作用。通过这种粘合剂的作用,介质和层状无机化合物的结合形成了更加牢固的复合体,因此能够例如进一步遮蔽含有溶存氧的液体,可防止氧导致的介质的再氧化。另一方面,此种情况下表面活性剂也发挥了防止上述缓冲剂、层状无机化合物以及介质形成聚合物而变得不能分散、即所谓的阻断剂的功能。
本发明的生物传感器通过以上述方法进行制造,能够防止例如介质被测定氛围中的氧或试样中的溶存氧等再氧化。因此,本发明的生物传感器消除了由上述还原型介质的再氧化导致的测定误差,且测定精度优异。
通过本发明的制造方法得到的生物传感器从氧化还原酶向介质进行的电子授受,不是介由水,而是介由上述层状无机化合物的层间、即电偶极子层进行的。因此,根据水分被上述无机凝胶层遮蔽的本发明的生物传感器,即便在例如高湿度环境等下也发挥能够防止劣化的效果。另外,由于上述层状无机化合物的电偶极子层比水更易通过电子,因此认为与反应速度的增大也有关。
由本发明的制造方法得到的生物传感器,通过遮断上述的氧也能防止例如氧化导致的电极生锈等。
本发明中,将防止上述介质的自然氧化的无机凝胶层也称为“防止氧化层”。
附图说明
[图1]图1为显示本发明实施方案中生物传感器的制造方法一例的工序图,(A)~(F)分别表示各工序。
[图2]图2为上述实施方案的生物传感器的剖面图。
[图3]图3为显示本发明实施例中使用葡萄糖传感器测定试样时电流值随时间变化的图,图3(A)表示实施例的结果,图3(B)表示比较例的结果。
[图4]图4为显示本发明其它实施例中试样中的溶存氧浓度与变化率(%)的关系的图。
[图5]图5为显示本发明另一实施例中试样中的溶存氧浓度与变化率(%)的关系的图。
[图6]图6为显示本发明另一实施例中试样中的溶存氧浓度与变化率(%)的关系的图。
具体实施方案
本发明中,上述层状无机化合物优选为层状粘土矿物,特别优选膨润性粘土矿物。
上述层状无机化合物可以指,例如无机物的多面体连接成为平面状而形成片材结构,此片材结构进一步重叠为层状而形成晶体结构的化合物。作为上述多面体的形状,有例如四面体片材、八面体片材等,具体地说,例如可列举出Si四面体、Al八面体等。作为这种层状无机化合物,包括例如层状粘土矿物、水滑石、蒙脱石、多水高岭石、高岭土矿物、云母等。
所谓上述层状粘土矿物,一般可列举出占据粘土(为细小土状的无机粒状物,用水润湿状态下显示可塑性)大部分的硅铝酸盐矿物,其通常将Si被4个氧原子(O)包围的Si四面体和Al或Mg被6个羟基(OH基)或6个氧原子包围的Al八面体或Mg八面体作为最小构成单位。
作为上述层状粘土矿物的结构,可列举出例如上述Si四面体与其他Si四面体共有一个面,剩余顶点的氧原子朝向同一个方向形成六角网状的片材(以下称为“四面体片材”),而Al八面体或Mg八面体与其他八面体共有棱角而形成片材(八面体片材),上述四面体片材与上述八面体片材层叠为层状的结构。具体地说,例如分别将在上述四面体片材与上述八面体片材各重叠1张而成的1∶1层上进一步层叠几层的结构的矿物称为1∶1型矿物;将在用2张四面体片材夹住1张八面体片材的2∶1层上进一步层叠几层的结构的矿物称为2∶1型矿物;将在上述2∶1层的层间进一步还夹有1张八面体片材的结构的矿物称为2∶1∶1型矿物。另外,将例如八面体片材为Mg(OH)2、且在所有的八面体位置上都有金属离子的物质称为3八面体型(Trioctahedral);将八面体片材为Al(OH)3、且1/3成为空位的物质称为2八面体型(Dioctahedral)。其中,作为本发明的上述层状无机化合物,优选2∶1型矿物。
作为构成上述层状无机化合物的元素,可以列举出例如锂、钠、钾、镁、铝、硅、氧、氢、氟、碳等,可以由任何一种构成,也可以由两种或更多种构成。没有特别的限定,作为具体例,可列举出例如下述式(1)~(9)所示的化合物等,这些化合物例如也可含有结晶水。这些下述式是作为矿物学上或化学上的纯化合物的化学式,但实际上有时含有例如硅酸钠等杂质。因此,通过元素分析等确定化学式时不一定非要与这些化学式一致,此在例如文献(D.W,Thompson,J.T.Butterworth,J.ColloidInterf.Sci.,151,236-243(1992))等中也有记载。
MxSi4(Al2-xMgx)O10X2 (1)
上述式(1)中,优选M为选自H、Li、Na和K中的至少一个,X为OH和F中的至少一个,x为小于2的正数。
Mx(Si4-xAlx)Al12O10X2 (2)
上述式(2)中,优选M为选自H、Li、Na和K中的至少一个,X为OH和F中的至少一个,x为小于4的正数。
MxSi4(Mg3-xLix)O10X2 (3)
上述式(3)中,优选M为选自H、Li、Na和K中的至少一个,X为OH和F中的至少一个,x为小于3的正数。
Mx(Si4-xAlx)Mg3O10X2 (4)
上述式(4)中,优选M为选自H、Li、Na和K中的至少一个,X为OH和F中的至少一个,x为小于4的正数。
MSi4Mg2.5O10X2 (5)
上述式(5)中,M优选为Li和Na中的至少一个、更优选为Na,X优选为OH和F中的至少一个、更优选为F。
M2Si4Mg2O10X2 (6)
上述式(6)中,M优选为Li和Na中的至少一个、更优选为Li,X优选为OH和F中的至少一个、更优选为F。
Mg6Al12(OH)16Xx (7)
上述式(7)中,X优选为选自卤素、NO3、SO4、CO3和OH中的至少一个基团以及阴离子型有机酸中的至少一种,更优选为CO3;x在X为卤素、OH、NO3或一元有机酸时优选为2,在X为SO4、CO3或二元有机酸时优选为1。
Na0.33Si4(Mg2.67Li0.33)O10X2 (8)
上述式(8)中,X优选为OH和F中的至少一个、更优选为OH。
Naa-b(Si4-aAla)(Mg3-bAlb)O10X2 (9)
上述式(9)中,X优选为OH和F中的至少一个、更优选为OH;a优选为小于4的正数;b优选为小于3的正数;优选a-b>0。
作为上述层状无机化合物的具体例,可以列举出例如高岭石、多水高岭石、蛇纹石等1∶1型粘土矿物;滑石、叶腊石、蒙脱石、蛭石(上述式(2)所示的化合物,以下相同)、四硅氟云母(上述式(5))、含有带云母(上述式(6))的云母等2∶1型粘土矿物;绿泥石等2∶1∶1型粘土矿物;2∶1~2∶1∶1型的中间矿物;伊毛缟石等半晶质粘土矿物;水铝英石等非晶质粘土矿物;水滑石(上述式(7))等。
另外,蒙脱石中根据例如被同晶型置换的四面体、八面体晶格中离子种类的不同,包括蒙脱石(上述式(1))、含有40~80%蒙脱石的天然物膨润土、贝得石(上述式(2))等2八面体型;锂蒙脱石(上述式(3)、优选上述式(8))、皂石(上述式(4)、优选上述式(9))、绿脱石等3八面体型等。
水滑石由例如上述式(7)表示。具体地说,是以例如Mg6Al2(OH)16CO3·4H2O表示的层状矿物,Mg(OH)2(氢氧镁石:具有中心带有Mg2+的氧八面体的层进行层压重叠而形成的结构)中的Mg2+的一部分被同晶型置换为Al3+。其带有正电荷,但由于层间的CO3 2-而保持电中性,并具有阴离子交换能力。虽然不是硅酸盐矿物,但通常作为粘土矿物处理。
上述层状无机化合物的组成的例子示于下述表1。下述表1中,“MI”表示以1价阳离子为代表的交换性阳离子,如H+、Na+、K+、Li+等。
表1
矿物名 | 组成 |
高岭石多水高岭石蛇纹石滑石叶蜡石蒙脱石贝得石锂蒙脱石皂石绿脱石蛭石水滑石 | Si2Al2O5(OH)4Si2Al2O5(OH)4·2H2OSi2(Mg2+,Fe2+)3O5(OH)4Si4Mg3(OH)2O10Si4Al2(OH)2O10MIxSi4(Al2-xMgx)O10(OH)2·nH2OMIx(Si4-xAlx)Al2O10(OH)2·nH2OMIxSi4(Mg3-xLix)O10(OH,F)2·nH2OMIx(Si4-xAlx)Mg3O10(OH)2·nH2OMIx(Si4-xAlx)Fe2O10(OH)2·nH2OMIx(Si4-xAlx)Al2O10(OH)2·nH2OMg6Al2(OH)16CO3·4H2O |
上述层状无机化合物的平均孔径没有特别限定,但优选例如相对于溶剂能够均匀分散的粒径。由于上述层状无机化合物一般为片状粒子,并且多个粒子处于反复凝集和分裂的动态平衡中,因此定义平均粒径的本身是困难的,但通过例如光散射法或使用电子显微镜观察等方法进行测定时,在水中分散的状态下,优选在1nm~20μm的范围,更优选在10nm~2μm的范围.
这些粘土矿物等层状无机化合物,也可以例如搭建季铵盐等支柱,从而事先调整层间距离、层间电荷或极性。
上述层状无机化合物中,更优选2∶1型粘土矿物,特别优选具有离子交换能力的膨润性粘土矿物。
上述膨润性粘土矿物中更优选膨润土、蒙脱石、蛭石、合成氟云母等,特别优选合成锂蒙脱石、合成皂石等合成蒙脱石;以合成氟云母为代表的膨润性合成云母;Na型云母等合成云母(天然云母通常为非膨润性粘土矿物)等。这些层状无机化合物可以单独使用,也可以2种或更多种组合使用。
作为这种层状无机化合物,可以使用例如市售品,可以列举出CO-OP CHEMICAL(株)生产的商品名LUCENTITE SWN、商品名LUCENTITE SWF(合成锂蒙脱石),商品名ME(氟云母),KUNIMINE工业(株)生产的商品名SUMECTON SA(合成皂石),协和化学工业(株)生产的商品名THIXOPY W(合成锂蒙脱石)、商品名KYOWAAD500(合成水滑石),Laporte公司生产的商品名Laponite(合成锂蒙脱石),(株)Nacalai Tesque公司生产的天然膨润土,(株)丰顺矿业公司生产的商品名Multigel(膨润土)等。
本发明中,作为上述表面活性剂,优选为两性表面活性剂,更优选例如在同一分子内带有正电荷和负电荷的两性表面活性剂,可列举出例如烷基氨基羧酸(或其盐)、羧基甜菜碱、磺基甜菜碱和磷酸甜菜碱等。其中更优选同一分子内带有正电荷和负电荷、且上述正电荷和负电荷分开的两性表面活性剂,例如为羧基甜菜碱、磺基甜菜碱和磷酸甜菜碱等。具体地说,作为上述羧基甜菜碱,可使用烷基二甲基氨基醋酸甜菜碱等,作为上述磺基甜菜碱,可使用CHAPS、CHAPSO和烷基羟基磺基甜菜碱等。其中优选磺基甜菜碱,更优选CHAPS、CHAPSO,特别优选CHAPS。
本发明中,作为上述缓冲剂,优选胺系缓冲剂,可以列举出例如Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES、Tricine和ADA等,优选ACES、Tris,更优选ACES。这些物质可单独使用1种,也可2种或更多种组合使用。
作为上述缓冲剂,也优选具有羧基的缓冲剂,可以列举出例如醋酸-醋酸钠缓冲剂、苹果酸-醋酸钠缓冲剂、丙二酸-醋酸钠缓冲剂、琥珀酸-醋酸钠缓冲剂等,其中优选琥珀酸-醋酸钠缓冲剂。
作为上述胺系缓冲剂和上述表面活性剂的组合,可列举出例如Tris和CHAPS、ACES和CHAPS、ACES和CHAPSO的组合等,更优选为CHAPS和ACES。另外,作为具有羧基的缓冲剂和上述表面活性剂的组合,可列举出例如琥珀酸-醋酸钠和CHAPS或CHAPSO、丙二酸-醋酸钠和CHAPS、苹果酸-醋酸钠和CHAPS或CHAPSO、醋酸-醋酸钠和CHAPS等,优选琥珀酸-醋酸钠和CHAPS的组合。
本发明中,作为上述介质,优选例如通过后述的氧化还原酶和测定对象物发生的反应可成为还原型、被电化学氧化、并通过氧化电流能够检测的介质,可以使用以往公知的介质。
具体的说,可以使用铁氰化钾、对苯醌及其衍生物、吩嗪硫酸甲酯、靛酚、2,6-二氯苯酚靛酚等靛酚衍生物、β-萘醌-4-磺酸钾、二茂铁、二茂铁羧酸等二茂铁衍生物、锇络合物、钌络合物、NAD+、NADP+、吡咯喹啉醌(PQQ)、亚甲蓝、细胞色素c、细胞色素b、铜络合物等。其中可优选使用铁氰化钾、二茂铁、锇络合物、钌络合物、NAD+、NADP+等。
另外,除此之外,作为介质,还可以使用例如1,1’-二甲基-4,4’-二吡啶盐、1,1’-二苄基-4,4’-二吡啶盐、1,4-二氨基苯、2-甲基-1,4-萘醌、N-甲基吩嗪盐、1-羟基-5-甲基吩嗪盐、1-甲氧基-5-甲基吩嗪盐、9-二甲基氨基苯并α吩噁嗪-7-金属盐、亚铁氰盐、7-羟基-3H-吩噁嗪-3-酮10-氧化物、3,7-二氨基-5-苯基吩嗪盐、3-(二乙基氨基)-7-氨基-5-苯基吩嗪盐、1,4-苯二醇、1,4-二羟基-2,3,5-三甲基苯、N,N,N’,N’-四甲基-1,4-苯二胺、Δ2,2’-二-1,3-二硫醇、2,6-二甲基苯醌、2,5-二甲基苯醌、2,3,5,6-四甲基-2,5-环己二烯-1,4-二酮、2,6-二氯-4-[(4-羟基苯基)亚氨基]-2,5-环己二烯-1-酮、2,6-二氯-4-[(3-氯-4-羟基苯基)亚氨基]-2,5-环己二烯-1-酮、7-(二乙基氨基)-3-亚氨基-8-甲基-3H-吩噁嗪盐、3,7-双(二甲基氨基)酚噻嗪-5-金属盐等。
本发明的制造方法中,上述无机凝胶层优选通过涂布至少含有介质、表面活性剂、缓冲剂以及层状无机化合物的分散液而形成。
本发明中,可以在上述无机凝胶层上形成含有氧化还原酶的层来作为层叠体的试剂层;或者也可在上述分散液中进一步含有氧化还原酶,在电极表面上形成含有上述氧化还原酶的无机凝胶层,以此作为单层的试剂层。这样形成单层的试剂层时,由于没有必要另外形成含有氧化还原酶的层和含有介质的层,因此制造变得更加简单。这种生物传感器像例如葡萄糖脱氢酶(GDH)那样,在酶反应中使用不必需氧的酶时,特别优选。
作为上述氧化还原酶,只要是例如与试样中的测定对象物和上述介质发生氧化还原反应的酶即可,没有特别限定,可以根据测定对象物的种类等进行适当决定。
具体地说,可列举出例如葡萄糖氧化酶(GOD)、吡喃糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶(GDH)、乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶、果糖脱氢酶、半乳糖氧化酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶、醇氧化酶、醇脱氢酶、胆红素氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、氨基酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、甘油脱氢酶、酰基辅酶A氧化酶、胆碱氧化酶、4-羟基安息香酸羟基化酶、马来酸脱氢酶、肌氨酸氧化酶、尿酸酶等。
上述氧化还原酶和上述介质的组合没有特别限定,可列举出例如GOD和铁氰化钾、GDH和钌络合物、胆固醇脱氢酶和二茂铁、醇脱氢酶和铜络合物的组合等。
(实施方案1)
对本发明的第1生物传感器制造方法的一例以图1和图2为基础进行说明。图1(A)~(F)为显示制造生物传感器的一系列工序的立体图。图2为上述图1(F)所示生物传感器的I-I方向的剖面图。图1(A)~(F)和图2中的同一位置带有同一符号。
如图1(F)和图2所示,此生物传感器1具备基板11、由具有导线部12a的作用极12和具有导线部13a的对极13构成的电极系、绝缘层14、含有介质和层状无机化合物及表面活性剂的无机凝胶层(防止氧化层)16、含有氧化还原酶的酶试剂层17、具有开口部的隔板18和具有贯通孔20的盖19。如图1(B)所示,基板11的一个端部(两图中的右侧)上设有检测部15,在检测部15中,作用极12和对极13与基板11的宽度方向平行配置。上述两电极的一端分别成为导线部12a、13a(两图中的左侧),它们按照与检测部15的其他端垂直的方式而被配置(图1(A))。作用极12和对极13之间成为绝缘部。在具备这种电极系的基板11上,如图1(B)所示,除了导线部12a、13a和检测部15之外,其余层叠绝缘层14,在未层叠绝缘层14的上述检测部15上,按顺序层叠无机凝胶层16和酶试剂层17。在绝缘层14上,如图1(E)所示,配置有隔板18,其与检测部15对应的位置成为开口部。在隔板18上,在与上述开口部相对应的一部分上配置具有贯通孔20的盖19(图1(F))。在此生物传感器1中,为上述开口部的空间部分、且上述酶试剂层17和绝缘层14及盖19所夹的空间部分,成为毛细管结构的试样供给部21。并且,上述贯通孔20成为用于通过毛细管现象而吸入试样的空气孔。
此生物传感器1的大小没有特别限定,可以根据供给试样的量等进行适当设定,如全长为5~50mm、全宽为1~50mm、最大厚度为2000~500μm、最小厚度为50~500μm。“长”是指生物传感器的长度方向的长度;“宽”是指宽度方向的长度(以下相同)。
基板11的大小例如长为5~50mm、宽为1~50mm、厚为1000~10μm;绝缘层14的大小例如长为5~50mm、宽为1~50mm、厚为10~200μm;检测部15的大小例如长为0.1~10mm、宽为0.1~10mm;无机凝胶层16的大小例如长为0.1~10mm、宽为0.1~10mm、厚为0.001~500μm;酶试剂层17的大小例如长为0.1~10mm、宽为0.1~10mm、厚为0.001~500μm。隔板的大小例如长为1~50mm、宽为1~50mm、厚为10~1000μm,其开口部例如长为0.1~10mm、宽为0.01~10mm。盖19的大小例如长为5~50mm、宽为1~50mm、厚为10~1000μm,其贯通孔例如直径为0.1~10mm。
无机凝胶层16中的层状无机化合物的含量可根据供给试样的种类及其量、检测部15的面积等进行适当决定,例如每1cm2的检测部15的面积为0.003~30mg的范围、优选0.1~10mg的范围、更优选0.3~3mg的范围。具体地说,上述层状无机化合物为蒙脱石时,例如每1cm2上述面积为0.003~30mg的范围、优选0.1~10mg的范围、更优选0.3~3mg的范围。如果上述含量为每1cm2面积0.003mg或以上,例如能够充分发挥氧阻断效果;如果为每1cm2面积30mg或以下,则能够进一步提高氧阻断效果和重现性、反应性。上述单位面积的层状无机化合物的量与无机凝胶层16的厚度有关,如上所述,层厚优选为0.001~500μm的范围。
另外,无机凝胶层16中表面活性剂(如两性表面活性剂)的含量例如可根据上述层状无机化合物的量进行适当决定,相对于300mg层状无机化合物例如为0.1mmol~100mmol的范围、优选为0.5mmol~10mmol、更优选为0.5mmol~1mmol的范围。
无机凝胶层16中介质的含量例如可根据测定试样的种类、测定对象物的种类、后述酶试剂层中氧化还原酶的量等进行适当决定,例如每1cm2检测部15的面积,优选为10mmol~100mol、更优选为10mmol~50mmol、特别优选为15mmol~20mmol的范围。
此无机凝胶层16还可以进一步含有缓冲剂。无机凝胶层16的上述缓冲剂含量例如可根据上述层状无机化合物的量进行适当决定,相对于0.3g层状无机化合物,缓冲剂例如优选为0.1mmol~100mmol、更优选为1mmol~50mmol、特别优选为10mmol~20mmol的范围。
上述酶试剂层17的氧化还原酶的含量没有特别限定,可以根据试样的种类及其量、测定对象物的种类和量等进行适当决定。具体地说,每1cm2检测部15的面积,例如为0.1U~100KU的范围、优选为1U~10KU的范围、更优选为1U~100U的范围。
酶试剂层17中的酶量和上述无机凝胶层16中的介质的比例为:例如每1000U的酶,介质为0.01~1M的范围、优选为0.01~0.5M的范围、更优选为50mM~200mM的范围。
这种生物传感器例如可如下制作。
首先准备用于形成电极系的基板11。作为上述基板11的材料,优选电绝缘性材料,可以列举出例如塑料、玻璃、纸、陶瓷、橡胶等。作为上述塑料,可列举出例如聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚丙烯(PP)、丙烯酸树脂、玻璃环氧树脂等。
接着,如图1(A)所示,在基板11上形成由具有导线部12a的作用极12和具有导线部13a的对极13构成的电极系。电极的形状并不限于图1(A)所示的形状。作为上述电极,优选碳电极、金电极、钯电极、铂电极等,根据其种类可以通过例如网板印刷、涂布法、蒸镀法等公知的方法形成。
碳电极的情况下,例如可以在上述基板11上通过网板印刷手段、涂布手段等形成碳墨。
上述金电极可以通过例如蒸镀法、电镀法、溅射法、金箔贴附法等形成。上述蒸镀法为通过例如离子电镀法,在真空度为1.33×10-4Pa、输入功率为300W、速率为5×10-1nm/秒、时间为2分钟的条件下,在例如PET等塑料片材上蒸镀金,进一步使用kisscut装置,在蒸镀于上述片材上的金箔层中插入间隙的方法。由此,间隙部分成为绝缘部,能够形成由作用极和对极构成的电极系。
接着,如图1(B)所示,在形成有上述电极系12、13的基板11上形成绝缘层14。此绝缘层在除了电极的导线部12a、13a(图1(B)中的左侧)和形成后述无机凝胶层等的检测部15之外的基板11上形成。
上述绝缘层14可如下形成:例如将在溶剂中溶解有绝缘性树脂的绝缘浆料印刷在上述基板11上,对其进行加热处理或者紫外线处理而形成。
作为上述绝缘性树脂,可以列举出例如聚酯、丁缩醛树脂、酚树脂等,作为上述溶剂,可列举出例如乙酸卡必酯、二元酸酯系混合溶剂(DBE溶剂)等。上述浆料中的上述绝缘性树脂的浓度优选为例如65~95重量%的范围、更优选为75~90重量%的范围、特别优选80~85重量%的范围。
上述加热处理的条件可根据所用上述绝缘性树脂的种类进行适当决定。
上述绝缘层14除了使用上述印刷法以外,还可以通过例如涂布、贴膜、蚀刻等方法形成。
接着,如图1(C)所示,在未形成绝缘层14的检测部15中,在基板11和电极12、13上形成无机凝胶层16。无机凝胶层16可如下形成:例如制备含有介质和表面活性剂、且分散有上述层状无机化合物的分散液,将其分注于上述检测部15中并干燥,由此形成。此无机凝胶层16不一定非要总是凝胶状,在使用前也可以是通过上述干燥工序干燥了的状态,在浸渍在液体试样等的情况下,优选为凝胶状。
作为用于制备上述分散液的溶剂,如可以使用水、缓冲液、醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等,其中优选超纯水。
上述分散液中的上述层状无机化合物的浓度例如为0.1~100mg/mL的范围、优选为1~100mg/mL的范围、更优选为10~30mg/mL的范围。上述分散液中的上述表面活性剂的浓度例如为1~200mM的范围、优选为1~100mM的范围、更优选为1~10mM的范围。
分散液中的层状无机化合物与表面活性剂的添加比例为,相对于300mg的上述层状无机化合物,表面活性剂例如为0.1mmol~100mmol的范围、优选为0.5mmol~10mmol、更优选为0.5mmol~1mmol的范围。
上述分散液的上述介质的浓度例如为1~1000mM的范围、优选为100~800mM的范围、更优选为200~500mM的范围、特别优选为300mM左右。
优选上述分散液中进一步含有上述胺系等缓冲剂,此时上述缓冲剂的浓度例如在1~1000mM的范围、优选在10~500mM的范围、更优选在50~200mM的范围。作为相对于层状无机化合物的上述缓冲剂的添加比例为,相对于0.3g的上述层状无机化合物,上述缓冲剂优选例如为0.1mmol~100mmol、更优选1mmol~50mmol、特别优选在10mmol~20mmol的范围。
由于上述表面活性剂和上述缓冲剂的添加量能够如上所述,由相对于无机微粒的比例来决定,因此上述表面活性剂和上述缓冲剂的添加比例(摩尔比A∶B)没有特别限定,例如在A∶B=1∶1~1∶250的范围、优选在1∶10~1∶100的范围、更优选在1∶25~1∶50的范围。
相对于上述溶剂,上述介质、上述层状无机化合物和表面活性剂等各成分的添加顺序没有特别限定,例如首先在上述溶剂中添加层状无机化合物,充分搅拌后,添加表面活性剂。然后优选再添加上述缓冲剂,最后溶解介质。按照此顺序,虽然机理不清楚,但能够形成更加均匀、且防止与氧接触的无机凝胶层。上述缓冲剂也可与表面活性剂一起添加,但特别优选在添加表面活性剂后再添加。
上述分散液的制备方法没有特别限定,如优选根据所用介质的种类等来调整pH或选择使用的缓冲剂的种类。以下,举出与介质种类相应的具体例。
首先,举例说明使用优选在中性左右下使用的介质的情况。一般来说,蒙脱石这样的层状化合物(无机凝胶)溶解在水等溶剂中则变得透明,其分散液的pH为高碱性(pH 10左右)。而优选在中性左右下使用的介质、酶等优选在稳定的pH条件下、即中性左右下进行添加。但是,无机凝胶在中性左右下有时会产生混浊或者沉淀。此时,作为缓冲剂如果添加上述胺系缓冲剂,则能够将上述分散液的pH调整到中性左右,并且,虽然机理不清楚,但无论是否在中性左右都可以在不产生沉淀的情况下添加介质。而且,作为其结果,如上所述那样,能够确实地形成可充分防止介质再氧化的无机凝胶层。本发明人等还首次发现,通过在添加两性表面活性剂这样的表面活性剂后添加胺系缓冲剂,能够充分防止所制备的分散液的混浊和沉淀。作为具体的添加顺序,优选为在层状无机化合物的分散液中添加表面活性剂,之后添加胺系缓冲剂。添加胺系缓冲剂后的分散液的pH例如在9~5的范围、优选为8~6、更优选为7.5~7。
作为优选在中性左右下使用的介质,可列举出如铁氰化钾、细胞色素c、PQQ、NAD+、NADP+、铜络合物等。
在使用优选在酸性左右下使用的介质的情况下,优选下述制备方法。如上所述,一般来说,将层状无机化合物(无机凝胶)溶解在溶剂中则变得透明,其分散液的pH变为强碱性。此时,为了添加优选在酸性左右下使用的介质,优选例如在上述分散液中添加HCl等酸,将上述分散液的pH调整至酸性侧,添加上述表面活性剂,之后添加上述具有羧基的缓冲剂来调整pH,然后添加介质。
优选这种方法的理由如下。本发明人等发现,蒙脱石这样的无机层状化合物,在其分散液中添加HCl等酸而成为强酸性条件(如pH 2左右)时,虽然变得混浊发生凝集,但进一步通过持续搅拌(例如24小时左右),即便在酸性侧也能使分散液变得透明。但是,在此种状态的分散液中不加入如上所述的成为粘合剂的缓冲剂,无法得到缓冲剂的效果,并且考虑到使用酶,在pH 2等的强酸性下,酶有可能失活。因此,通过进一步研究,本发明人等发现,通过在强酸性左右下变得透明的分散液中加入两性表面活性剂这样的表面活性剂后,再添加具有羧基的缓冲剂,并设定不影响介质和酶的各成分的pH(如pH 4.5左右),就能够充分防止沉淀的产生,能够在充分稳定的状态下使用介质和酶。
上述分散液的pH,最初优选为1~3的强酸性、更优选为pH 1.5~2。作为所使用的酸,没有特别限定,如盐酸、磷酸、醋酸等。在强酸性下的上述分散液的搅拌条件没有特别限定,搅拌时间如为12~72小时、优选为18~48小时、特别优选24~30小时。通过添加具有羧基的缓冲剂,上述分散液的pH优选设定为3~6、更优选为4~5、特别优选为4.5~4.8。
作为优选在酸性左右下使用的介质,可列举出例如钌络合物、锇络合物、二茂铁、吩嗪硫酸甲酯、靛酚、亚甲蓝等。
在将层状无机化合物、表面活性剂和缓冲剂添加到上述溶剂中后,优选静置一段时间。静置时间优选例如24小时或以上、更优选为3天或以上。
此分散液向检测部15的注入比例可根据例如检测部15的大小、分散液中上述层状无机化合物等的含量、上述层状无机化合物的种类等进行适当决定。具体地说,相对于检测部15的单位面积(cm2),例如优选按照上述层状无机化合物变为0.003~30mg的范围的方式注入上述分散液、更优选在0.1~10mg的范围、特别优选在0.3~3mg的范围。因此,分散液的层状无机化合物的浓度为0.3重量%时,相对于检测部的单位面积(cm2),优选注入例如0.001~10mL的范围、更优选在0.03~3.3mL的范围、特别优选在0.1~1mL的范围。
将上述分散液注入到检测部15的方法没有特别限定,如可以使用自动驱动式分注机等来进行。
干燥注入的上述分散液的手段没有特别限定,如可采用自然干燥、风干、减压干燥、冷冻减压干燥等方法。另外,也可组合使用这些手段。其处理温度优选在10~60℃的范围、更优选在25~50℃的范围、特别优选在30~40℃的范围。相对湿度RH优选在5~40%的范围、更优选在10~20%的范围、特别优选在10~15%的范围。处理时间可以根据例如干燥手段进行适当决定,优选在1~60分钟的范围、更优选在5~30分钟的范围、特别优选在5~10分钟的范围。
接着,如图1(D)所示,在上述无机凝胶层16上形成酶试剂层17。此酶试剂层17可如下形成:制备含有上述氧化还原酶的酶液,将其注入到上述无机凝胶层16上并干燥,进而形成。作为上述氧化还原酶,可以使用例如前述的酶。
上述酶液例如可以将酶充分溶解于溶剂中而制备。作为上述溶剂,没有特别限定,可以使用例如水、缓冲液、乙醇、甲醇、丁醇、二甲基亚砜(DMSO)和四氢呋喃等有机溶剂等。作为上述缓冲液,可以列举出例如磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、Good’s缓冲液等,其pH可根据酶的种类进行适当决定,例如优选pH5~10的范围、更优选在6~9的范围、特别优选在7~8的范围。另外,作为水,可列举出精制水、蒸馏水、超纯水等,其中优选超纯水,这是因为超纯水中的杂质极少,能够制作高精度的生物传感器。
上述酶液中的试剂的浓度没有特别限定,优选例如1~10KU/mL的范围、更优选在3~6KU/mL的范围。
优选上述酶液中进一步含有表面活性剂,特别优选含有两性表面活性剂。作为上述两性表面活性剂,可使用例如与上述相同的物质。
此酶液除了含有氧化还原酶之外,还可以含有例如不会成为氧化还原酶基质的糖类、氨基酸及其衍生物、咪唑等胺化合物、甜菜碱等。作为上述糖类,可以举出例如蔗糖、蜜三糖、乳糖醇、核糖醇、阿拉伯醇等。其中,上述糖类能够以例如提高酶的稳定性为目的进行添加、上述氨基酸及其衍生物和甜菜碱能够以例如防止干燥导致的试剂硬化为目的进行添加、咪唑能够以例如稳定介质等为目的进行添加。
上述酶液的注入量可根据形成的酶试剂层17的大小、试剂的浓度、试样的量、测定对象物的种类等进行适当决定。
注入的上述酶液的干燥手段没有特别限定,可采用例如自然干燥、风干、减压干燥、冷冻减压干燥等方法,也可以将这些手段组合使用。作为干燥条件,例如温度在10~60℃的范围、相对湿度RH在5~40%的范围、时间在1~60分钟的范围。使用酶作为试剂时,可以根据酶的种类按照不失活的方式设定适宜温度。
接着,如图1(E)所示,在绝缘层14上配置隔板18。如图所示,隔板18与上述酶试剂层17相对应的位置成为开口部。
作为上述隔板18的材料,可以使用例如树脂制膜或胶带等。另外,如果是双面胶带,则不仅仅与上述绝缘膜14粘接,也可以容易地粘接后述的盖19。另外,也可以使用例如抗蚀剂印刷等手段形成隔板。
然后,如图1(F)所示,在上述隔板18上配置盖19。作为上述盖19的材料,没有特别限定,如可使用各种塑料等,可优选列举出PET等透明树脂。
这样制作的生物传感器1,在长期保存的情况下为了防止湿气的影响,优选与例如分子筛、硅胶、氧化钙等干燥剂共同密封保存。
此生物传感器1可以与例如下述测定机器组合使用,该测定机器具备在一定时间施加规定电压的构件、测定从上述生物传感器传送的电信号的构件、将上述电信号换算为测定对象物浓度的换算构件等各种构件。
对该生物传感器1的使用方法举例说明,此例中的试样为全血、测定对象物为葡萄糖、氧化还原酶为GDH、介质为铁氰化钾。
首先,使全血试样与生物传感器1的开口部21的一端相接触。此开口部21如上所述为毛细管结构,由于在与另一端相对应的盖19上设有空气孔20,因此能够通过毛细管现象将上述试样吸入至内部。被吸入的上述试样浸透在设置于检测部15上的酶试剂层17中,溶解酶试剂层17中的GDH,接着到达作为酶试剂层17的下层的无机凝胶层16的表面。然后,到达表面的试样中的葡萄糖与GDH、无机凝胶层16中的铁氰化钾发生反应。具体地说,作为测定对象物的葡萄糖被GDH氧化,通过因该氧化反应而移动了的电子,铁氰化钾被还原,生成亚铁氰化钾(亚铁氰离子)。
此时,虽然试样通过酶试剂层17到达无机凝胶层16,但没有通过无机凝胶层16到达电极表面。因此,能够防止被还原的亚铁氰化钾被试样中的溶存氧再氧化,由此抑制测定精度的降低。另外,通过电子显微镜确认了水分未达到电极表面。由于含在上述试样中的红血球等杂质也不能通过层状无机化合物之间,因此不通过此无机凝胶层16,也防止了向电极12、13表面的吸附。
之后,在无机凝胶层16中被还原的亚铁氰钾与位于无机凝胶层16下部的电极之间进行电子授受,由此,能够测定葡萄糖浓度。具体可如下进行。
从供给全血试样开始经过一定时间后,通过上述施加电压的构件在对极13和作用极12之间施加电压,将与电极接触的上述还原型亚铁氰化钾(亚铁氰离子)电化学氧化为铁氰化钾,介由作用极12的导线部12a、通过上述测定电信号的构件等检测此时的氧化电流。由于此氧化电流的值与试样中葡萄糖浓度成比例,因此如果使用上述换算构件将其换算为葡萄糖浓度,则能够求出试样中的葡萄糖浓度。
通过这种生物传感器,能够防止如上所述溶存氧等的影响导致的还原型介质的再氧化,且能够提高测定精度和重现性。
本实施方案中,示例了将本发明的生物传感器用于葡萄糖测定的例子,但并不限定于此,例如可根据测定对象物适当决定试剂,制成各种测定对象的生物传感器。具体地说,例如乳酸测定用生物传感器时可使用乳酸氧化酶、醇测定用生物传感器时可使用醇氧化酶、胆固醇测定用生物传感器时可使用胆固醇氧化酶等。另外,葡萄糖测定用生物传感器时还可以将例如吡喃糖氧化酶、葡萄糖氧化酶等作为试剂使用。
代替层叠上述无机凝胶层和酶试剂层,也可在分散有上述层状无机化合物等的分散液中再添加氧化还原酶,在检测部15上形成兼作酶试剂层和无机凝胶层的单层。此时,上述分散液的氧化还原酶量等没有特别限定,如可参考上述添加量。
实施例1
如下所示,制作与上述图1(F)相同结构的葡萄糖传感器。
首先,准备PET制基板(长为50mm、宽为6mm、厚为250μm)作为葡萄糖传感器的绝缘基板11,通过网板印刷,在其中一个表面上形成由分别具有导线部的作用极12和对极13构成的碳电极系。
接着,如下所示在上述电极上形成绝缘层14。首先,将绝缘性树脂聚酯按照浓度达到75重量%的方式溶解于溶剂乙酸卡必酯中,制备绝缘性浆料,将其网板印刷在上述电极上。印刷条件为300网筛、橡胶辊压40kg,印刷的量是每1cm2电极面积为0.002mL。对检测部15和导线部12a、13a不进行网板印刷。然后,通过在90℃下加热处理60分钟而形成绝缘层14。
接着,在未形成上述绝缘层14的上述检测部15上,如下所示形成无机凝胶层16。首先在100mL精制水中混悬0.6g商品名为“LUCENTITESWN”(CO-OP CHEMICAL公司生产)的合成蒙脱石,搅拌约8~24小时。此合成蒙脱石混悬液的pH约为10。在10mL此合成蒙脱石混悬液中按顺序添加0.1mL 10%(w/v)的CHAPS(同仁化学研究所生产)水溶液、5.0mL 1.0M的ACES缓冲液(pH为7.4,同仁化学研究所生产)和4.0mL的精制水,接着混合1.0g作为介质的[Ru(NH3)6]Cl3(Aldrich公司生产)。将此混合液作为无机凝胶层形成液(pH为7.5)。此无机凝胶形成液中的组成物的最终浓度如下所示。
LUCENTITE SWN 0.3%(w/v)
CHAPS 0.3%(w/v)
ACES缓冲液(pH为7.5) 100mM
[Ru(NH3)6]Cl3 5.0%(w/v)
将1.0μL此无机凝胶形成液分注于检测部15。检测部15的表面积约为0.1cm2,上述检测部15的电极12、13的表面积约为0.12cm2。然后,在30℃、相对湿度为10%的条件下使其干燥10分钟,形成无机凝胶层16。
在上述无机凝胶层16上形成酶试剂层17。其如下形成:将1.0μL5000U/mL的GDH水溶液分注于检测部15的上述无机凝胶层16上,在30℃、相对湿度为10%的条件下干燥10分钟进而形成。
最后,在绝缘层14上配置具有开口部的隔板18,然后在上述隔板18上配置具有贯通孔20的盖19,此贯通孔成为空气孔,制作生物传感器1。由于夹在上述盖19和绝缘层14的隔板18的开口部的空间为毛细管结构,因此将其作为试样供给部21。
作为比较例1,除了在制备无机凝胶层形成液时使用精制水代替上述合成蒙脱石混悬液之外,与实施例1同样操作,制作葡萄糖传感器。
实施例2
此例为使用上述实施例1制作的葡萄糖传感器,测定与葡萄糖浓度相对应的应答电流的随时间变化。
液体试样使用人的全血。首先,将采血后的全血在37℃下放置约1天,将葡萄糖浓度调整至0mg/100mL。然后,向其中添加葡萄糖,制备各种葡萄糖浓度(约200、400、600mg/100mL)的试样。将未添加葡萄糖的全血调整为葡萄糖浓度0mg/100mL。然后,作为实施例2,对上述葡萄糖传感器1施加200mV的电压,然后将试样滴加在试样供给部21上,测定滴加5秒后的应答电流的时间过程。作为比较例2,对比较例1的葡萄糖传感器进行同样地测定。实施例和比较例都各进行3次测定(n=3)。这些结果示于图3(A)(B)。图3为显示使用葡萄糖传感器测定试样时的电流值随时间变化的图,图3(A)为实施例2的结果,图3(B)为比较例2的结果。
如同图(A)所示,通过实施例1的葡萄糖传感器,与同图(B)所示的比较例1的葡萄糖传感器相比,应答电流值的峰在更早的时间出现,并且也得到了更高的峰电流值。能够得到高的峰电流值的原因认为是通过实施例1的葡萄糖传感器,由于在无机凝胶层中的氧被阻断,因此通过葡萄糖与GDH的反应而被还原的介质不会被氧再氧化,而被电化学氧化,从而能够测定其氧化电流。另外,电流值的峰在早时间出现的原因认为是在电极上的无机凝胶层中,蒙脱石的片材内混入作为介质的[Ru(NH3)6]Cl3而被牢固地固定,因此在电极表面介质介由蒙脱石而变为被轻微固定的状态,从而在电极左右的介质浓度增大,反应速度增大。
实施例3
此例为使用本发明的葡萄糖传感器,确认从滴加试样开始经过一定时间后的应答电流值的重现性。
在人全血中添加葡萄糖,分别制备葡萄糖浓度为0、103、415、616、824mg/100mL的试样。
作为实施例3,除了将上述无机凝胶层形成液中的蒙脱石浓度(LUCENTITE SWN)变为0.24%(w/v)以外,与上述实施例1同样操作,制作了葡萄糖传感器。在上述葡萄糖传感器的电极间施加200mV的电压后,滴加试样,测定滴加5秒后的应答电流值。上述测定使用同一个葡萄糖传感器,对各试样分别进行10次(n=10)。作为比较例3,使用上述比较例1的葡萄糖传感器,与上述实施例3同样进行测定(n=10)。
从所测定的实施例3和比较例3的应答电流值(n=10)求出表示测定重现性的CV值。这些结果示于下述表2。
表2
试样中的葡萄糖浓度 | ||||
103mg/100mL | 415mg/100mL | 616mg/100mL | 824mg/100mL | |
实施例3比较例3 | 3.02%3.84% | 2.34%3.31% | 2.90%3.35% | 2.33%7.30% |
由上述表2的结果可知,比较例3特别将试样中的葡萄糖浓度增加到824mg/100mL,由此CV值大幅度地变为7.30,与此相对,通过实施例3,CV值稳定在2.34~3.02之间,无论上述葡萄糖浓度增加与否,都能重现性良好地进行测定。其结果可说明,实施例的葡萄糖传感器能够以比不含蒙脱石的比较例的生物传感器更高的重现性进行测定。
实施例4
此例为确认在一定湿度和温度下暴露对上述实施例3制作的葡萄糖传感器的影响。
将上述葡萄糖传感器放置并暴露于维持在相对湿度为80%、温度为40℃的室内17小时后,在电极间施加200mV的电压。然后滴加人全血试样,此全血试样中按照葡萄糖浓度为0、600mg/100mL的方式添加有葡萄糖,测定滴加5秒钟后的应答电流值。将其作为实施例4。作为比较例4,对上述比较例1的葡萄糖传感器进行同样测定。作为实施例4和比较例4的对照,分别使用上述葡萄糖传感器,在上述通常的室温湿度(约25℃、约60%Rh)条件下,对上述试样测定应答电流值。然后,将对照的电流值作为100%时,求出上述实施例4和比较例4的灵敏度(%)。结果示于以下表3。
表3
灵敏度(%) | |
实施例4比较例4 | 74.2%27.6% |
由上述表3可知,实施例3的葡萄糖传感器即便在高湿度条件下暴露,与比较例1的葡萄糖传感器相比,暴露后的灵敏度降低更小。即,可以说实施例3的葡萄糖传感器,如上所述,通过无机凝胶层阻断了例如空气中的水分和试样中的溶存氧,能够防止介质与氧的接触,因此对湿度具有耐受性。
实施例5
此例为确认试样中的溶存氧对本发明的葡萄糖传感器的影响。
在人全血中添加葡萄糖,按照葡萄糖浓度变为111mg/100mL的方式制备试样,然后分别将溶存氧调整为25.1mmHg左右(未调整)、92.0mmHg左右和171.6mmHg左右。通过在试管内将溶存氧未调整(25.1mmHg)的上述试样与氧混合,将溶存氧浓度调整到高浓度(92.0mmHg、171.6mmHg)。
作为实施例5,除了将上述无机凝胶层形成液的蒙脱石浓度(LUCENTITE SWN)调整至0.12%、0.24%、0.36%、0.48%(w/v)之外,与上述实施例1同样制备4种葡萄糖传感器。然后,在上述葡萄糖传感器的电极间施加200mV的电压后,滴加上述试样,测定滴加5秒后的应答电流值。对于这些各葡萄糖传感器,以相对于溶存氧未调整(25.1mmHg)试样的上述应答电流值为基准,根据下述式(10)求出各试样(溶存氧为92.0mmHg、171.6mmHg)的应答电流值的变化率(%)。作为比较例5,对上述比较例1的葡萄糖传感器液进行同样地测定,求出变化率(%)。它们的结果示于图4。图4为显示试样中溶存氧浓度与变化率(%)关系的图,图中△、○、□、分别为实施例5,●为比较例5。变化率(%)的绝对值越大,应答电流越变化。
变化率(%)=[(A/B)-1]×100 (10)
A:溶存氧调整试样的应答电流
B:溶存氧未调整试样的应答电流
如图4所示,根据实施例5,即便增加试样的溶存氧,与比较例5相比,变化率(%)的绝对值也小。由此可知,根据含有蒙脱石的实施例的葡萄糖传感器,溶存氧导致的灵敏度降低小、且能够减轻试样等溶液中的溶存氧的影响。
实施例6
此例为确认试样中的溶存氧对将GOD用作氧化还原酶的本发明的葡萄糖传感器的影响。
使用按照达到以下最终浓度的方式制备的分散液作为无机凝胶层形成液,作为酶溶液,使用1200U/mL的GOD溶液(天野公司生产)代替GDH水溶液,使用铁氰化钾(和光纯药工业公司生产)代替[Ru(NH3)6]Cl3、使用Tris-HCl缓冲液(pH为7.4,同仁化学研究所生产)代替ACES缓冲液,除此之外,与上述实施例1同样操作制作葡萄糖传感器。
LUCENTITE SWN 0.3%(w/v)
CHAPS 0.1%(w/v)
Tris-HCl缓冲液 100mM
铁氰化钾 3.0%(w/v)
作为比较例6,将1μL含有1200U/mL的GOD和3.0%(w/v)的铁氰化钾的溶液注入到检测部并干燥,以此来代替形成无机凝胶层和酶试剂层,除此之外与上述实施例6同样操作制作生物传感器。
在人全血中添加葡萄糖,按照葡萄糖浓度变为600mg/100mL的方式制备试样,然后分别将溶存氧调整为48.9mmHg(未调整)、106.4mmHg和180.4mmHg。与上述实施例5相同,通过在试管内将溶存氧未调整的上述试样与氧混合,将溶存氧浓度调整到高浓度。
在人全血中添加葡萄糖,制备葡萄糖浓度变为600mg/100mL的试样。然后,在上述葡萄糖传感器的电极间施加500mV的电压后,测定滴加试样5秒后的应答电流值。对比较例6的葡萄糖传感器也进行同样测定。对实施例6和比较例6与上述实施例5相同,以相对于溶存氧未调整(48.9mmHg)试样的上述应答电流值为基准,根据上述式(10)求出相对于各试样(溶存氧为106.4mmHg、180.4mmHg)的应答电流值的变化率(%)。它们的结果示于图5。图5为显示试样中溶存氧浓度与变化率(%)关系的图,同图中○为实施例6、●为比较例6的结果。
如图5所示,可知使用GOD作为氧化还原酶的实施例6与比较例6相比,试样中的溶存氧导致的灵敏度下降小,且能够减轻溶存氧的影响。
实施例7
实施例7使用了实施例1制作的葡萄糖传感器,该葡萄糖传感器中分别使用CHAPS作为表面活性剂(两性表面活性剂)、使用ACES缓冲液作为胺系缓冲剂。另一方面,作为比较例7,除了使用胆酸(阴离子系表面活性剂)代替CHAPS作为表面活性剂、使用磷酸钠代替ACES作为缓冲剂之外,其余与上述实施例1同样操作,制作葡萄糖传感器并使用。
在人全血中添加葡萄糖,制备葡萄糖浓度为100mg/100mL的试样,然后分别将溶存氧调整为34.7mmHg(未调整)、117.1mmHg和185.3mmHg左右。与上述实施例5相同,通过在试管内将溶存氧未调整的上述试样与氧混合,将溶存氧浓度调整到高浓度。
在葡萄糖传感器的电极间施加200mV的电压后,滴加上述试样,测定滴加5秒后的应答电流值。对这些各葡萄糖传感器,以相对于溶存氧未调整试样的上述应答电流值为基准,根据上述式(10)求出相对于其他试样的应答电流值的变化率(%)。比较例7也使用上述葡萄糖传感器进行同样的测定,求出变化率(%)。它们的结果示于图6。图6为显示试样中溶存氧浓度与变化率(%)关系的图,同图中○为实施例7、
●为比较例7的结果。
如图6所示,不使用两性表面活性剂而使用阴离子性表面活性剂、不使用胺系缓冲剂而使用磷酸钠作为缓冲剂的比较例7的葡萄糖传感器,不论是否含有蒙脱石,与实施例7相比,受到溶存氧的很大影响。由此可知,像实施例那样,通过在两性表面活性剂和胺系缓冲剂的存在下形成含有蒙脱石的无机凝胶层,能够防止试样中的氧的影响。另外,像比较例那样使用阴离子性表面活性剂时,难以在电极上承载分散液,制作本身是困难的。
实施例8
根据以下所示的方法,除了制备了无机凝胶形成液以外,与上述实施例1同样制作了生物传感器。
将0.6g合成蒙脱石(商品名LUCENTITE SWN:CO-OP CHEMICAL公司生产)、1g 10%(w/v)的CHAPS(同仁化学研究所生产)水溶液和98.4g精制水混合(合计为100g),将此蒙脱石混悬液搅拌一晚。在40g搅拌后的混悬液中加入2N的HCl(4g)并搅拌一晚(约24小时)(搅拌机:商品名Magnetic StirrerHS-3E:株式会社井内盛荣堂生产)。通过添加HCl,上述混悬液变浑浊,但搅拌一晚后变得透明。在此混悬液中按照200mM琥珀酸-醋酸钠缓冲液(pH为4.5)达到1∶1的方式进行混合。混合该缓冲液后的混悬液的pH约为4.5。在添加有上述缓冲剂的混悬液中,进一步添加作为介质的[Ru(NH3)6]Cl3(Aldrich公司生产),使其为5%(w/v),将此作为无机凝胶层形成液。此无机凝胶形成液中组成物的最终浓度如下所示。
LUCENTITE SWN 0.3%(w/v)
CHAPS 0.3%(w/v)
琥珀酸-醋酸钠缓冲液(pH为4.5) 100mM
[Ru(NH3)6]Cl3 5.0%(w/v)
如上所述,通过本发明的生物传感器的制造方法,由于例如能够防止用于间接测定试样中测定对象物的还原型介质被测定氛围中的氧和试样中的溶存氧等再氧化,因此能够提供消除了上述还原型介质的再氧化导致的测定误差、且测定精度优异的生物传感器。
Claims (31)
1.一种生物传感器的制造方法,其包含下述工序:准备具有电极的基板,并在所述电极表面上形成至少含有介质、表面活性剂、缓冲剂以及层状无机化合物的无机凝胶层。
2.如权利要求1所述的制造方法,其中,所述表面活性剂为两性表面活性剂。
3.如权利要求2所述的制造方法,其中,所述两性表面活性剂为在同一分子内带有正电荷和负电荷的表面活性剂。
4.如权利要求3所述的制造方法,其中,所述两性表面活性剂为选自烷基氨基羧酸盐、羧基甜菜碱、磺基甜菜碱和磷酸甜菜碱中的至少一种表面活性剂。
5.如权利要求2所述的制造方法,其中,所述两性表面活性剂为在同一分子内带有正电荷和负电荷、且所述正电荷和负电荷分开的表面活性剂。
6.如权利要求5所述的制造方法,其中,所述两性表面活性剂为选自羧基甜菜碱、磺基甜菜碱和磷酸甜菜碱中的至少一种表面活性剂。
7.如权利要求2所述的制造方法,其中,所述两性表面活性剂为烷基二甲基氨基醋酸甜菜碱。
8.如权利要求2所述的制造方法,其中,所述两性表面活性剂为选自CHAPS、CHAPSO和烷基羟基磺基甜菜碱中的至少一种磺基甜菜碱。
9.如权利要求1或2所述的制造方法,其中,所述缓冲剂为胺系缓冲剂。
10.如权利要求9所述的制造方法,其中,所述胺系缓冲剂为选自Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES、Tricine和ADA中的至少一种物质。
11.如权利要求1或2所述的制造方法,其中,所述缓冲剂为具有羧基的缓冲剂。
12.如权利要求11所述的制造方法,其中,所述具有羧基的缓冲剂为选自醋酸-醋酸钠缓冲剂、苹果酸-醋酸钠缓冲剂、丙二酸-醋酸钠缓冲剂和琥珀酸-醋酸钠缓冲剂中的至少一种缓冲剂。
13.如权利要求1或2所述的制造方法,其中,通过涂布至少含有介质、表面活性剂、缓冲剂以及层状无机化合物的分散液来形成所述无机凝胶层。
14.如权利要求13所述的制造方法,其中,在使表面活性剂和层状无机化合物分散到分散介质中后,添加缓冲剂,并进一步添加介质,由此制备所述分散液。
15.如权利要求14所述的制造方法,其中,在使层状无机化合物分散在分散介质中后,添加表面活性剂,然后添加胺系缓冲剂,接着进一步添加介质,由此制备所述分散液。
16.如权利要求15所述的制造方法,其中,所述介质为选自铁氰化钾、细胞色素c、PQQ、NAD+、NADP+、铜络合物和钌络合物中的至少一种物质。
17.如权利要求15所述的制造方法,其中,添加了所述胺系缓冲剂后的分散液的pH在5~9的范围。
18.如权利要求14所述的制造方法,其中在使层状无机化合物分散在分散介质中并在强酸性条件下搅拌后,添加表面活性剂,接着添加具有羧基的缓冲剂,进一步添加介质,由此制备所述分散液。
19.如权利要求18所述的制造方法,其中,所述介质为选自钌络合物、锇络合物、二茂铁、吩嗪硫酸甲酯、靛酚和亚甲蓝中的至少一种物质。
20.如权利要求18所述的制造方法,其中,所述强酸性条件为pH在1~3的范围。
21.如权利要求18所述的制造方法,其中,添加了具有羧基的缓冲剂后的分散液的pH在3~6的范围。
22.如权利要求1所述的制造方法,其中,所述无机凝胶层为防止所述介质自然氧化的层。
23.如权利要求1所述的制造方法,其中,在所述无机凝胶层上进一步形成含有氧化还原酶的层。
24.如权利要求13所述的制造方法,其中,在所述分散液中进一步含有氧化还原酶,从而形成含有所述氧化还原酶的无机凝胶层。
25.如权利要求1所述的制造方法,其中,所述层状无机化合物为层状粘土矿物。
26.如权利要求25所述的制造方法,其中,所述层状粘土矿物为膨润性层状粘土矿物。
27.如权利要求13所述的制造方法,其中,所述分散液中的层状无机化合物和表面活性剂的添加比例为,相对于0.3g的层状无机化合物,表面活性剂在1~200mmol的范围。
28.如权利要求13所述的制造方法,其中,所述分散液中的层状无机化合物和缓冲剂的添加比例为,相对于0.3g的层状无机化合物,缓冲剂在1~1000mM的范围。
29.如权利要求23或24所述的制造方法,其中,所述氧化还原酶为选自葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶、果糖脱氢酶、半乳糖氧化酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶、醇氧化酶、醇脱氢酶、胆红素氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、氨基酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、甘油脱氢酶、酰基辅酶A氧化酶、胆碱氧化酶、4-羟基安息香酸羟基化酶、马来酸脱氢酶、肌氨酸氧化酶和尿酸酶中的至少一种酶。
30.如权利要求1所述的制造方法,其中,所述介质为选自铁氰化钾、对苯醌及其衍生物、靛酚衍生物、β-萘醌-4-磺酸钾、二茂铁衍生物、锇络合物、钌络合物、NAD+、NADP+、吡咯喹啉醌、亚甲蓝、细胞色素c、细胞色素b和铜络合物中的至少一种物质。
31.一种通过权利要求1所述的生物传感器的制造方法制造得到的生物传感器。
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