KR20020065644A - 기판 표면 결합용의 다수의 부착 잔기를 갖는 생분자 - Google Patents

기판 표면 결합용의 다수의 부착 잔기를 갖는 생분자 Download PDF

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KR20020065644A
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마르쿠스 슈바이쩌
노르베르트 빈드하브
존 알. 하벤스
토마스 제이. 오노프레이
찰스 에이치. 그리프
다구앙 왕
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나노겐 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 기판 표면 부착용의 다수의 결합 부위를 갖는 생분자에 관한 것이다. 다수의 부착 부위는 생분자상에 직접 생성되거나 또는 다수개가 부가되어 수지상 구조물을 형성함으로써 기판 결합용 잔기에 대한 부착 부위를 제공할 수 있는 분지된 포스포르아미다이트 잔기를 사용하여 생성할 수 있다. 기판 결합 잔기는 비공유결합 잔기를 포함할 수 있다. 공유결합 잔기의 경우, 히드라지드를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 이러한 히드라지드는 포스포르아미다이트와 같은 보호된 빌딩 블록 또는 이러한 히드라지드의 전구체 형태를 포함하는 빌딩 블록을 통해 도입될 수 있다.

Description

기판 표면 결합용의 다수의 부착 잔기를 갖는 생분자 {BIOMOLECULES HAVING MULTIPLE ATTACHMENT MOIETIES FOR BINDING TO A SUBSTRATE SURFACE}
하기 기재는 본 발명과 관련된 정보의 요약에 관한 것이다. 본원에서 제공된 어떠한 정보도 본원에 청구된 발명에 대한 선행 기술로서 인정되지 않으며, 구체적 또는 암시적으로 언급된 어떤 간행물도 본 발명에 대한 선행 기술로서 인정되지 않는다.
올리고뉴클레오티드를 기판상에 고정하는 것은 DNA 칩 기술, 표면 플라스몬 공명 실험 또는 기타 바이오센서 분야 등의 많은 분야에 있어서 중요하고 필수적인 단계이다. 통상적으로는, 하나의 반응성 기, 예를 들어 아민, 티올 또는 알데히드 (공유결합 부착), 또는 기를 형성하는 안정한 결합체, 예를 들어 비오틴, 페닐보론산 등 (비공유결합 부착)으로 올리고뉴클레오티드의 3'- 또는 5'-말단을 수식함으로써 올리고뉴클레오티드를 기판상에 고정시킨다. 이어서, 수식된 올리고뉴클레오티드를 고정시킬 위치로 주소지정하고, 적절한 관능기, 예를 들어 알데히드, 말레이미드, 히드라지드 등과 반응시키거나 또는 스트렙타비딘 등과 같은 결합 분자와 결합시킨다. 기판상의 특정 위치에 주소지정하는 것은 스폿팅 (핀 또는 드롭 침착), 전자적 주소지정 또는 다양한 다른 방법에 의해 수행할 수 있다. 어떤 경우, 고정화 반응은 느리며, 기판상에서 올리고뉴클레오티드를 장시간 (밤새) 인큐베이션할 것을 요한다. 이러한 고정화 반응은 또한 가역적이어서, 시간에 따라 생분자를 방출시킬 수도 있다.
다른 예에서, 생분자상의 덴드리머 (dendrimeric) 구조물이 기재되어 있지만 (예를 들어, WO 99/10362, WO 96/19240 및 WO 99/43287), 덴드리머 구조물의 용도는 예를 들어 검출용 신호 부위를 제공하는 것으로 지시되어 왔으며, 생분자 자체는 통상의 방법을 이용하여 간단하게 기판에 부착시킨다.
이와는 달리, 본 발명은 다수의 반응성 부위, 즉 친핵체, 친전자체, 및 루이스 산 또는 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 생분자를 고정하는 개선된 방법에 관한 것이다. 이러한 방법의 이점은 고정 속도가 더 빠르고, 부착 안정성이 더 높으며, 기판 표면상에 더 많은 양의 올리고뉴클레오티드를 고정시킬 수 있다는 것이다. 이러한 이점은 고정화에 사용되는 방법과는 독립적이다. 다수의 부착 부위를 갖는 올리고뉴클레오티드는 공유결합 및 비공유결합 부착 화학 둘 다에 의해 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 히드라지드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 제조에 관한 것이다. 히드라지드는 어떤 유형의 결합 반응에도 사용될 수 있는 친핵체 반응성 기이다. 이들은, 예를 들어, 히드라존을 형성하는 친전자성 알데히드 (추가로 환원반응에 의해 안정화될 수 있음) 및 안정한 공유결합을 형성하는 활성 에스테르와 반응할 수 있다 (도 18 참조). 이러한 화학적 방법은 플루오로포어 (fluorophore), 단백질 또는 펩티드, 리포터 기 및 기타 올리고머를 올리고뉴클레오티드에 부착시키는데 사용될 수 있다. 히드라지드의 반응은 또한 생분자를 기판상에 고정시키는데 사용될 수도 있다. 이러한 히드라지드 수식된 올리고뉴클레오티드는 선행 문헌에는 개시되어 있지 않다.
본원에 개시된 본 발명의 이점은 매우 많다. 예를 들어, 본 발명은 짧은 반응 시간을 이용하고, 결합된 대상 당 다수의 결합 부위를 허용하고, 비교적 넓은 pH 범위에 대해 안정성을 제공하며, 무수 또는 수성 조건 둘 다에서 부착능을 제공함으로써, 어떠한 적절한 용도를 위해 분자를 임의 고상 표면에 부착하는 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 고상 합성, 및(또는) DNA, RNA, PNA, p-RNA (피라노실-RNA) 및 펩티드를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 생분자 등의 소분자 라이브러리의 합성에 있어 유용하다. 본 발명은 또한 혼성화 기초 분석, 진단 및 유전자 서열 확인 등이 있지만 이에 한정되지는 않는, 고정화된 시약을 필요로 하는 분석 기술에 유용하다.
<발명의 개요>
본 발명의 제1 실시양태에서, 기판 표면에 결합하는 관능성 또는 반응성 잔기를 연결시키기 위한 다수의 분지 또는 덴드리머 잔기를 갖는 생분자가 제공된다.
하나의 올리고뉴클레오티드내에서 다수의 반응성 부위 또는 결합제를 갖는올리고뉴클레오티드의 사용은 이러한 고정화 방법에 대해 상당한 이점을 제공한다. 첫째, 이러한 올리고뉴클레오티드의 사용은 고정화 반응의 속도를 증가시킨다. 이러한 효과에 대한 한가지 이유는, 확산에 의한 부착 대상물 사이의 초기 접촉 기회가 하나의 올리고뉴클레오티드가 다수의 반응성 부위를 보유하는 경우에 더 많다는 것이다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 1차 연결 이후에 (또는 그와 동시에) 형성되는 2차 및 다수의 공유결합 또는 비공유결합 연결을 통해 고정될 수 있다. 그런데, 이러한 이차 연결의 형성은 분자간 1차 연결 형성에 대해 동적으로 조장되는 분자내 반응이다. 이것은 더 빠른 고정 속도에 대한 다른 이유가 된다.
둘째, 부착의 전체적인 안정성은 올리고뉴클레오티드와 기판 사이에서 다수의 연결이 형성됨에 따라 증가하며, 이는 생분자를 기판과 접촉시키는데 사용되는 방법과는 독립적이다.
다수의 비공유결합 결합체의 형성은 올리고뉴클레오티드와 기판 사이에서 결합체의 더 높은 전체적인 안정성을 나타내며, 안정한 고정화로 인해 낮은 친화성의 결합체 빌더 (builder)의 사용을 허용한다. 올리고뉴클레오티드에 대해 흔히 사용되는 몇몇 고정 화학법은 가역적이며 (예를 들어, 아민과 알데히드 사이에 쉬프 (Schiff) 염기 형성), 이후에 예를 들어 NaCNBH3를 사용한 환원에 의한 안정화 단계를 필요로 한다. 이러한 가역적인 반응의 경우, 다수의 연결을 통한 고정화가 유리한데, 이 고정화가 안정화 반응에 앞서 형성되는 중간체에 더 높은 안정성을 부여하기 때문이다. 어떤 경우, 안정성은 안정화 반응이 필요없을 정도로 충분히 크다.
셋째, 다수의 부착 부위를 갖는 올리고뉴클레오티드의 사용으로 올리고뉴클레오티드가 더 많이 로딩된 기판을 제작할 수 있다. 일반적으로, 기판상의 반응성 부위는 대체로 올리고뉴클레오티드보다 과량이며, 다수의 부착 잔기로 인한 부착성 향상은 기판상에서 더 많은 부위를 이용할 수 있게 한다.
다른 실시양태에서, 생분자상에 제공된 다수의 반응성 결합 잔기는 생분자를 기판 표면에 공유결합 또는 비공유결합 방식으로 결합시킬 수 있다. 비공유결합에 대해, 다수의 결합 잔기는 화학 잔기, 예를 들어 비오틴, 스트렙타비딘, 페닐 보론산 (PBA) 및 살리실릭 히드록삼산 (SHA)을 포함할 수 있다. 공유결합에 대해, 다수의 결합 잔기는 반응성 히드라지드 구조물의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 구조물은 분지 또는 비분지됨으로써 이용할 수 있는 가능한 결합 잔기의 수준에서의 큰 다양성을 허용할 수 있다. 따라서, 생분자에 수지상 분지 구조물을 제공할뿐만 아니라, 각 분지가 생분자를 기판 표면에 결합시키는데 사용되는 반응성 히드라지드 구성원을 갖도록 반응성 결합 잔기 자체를 분지시킬 수도 있다.
다른 실시양태에서, 생분자상의 다수의 결합 잔기는, 전자적으로 주소지정가능한 마이크로칩을 포함하는 기판 표면에 부착된 생분자가 마이크로칩 전극의 전자적 바이어싱 (biasing)으로부터 생성되는 높은 전압 및 전류에 의해 마이크로칩상의 부착 부위에서 우연히 제거되는 것으로부터 보호하는 방법을 제공한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 4 mA/cm2이상의 전류 밀도를 견딜 수 있는기판에 생분자를 결합시키는 다수의 부착 반응을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 부가반응이 단일한 반응 단계로 일어날 수 있도록, 생분자에 부착된 수지상 구조물에 반응성 결합 잔기를 부가하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 또는 다수의 히드라지드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 새로운 화학적 변형을 포함하는 물질의 조성물을 제공함으로써, 수식된 올리고뉴클레오티드의 생성을 위한 빌딩 블록 (예를 들어, 포스포르아미다이트)을 제공한다. 이러한 히드라지드는 반응성 기를 포함하며 올리고뉴클레오티드를, 플루오로포어 또는 다른 소분자, 펩티드, 단백질 또는 항체, 또는 기판 표면에 결합시키는데 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이러한 부착 반응은 표면에 화합물을 고정시켜야 하는 생분자의 표면 합성 및 분석 방법에 이용될 수 있다.
본 발명은 생분자를 기판 표면에 결합시키기 위한 부착 화학에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생분자를 기판 표면에 결합시키기 위한 화학 결합 잔기를 다수개 갖는 생분자를 제공하는 분지된 구조물을 포함하는 부착 화학에 관한 것이다.
도 1은 올리고뉴클레오티드를 평면 기판에 고정시키기 위한 통상의 방법을 나타내는 반응식이다. 일반적으로, 단일한 반응성 기를 사용하여 올리고머를 기판 표면에 결합시킨다.
도 2는 본 발명의 고정 방법을 나타내는 반응식이며, 여기서 생분자는 그를 기판에 공유 또는 비공유결합시키는데 관여할 수 있는 다수의 부착 또는 결합 잔기를 갖는다.
도 3은 기판 표면 결합용의 다수의 반응성 잔기에 부착된 핵산 가닥의 한 예를 보다 상세히 보여준다. 이 예에서, 분지된 포스포르아미다이트의 화학 구조는 다양한 방식으로 부가되어 생분자에 부착된 덴드리머 구조물을 형성시킨다.
도 4는 페닐 보론산 (PBA) 부착 잔기를 포함하는 덴드리머 구조를 갖는 구조물을 생성하는 일련의 화학 단계를 나타낸다.
도 5A 및 B는 생분자를 기판 표면에 비공유결합시키는 4개 (A) 또는 8개 (B)의 결합 잔기를 갖는 올리고뉴클레오티드 생분자를 포함하는 화학 구조물을 생성하는 일련의 화학 단계를 나타낸다.
도 6A 내지 C는 포스포르아미다이트를 사용하여 다수의 반응성 부위를 갖는 생분자를 생성하는 합성 단계를 보여준다. 이들 잔기는 에스테르기를 포함하며, 에스테르기는 히드라진으로 올리고뉴클레오티드를 탈보호하는 동안에 히드라진으로 전환된다.
도 7은 공유결합을 통해 생분자를 기판에 고정시키는데 사용되는 히드라지드 잔기가 직접 부착된 생분자를 포함하는 화학 구조물 A 및 B를 나타낸다.
도 8A 내지 D는 다수의 결합 잔기를 갖는 구조물을 생성하는 화학 합성을 보여준다. (A)에서, 분지된 포스포르아미다이트는 올리고뉴클레오티드에 부가되고, 이관능성 포스포르아미다이트로 추가로 수식된 다음, 디에틸아민/CH2Cl2및 히드라진으로 탈보호되어, 기판 결합용의 히드라지드기를 4개 갖는 결합 잔기를 생성시킨다. (B)에서는, 6개의 히드라지드 결합 잔기를 생성시키는, (A)와 유사한 반응식이 제공된다. (C)에서, 두가지 다른 분지된 포스포르아미다이트의 연속 사용은 생분자 당 16개의 히드라지드 결합 잔기를 형성시킨다. (D)에서, 분지된 포스포르아미다이트를 두 단계로 사용하여 덴드리머 구조물을 형성시킨 다음, 포스포르아미다이트 및 히드라진으로 처리하여 생분자 당 4개의 히드라지드 결합 잔기를 형성시킨다.
도 9A 내지 C는 3가지 반응을 보여주는데, 이중 반응식 A 및 B는 올리고뉴클레오티드 생분자로 혼입되는 신규 포스포르아미다이트를 제조하기 위한 단계를 나타낸다. 도 9C는 히드라지드-표지된 올리고뉴클레오티드를 활성화된-에스테르 단량체와 반응시켜 생분자의 고정을 위한 기판을 제조할 수 있는 반응식을 나타낸다.
도 10A 내지 C는 도 9의 반응식 3에 나타낸 것과 같은 활성화된 에스테르 단량체에 히드라지드-표지된 올리고머를 커플링시키 위한 반응 혼합물의 3가지 다른 HPLC 결과에 대한 그래프이다.
도 11은 다수-표지된 생분자의 부착에 대한 반응 속도를 보여주는 그래프이다. 히드라지드/N-히드록시숙신이미딜 (NHS) 에스테르 결합은 다른 공유결합 시스템의 속도보다 빠르며 두 비공유결합 시스템의 속도 정도로 측정가능하게 일어난다.
도 12는 표지된 히드라지드 올리고의 공유결합 부착이 기판 표면의 활성화된 에스테르의 양에 의존한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 13 및 14는 각각 NHS 또는 N-히드록시-술포숙신이미딜 (술포-NHS) 에스테르 수식된 기판 표면에 대한 공유결합 부착의 능력을 보여주는 그래프이다. 그래프는 인가된 전류의 범위에 걸쳐 전극에 부착된 표지된 올리고머로부터의 특이적및 비특이적 형광 강도를 보여준다.
도 15는 히드라지드 잔기의 다수의 결합이 기판상에서 더 높은 수준의 생분자의 검출을 제공함을 보여주는 그래프이다.
도 16은 전자적인 리버스 도트 블롯의 결과를 보여주는 그래프이며, 여기서 혼성화는 히드라지드-수식된 올리고뉴클레오티드 (ATA5)를 포함하는 부위에서만 완전하였다. 포획 프로브는 적절한 전자적 조건하에서 활성화된-에스테르-함유 기판에 특이적으로 결합하였다. 히드라지드가 없는 비특이적 포획체는 활성화된 에스테르와 반응하지 않았으며, 따라서 혼성화에 이용할 수 없었다.
도 17은 두가지 다른 프로토콜 A 및 B를 수행하는 히드라지드 수식된 올리고뉴클레오티드의 합성을 보여준다. A에서, 보호된 히드라지드 포스포르아미다이트를 사용하여 올리고머를 수식한 다음, 탈보호한다. B에서, 에스테르 포스포르아미다이트를 사용하여 올리고머를 수식한 다음, 히드라진과 반응시킨다.
도 18은 히드라지드 수식된 올리고머와 반응할 수 있는 다양한 관능기를 보여주는 반응식을 나타낸다.
도 19 및 20은 알데히드와 축합하는 히드라지드 올리고머의 예이다.
도 21은 올리고머마다 3, 4 및 8개의 페닐보론산으로 표지된 올리고머에 대한 기록된 평균 형광 강도 (MFI) 값을 보여준다. 부착된 올리고머를 강력 세척 조건으로 처리하여 부착 시스템의 안정성을 모니터링하였다.
도 22는 알데히드 풍부 투과층상에서 덴드리머 히드라지드의 동적 평형 및 안정성을 나타내는 그림이다. 4개의 히드라지드 잔기를 나타내는 올리고머는 알데히드 풍부 투과층상에 전자적으로 로딩되어 다수의 히드라존 결합을 형성시킨다. 이러한 특정 예에서, 각각의 결합은 가수분해에 대해 민감하다. 다수의 부착 부위의 사용으로 얻어진 안정성은 몇몇 히드라존의 가수분해를 허용하지만, 다른 것들은 원상태로 남아있다. 인접하는 히드라존 부착 부위를 통해 연결된 히드라지드는 확산될 수 없으며, 따라서 결합을 재형성할 수 있는 알데히드 풍부 투과층내에 보유된다.
도 23은 히드라존 결합을 통해 커플링된 글리옥실 아가로스 투과층상에서 히드라지드 1, 2, 4 및 8개의 덴드리머 올리고머의 부착을 나타내는 그래프이다.
도 24는 아세탈 수식된 히드로겔상에서 덴드리머 올리고머의 부착을 나타내는 그래프이다. 공유결합 부착능을 위한 알데히드를 생성시키기 위해서는 아세탈 잔기를 산으로 가수분해시켜야 한다.
도 25는 서모딕스 (Surmodics) 3D 링크 (등록상표) 아민 결합 슬라이드상에서 다양한 농도의 히드라지드 올리고머의 사용 및 향상된 결합을 보여준다. 도 25B는 유리 슬라이드에 결합된 올리고머의 실제 형광 사진영상이며, 이들의 결합 수준을 도 25A에 그래프로 나타내었다.
도 26은 도 25에서 사용된 서모딕스 슬라이드에 대한 비특이적 부착 결합 수준을 나타낸다. 도 26B는 유리 슬라이드에 결합된 올리고머의 실제 형광 사진영상이며, 이들의 결합 수준을 도 26A에 그래프로 나타내었다.
도 27A는 히드라지드 올리고머가 고상 지지체에 성공적으로 고정될 수 있는 적절한 pH 범위를 나타내며, 도 27B는 더 낮은 농도에서 검출가능한 표준 아민 수식된 올리고머에 대한 히드라지드 올리고머의 개선된 감응성을 나타낸다.
도 28은 분지 또는 비분지된 히드라지드 수식된 올리고머가 다른 부착 시스템에 쉽게 수식될 수 있는 한 예를 나타낸다. 이러한 특정 예에서, 6개의 히드라지드를 갖는 분지된 올리고머를 p-포르밀페닐보론산으로 수식하여 분지된 PBA 부착 프로브를 제조한다.
<바람직한 실시양태의 상세한 설명>
본 발명의 특정 실시양태를 인용하여, 다수의 기판 표면 결합 잔기를 갖는 생분자를 제공한다.
"생분자"란 시험 샘플에서 분자 대상물과 접촉시키는데 사용되는 생물학적으로 관련된 분자를 의미한다. 일반적으로, 생분자에는 적어도 부분적으로는 생분자를 기판 표면에 결합시키기 위한 화학 잔기에 부착된 단일 핵산, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, CNA (시클로헥실 핵산), p-MeNA (메틸 또는 메톡시 포스페이트 핵산)를 비롯한 핵산, 단백질, 펩티드, 효소 및 항체와 같은 분자가 포함된다. 생분자로는 또한 생분자를 기판 표면에 결합시키기 위한 화학 잔기에 부착된 펩티드 핵산 (PNA) 또는 p-RNA (피라노실 RNA)와 같은 자연적으로 발생하는 분자로부터 구조적으로 유도되는 비천연 또는 합성 분자가 포함된다. 그러한 결합 잔기를 갖는 경우, 생분자는 또한 "유도체화된 생분자"로 언급될 수도 있다. 따라서, 이러한 생분자로는 또한 산화된 리보오스, 아민 종결부를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 본원에 참고로 포함되는 헤르만손의 문헌 (Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques copyright 1996, Academic Press, San Diego, CA)에 약술된 잘 알려진 생결합물 쌍의 어떤 부분, 및(또는) pRNA (pRNA에 관하여는 1999년 8월 13일에 출원되어 동시 계류중인, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제09/374,338호에 기재되어 있음)와 같은 다른 핵산 구조물이 포함된다. 일반적으로, 화학 잔기의 생분자로의 부착은 공유결합을 포함한다. 유도체화된 생분자의 기판 표면으로의 부착에 대하여, 이러한 부착은 공유결합 또는 비공유결합을 사용할 수 있다.
"중합체"란 일반적으로 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 일반적으로 단량체로 언급되는 다수의 작은 분자가 연속적으로 연결되어 어셈블리된 거대분자를 의미한다 (보다 상세한 설명에 대하여는, 문헌 (Odian, G. Principles of Polymerization, Third Edition copyright 1991 John Wiley and Sons Inc., New York, NY)을 참조한다). 바람직한 실시양태에서, 동종 중합체는 단일한 유형의 단량체로 구성될 수 있지만, 이종 중합체는 하나 이상의 유형의 단량체로 구성된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 중합체의 형성은 개시제의 열 분해 (예를 들어, AIBN, 벤조일 퍼옥사이드), 개시제의 광분해 절단 (예를 들어, Daracur 4265의 UV 개시), 산화환원 반응 (예를 들어, 세륨 (IV) 술페이트), 이온화 방사선 (예를 들어, α, β, γ또는 X-선), 플라즈마 개시 (예를 들어, 아르곤, 질소, 산소), 또는 전류를 사용하여 미리선택된 부위에서만 중합이 일어나는 것인, 테트라부틸암모늄 퍼클로레이트를 사용하는 전기분해 개시 (Samal, S. K.; Nayak, B. J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 1988, 21, 1035)에 의해 개시될 수 있다.
"결합 잔기"는 일반적으로 기판 표면에 생분자를 부착시키는데 사용되는 임의 화학 잔기를 의미한다. 결합 잔기는 생분자내에 포함되거나 또는 기판 표면에 포함될 수 있다. 표 1결합 잔기는 사용되는 결합 잔기의 목록을 제공한다.
"루이스 염기"란 일반적으로 한쌍의 전자를 전자 결핍 중심으로 제공할 수 있는 임의 화학 잔기를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 루이스 염기는 보다 구체적으로는 "친핵체"를 의미하며, 반응성 중심은 한쌍의 전자를 탄소에 제공하여 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 반응성 중심과 탄소 사이에서 공유결합을 형성한다 (확대된 정의에 대하여는, 문헌 (Smith, M. B. Organic Synthesis copyright 1994 McGraw Hill Inc., New York, NY, 또는 임의의 화학 문헌)을 참조한다).
"루이스 산"이란 일반적으로 한쌍의 전자를 수용할 수 있는 임의의 전자 결핍 화학 잔기를 의미한다. "친전자체"란 일반적으로 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 루이스 산이 탄소인 특이적인 경우를 의미한다 (확대된 정의에 대하여는, 문헌 (Smith, M. B. Organic Synthesis copyright 1994 McGraw Hill Inc., New York, NY, 또는 임의의 유기 화학 문헌)을 참조한다). 바람직한 실시양태에서, 한 예로서, 살리실릭 히드록삼산은 루이스 염기로 작용하여 한쌍의 전자를 페닐 보론산의 루이스산인 붕소에 전달하여 비공유결합을 형성시킬 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 한 예로서, 히드라지드는 한쌍의 전자를 친전자체인 NHS 에스테르의 반응성 탄소 중심에 제공하는 친핵체로 작용하여 상기 탄소 중심에 공유결합을 형성할 수 있다.
"분지된 연결 잔기"는 일반적으로 특이적 반응성 잔기를 통해 생분자에 커플링될 수 있고, 또한 다른 반응성 중심을 통해 하나 이상의 분자에 추가로 부착될 수 있는 임의의 화학 종을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 분지된 연결 잔기는 예를 들어 표 2, 번호 1 내지 4에 나타낸 포스포르아미다이트이다. 이들 예에서, 인은 반응성 잔기로 작용하지만, 번호 1, 2 및 3의 에스테르 및 번호 4의 보호된 알콜은 다른 반응성 중심이다.
"분지된 연결 구조물"은 일반적으로 분지된 연결 잔기로 생분자를 처리하여 생성된 생분자를 의미한다. 분지된 연결 잔기의 다른 반응성 중심은 분지된 연결 구조물내에 포함되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 한 예로서, 분지된 연결 구조물을 표 2에서 번호 5로 나타내었으며, 여기서 나타낸 생분자는 분지된 연결 잔기, 특히 표 2에서 번호 4로 나타낸 화합물로 생분자를 처리한 결과이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 분지된 연결 구조물은 동종의 것들과 결합될 수 있는데, 이 때 생분자는 분지된 연결 잔기로 수식된 다음, 생성된 분지된 연결 구조물의 다른 반응성 중심을 통해 동일한 분지된 연결 잔기에 의해 추가로 수식되어, 새로운 분지된 연결 구조물을 형성한다. 분지된 연결 잔기의 일련의 결합에 의해 더 큰 분지된 연결 구조물을 구성하는 것은 표 2, 번호 6 내지 8에 나타낸 바와 같이 추가로 지속시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 분지된 연결 잔기는 이종의 것들과 결합할 수 있는데, 여기서 생분자는 분지된 연결 잔기로 수식된 다음, 초기 분지된 연결 잔기의 다른 반응성 중심을 통해 다른 분지된 연결 잔기에 의해 추가로 수식되어, 새로 분지된 연결 구조물을 형성시킨다. 분지된 연결 잔기의 일련의 결합에 의해 더 큰 분지된 연결 구조물을 구성하는 것은 표 2, 번호 9 내지 12에 나타낸 바와 같이 추가로 지속시킬 수 있다.
분지된 연결 잔기 및 분지된 연결 구조물
번호 화학 구조 화합물 명 또는 종류
1 분지된 연결 잔기: 디에틸 5-{[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]메틸}이소프탈레이트; 화합물 1c; 디에스테르 포스포르아미티드
2 분지된 연결 잔기: 디에틸 3-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]글루타레이트; 분지된 디에스테르 포스포르아미다이트
3 분지된 연결 잔기: 디메틸 3,3'-(2-{[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]메틸}-2-{[2-(메톡시카르보닐)에톡시]메틸}프로판-1,3-디일비스옥시)디프로피오네이트; 화합물 1d; 트리-에스테르 포스포르아미다이트
4 분지된 연결 잔기: 1,3-비스-((디 p-메톡시페닐)페닐메톡시)-2-프로필 O-2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노포스포르아미다이트; 대칭으로 분지된 포스포르아미다이트. DMT = 디-(p-메톡시페닐)페닐메틸
5 제1 형성다른 반응성 종이 알콜 (R=H) 또는 보호된 알콜 (R=DMT)인 분지된 연결 구조물
6 제2 형성다른 반응성 종이 알콜 (R=H) 또는 보호된 알콜 (R=DMT)인 동종의 분지된 연결 구조물
7 제3 형성다른 반응성 종이 알콜 (R=H) 또는 보호된 알콜 (R=DMT)인 동종의 분지된 연결 구조물
8 제4 형성다른 반응성 종이 알콜 (R=H) 또는 보호된 알콜 (R=DMT)인 동종의 분지된 연결 구조물
9 제2 형성이종의 분지된 연결 구조물
10 제2 형성이종의 분지된 연결 구조물
11 제2 형성이종의 분지된 연결 구조물
12 제3 형성이종의 분지된 연결 구조물
"기판"은 일반적으로 생분자의 다수의 반응성 결합 잔기가 커플링될 수 있는 잔기를 포함하는 표면을 갖는 임의의 물질을 의미한다. 이러한 기판으로는 유리 슬라이드, 관능화된 유리 슬라이드, 화학적으로 활성화된 마이크로칩 표면, 반응성 분자의 하나 또는 다수의 층으로 덮힌 표면, 또는 생분자의 다수의 반응성 결합 잔기가 반응할 수 있는 잔기를 갖는 중합체로 덮힌 표면이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 기판 표면은 전자적으로 주소지정가능한 마이크로칩의 투과층이다. 바람직한 실시양태에서, 기판의 관능성 잔기, 화학적으로 활성인 잔기 또는 반응성 잔기는 표 1에 나열된 관능성 기들 (이것들로 한정되지는 않음)로부터 선택된다.
"전구체"는 일반적으로 1종 이상의 화학 시약으로 처리하여 다른 반응성 잔기로 변형될 수 있는 임의의 반응성 잔기를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 한 예로서, 1d (표 2의 번호 3)의 3가지 에스테르 잔기는 히드라지드에 대한 전구체들이다. 이들을 히드라진으로 처리하여 히드라지드 잔기로 변형시킨다.
"보호된"은 일반적으로 하나 이상의 시약으로 반응성 잔기의 반응성을 차단시키는 것을 의미하지만, 화학 반응은 초기 반응성 잔기로부터의 차단 또는 복합화 없이 동일한 화합물의 다른 반응성 부위에서 수행될 수 있다. 다른 반응성 부위에서 변형의 완료시, 반응성 잔기의 보호기는 제거되어 반응성 중심이 차단되지 않을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 보호된 잔기는 특정 유형의 전구체이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 한 예로서, 도 9A의 1a의 히드라지드 잔기는 트리틸기로 보호된다. 생분자로의 1a의 부가시에, 트리틸기는 화학적으로 제거되어 히드라지드 관능기를 탈보호한다.
"활성화가능한"이란 일반적으로 하나 이상의 화학 시약으로 처리하는 경우 반응성 잔기로 변형될 수 있는 임의의 관능기를 의미한다. "활성화된"이란 반응성 잔기로의 변형을 수행한 관능기를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 활성화가능한 잔기는 보호된 잔기 또는 전구체일 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 관능기는 일반적으로 양성의 비반응성이거나 또는 기판 또는 생분자에 결합할 수 없는 것으로 생각된다. 1종 이상의 화학 시약으로 처리하는 경우, 관능기는 기판 또는 생분자에 결합할 수 있는 잔기로 변형된다. 바람직한 실시양태에서, 한 예로서, 표 2, 번호 1 내지 3에 나열된 화합물의 에스테르기는 히드라진으로 처리하는 경우 히드라지드로 변형된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 한 예로서, 아세탈기를 포함하는 기판은 일반적으로 비반응성인 것으로 생각된다. 산 공급원으로 처리하는 경우, 아세탈은 히드라지드 수식된 생분자에 결합할 수 있는 알데히드로 변형된다.
"마이크로어레이 (microarray)"란 일반적으로, 형성된 생분자를 포함하는 다수의 위치들의 기하학적 배열을 의미하며, 이러한 각각의 위치들은 1 mm 이하의 길이로 한정된다. 마이크로어레이는 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,632,957호에서 "APEX 칩"으로 명명된 것과 같은 전자적으로 주소지정가능한 마이크로어레이를 포함한다.
도 2는 본 발명의 개요의 기본적인 반응을 보여주며, 여기서 생분자는 다수의 부착 잔기를 통해 기판 표면에 결합된다. 다수의 부착 잔기는 하기와 같은 방법들을 이용하여 생분자에 제공할 수 있다. 이러한 방법들 각각은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 생분자의 표준 고상 합성에 적합하다.
1. 다수의 부착 부위를 갖는 올리고뉴클레오티드의 제조
1.1 분지된 포스포르아미다이트를 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성:
분지된 포스포르아미다이트를 갖는 분지된 생분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 구조물은 시판된다 (Chemgenes, Ashland, MA ; Glenn Research, Sterling, VA). 고상 올리고뉴클레오티드 합성에서 이러한 분지된 아미디트의 1회 이상의 연속적 커플링 이후에 (도 5A 및 B), 2개 이상의 말단 히드록실기를 갖는 올리고뉴클레오티드가 형성된다. 여기서, 분지를 올리고뉴클레오티드로 도입하는 임의의 다른 빌딩 블록을 유사한 방식으로 사용할 수 있다. 이들 히드록실기를 제2 유형의 포스포르아미다이트와 반응시켜, 기판에 생분자를 부착시키기 위한 반응성 기 (즉, 결합 잔기)를 형성시킬 수 있다. 이러한 포스포르아미다이트는 여러 이용가능한아미디트, 예를 들어 비오틴 아미티드 (예를 들어, Glenn Research, Cat No. 10595002), 아미노 수식체 (예를 들어, Glenn Research, Cat. No. 10190602), 티올 수식체 (예를 들어, Glenn Research, Cat. No. 10192602), 페닐보론산 아미티드 (Prolinx, Bothell, WA) 및 다른 것들로부터 선택될 수 있다. 또한, 보호된 형태 또는 전구체 형태 (도 9A)로 히드라지드를 포함하는 포스포르아미다이트를 사용할 수 있다. 결과는 2개 이상의 (바람직하게는 2개 내지 8개의) 반응성 기를 갖는 올리고뉴클레오티드이다.
1.2 부착을 위한 하나 이상의 반응성 기를 갖는 신톤 (synthon)의 직접적인 도입:
또는, 특별한 포스포르아미다이트의 커플링에 의해 다수의 부착 부위를 갖는 생분자를 얻을 수 있다. 이러한 아미디트는 보호된 형태 또는 전구체 형태로 기판에서의 고정을 위한 하나 이상의 반응성 기를 포함할 수 있다. 분지된 아미디트에서 반응성 기는 또한 아미노기, 티올, 알데히드 또는 히드라지드와 같은 공지된 관능기 중 하나일 수 있다. 이러한 아미디트의 예는 도 6A 내지 C에 나타나 있다.
1.3 조합된 방법:
다수의 반응성 기를 갖는 생분자를 합성하는 세번째 방법은 분지된 아미디트와 다수의 반응성 부위를 갖는 아미디트의 커플링의 조합이다 (도 8A 내지 C).
특히 바람직한 실시양태에서, 공유결합을 통해 기판 표면에 대한 부착을 위한 결합된 히드라지드를 갖는 생분자가 제공된다. 이 실시양태에서, NHS 및 술포-NHS 및 다른 잔기는 기판 또는 임의 다른 유형의 생분자를 활성화하고, 생분자 또는 심지어 고체 표면에 커플링하는 수단으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 이용에 있어서, 이러한 부착은 생분자의 부착이 수행되어 전자 마이크로칩의 전자적 주소지정과 관련된 극단적인 반응 조건에 의해 유발되는 결합된 생분자에 대한 손상에 대하여 저항성을 제공할 수 있는 새로운 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 히드라지드 화학 및 다수의 부착 반응은 전자 시스템의 환경에서 생존성에 대한 요건을 이행하며, 이 요건은 생분자의 수 용해성, 생분자 및 고정화 기판상에서의 그의 커플링쌍의 물에 대한 안정성, 및 약 4의 pH에 대한 관능성에 대한 필요를 포함한다.
히드라지드 결합 잔기가 부가되어 본 발명에서 이용되는 방법은 하기 실시예에서 제공된다. 이러한 실시예는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 생분자의 부위 특이적 공유결합 부착을 보여주며, 여기서 부착은 전자적으로 주소지정가능한 마이크로어레이상의 N-히드록시숙신이미딜 (NHS) 수식된 폴리아크릴아미드 투과층상에서 전자적 농도의 히드라지드 수식된 올리고머를 사용하여 달성된다. 올리고머의 히드라지드 잔기는 비스히드라지드 결합을 형성하는 NHS 에스테르를 대체한다. 따라서, 이러한 예는 하기의 사실을 나타낸다. 1) 실시예 1 (도 9)에 나타낸 바와 같은 신규 히드라지드 포스포르아미다이트 (예를 들어, 화합물 1)의 합성, 및 표준 합성 방법을 이용한 이들 아미디트의 합성 올리고머상으로의 성공적인 혼입, 2) N-히드록시- 또는 N-히드록시술포-숙신이미딜 수식된 투과층의 제조, 및 3) 전자적으로 주소지정가능한 마이크로어레이상의 2층의 투과층 (활성화된 단량체는 상층에만 혼입됨).
달리 지시되지 않는 한, 모든 반응은 자석 막대로 교반한다. 시약은 알드리치 케미칼 컴파니 (Aldrich Chemical Company, Milwaukee WI)사로부터 분석 등급으로 입수하였고, 용매는 리델 (Riedel)사로부터 입수하였다. 실리카 겔 60 (Merck, 230-400 메쉬)을 사용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 융점은 보정하지 않았다. IR 스펙트럼은 그레이스비 스페커크 (Graseby Specac) 10500 ATR 유닛을 장착한 퍼킨 엘머 패러건 (Perkin Elmer Paragon) 1000 FT-IR상에서 측정하였다. 브루커 (Bruker) DRX 400 스펙트로미터를 사용하여1H-NMR 스펙트럼을 400 MHz에서 기록하고,13C 스펙트럼을 100 MHz에서 기록하고,31p를 162 MHz에서 측정하였다. 내부 표준으로 TMS를 사용하여1H 케미칼 쉬프트를 δ의 유닛으로 보고하고, 커플링 상수를 Hz의 유닛으로 보고하였다. ESI 질량 스펙트럼을 핀니건 (Finnigan) LCQ 기구상에서 음 이온화 모드로 기록하였다.
<실시예 1>
실험예 1.1
N-트리페닐메틸-6-히드록시카프론산 히드라지드의 합성 (화합물 5, 도 9A):
THF 200 ml 중 트리틸히드라진 하이드로클로라이드 (3a) 6.2 g (20 mmol)의 용액에 트리에틸아민 2.22 g (22 mmol, 1.1 당량)을 가하였다. 용액을 실온에서15분 동안 교반하고, 여과하고, 농축하여 화합물 3을 얻은 다음, ε-카프롤락톤 (화합물4) 2.29 g (20 mmol, 1 당량)으로 처리하였다. 혼합물을 65 ℃로 5시간 동안 가열한 다음, 실온으로 18시간 동안 냉각시켰다. 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로부터 재결정화하여 백색 분말 (화합물 5) 3.55 g (45 %)을 얻었다.
실험예 1.2
6-[(2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]-N'-트리틸헥사노히드라지드의 합성 (화합물 1a , 도 9A):
실온에서 무수 디클로로메탄 50 ml 중 N-트리페닐메틸-6-히드록시카프론 히드라지드 (화합물 5) 3.0 g (7.7 mmol)의 용액에 15분에 걸쳐 N-에틸디이소프로필 아민 4.0 g (31 mmol, 4 당량) 및 클로로(디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스핀 (화합물 6) 2.01 g (8.5 mmol, 1.1 당량)을 천천히 가하였다. 완전히 가한 다음, 반응물을 1시간 동안 교반하여 농축하고, 크로마토그래피 (0.2 % 트리에틸아민과 함께 에틸 아세테이트/n-헵탄 2/3)하여 연한 황색 포말체인1a3.19 g (70 %)을 얻었다.
실험예 1.3
에틸 6-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]헥사노에이트의 제조 (화합물 1b , 도 9B, 반응식 2):
실온에서 디클로로메탄 30 ml 중 에틸 6-히드록시헥사노에이트 1.65 g (10 mmol) (화합물 7)의 용액에 15분에 걸쳐 N-에틸디이소프로필 아민 5.17 g (40 mmol, 4 당량) 및 화합물62.6 g (11 mmol, 1.1 당량)을 천천히 가하였다. 완전히 가한 다음, 반응물을 15분 동안 추가로 교반하여 농축하고, 크로마토그래피 (0.2 % 트리에틸아민과 함께 에틸 아세테이트/n-헵탄 1/4)하여 투명한 오일인 화합물1b2.47 g (69 %)을 얻었다.
실험예 1.4
에스테르 포스포르아미다이트: 디에틸 5-{[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]메틸}이소프탈레이트의 제조 (화합물 1c, 도 6B):
실온에서 무수 디클로로메탄 20 ml 중 디에틸 5-(히드록시메틸)이소프탈레이트 [252.27] 1.29 g (5 mmol) (98 %, Aldrich ; CAS 181425-91-2)의 용액에 15분에 걸쳐 N-에틸디이소프로필 아민 [129.25] 2.59 g (40 mmol, 4 당량) 및 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필-클로로-포스포르아미다이트 [236.68] (Aldrich; CAS 8999270-1) 1.3 g (11 mmol, 1.1 당량)을 교반하면서 가하였다. 혼합물을 농축하고, 에틸 아세테이트/n-헵탄 (2:3) 30 mL로 염을 침전시켰다. 하이드로클로라이드 침전물을 여과하고, 여과물을 농축시키고, 크로마토그래피 컬럼에 직접 가하였다. 트리에틸아민 몇 방울을 포함하는 에틸 아세테이트/n-헵탄 (1:4)으로 용출시켜 무색 오일로서1c를 1.6 g (70 %) 얻었다.
실험예 1.5
디메틸 3,3'-(2-{[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]메틸}-2-{[2-(메톡시카르보닐)에톡시]메틸}프로판-1,3-디일비스옥시)디프로피오네이트의 합성 (화합물 1d , 도 8B):
실온에서 무수 디클로로메탄 2 ml 중 트리스-2,2,2-{[(메톡시카르보닐)에톡시]메틸}에탄올 (CAS 169744-28-9; (Coutts, S. ; Jones, D. S. ; Livingston, D.A. ; Yu, L.:1995, Chemically-defined nonpolymeric valency platform molecules and conjugates thereof, 유럽 특허 출원 EP 0642798A2) 300 mg (0.760 mmol)의 용액에 무수 아세토니트릴 중 1H-테트라졸 0.4 M 용액 (고상 DNA 합성으로부터의 표준 활성제 용액) 2 방울 및 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미디트 (Aldrich ; CAS 102691-36-1) 274 mg (0.91 mmol; 1.1 당량)을 가하고, TLC 에 의한 결과, 출발 물질이 완전히 소모될 때까지 (3시간) 실온에서 교반하였다. 용매를 진공에서 제거하고, 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 트리에틸아민을 몇 방울 포함하는 에틸 아세테이트/n-헵탄 (2:3)으로 용출시켜 무색 오일1d를 240 mg (53 %) 얻었다.
실험예 1.6
트리틸 보호된 히드라지드 아미디트를 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성 (예: 화합물 1 ; 도 17A 참조):
자동화 올리고뉴클레오티드 합성기상에서 고상 포스포르아미다이트 화학을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 보호된 히드라지드를 갖는 포스포르아미다이트를 아세토니트릴 중 0.1 M 용액으로 가하고, 표준 활성화 시약 및 커플링 시간을 이용하여 목적하는 위치에 연속하여 커플링시켰다.
CPG 결합된 올리고 (1 mmol)를 1.5 ml 테스트 튜브에 넣고, 농축 NH40H 2.0 ml로 처리하였다. 55 ℃에서 2시간 후에, 암모니아 용액을 제거하고, 감압하에 건조 증발시켰다. 잔사를 물 1 ml 중에 용해시키고, 0.45 ㎛ 주사기 필터를 통해 여과하였다. 머크 리크로스퍼 (Merck LiChrospher) RP 18, 10 μM, 컬럼 (분석: 4 x 250 mm, 유속 = 1.0 ml/분; 예비: 10 x 250, 유속 = 3.0 mL/분)을 사용하는 역상 HPLC에 의해 완충액 A로 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 pH = 7.0 (TEAA) 및 완충액 B로 완충액 A 중 75 % 아세토니트릴을 사용하여 트리틸 보호된 히드라지드 올리고를 정제하였다. 100분내에 0 % B 내지 100 % B의 구배를 분석 및 예비 분리를 위해 사용하였다. 생성물상에 트리틸을 포함하는 분획을 푸울링하여, 건조 증발시켰다.
트리틸 보호기를 제거하기 위해, 올리고를 80 % 아세트산으로 실온에서 30분 동안 처리하였다. 산을 진공 제거하고, 잔사를 물에 용해시킨 다음, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 수층을 다시 건조하여 재용해시켰다. HPLC 분석은 일반적으로 단일 생성물 (어떤 경우 이중 피크로서)을 나타내며, 이를 정제하지 않고 추가의 반응에서 사용할 수 있었다. 또는, 상기 기재된 용매 시스템을 사용하여 HPLC 정제를 수행할 수 있었다.
실험예 1.7
포스포르아미다이트 함유 전구체 형태를 사용하는 올리고뉴클레오티드의 히드라지드 관능기 합성의 원위치 생성 (예: 화합물 1b 와 같은 에스테르, 도 9B, 반응식 2; 도 17B 참조):
자동화 올리고뉴클레오티드 합성기에서 고상 포스포르아미다이트 화학을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 히드라지드의 전구체 형태를 갖는 포스포르아미다이트를 아세토니트릴 중 0.1 M 용액으로 가하고, 표준 활성화 시약 및 커플링 시간을 사용하여 목적하는 위치에서 연속으로 커플링시켰다. 히드라지드의 전구체 형태는 올리고뉴클레오티드 합성의 조건에 대해 안정하지만, 반응성 히드라지드는 히드라진과 함께 인큐베이션할 때까지 형성되지 않기 때문에, 산에 불안정한 보호기로 표지된 히드록실기를 포함하는 포스포르아미다이트 및 히드라지드 전구체를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 임의 위치에 히드라지드를 도입할 수 있었다.
CPG 결합된 올리고 (1 mmol)를 디클로로메탄 3.5 mL 중 디에틸아민 50 mg의 용액으로 처리하였다. 밤새 인큐베이션 (빛 차단)한 후에, 상청액을 제거하고, 지지체에 결합된 올리고를 디클로로메탄으로 수회 세척하고, 진공 건조하였다.
벤조일 및 이소부티릴 보호기의 절단, 올리고의 5'-말단의 에스테르의 히드라지드로의 전환, 및 지지체로부터 올리고의 절단 (도 17B)의 경우, 결합된 올리고를 갖는 CPG를 24 % 히드라진 수화물 1 ml로 처리하였다. 4 ℃에서 18시간 동안 계속 교반한 다음, 반응을 완료하였다. 히드라진 용액으로부터 올리고의 분리는 역상 추출법 (예를 들어, Sep-Pak 또는 HPLC)에 의해 달성할 수 있었다.
C18 Sep-Pak 카트리지 (0.5 g Waters, No. 20515)를 아세토니트릴 10 ml에 이어서 0.1 M 트리에틸암모늄 중탄산염 완충액 pH 7.0 (TEAB)으로 세정하여 활성화하였다. 히드라진 용액을 5-배 부피의 TEAB로 희석시키고, 카트리지에 가하였다. 올리고를 Sep-Pak 컬럼에 결합시킨 다음, 잔류 히드라진을 TEAB 10 mL로 세척하여 제거하였다. 이어서, TEAB/아세토니트릴 (1:2)을 사용하여 컬럼으로부터 올리고를 용출시켰다. 올리고 함유 분획을 푸울링하고, 증발 건조시켰다. 생성물의 RP-HPLC 특성화 및 정제를 위해, 프로토콜 1에 기재된 것과 동일한 조건을 적용할 수 있었다.
다른 예들이 하기에 제공되어 있으며, 여기서 올리고머는 프로세싱되어 본 발명의 다수의 부착 잔기에 연결된다. 올리고를 이러한 개시에서 이들 각각의 기재 순서로 번호를 매겼다.
실시예 2:
실험예 2.1비분지된 올리고뉴클레오티드의 합성
2.1.1 올리고 9 : 히드라지드-15머: (1-TTT TTT TTT TTT TTT-3')
아미디트 화합물1a에 대하여 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다. 트리틸 ON 생성물은 기재된 조건하에서 42.2분에 용출하였다. 올리고9는 25.6분에 용출하였다 (이중 피크). LRMS (ESI): M 이론치: 4709.15, 실측치: 4709.5.
2.1.2 올리고 10 : 히드라지드-19머: (1-dGA TGA GCA GTT CTA CGT GG-3')
아미디트 화합물1a에 대하여 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다. 트리틸 ON 생성물은 기재된 조건하에서 41.5분에 용출하였다. 올리고10은 25.1분에 용출하였다 (단일 피크). HRMS (ESI): M 이론치: 6092, 실측치: 6092.
2.1.3 히드라지드의 원위치 생성 (올리고 11 ; 히드라지드 19머 (8-dGA TGA GCA GTT CTA CGT GG-Cy3)
올리고뉴클레오티드의 합성을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. Cy3 염료로 로딩된 CPG 지지체를 사용하여 올리고의 3' 말단에 플루오로포르 (fluorophor)를 표지하였다. CPG 결합된 올리고를 상기 실시예 1(E)에 기재된 바와 같이 처리하고, 생성물을 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 히드라지드 올리고는 실시예 1(D)에 기재된 HPLC 조건하에 31.8분에 용출하였다. LRMS (ESI): M 이론치: 6599.7, 실측치: 6598 ±2.
실험예 2.2분지된 올리고뉴클레오티드의 합성
다수의 히드라지드를 올리고뉴클레오티드로 도입하기 위해, 분지된 포스포르아미다이트, 히드라지드로 전환되는 에스테르기를 하나 이상 갖는 포스포르아미다이트, 및 이들 두가지의 조합을 사용하였다. 이러한 방법으로 하나 내지 여러개 (40개 이하)의 히드라지드를 보유하는 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있었다. 이러한 실험은 p-RNA를 사용하는 것으로 기재되어 있으며, DNA와 같은 다른 올리고뉴클레오티드에 대하여도 적용가능하다.
실험 2.2.1p-RNA 올리고뉴클레오티드의 합성
하기와 같은 예외 및 변형을 제외하고는, p-RNA 올리고뉴클레오티드의 합성을 문헌 (Miculka, C. ; Windhab, N. ; Brandstetter, T. Burdinski, G ; PCT patent application No. WO 99/15540 (1999))에 기재된 바와 같이 수행하였다: 펜토피라노실 뉴클레오시드의 포스포르아미다이트를 KOH를 사용하여 진공 건조하고, 무수 아세토니트릴 중에 용해시켜 0.1 M 용액을 얻었다. 이 용액을 새로 활성화된 분자체 (3Å)상에서 3시간 동안 건조한 다음, PE 바이오시스템즈 익스페디트 (Biosystems Expedite) 8905 DNA 합성기상에서 고상 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 사용하였다. 다른 포스포르아미다이트를 무수 아세토니트릴 중 0.1 M로 용해시키고, 추가의 처리 없이 사용하였다. 2'-말단에서 Cy3 염료를 운반하는 p-RNA 올리고뉴클레오티드의 경우, CPG 지지체 커스텀을 모노메톡시트리틸 보호된 Cy3 (CAS: 182873-80-9, AP-Biotech, Freiburg, Germany)로 로딩하고, 무수 아세토니트릴 중 무수 피리디늄 하이드로클로라이드의 0.1 M 용액을 활성제로 사용하였다. 펜토피라노실 뉴클레오시드에 대한 탈트리틸화 시간이 10분으로 증가하였으며, 커플링 시간은 25분으로 증가하였다. 모든 다른 시약 및 용액, 및 방법들은 기기 제작자의 추천에 따른 것이다.
실험 2.2.2p-RNA 올리고뉴클레오티드의 탈보호:
β-시아노에틸 보호기 절단의 경우, 올리고뉴클레오티드를 실온에서 (빛 차단) 밤새 디클로로메탄 중 디에틸아민의 1.5 % (w/v) 용액으로 처리하였다. 상청액을 제거하고, 지지체 결합된 올리고뉴클레오티드를 디클로로메탄으로 수회 세척하고, 진공 건조하였다.
벤조일 및 이소부티릴 보호기의 절단, 올리고의 5' 말단의 에스테르의 히드라지드로의 전환, 및 지지체로부터 올리고의 절단의 경우, 결합된 올리고를 갖는 CPG를 24 % 히드라진 수화물 1 ml로 처리하였다. 4 ℃에서 지속적인 교반하에서 18시간 후에, 반응을 완료하였다. 히드라진 용액으로부터 올리고의 분리는 역상 추출법 (예를 들어, Sep-Pak 또는 HPLC)에 의해 달성할 수 있다.
C18 Sep-Pak 카트리지 (0.5 g Waters, No. 20515)를 아세토니트릴 10 mL에 이어서 0.1 M 트리에틸암모늄 중탄산염 완충액 pH 7.0 (TEAB) 10 mL로 세정하여 활성화하였다. 히드라진 용액을 5배 부피의 TEAB로 희석시키고, 카트리지에 가하였다. 올리고를 Sep-Pak 컬럼에 결합시킨 후에, TEAB 10 mL를 사용하여 잔류 히드라진을 세척하여 제거하였다. 이어서, TEAB/아세토니트릴 (1:2)을 사용하여 올리고를 컬럼으로부터 용출시켰다. 올리고 함유 분획을 푸울링하고, 건조 증발시켰다. 생성물의 특성화 및 정제를, 머크 리크로스퍼 (Merck LiChrospher) RP 18, 10 μM, 컬럼 (분석: 4 x 250 mm, 유속 = 1.0 ml/분; 예비: 10 x 250, 유속 = 3.0 mL/분)을 사용하는 역상 HPLC에 의해 완충액 A로 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 pH = 7.0 (TEAA) 및 완충액 B로 완충액 A 중 75 % 아세토니트릴을 사용하여 달성하였다. 100분 (HPLC 방법 A) 또는 30분 (HPLC 방법 B)내에 0 % B 내지 100 % B의 구배를 분석 및 예비 분리를 위해 사용하였다.
A. 올리고 12 : 1개의 히드라지드를 갖는 Cy3 표지된 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(Hyd 1 ) TAG GCA TT (Cy3)-2'
아미디트 화합물1b에 대하여 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다.
B. 올리고 13 : 3개의 히드라지드를 갖는 Cy3 표지된 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(Hyd 3 ) TAG GCA TT (Cy3)-2'
아미디트 화합물1d에 대하여 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다. 기재된 조건하에서 생성물은 37.9분 (HPLC 방법 A)에 용출하였다. LRMS (ESI): M 이론치: 3516.6, 실측치: 3515.
C. 올리고 14 : 4개의 히드라지드를 갖는 Cy3 표지된 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(Hyd 2 ) 2 (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
아미디트 화합물1c및 대칭 분지된 포스포르아미다이트 (SBA; Clontech, No. 5252-2)에 대하여 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다. 기재된 조건하에서 생성물은 37.3분 (HPLC 방법 A)에 용출하였다. LRMS (MALDI): M 이론치: 3784.7, 실측치: 3784.
D. 올리고 15 : 8개의 히드라지드를 갖는 Cy3 표지된 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(Hyd 2 ) 4 (SBA) 2 (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
아미디트 화합물1e및 대칭 분지된 포스포르아미다이트 (SBA; Clontech, No. 5252-2)에 대하여 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다. 기재된 조건하에서 생성물은 36.9분 (HPLC 방법 A)에 용출하였다. LRMS (MALDI): M 이론치: 4661.1, 실측치: 4464.
E. 올리고 16 : 스페이서 및 8개의 히드라지드를 갖는 Cy3 표지된 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(Hyd 2 ) 4 (SBA) 2 (SBA) (S18) TAG GCA TT (Cy3)-2'
아미디트 화합물1c및 대칭 분지된 포스포르아미다이트 (SBA; Clontech, No. 5252-2) 및 스페이서 18 (S18, Glen research No. 101918-02)에 대하여 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다. 기재된 조건하에서 생성물은 38.7분 (HPLC 방법 A)에 용출하였다.
F. 올리고 17 : 16개의 히드라지드를 갖는 Cy3 표지된 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(Hyd 2 ) 8 (SBA) 4 (SBA) 2 (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
아미디트 화합물1c및 대칭 분지된 포스포르아미다이트 (SBA; Clontech, No. 5252-2)에 대하여 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다. 기재된 조건하에서 생성물은 38.7분 (HPLC 방법 A)에 용출하였다.
G. 올리고 18 : 4개의 히드라지드를 갖는 p-RNA 올리고 (Cy3 염료 없음): p-RNA 올리고 4'-(Hyd 2 ) 2 (SBA) TAG GCA TT-2'
아미디트 화합물1c에 대하여 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다. 기재된 조건하에서 생성물은 12.75분 (HPLC 방법 B)에 용출하였다. LRMS (ESI): M 이론치: 3275.1, 실측치: 3275.4.
실험예 2.3
히드라지드 올리고뉴클레오티드를 보로네이트 올리고뉴클레오티드로 전환시키는 일반적인 방법
히드라지드 올리고뉴클레오티드 50 nmol을 10 mM 암모늄 아세테이트 완충액(pH 4.0) 200 ㎕ 중에 용해시키고, 히드라지드 당 4-포르밀페닐보론산 (Aldrich No. C43,196-6; CAS: 87199-17-5) 15 당량을 가하였다. 4개의 히드라지드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 경우, 예를 들어 DMSO (3 μmol) 중 4-포르밀페닐보론산의 0.1 M 용액 30 ㎕를 사용하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 4-포르밀페닐보론산 당 NaCNBH320 당량을 가하고, 인큐베이션을 실온에서 1시간 더 계속하였다. 예를 들어, 4개의 히드라지드를 갖는 올리고뉴클레오티드의 경우, 10 mM 암모늄 아세테이트 완충액 (pH 4.0) 중 1 M NaCNBH3용액 (1 ml에 용해된 6.3 mg) 150 ㎕ (150 μmol)가 필요하다.
과량의 4-포르밀페닐보론산 및 소듐 시아노보로하이드라이드의 제거는 HPLC, 겔 여과 (Pharmacia PD10 컬럼), 또는 고상 추출법 (Merck LiChrolute 컬럼)의 방법에 의해 제거된다. 보로네이트 수식된 올리고뉴클레오티드의 경우, 말단 캡핑된 HPLC 컬럼을 사용하는 것이 중요하다. 통상의 조건은 페노메넥스 루나 (Phenomenex Luna) 페닐 헥실 컬럼 (분석: 4.6 x 250 mm, 유속 = 1.0 ml/분; 예비: 10 x 250, 유속 = 3.0 mL/분)으로, 완충액 A로 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 pH = 7.0 (TEAA) 및 완충액 B로 완충액 A 중 75 % 아세토니트릴을 사용한다. 100분 (HPLC 방법 A) 또는 30분 (HPLC 방법 B)내에 0 % B 내지 100 % B의 구배를 분석 및 예비 분리를 위해 사용하였다. 생성물을 포함하는 분획을 푸울링하고, 증발 건조시켰다.
A. 올리고 19 : 1개의 보로네이트를 갖는 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(PBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
출발 물질로 올리고뉴클레오티드12를 사용하여 일반적인 프로토콜에 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다.
B. 올리고 20 : 3개의 보로네이트를 갖는 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(PBA) 3 TAG GCA TT (Cy3)-2'
출발 물질로 올리고뉴클레오티드13을 사용하여 일반적인 프로토콜에 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다.
C. 올리고 21 : 4개의 보로네이트를 갖는 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(PBA) 4 (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
출발 물질로 올리고뉴클레오티드14를 사용하여 일반적인 프로토콜에 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다.
D. 올리고 22 : 8개의 보로네이트를 갖는 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(PBA) 8 (SBA) 2 (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
출발 물질로 올리고뉴클레오티드15를 사용하여 일반적인 프로토콜에 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다. 기재된 조건하에서 생성물은 46.3분 (HPLC 방법 A)에 용출하였다.
E. 올리고 23 : 스페이서 18 및 8개의 보로네이트를 갖는 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(PBA) 8 (SBA) 2 (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
출발 물질로 올리고뉴클레오티드16을 사용하여 일반적인 프로토콜에 기재된바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다.
F. 올리고 24 : 16개의 보로네이트를 갖는 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(PBA) 16 (SBA) 4 (SBA) 2 (SBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
출발 물질로 올리고뉴클레오티드17을 사용하여 일반적인 프로토콜에 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다. 기재된 조건하에서 생성물은 49.0분 (HPLC 방법 A)에 용출하였다.
G. 올리고 25 : 1개의 보로네이트를 갖는 p-RNA 올리고: p-RNA 올리고 4'-(PBA) TAG GCA TT (Cy3)-2'
출발 물질로 올리고뉴클레오티드18을 사용하여 일반적인 프로토콜에 기재된 바와 같이 합성 및 탈보호를 수행하였다.
실시예 3:HPLC 분석
히드라지드 올리고의 합성 완료 후에, 제1 실험 세트에 의해 NHS 또는 술포-NHS 에스테르를 갖는 히드라지드 표지된 올리고의 용액 반응 동역학을 조사하였다. 50 mM 히스티딘 30 ㎕ 중 132 μM 히드라지드 ATA5 5 ㎕의 용액에 10 mM NHS 아크릴레이트 5 ㎕를 가하였다. 용액을 실온에서 단시간 동안 교반한 다음, HPLC 시스템에 주입하였다. 용액 중 화합물의 HPLC 결과는 주어진 반응 시간 동안 반응 혼합물 중에 존재하는 히드라지드 ATA5 및 N'-아크릴로-ATA5 디히드라지드의 양을 나타내었다. 출발 ATA5 히드라지드 및 수식된 ATA5 히드라지드의 보유 시간은 차이가 있었으며, 구별할 수 있었다.
도 10A 내지 C는 반응 혼합물의 세가지 분리 기록을 나타낸다. 제1 기록 (A)는 비수식된 ATA5 히드라지드 (A)로부터 얻어졌으며, 제3 기록 (C)는 NHS 아크릴레이트를 사용하여 5분의 반응 시간 후에 완전하게 수식된 ATA5 히드라지드 (B)를 나타낸다. 중간 기록 (B)는 1분 동안 반응으로 포획된 불완전한 수식을 나타낸다. ATA5 히드라지드의 대략적인 소모를 가정하면, 1200 M-1s-1의 슈도-1차 (pseudo-first order) 반응 속도가 결정된다.
이 속도와 사용된 다른 부착 시스템의 비교는 도 11에 나타나 있다. 수성 환경 중 히드라지드를 갖는 NHS 에스테르에 대한 반응 속도는 매우 효과적인 반응을 나타낸다. 또한, 반응의 pH를 변화시켜 히드라지드 수식의 pH 의존성을 결정하였다. HCl을 사용하여 pH 6, 5.5, 5.0, 4.5 및 4로 조정된 50 mM의 완충 시스템을 사용하여 실험을 수행하였다. 그러나, pH 4에서, 히드라지드 올리고는 영향받지 않았고, 변형을 나타내지 않았으며, 따라서 약 4.5의 pH 하한치를 나타내었다.
실시예 4:칩 제작
마이크로어레이를 포함하는 칩을 아르곤 하에서 5분 동안 플라즈마로 처리하였다. 이어서, 증기상 침착을 이용하여 25 부위의 1 cm ×1 cm 칩을 실린화하였다. 마이크로어레이의 중심부에 UV 개시제로서 0.3 % Daracur 4265와 함께 1:1 DMSO/H20 중 9:1 (몰 비율) 아크릴아미드/비스아크릴아미드의 20 (중량)% 용액 0.10 ㎕를 가하였다. 칩을 미세반응 주형 시스템에 놓고, 마이크로어레이 부위를 4 ㎛2공동 (측면상 3 mm)을 포함하는 UV 창에 대고 눌렀다. 용액을 UV 광으로 20초 동안 조사하고, 주형 시스템으로부터 제거하고, 물로 씻어내고, 공기로 건조하였다. 웰은 마이크로어레이상에서 사각형 하이드로겔 층을 형성하였다. 주형의 파라메타를 넘는 과도한 중합을 제거하였다.
존재하는 투과층에 20 (중량)%의 단량체 농도의 NHS 또는 술포 NHS/Am/Bis 10/83/7 (몰 비율)을 포함하는 용액 0.80 ㎕를 가하고, 존재하는 중합체를 1분 동안 포화시켰다. 칩을 미세반응 주형 시스템상에 로딩하고, 4.6 mm의 직경 및 5 ㎛의 웰 깊이를 갖는 원형 주형을 사용하여 상기와 같이 중합하였다. 이러한 제2의 주형은 존재하는 사각형 층을 완전히 포함하였으며, 그 이상으로 연장되었다. 제2 층의 부착은 중합체 사슬과 결합 실란의 삽입을 통해 달성되었다. 칩을 물로 세척하고, 압축 공기를 사용하여 건조시킨 다음, 하기 실험에서 테스트하였다.
실험예 4.1:활성화된 에스테르 농도; 표지된 포획 주소
상기 기재된 바와 같이 0, 1, 2 및 4 % 술포-NHS를 포함하는 2겹의 투과층이 연결된 칩에 특이적 표지된 포획체로 500 히드라지드-T12-BTR을 전자적으로 로딩하였으며, 50 mM nM 비오틴 T12-BTR을 비특이적 표지된 포획체로 사용하였다. 모든 용액을 50 mM 히스티딘 중에 완충하였다. 포획체를 500 nA/패드의 전류로 120초 동안, 한번에 4 패드로 주소지정하였다. 각 칩을 1 % SDS, 0.2 x STE로 세척하고, 1% SDS 중에 20분 동안 담갔다. 칩을 1초 동안 영상화하고, 평균 MFI 값을 기록하였다.
도 12에서 알 수 있는 바와 같이, 표지된 히드라지드 올리고의 공유결합 부착은 투과층에서 활성화된 에스테르의 양에 의존하며, 농도 증가에 따라 증가한다. 비오틴 표지된 올리고의 비특이적 부착은 또한 꽤 적으며, 실험에서 평균 40 MFI/s이다.
실험예 4.2: 전자적 조건
상기 기재된 바와 같이 10 % NHS 또는 술포-NHS를 포함하는 2겹 투과층이 연결된 칩에 특이적 표지된 포획체로서 500 및 5 nM 히드라지드-T12-BTR을 전자적으로 로딩하였다. 500 mM nM 비오틴-T12-BTR을 비특이적 표지된 포획체로 사용하였다. 모든 용액을 50 mM 히스티딘 중에 완충하였다. 포획체를 400, 500, 600, 700 및 800 nA/패드의 전류로 120초 동안, 한번에 3 패드로 주소지정하였다. 비특이적 포획체를 800 nA/패드로 로딩하였다. 각 칩을 1% SDS, 0.2 x STE로 세척하고, 1% SDS 중에 20분 동안 담갔다. 칩을 1초 동안 영상화하고, 평균 MFI 값을 기록하였다.
도 13에서 알 수 있는 바와 같이, NHS 수식된 투과층에 대한 특이적 포획체의 부착은 600 nA에서 크게 증가하였지만, 술포-NHS 수식된 히드로겔은 최대 부착을 위해서는 약간 더 높은 전류를 필요로 하였다 (도 14).
실험예 4.3: 다수 결합의 효과
상기 기재된 바와 같이 10 % NHS를 포함하는 2겹 투과층이 연결된 칩에 1, 2, 4 또는 8개의 히드라지드 잔기를 포함하는 Cy3 표지된 ATA5 올리고를 로딩하였다. 4개의 올리고머를 500 nM에서 700 또는 800 nA/패드의 전류로 120초 동안 전자적으로 주소지정하고, 50 mM 히스티딘 중에 완충하였다. 완료 후에, 칩을 세척하고, 결합 수준을 측정하였다.
기록된 MFI/s 값은 도 15에 나타나 있다. 동일한 전류에서 올리고머 당 부착에 이용가능한 히드라지드 잔기수의 비교는 올리고머에 대한 히드라지드의 증가와 함께 증가된 결합 수준을 나타낸다.
실험예 4.4:리버스 도트-블롯 전자적 혼성화
상기 기재된 바와 같이 15 % NHS를 포함하는 2겹의 투과층이 연결된 칩에 특이적 포획체로서 Cy3 표지를 갖는 옥타-히드라지드 ATA5 올리고머를 로딩하였다. 특이적 포획체를 500 nM에서 600 또는 700 nA/패드의 전류로 120초 동안 로딩하고, 50 mM 히스티딘 중에 완충하였다. 전자적 혼성화를 특이적 표적으로 5 nM RCA5 T12-Cy5를 사용하여 수행하고, 5 nM RCA4-Cy5의 용액을 비특이적 표적으로 사용하였다. 표적을 400 nA/패드에서 60초 동안 로딩하고, 표준 프로토콜에 따라 칩을 세척하고 영상화하였다.
도 16에 제공된 데이타는 주로 비특이적 표적에 대한 특이적 표적의 혼성화를 나타낸다. 이것은 또한 상기 보고된 데이타와 일치함을 유의해야 하며, 포획체의 전자적 로딩에 대한 600 내지 700 nA의 전류의 증가는 혼성화를 증가시킨다.
실시예 5:비공유결합 잔기를 갖는 생분자의 합성
도 4 및 5A 및 B는 다수의 결합 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 합성을 나타낸다. 도 4에는, 올리고 합성이 나타나 있으며, 여기서 2개의 PBA를 포함하는 단일한 분지된 포스포르아미다이트가 부가되어 있다. 도 5A 및 B는 각각 4개의 PBA를 갖는 2개의 분지 및 8개의 PBA를 갖는 3개의 분지를 나타낸다. 나타낸합성은 ABI394 DNA 합성기상에서 수행되었다. 분지된 포스포르아미다이트의 단계별 커플링 수율은 약 96 내지 98%로 보통의 뉴클레오티드 포스포르아미다이트와 유사하였다. PBA 포스포르아미다이트를 마지막 단계에서 가하였다. 고상 지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 절단 및 보호기의 제거는 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이 보통의 올리고뉴클레오티드의 취급과 동일하였다.
PBA-함유 분지된 올리고뉴클레오티드를 정제하여 HPLC에 의해 분석하였다. PBA-함유 올리고뉴클레오티드의 HPLC는 보통의 올리고뉴클레오티드의 것보다 더 넓은 피크를 나타내었다.
실험예 5.1:비공유결합 잔기를 통한 생분자의 전자적 로딩
20 nM 비분지 및 분지된 PBA-함유 ATA5 포획 프로브를 히드로겔 기판상에 전자적으로 로딩하였다. 포획 프로브를 50 mM 히스티딘 중에 한번에 10 패드로 120초 동안 로딩하였다. 20 nM RCA5-BTR을 수동으로 5분 동안 로딩하였다. 기판을 세척하고 영상화하였다. 분석 결과, 분지 및 비분지된 포획 프로브 모두 목적한 대로 투과층에 고정된 것으로 나타났다.
실험예 5.2:비공유 결합 잔기를 통한 전자적으로 로딩된 생분자의 안정성
올리고 20, 21 및 22 (3, 4 및 8개의 PBA 결합 부위를 포함하는 p-RNA)를 SHA 수식된 히드로겔 칩에 전자적으로 주소지정하였다. 종료시에, 상기 기재된 표준 세척 방법 이후에 초기 영상을 기록하였다. 이어서, 50 mM 히스티딘 10 ㎕로 반복적으로 씻어내어 칩 어레이를 규칙적으로 세척하였다. 5회 세척 후에 영상을 기록하였다. 도 21에 나타낸 결과는 2가지 특징을 포함한다. 첫째, 올리고 당 더많은 수의 부착 부위를 갖는 더 높은 등급의 덴드리머에 대한 기록된 신호는 뚜렷하게 더 높다. 또한, 신호는 25회의 세척 사이클 동안에 걸쳐 꽤 안정하며, 이는 덴드리머 부착 시스템의 사용으로 인한 향상된 안정성을 나타낸다. 올리고 22는 그의 초기 신호의 약 14%를 상실하였고, 올리고 20 및 21은 각각 25 및 35% 감소하였다.
실시예 6:다수의 히드라존 형성을 통한 공유결합 부착
미리, 단일한 아민 또는 히드라지드로 수식된 올리고를 알데히드 수식된 히드로겔상에 전자적으로 로딩하였다. 알데히드와 아민 또는 히드라지드의 상호작용은 각각 이민 (질소에 대해 이중 결합을 갖는 탄소) 또는 히드라존을 형성시킨다. 이들 잔기는 수성 조건에서 가역적이며, 안정한 비가역적 공유결합 부착을 형성하기 위해서는 NaBH3CN으로 추가로 환원시켜야 한다. 또한, 단일한 히드라지드를 포함하는 전자적 농도의 올리고머는 히드라존 형성을 통해 올리고머를 기판에 부착시켰다. 환원 단계를 제거하자 쉽게 가수분해되는 불안정한 결합이 형성되었으며, 여기서 결합된 올리고는 쉽게 확산되어 제거되었다. 올리고마다 형성되는 상당수의 히드라존이 존재한다면, 덴드리머 히드라지드의 사용은 추가의 환원을 필요로 하지 않는 다소 불안정한 결합을 통해 공유결합 부착 방법을 제공한다. 가역적 히드라존 형성은 몇몇 결합 부위에서 나타날 수 있지만, 다른 부위들은 원상태로 남아 있다 (도 22). 히드라지드는 확산할 수 없고, 알데히드가 풍부한 환경내에 트랩핑되며, 쉽게 재형성될 수 있다. 이러한 평형은 올리고마다 증가된 수의 부착부위를 이용하며, 모든 결합이 즉시 가수분해되지 않는 한, 안정한 부착 시스템을 제공하는 것으로 생각된다. 알데히드가 풍부한 투과층은 글리옥실 아가로스에서와 같이 직접 제조될 수 있거나, 또는 아세탈 수식된 투과층으로부터 형성될 수 있다. 후자에서, 아세탈 잔기는 산의 존재하에 쉽게 가수분해되어 알데히드를 형성한다. 아세탈은 보호기로 작용하여, 활성화가 필요할 때까지 알데히드 관능성을 보존한다. 가수분해는 산 용액에 1시간 동안 노출시키거나 또는 묽은 염 용액 중에 완충된 약한 전자적 흐름으로 처리하여 완료할 수 있다. 후자의 방법은 캐쏘드에서 발생된 산을 이용함으로써 부위 특이적 가수분해를 제공한다.
실험예 6.1:글리옥실 아가로스에 부착된 덴드리머 히드라지드 올리고머
표준 25 부위 칩은 글리옥실 아가로스로 코팅된 스핀이었다 (FMC, Princeton, NJ). 1, 2, 4 및 8개의 히드라지드를 포함하는 500 nM 히드라지드 Cy3 표지된 올리고를 500 nA/패드에서 각각 2분 동안 전자적으로 로딩하고, 50 mM 히스티딘 중에 완충시켰다. 확립된 방법에 따라 칩을 세척하고, 영상화하였다. 기록된 MFI/s 값은 도 23에 나타나 있다. 1개 또는 2개의 히드라지드를 갖는 올리고는 꽤 불안정하였으며, 예상된 바와 같이 배경 노이즈를 넘는 검출가능한 형광을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 더 많은 수의 히드라지드를 갖는 올리고는 안정한 공유결합 부착을 형성할 수 있었다.
실험예 6.2: 아세탈 수식된 히드로겔에 부착된 덴드리머 히드라지드 올리고머; 탈보호 및 공유결합 부착
표준 25 어레이 부위 마이크로칩을 아크릴아미드, 비스아크릴아미드 및 비닐아세탈이 15:2:3 비율로 구성된 단일 층 히드로겔로 수식하였다. 선택된 부위를 50 mM NaCl 용액 중에서 300 nA/패드의 전류로 2분 동안 처리하여 알데히드를 노출하는 아세탈 관능기를 가수분해하였다. 올리고 당 8개의 히드라지드를 포함하는 덴드리머 히드라지드 올리고머를 500 nA/패드에서 2분 동안 전자적으로 로딩하고, 활성화된 패드 및 활성화되지 않은 패드에 대해 50 mM 히스티딘 중에서 완충하였다. 비특이적 올리고를 또한 아세탈 및 알데히드 수식된 부위 모두에서 전자적으로 로딩하였다. 표준 세척 사이클 후에, 칩을 영상화하였다. 기록된 MFI/s 데이타는 도 24에 나타내었다.
도 24에서 알 수 있는 바와 같이, 전자적으로 활성화된 이후에 덴드리머 표지된 올리고머로 전자적으로 로딩된 패드는 가장 높은 형광 신호를 나타내었다. 흥미롭게도, 미리-주소지정되지 않았던, 아세탈로 남아 있는 패드는 또한 히드라지드 수식된 올리고머의 약간의 부착을 나타내었다. 아마도, 올리고머를 농축시키는데 인가된 전자적 흐름은 국소적으로 히스티딘의 완충능을 초과하기에 충분한 산을 발생시켰으며, 따라서 상당량의 아세탈 잔기를 가수분해할 수 있었다.
실시예 7:기판 표면 이외의 분자에 대한 히드라지드 올리고뉴클레오티드의 커플링
실험예 7.1히드라지드-15머 9 와 벤질옥시 아세트알데히드의 반응: 도 19
히드라지드 올리고뉴클레오티드910 μmol을 10 mM 암모늄 아세테이트 완충액 (pH 4.0) 60 ㎕ 중에 용해시켰다. 벤질옥시아세트알데히드 (CAS: 6065-87-3;C9H10O2[150. 1760] Aldrich No. 38, 218-3) 1 방울을 가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 정치하였다. 용매 및 과량의 알데히드를 진공에서 제거하고, 생성물을 HPLC (컬럼: Merck LiChrospher RP 18, 10 μM, 4 x 250 mm ; 완충액 A = 0. 1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 pH = 7.0, 완충액 B = 완충액 A 중의 75 % 아세토니트릴; 유속 = 1.0 mL/분; 구배: 100분내에 0 % B 내지 100 % B)에 의해 분석하였다. 생성물의 보유 시간은 30.7분이었고, 올리고9는 25.5분에 용출하였다.
실험예 7.2올리고 10 과 펩티드의 결합 반응, 도 20
올리고104.4 nmol을 10 mM 암모늄 아세테이트 완충액 (pH 4.0) 60 ㎕중에 용해시켰다. 완충액 15 ㎕ 중 진통제 (antipain) 하이드로클로라이드 (CAS: 37682-72-7; C27H44N1006ㆍ2HCl; [677.6304]; Calbio No. F178220) 44 nmol (10 당량)을 가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 중간체 생성물을 실온에서 1시간 동안 NaBH3CN (100 당량)으로 환원시켰다. 생성물을 HPLC (컬럼: Merck LiChrospher RP 18, 10 μM, 4 x 250 mm; 완충액 A = 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트 pH = 7.0, 완충액 B = 완충액 A 중 75 % 아세토니트릴; 유속 = 1.0 mL/분; 구배: 60분내에 10 % B 내지 85 % B)에 의해 분리하였다. 생성물 (올리고뉴클레오티드 펩티드 결합물)의 보유 시간은 16.5분이었고, 올리고10은 13.9분에 용출하였다. MS (ESI): 이론치: 6680.6; 실측치: 6679.6.
실시예 8:슬라이드 표면상의 히드라지드 수식된 생분자의 수동식 도포
히드라지드 수식된 올리고뉴클레오티드를 시판 슬라이드에 결합시키는 경우,1 내지 16개의 히드라지드를 포함하는 일련의 p-RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 12, 13 및 14와 함께,1d로부터 제조되는 3개 및 6개의 히드라지드를 갖는 올리고머를 사용하였다. 또한, 아민 말단의 올리고머 (5' 아미노 수식체 C6로 제조됨; Glenn Research) 및 수식되지 않은 올리고뉴클레오티드를 비특이적 대조군으로 사용하였다. 모든 올리고머는 2' 말단에서 Cy3로 표지되었으며, 동일한 뉴클레오티드 서열을 보유하였다.
실험예 8.1:서모딕스 (Surmodics) 3D 링크 (등록상표) 아민 결합 슬라이드로의 부착
올리고뉴클레오티드를 pH 8.5에서 3D 링크 (등록상표) 프린트 완충액 (Surmodics, Inc, Eden Prairie, Minnesota) 중에 10 μM 내지 100 nM 범위의 농도로 용해시켰다. 각 용액으로부터, 0.5 ㎕를 슬라이드 표면에 직접 가하고, 암조건하에서 밤새 포화 NaCl 용액으로 밀봉된 챔버내에 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 슬라이드를 50 ℃에서 15분 동안 처리하고, 3D 링크 (등록상표) 차단 완충액으로 미반응된 표면 부위를 차단하였다. 슬라이드를 물로 2회 세척한 다음, 50 ℃에서 0.2 % SDS로 30분간 세척하고, 마지막으로 물로 2회 세척한 다음, 공기 건조하였다. 파마시스 (Pharmacis) 스캐너상에서 20초의 통합 시간 동안 형광 검출을 수행하였다. 영상 및 강도 프로필은 도 25에 나타나 있다.
비특이적 올리고뉴클레오티드는 10 μM에서 10 x 103내지 25 x 103의 상대 유닛에서 신호를 생성하였다. 신호 강도를 단일 아미노기를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 대해 관찰된 것과 비교하였다. 대조적으로, 히드라지드 수식된 올리고뉴클레오티드는 35 내지 40 x 103형광 유닛의 훨씬 더 많은 로딩을 제공하였다. 또한, 히드라지드 수식된 올리고뉴클레오티드는 낮은 농도에서 높은 형광 신호를 나타내었으며, 5 μM의 검출 하한치를 갖는 아민 수식된 올리고머에 비해 1.25 μM의 검출 하한치를 나타내었다.
실험예 8.2:수퍼알데히드 슬라이드로의 부착
올리고뉴클레오티드를 10 μM 내지 100 nM 범위의 농도를 갖는 pH 8.5의 서모딕스 3D 링크 (등록상표) 프린트 완충액, 또는 pH 4.0의 10 mM 암모늄 아세테이트 완충액 중에 용해시켰다. 각 용액으로부터, 0.5 μM를 수퍼알데히드 슬라이드 (Telechem International, Inc, Sunnyvale, CA)의 표면에 가하고, 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 슬라이드를 0.2 % SDS로 2회 처리하고, 물로 4회 (각각 2분 동안) 세척하였다. 이어서, 표면을 PBS 완충액 (pH = 7) 중 0.3 % NaBH3CN의 용액으로 처리하고, 에탄올 133 mL로 버블링을 제거하였다. 0.2 % SDS 및 물로 1분간 세척을 3회 수행하였다. 파마시스 스캐너로 20초의 통합 시간 동안 형광 검출을 수행하였다. 영상 및 강도 프로필을 도 26에 나타내었다.
도 26에서 알 수 있는 바와 같이, pH 8.5 및 4.0 모두에서 히드라지드 올리고뉴클레오티드는 아민 말단의 올리고머에 비해 훨씬 더 높은 신호 강도를 제공하였으며, pH의 변화에 의해 영향받지 않았다. 또한, 동일한 농도라면, 히드라지드 수식된 올리고머는 아민 수식된 올리고머보다 훨씬 더 높은 신호 강도를 제공하였다. 아민 올리고뉴클레오티드는 2.5 μM 미만에서 더 이상 검출되지 않았지만, 히드라지드 올리고머는 1.25 μM처럼 낮게 검출되었다.
상기 내용은 본 발명의 실시태양의 예를 들기 위한 것이며, 어떤 식으로든 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다. 본 발명은 특정 변형에 대하여 기재되었지만, 그의 상세한 내용이 한정되는 것으로 생각되어서는 안되며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남 없이 다양하게 적용, 변화 및 변형시킬 수 있음은 물론이며, 그러한 동등한 실시양태는 본원에 포함되는 것으로 생각된다. 모든 간행물 및 특허 문헌은 각 개별 문헌 또는 특허 출원이 구체적 및 개별적으로 참고로 포함되도록 나타내었다면 동일한 정도로 본원에 포함된다.

Claims (36)

  1. (a) 생분자를 제공하는 단계,
    (b) 상기 생분자를 분지된 연결 잔기와 접촉시켜, 기판의 결합 잔기와 커플링할 수 있는 분지된 연결 구조물을 형성하는 단계, 및
    (c) 상기 연결 구조물을 상기 기판내에 포함된 결합 잔기와 접촉시켜, 상기 생분자가 결합된 커플링된 기판 결합 구조물을 형성하는 단계
    를 포함하는, 생분자를 기판에 연결시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분지된 연결 구조물을 활성화시켜 커플링된 기판 결합 구조물을 형성하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 기판이 중합체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 기판이 활성화된 중합체인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 기판을 전자적으로 주소지정가능한 마이크로칩과 접촉시키는 방법.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 기판이 활성화된 유리 슬라이드인 방법.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 기판이 유리 슬라이드인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 생분자의 연결 구조물이 루이스 염기 또는 친핵체 (nucleophile)를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 생분자의 연결 구조물이 루이스 산 또는 친전자체 (electrophile)를 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 루이스 염기 또는 친핵체가 알콜, 아민, 히드라진, 히드라지드, 살리실릭 히드록삼산 및 술프히드릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 루이스 산 또는 친전자체가 에폭사이드, 아지리딘, 비닐, 알데히드, 케톤, 아세탈, 디술피드, 카르복실산, 아미드, 브로모 또는 요오도아세트아미드, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 술포-N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 아즐락톤, 이소시아네이트, 티오이소시아네이트, 페닐 보론산 및 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 생분자의 결합 잔기가 루이스 산 또는 친전자체를 포함하는것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 결합 잔기가 루이스 염기 또는 친핵체를 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 루이스 산 또는 친전자체가 에폭사이드, 아지리딘, 비닐, 알데히드, 케톤, 아세탈, 디술피드, 카르복실산, 아미드, 브로모 또는 요오도아세트아미드, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 술포-N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 아즐락톤, 이소시아네이트, 티오이소시아네이트, 페닐 보론산, 포스포르아미다이트 및 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 루이스 염기 또는 친핵체가 알콜, 아민, 히드라진, 히드라지드, 살리실릭 히드록삼산 및 술프히드릴로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 분지된 연결 잔기가 포스포르아미다이트인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 포스포르아미다이트가
    디에틸 3-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]글루타레이트,
    디에틸 5-{[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]메틸}이소프탈레이트,
    디메틸 3,3'-(2-{[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]메틸}-2-{[2-(메톡시카르보닐)에톡시]메틸}프로판-1,3-디일비스옥시)디프로피오네이트,
    에틸 6-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]헥사노에이트, 및
    6-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]-N'-트리틸헥사노히드라지드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 분지된 연결 잔기가 기판에 결합하기 위해 활성화되는 분지된 연결 구조물을 형성하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 생분자와 상기 기판이 공유결합을 통해 연결되는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 생분자와 상기 기판이 비공유결합을 통해 연결되는 것인 방법.
  21. (a) 생분자를, 보호된 히드라지드 또는 히드라지드 전구체를 포함하는 포스포르아미다이트에 커플링시키는 단계, 및
    (b) 상기 보호된 히드라지드 또는 히드라지드 전구체를 하나 이상의 시약과 접촉시켜, 보호된 형태 또는 전구체 형태를 히드라지드 잔기로 전환시키는 단계
    를 포함하는, 히드라지드를 생분자에 부착시키는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 포스포르아미다이트가
    디에틸 3-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]글루타레이트,
    디에틸 5-{[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]메틸}이소프탈레이트,
    디메틸 3,3'-(2-{[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]메틸}-2-{[2-(메톡시카르보닐)에톡시]메틸}프로판-1,3-디일비스옥시)디프로피오네이트,
    에틸 6-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]헥사노에이트, 및
    6-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]-N'-트리틸헥사노히드라지드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 디에틸 3-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]글루타레이트,
    디에틸 5-{[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]메틸}이소프탈레이트,
    디메틸 3,3'-(2-{[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]메틸}-2-{[2-(메톡시카르보닐)에톡시]메틸}프로판-1,3-디일비스옥시)디프로피오네이트,
    에틸 6-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]헥사노에이트, 및
    6-[(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스파닐옥시]-N'-트리틸헥사노히드라지드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 포스포르아미다이트를 포함하는 조성물.
  24. 제21항에 있어서, 상기 생분자를 먼저 활성화한 다음, 알데히드, 케톤, 에스테르, 활성화된 에스테르, 아세탈, 할로아세트아미드 및 알킬 할라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 잔기를 포함하는 기판에 부착시키는 방법.
  25. 보호된 히드라지드 또는 히드라지드 전구체와 함께 제24항의 생분자를 먼저 히드라지드로 전환시킨 다음, 2-포르밀페닐보론산, 3-포르밀페닐보론산 및 4-포르밀페닐보론산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약으로 처리하는, 상기 생분자의 활성화 방법.
  26. 제25항에 있어서, 활성화된 생분자가 환원되는 것인 방법.
  27. (a) 올리고뉴클레오티드를 하나 이상의 전구체 형태의 히드라지드 잔기에 커플링시키는 단계, 및
    (b) 상기 전구체 형태를 하나 이상의 시약과 접촉시켜, 전구체를 히드라지드 잔기로 전환시키는 단계
    를 포함하는, 히드라지드 함유 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 전구체 형태의 히드라지드 잔기가 알데히드, 케톤, 에스테르, 카르복실산, 활성화된 에스테르, 아세탈, 할로아세트아미드, 알킬 할라이드 및 트리틸 히드라지드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서,
    (a) 상기 분지된 연결 구조물을 보론산 함유 잔기와 접촉시키는 단계, 및
    (b) 상기 보론산 함유 잔기를 상기 기판에 접촉시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  30. 생분자를, 전자적으로 주소지정가능한 마이크로칩상의 살리실릭 히드록삼산을 포함하는 기판 표면에 결합시키는데 있어서의, 분지 및 비분지된 페닐 보론산함유 분자의 용도.
  31. 전자적으로 주소지정가능한 마이크로칩상의 활성 에스테르를 포함하는 기판 표면에 결합하는 분지 및 비분지된 히드라지드 함유 생분자의 용도.
  32. 제31항에 있어서, 활성 에스테르가 아즐락톤, N-히드록시 숙신이미딜 에스테르 및 술포 N-히드록시 숙신이미딜 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  33. 전자적으로 주소지정가능한 마이크로칩상의 알데히드를 포함하는 기판 표면에 결합하는 분지 및 비분지된 히드라지드 함유 생분자의 용도.
  34. 전자적으로 주소지정가능한 마이크로칩상의 케톤을 포함하는 기판 표면에 결합하는 분지 및 비분지된 히드라지드 함유 생분자의 용도.
  35. 각 생분자가 다수개의 결합 잔기에 의해 그에 결합되어 있고, 이 결합 잔기는 분지된 연결 구조물에 의해 상기 생분자에 커플링되어 있는 것인, 상기 결합된 생분자를 갖는 마이크로어레이 (microarray).
  36. 제35항에 있어서, 상기 어레이 ㎛2당 생분자 103개를 초과하는, 결합된 생분자의 밀도를 갖는 마이크로어레이.
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