JP4744054B2 - シラン化固体支持体上で核酸を合成および固定化するための方法 - Google Patents
シラン化固体支持体上で核酸を合成および固定化するための方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は、１以上のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の、核酸を合成または固定化するための使用、およびまた固体支持体上で核酸を合成または固定化するための方法に関する。
【０００２】
無機表面上で化学合成を行うかまたは分子を固定化するために、第一に、無機支持体への有機分子の結合を提供するカップリング剤を表面上へグラフトすることが必要である。
【０００３】
オルガノシリコンカップリング剤が、この目的のために、L.A. CHRISEYら（Nucleic Acids Research, 1996, 24, 15, 3031-3039）および U. MASKOSら（Nucleic Acids Research, 1992, 20, 7; 1679-1684））によって提案されている。しかし、使用される薬剤、すなわち３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランおよび種々のアミノシランは、それらが表面上にランダムにそして非再現的に（nonreproducibly）堆積するという欠点を有する。それらはその上に厚みが制御され得ない不均一な膜を形成し、この膜はまた引き続いての化学処理に対して余り耐久性がなく、膜の不均一性は、実際に、シロキサン結合の乏しい保護を意味する。従って、これらの分子の再現可能なグラフトを得ることは非常に困難である。支持体上にオリゴヌクレオチドを結合または合成する前に、更なる表面反応が、表面での立体障害を減少させるため（例えば、L.A. CHRISEYらによって記載されるように、二官能性ヘテロ環式分子をグラフトすること）、表面をより親水性にするため（U. MASKOSらは、エチレングリコールまたはペンタ−もしくはヘキサエチレングリコールをグラフトすることを記載する）、および／または表面官能基の乏しい反応性を克服するために必要であり、これらはまたそれら自体で制御されない更なる操作である。
【０００４】
A. ULMANは、Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554において、官能化アルキルトリクロロシランタイプのオルガノシリコン化合物を使用する、固体支持体上での組織化自己集合単層の形成を記載した。生体分子を結合させるためのその使用が提案され、これは、この文脈で、チオール官能基での生体分子の修飾およびヘテロ二官能分子での表面の修飾を恐らく必要とする方法である。
【０００５】
従って、本発明者らは、先行技術の欠点を克服し、そして緻密で（dense）そして組織化された（organized）単層膜で修飾された固体支持体上で、生体分子（特に核酸）を合成しそして固定化するための方法を提供する目標を設定した。
【０００６】
本発明の主題は、核酸を合成または固定化するための、式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の使用であり：
【０００７】
【化２】
【０００８】
ここで：
−ｎは、１５〜３５、好ましくは２０〜２５であり、
−ｍは、０または１に等しく、
−Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、互いに同一または異なり得、直鎖または分枝鎖の、Ｃ1〜Ｃ6の飽和アルキル基または加水分解性基からなる群から選択され、Ｘ1、Ｘ2またはＸ3の少なくとも１つは加水分解性基を示し、
−Ａは、基−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k−（ＣＨ2）i−を示し、ここで、ｋは０〜１００、好ましくは０〜５であり、そしてｉは０に等しいかそれより大きい整数、好ましくは０または１を示し、
−ｍ＝０の場合、Ｂは基−ＯＣＯＲ、−ＯＲまたは−ＣＯＯＲあるいはハロゲン原子を示し、Ｒは水素原子あるいは直鎖または分枝鎖のＣ1〜Ｃ6アルキル基を示し、
−ｍ＝１の場合：
・ｋ＝０およびｉ＝０の場合、Ｂは基Ｒ1を示し、
・ｋ＝０およびｉ≧１の場合、Ｂは基−ＯＲ1、−ＯＣＯＲ1、−ＮＲ1Ｒ2、−ＣＯＯＲ1、−ＣＯＮＲ1Ｒ2または−ＳＲ1あるいはハロゲン原子を示し、
・ｋ≧１およびｉ＝０の場合、Ｂは基−Ｒ1、−ＣＯＲ1、−ＣＯＯＲ1または−ＣＯＮＲ1Ｒ2を示し、
・ｋ≧１およびｉ≧１の場合、Ｂは、基−ＯＲ1、−ＯＣＯＲ1、−ＮＲ1Ｒ2、−ＣＯＯＲ1、−ＣＯＮＲ1Ｒ2または−ＳＲ1あるいはハロゲン原子を示し、
・Ｒ1およびＲ2は、同一または異なり得、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、１〜２４の炭素原子を含む、必要に応じて置換された炭化水素ベース鎖、あるいは芳香族基を示す。
【０００９】
Ｂが、ｉの値とは関係なく、基−ＯＲ1、−ＯＣＯＲ1または−ＣＯＯＲ1を示す場合、そしてｋ≧１の場合、Ｂは、Protective groups in organic synthesis (T.W. GREEN et al., 2nd edition, Wiley Interscience) に記載される保護基（例えば、環式保護基）のような、ヒドロキシルまたはカルボン酸官能基の保護から得られる任意の基を示し得ることが理解される。
【００１０】
本発明の目的のために、そして引き続いての文章において、用語“核酸”は、等しく、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは修飾された塩基の修飾された骨格を有する核酸（例えば、ホスホジエステル結合の変わりにペプチド結合を含むペプチド核酸（ＰＮＡ））でさえ意味するように意図される。
【００１１】
用語“芳香族”は、１以上のアリール環（例えば、フェニル環）を有する任意の基を意味するように意図される。表現“組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）”は、分子が組織化される分子の集合（assembly）を意味するように意図され、この組織化（organization）は、分子の鎖間の相互作用および強力な結合（cohesion）に起因し、安定でそして秩序化された（ordered）異方性膜を生じさせる(A. ULMAN, Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554)。
【００１２】
固体支持体上に形成された組織化自己集合単層は、化学的および構造的のどちらにも十分に規定されたパラメータを有する均一で緻密な（dense）有機表面を生成することを可能にする。ｎ、ｍ、ｋおよびｉの十分に定義された値についての式（Ｉ）の化合物の自己集合の特性に起因して得られる、この単層の形成は、完全に、各オルガノシリコン化合物について再現可能（reproducible）である。さらに、非常に緻密な、組織化された、自己集合単層の形成は、化学的（酸性または塩基性）処理からシロキサン結合を保護し、これは、表面上で種々の化学反応を行うことを可能にする。
【００１３】
本発明において使用される式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物は、有利なことに、基Ａの性質および使用され得る末端基Ｂの多様性の点から、非常に様々な官能性および大きな反応性を有し、これらの基Ｂが、当然ながら、当業者に周知の有機化学反応に従って望まれるように修飾または官能化されることが可能である。
【００１４】
本発明に従う使用は、特に有利には、選択される式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物によって、支持体上に形成された組織化自己集合単層の均一性および安定性の点から、確実に（reliably）そして再現可能に（reproducibly）、支持体上で核酸を合成または固定化することを可能にする。核酸が、オルガノシリコン化合物と固体支持体との間に現れるシロキサン結合の分解（degradation）なしに、強力な共有結合によって修飾化支持体上で合成または固定化される。
【００１５】
好適な固体支持体は、一般的に、水和表面を有するものおよび／またはヒドロキシル基を提示する表面を有するものである。好ましくは、該支持体は、ガラス、セラミックス（例えば、酸化物タイプのもの）、金属（例えば、アルミニウムまたは金）およびメタロイド（例えば、シリコン）からなる群から選択される。
【００１６】
本発明の目的のために、用語“加水分解性”は、水性媒体中で酸と反応して化合物Ｘ1Ｈ、Ｘ2ＨまたはＸ3Ｈを与え得る任意の基を意味すると意図され、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は式（Ｉ）において定義される通りである。
【００１７】
有利な実施形態によれば、該加水分解性基は、ハロゲン原子、基−Ｎ（ＣＨ3）2および基−ＯＲ’［Ｒ’は直鎖または分枝鎖の、Ｃ1〜Ｃ6飽和アルキル基である］からなる群から選択される。
【００１８】
基Ｂおよび加水分解性基に関して、好適なハロゲン原子は、等しく、フッ素および塩素、臭素またはヨウ素である。
【００１９】
別の有利な実施形態によれば、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが０に等しく、ｋが１または３に等しく、そしてＢが基−ＣＯＣＨ3を示す。
【００２０】
別の有利な実施形態によれば、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが１に等しく、ｋが２に等しく、そしてＢが基−ＣＯＯＣＨ3を示す。
【００２１】
別の有利な実施形態によれば、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが１６、２２または２７に等しく、ｍが０に等しく、そしてＢが基−ＯＣＯＣＨ3を示す。
【００２２】
別の有利な実施形態によれば、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２１に等しく、ｍが０に等しく、そしてＢが基−ＣＯＯＣＨ3を示す。
【００２３】
本発明に従う修飾化固体支持体の使用は、特にＤＮＡチップ（即ち、公知の一セットのＤＮＡが非常に正確な順序で共有結合されている支持体）を製造するために有利であり、これらのチップは多数回再使用可能である。このようなＤＮＡチップは、支持体上に固定化されたＤＮＡの標的核酸またはオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、これらの標的分子の配列を決定すること、または遺伝子発現をモニターすることを可能にする。多くの用途がある：新規の遺伝子および新規の医療品（medical products）を発見すること、診断、毒性研究を行うことなど。
【００２４】
本発明の主題はまた、固体支持体上で核酸を合成するための方法であって、該支持体が、上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）で修飾されていること、および以下の工程：
ａ）上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾された固体支持体を製造すること［ここで、該オルガノシリコン化合物は、それらの末端に、保護されたアミンまたはヒドロキシル官能基を有する］；
ｂ）必要に応じて、該アミンまたはヒドロキシル官能基を脱保護すること；
ｃ）局所様式で（in a localized manner）、ヌクレオチドを、工程ａ）または
ｂ）で得られた修飾化固体支持体へ共有結合させること；
ｄ）同一または異なるヌクレオチドで少なくとも１回工程ｃ）を繰り返すこと、を含むことを特徴とする。
【００２５】
工程ａ）は、有利には、以下の工程：
ｉ）前記固体支持体から汚染物質（contaminants）を除去し、そしてその表面を水和および／またはヒドロキシル化すること、
ｊ）上記に定義される一般式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物を、少なくとも１つの無極性炭化水素ベース溶媒を含む少なくとも２つの溶媒の混合物へ、不活性雰囲気下で、導入すること［該化合物は、１末端に、保護されたアミンまたはヒドロキシル官能基を有する］、
ｋ）工程ｉ）で得られた支持体を、工程ｊ）で調製された溶液中での浸漬によってシラン化すること、
ｌ）必要に応じて、自己集合単層を有する工程ｋ）で得られたシラン化支持体を、５０〜１２０℃の温度で、５分間〜一晩、アニールすること（annealing）、ならびに
ｍ）工程ｋ）またはｌ）で得られた修飾化支持体を、溶媒（好ましくは、極性溶媒）でリンスすること、
によって行われる。
【００２６】
用語、固体支持体の“汚染物質（contaminants）”は、支持体の表面に存在し、そして支持体自体の化学構造の一部でない、任意の化合物（例えば、脂質、ダストまたは他のもの）を意味するように意図される。
【００２７】
固体支持体の性質に従って、工程ｉ）は、１以上の溶媒および／または酸化剤および／またはヒドロキシル化剤（例えば、スルホクロニック（sulfochromic）混合物）、洗剤（例えば、Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標））、オゾンを用いた光化学処理（photochemical treatment）または任意の他の好適な処理を使用して行われ得る。
【００２８】
工程ｊ）において、保護されたアミンまたはヒドロキシル官能基の例として、基−ＮＲ’Ｒ”および−ＯＣＯＲ’が言及され得、ここでＲ’およびＲ”は、アルキル鎖を示す。アミンまたはヒドロキシル官能基の保護から生じる任意の他の基がまた、認識され得る。
【００２９】
工程ｊ）は、有利には、少なくとも１つの無極性炭化水素ベース溶媒および少なくとも１つの極性溶媒の混合液中で行われ得る。この場合、無極性溶媒および極性溶媒の容積比は、好ましくは、７０／３０〜９５／５である。
【００３０】
例として、そして非制限様式で、工程ｊ）の間、使用され得る無極性炭化水素ベース溶媒はシクロヘキサンであり、そして使用され得る極性溶媒はクロロホルムである。
【００３１】
工程ｊ）において、溶媒の混合物中のオルガノシリコン化合物の濃度は、好ましくは、１×１０-5〜１×１０-2ｍｏｌ／リットルである。
【００３２】
支持体をシラン化するための工程ｋ）は、使用される溶媒に従って、１分〜３日の時間の間、そして−１０℃〜１２０℃の温度で、行われ得る。
【００３３】
本発明に従って固体支持体上で核酸を合成するための方法の間、工程ｂ）が、当業者に公知の任意の技術によって、例えば水酸化カリウムでの処理によって行われ得る。工程ｃ）およびｄ）は、ホスホルアミダイト（phosphoramidite）化学によって、または例えばA. ELLINGTON and J.D. POLLARD in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New Yorkによって記載される、当業者に公知のヌクレオチドを共有結合的にカップリングするための任意の他のタイプの化学によって、行われ得る。
【００３４】
本発明に従う合成方法の有利な実施形態によれば、前記オルガノシリコン化合物の末端へ、末端アミンまたはヒドロキシル官能基を有するスペーサーアームをグラフトするための工程が、工程ａ）またはｂ）の後および工程ｃ）の前に行われる。
【００３５】
このようなスペーサーアームは、所望の特性に依存して、電荷、長さおよび極性において可変であり得る。例えば、それらは、帯電した鎖（例えば、脱塩基部位を有するホスホルアミダイトなど）、非帯電親水性鎖（例えば、ポリエチレングリコール）、非帯電疎水性鎖（経てば、アルキル鎖）、または水性アンモニア不安定性基（aqueous ammonia-labile group）を含む鎖（例えば、基−ＳＯ2）を含み得る。
【００３６】
修飾化支持体へヌクレオチドを共有結合的にカップリングするための工程ｃ）は、局所様式で（in a localized manner）、即ち支持体上の所定の場所で、行われる。
【００３７】
工程ｃ）の繰り返しは、望まれる回数だけ行われ得；工程ｃ）は、例えば、収率はこのような数を超えて減少することを知って、約１００回行われ得る。
【００３８】
工程ｃ）およびｄ）においてカップリングされたヌクレオチドは、好ましくは、固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成に関する文献に記載されるように、好適に保護されている。工程ｄ）に引き続いて、固体支持体上で合成された核酸は、任意の好適な化学処理、例えば水性アンモニアによって脱保護され得ることが明瞭に理解される。この処置は、水性アンモニア不安定性スペーサーアームがこれらの核酸とシラン化表面との間に導入されていなければ、支持体からの核酸の切断を伴わない。
【００３９】
本発明の主題はまた、固体支持体上で核酸を固定化するための方法であって、前記支持体が、上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾されていること、および以下の工程：
ａ）上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾された固体支持体を製造すること［ここで、該オルガノシリコン化合物は、それらの末端に、保護されたアミンまたはカルボン酸官能基を有する］；
ｂ）必要に応じて、該アミンまたはカルボン酸官能基を脱保護すること；
ｃ）必要に応じて、該修飾化固体支持体が、末端カルボン酸官能基を有する場合、これらの官能基を活性化すること；
ｄ）工程ａ）、ｂ）またはｃ）で得られた修飾化固体支持体を、局所的に適用された（applied locally）、固定化される核酸（単数または複数）の１以上の極性溶媒中の１以上の溶液と接触させること［該核酸は、それらの末端の１つで、該修飾化固体支持体が必要に応じて保護された末端カルボン酸官能基を有する場合にはアミン官能基で、または該修飾化固体支持体が必要に応じて保護された末端アミン官能基を有する場合には活性化カルボン酸官能基で官能化されているスペーサーアームを有する］；ならびに
ｅ）該核酸が固定されている固体支持体を洗浄すること、
を含むことを特徴とする。
【００４０】
工程ａ）は、有利には、工程ｊ）において、オルガノシリコン化合物が、１末端で、保護されたアミンまたはカルボン酸官能基を有するという相違を伴って、固体支持体上で核酸を合成するための方法に関して上記で記載したように行われる。
【００４１】
カルボン酸官能基を活性化するための工程ｃ）は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはカルボジイミドの溶液、あるいは当業者に公知の任意の他の好適な活性化試薬を使用して行われ得る。
【００４２】
工程ｄ）の間、核酸を可溶化するために、後者の良好な溶解性および溶液の蒸発の制御を可能にする任意の溶液が使用され得ることが明らかに理解される；例として、そして非限定的な様式で、アセトニトリル／水混合物が言及され得る。固定化される核酸の各溶液は、微細堆積（microdeposition）の好適な手段を使用して、支持体上の所定の場所に堆積される。
【００４３】
本発明に従う固定化方法の有利な実施形態によれば、前記オルガノシリコン化合物の末端へ、末端アミンまたはカルボン酸官能基を有するスペーサーアームをグラフトするための工程が、工程ａ）またはｂ）の後および工程ｃ）の前に行われる。好適なスペーサーアームは、上記に記載の通りである。
【００４４】
本発明の主題はまた、前記核酸がＤＮＡである、本発明に従う核酸を固定化するための方法を使用して得られることを特徴とする、ＤＮＡチップである。
【００４５】
本発明に従うＤＮＡチップは、安定であり、そして従って多くのハイブリダイゼーションおよび変性サイクルにおいて再使用され得るという利点を有する。
【００４６】
上記のアレンジメントに加えて、本発明はまた、以下の説明から明らかとなるであろう他のアレンジメントを含み、これは、本発明の文脈で使用され得るオルガノシリコン化合物の合成およびこれらのオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で修飾され固体支持体上での核酸の合成または固定化の実施例、ならびにまた添付の図面を参照する。
【００４７】
しかし、これらの実施例は、本発明の主題の単なる例示のために与えられ、それらは決してその限定を構成しないことが、明らかに理解されるべきである。
【００４８】
実施例１：ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の合成
１）不飽和アルコールの合成（図１）
・マグネシウム化合物２の調製
マグネシウム（１．８ｇ；７０ｍｍｏｌ）を、５００ｍｌの三ツ口丸底フラスコへ、不活性雰囲気下で導入する。前もって７０ｍｌの無水ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）に溶解した、不飽和臭素化誘導体１（１６．３ｇ；７０ｍｍｏｌ）を滴下する。数滴のジブロモエタンが、該マグネシウムを活性化するために必要であり得る。反応混合物を、１時間３０分間還流させ、マグネシウム化合物２を得、これを直ちに使用する。
【００４９】
・リチウムアルコキシド４の調製
ブロモアルコール３（１７．７ｇ；７０ｍｍｏｌ；１ｅｑ）を、不活性雰囲気下で、乾燥２５０ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中、７０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解する。溶液を−７８℃へ冷却し、次いでメチルリチウム（５０ｍｌ；８０ｍｍｏｌ；１．１ｅｑ）を滴下する。リチウムアルコキシド４が得られる。
【００５０】
・不飽和アルコール５の調製
マグネシウム化合物２を−７８℃へ冷却し、次いでヨウ化銅（１．１ｇ；３．５ｍｍｏｌ；０．０５ｅｑ）を添加した。溶液を２５分間−７８℃で攪拌し、次いで紫色が得られるまで、周囲温度へ再加熱する。次いで、溶液を、直ちに−７８℃へ冷却し、そしてアルゴン雰囲気下で中空針（hollow needle）を使用してリチウムアルコキシド４を導入する。溶液を１時間−７８℃で、次いで１８時間周囲温度で攪拌する。過剰メチルリチウムを、エタノールの添加し、続いて１０％塩酸水溶液の添加による酸性媒体中での加水分解によって破壊する。有機相をジエチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水、そして最終的に飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で洗浄する。次いで、有機相を中性へ洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、次いで真空下で濃縮する。生成物をアセトンからの再沈殿で精製する。化合物５を白色固体の形態で得る（１９．８ｇ；融点６１．７−６２．８°Ｃ；収率８７％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００５１】
【数１】
【００５２】
２）エチレングリコールの導入（図２）
・不飽和塩素化誘導体６の合成
上記で得られたアルコール５（１５ｇ；４６ｍｍｏｌ；１ｅｑ）およびピリジン（４０．３６ｍｌ；６ｍｍｏｌ；０．１ｅｑ）を、マグネチックスターラーを備えそして垂直還流冷却器を載せた２５０ｍｌの二ツ口丸底フラスコへ導入する。次いで、塩化チオニル（６ｍｌ；７０ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を滴下する。反応媒体を１時間攪拌し、次いでＯＨバンドが完全に消失するまで還流させる（赤外分光法によってモニターされる）。続いて反応媒体を、加水分解し、次いでジエチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、１０％塩酸溶液、水、次いで飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。化合物６を黄色固体の形態で得、次いでシリカクロマトグラフィー（溶出液：石油エーテル／エーテル、７０／３０ ｖ／ｖ）によって精製し；白色固体を得る（１４ｇ；融点３４．１〜３４．９℃；収率７５％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００５３】
【数２】
【００５４】
・不飽和ヨウ素化誘導体７の合成
不飽和塩素化化合物６（１０．６ｇ；３２ｍｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム（２２ｇ；１４０ｍｍｏｌ；４ｅｑ）を、２５０ｍｌ丸底フラスコ中のアセトン（４０ｍｌ）に可溶化させる（solubilized）。次いで、溶液を１８時間還流させる。次いで、反応媒体をジエチルエーテルで抽出し、エーテル相を合わせ、次いで水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。生成物をアセトンからの沈殿操作によって精製する。化合物７を、黄色固体の形態で得る（１１ｇ；融点４１．１〜４２．０℃；収率８１％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００５５】
【数３】
【００５６】
・不飽和アルコール８の合成
２０ｍｌの無水ＴＨＦ中のエチレングリコール（１１．５ｇ；１８０ｍｍｏｌ；１０ｅｑ）および予め粉末にされた水酸化ナトリウム（３．７ｇ；９０ｍｍｏｌ；５ｅｑ）の溶液を、３０分間還流させる。ヨウ素化化合物７（８ｇ；１８ｍｍｏｌ；１ｅｑ）および硫酸水素テトラブチルアンモニウム（０．６２ｇ；１．８ｍｍｏｌ；０．１ｅｑ）を添加する。次いで、反応媒体を７２時間還流する。周囲温度へ戻した後、塩酸水溶液（１０％、５０ｍｌ）を導入する。次いで、反応媒体をジエチルエーテルで３回抽出し；エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液で２回、水、次いで飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性へ洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。得られた固体をジクロロメタンから再沈殿させ、次いでシリカクロマトグラフィーによって精製する（溶出液：ジクロロメタン／酢酸エチル；ｖ／ｖ：３０／７０）。化合物８を、白色固体の形態で得る（１．４ｇ、融点６１．２〜６２．４℃；収率２１％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００５７】
【数４】
【００５８】
・エステル形態で保護された不飽和アルコール９の合成
不飽和アルコール８（０．９ｇ；２．７ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌの二ツ口丸底フラスコ中、ジクロロメタン（１０ｍｌ）およびトリエチルアミン（０．６ｍｌ；５．４ｍｍｏｌ；２ｅｑ）に懸濁させる。反応媒体を０℃へ冷却し、次いで塩化アセチル（０．５ｍｌ；４ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を、シリンジを使用して滴下する。反応媒体を１５分間０℃で、次いで１時間３０分間周囲温度で攪拌する。続いて、それを加水分解し、次いでジエチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水、次いで飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。化合物９を白色固体の形態で得る（０．９ｇ；収率１００％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００５９】
【数５】
【００６０】
３）３つのエチレングリコール単位の導入（図２）
上記で得られた不飽和ヨウ素化誘導体７およびトリエチレングリコールから出発して、不飽和アルコール１０を得、次いでエステル化して生成物１１を得る。これは、上述と同一のプロトコルに従って行われる。
【００６１】
赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによる生成物１０の分析は、以下の通りである。
【００６２】
【数６】
【００６３】
赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによる生成物１１の分析は、以下の通りである。
【００６４】
【数７】
【００６５】
４）不飽和エステルの調製（図３）
上記で得られた不飽和アルコール１０から出発して、対応の酸および対応のエステルを以下のように調製した。
【００６６】
・酸１２の調製
不飽和アルコール１０（３ｇ；６．６ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中の１０ｍｌのアセトンに懸濁させる。８０ｍｌの２Ｍジョーンズ試薬（BOWDEN et al., J. Chem. Soc., 1946, 39）をこの懸濁液に添加する。懸濁液を２時間還流させる。周囲温度へ戻した後、アセトンを蒸発させ、そして固体を濾別し、次いで水で５回および０℃に冷却したアセトンで３回リンスする。次いで、固体をＴＨＦ／アセトン混合物（ｖ／ｖ：９／１）からの再結晶によって精製し、化合物１２を白色固体の形態で得る（２．９ｇ；収率９４％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００６７】
【数８】
【００６８】
・エステル１３の調製
酸１２（２．９ｇ；６．４ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中、０℃、不活性雰囲気下で、無水トルエン（７ｍｌ）に可溶化させる。塩化オキサリル（１．２２ｇ；９．６ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を滴下し、次いで混合物を周囲温度で２時間攪拌する。次いで、過剰の試薬および溶媒を、真空下で蒸発させる。塩化アシルをアルゴン下で一時的に保存する。予め塩化カルシウム上で蒸留させたメタノール（６ｍｌ；１２８ｍｍｏｌ；２０ｅｑ）を、徐々に添加する。次いで、反応媒体を１８時間還流し、その後周囲温度へ戻し、次いで過剰メタノールを蒸発させる。次いで、反応媒体を３回ジエチルエーテルで抽出する。エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水、および飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。化合物１３を白色固体の形態で得、次いでシリカクロマトグラフィー（溶出液：石油エーテル／エーテル、容積で５０／５０）によって精製する。３００ｍｇの白色固体を得る（収率１０％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００６９】
【数９】
【００７０】
単一エチレングリコール単位を含むアルコール８を使用することによって、対応の酸およびエステルがまた、アルコール１０から出発してここで記載したのと同一のプロトコルに従って得られ得る。
【００７１】
５）不飽和前駆体のシリル化（図４）
エステル９（１５０ｍｇ；０．３３ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下、乾燥Ｓｃｈｌｅｎｋチューブへ導入する。新たに蒸留したトリクロロシラン（０．３ｍｌ；２．２ｍｍｏｌ；６ｅｑ）、無水トルエン（０．３ｍｌ）およびＡＢＣＲによって販売される（リファレンス６８４７８−９２−２）Ｋａｒｓｔｅｄ触媒（ＰＣＯ ７２）の１滴を添加する。次いで、反応媒体を２時間４０℃にする。周囲温度へ戻した後、トルエンおよび過剰なトリクロロシランを、ベーンポンブ（vane pump）（圧力は０．５ｍｍＨｇである）を使用して、減圧下で、蒸発させる。化合物１４を白色固体の形態で得、そしてアルゴン下で保存する（収率９９％）。それは、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが０に等しく、ｋが１に等しく、そしてＢが基−ＣＯＣＨ3を示す、上記に定義される式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物である。
【００７２】
プロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによる化合物１４の分析は、以下の通りである。
【００７３】
【数１０】
【００７４】
化合物１１から出発することによってそして同一のプロトコルを使用することによって、対応のオルガノシリコン化合物１５が得られる。それは、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが０に等しく、ｋが３に等しく、そしてＢが基−ＣＯＣＨ3を示す、式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物である。プロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００７５】
【数１１】
【００７６】
上記で得られた化合物１３から出発することによってそして同一のプロトコルを使用することによって、対応のオルガノシリコン化合物１６が得られる。それは、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが１に等しく、ｋが２に等しく、そしてＢが基−ＣＯＯＣＨ3を示す、式（Ｉ）の化合物である。プロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００７７】
【数１２】
【００７８】
表Ｉは、本実施例において得られた式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の構造を概括する。
【００７９】
【表１】
【００８０】
実施例２：ｍ＝０である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の合成
１）不飽和前駆体の合成（図５）
１−１：基−ＯＣＯＣＨ3を有する不飽和前駆体
・化合物１７
実施例１で得られた不飽和アルコール５（０．９ｇ；２．７ｍｍｏｌ）を、１００−ｍｌの２ツ口丸底フラスコ中、ジクロロメタン（１０ｍｌ）およびトリエチルアミン（０．６ｍｌ；５．４ｍｍｏｌ；２ｅｑ）に懸濁させる。反応媒体を、０℃へ冷却し、次いで塩化アセチル（０．５ｍｌ；４ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）をシリンジを使用して滴下する。反応媒体を、１５分間０℃で、次いで１時間３０分間周囲温度で、攪拌する。続いて、反応媒体を、加水分解させ、次いで３回ジエチルエーテルで抽出する。エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水、および次いで飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。化合物１７を、白色固体形態で得る（０．９ｇ；収率１００％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによる分析は、以下の通りである。
【００８１】
【数１３】
【００８２】
・化合物１８
化合物１７の製造と同一のプロトコルを使用することによって、しかし１６炭素原子を有する不飽和アルコールから出発して、化合物１８を得、赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるこの分析は、以下の通りである。
【００８３】
【数１４】
【００８４】
・化合物１９
化合物１７の製造と同一のプロトコルを使用することによって、しかし２７炭素原子を有する不飽和アルコールから出発して、化合物１９を得、赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるこの分析は、以下の通りである。
【００８５】
【数１５】
【００８６】
１−２：臭素化不飽和前駆体
式ＣＨ2＝ＣＨ−（ＣＨ2）xＢｒ［ｘは、３〜２３である］の不飽和臭素化誘導体から出発して、実施例１に記載の化合物２の製造のためのプロトコルに従って、式ＣＨ2＝ＣＨ−（ＣＨ2）xＭｇＢｒのオルガノマグネシウム化合物を得る。化合物５の生成のための実施例１に従うブロモアルコールとのカップリングについてのものと同一の条件下での、二臭素化誘導体Ｂｒ（ＣＨ2）yＢｒ（ｘ＋ｙは、最小１３そして最大３３に等しい）とのそのカップリングは、式２０、２１および２２の不飽和臭素化誘導体を生成する。
【００８７】
化合物２０は、ｘが９に等しい不飽和臭素化誘導体およびｙが１０に等しい二臭素化誘導体を使用して得られる。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００８８】
【数１６】
【００８９】
化合物２１は、ｘが１４である不飽和臭素化誘導体およびｙが１０に等しい二臭素化誘導体を使用して得られる。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００９０】
【数１７】
【００９１】
化合物２２は、ｘが９である不飽和臭素化誘導体およびｙが５に等しい二臭素化誘導体を使用して得られる。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００９２】
【数１８】
【００９３】
１−３：カルボン酸基−ＣＯＯＨを有する不飽和前駆体
実施例１で得られる不飽和アルコール５（１３ｇ；４０ｍｍｏｌ）を、２５０−ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中、４０ｍｌのアセトンに懸濁させる。８０ｍｌのジョーンズ試薬（２Ｍ）を、この懸濁液に添加する。この懸濁液を、２時間還流させる。周囲温度に戻した後、アセトンを蒸発させ、固体を濾過し、次いで水で５回、そして０℃に冷却したアセトンで３回リンスする。次いで、固体をＴＨＦ／アセトン混合物（ｖ／ｖ：９／１）からの再結晶によって精製し、化合物２３を白色固体形態で得る（９．９ｇ；融点７３−７４°Ｃ；収率９４％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００９４】
【数１９】
【００９５】
１−４：メチルエステル基−ＣＯＯＣＨ3を有する不飽和前駆体
上記で得られた酸２３（４ｇ；１１．８ｍｍｏｌ）を、１００−ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中、０℃、不活性雰囲気下で、無水トルエン（２０ｍｌ）に可溶化させる。塩化オキサリル（２ｇ；１７．６ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を滴下して導入し、次いで混合物を周囲温度で２時間攪拌する。次いで、過剰な試薬および溶媒を真空下で蒸発させる。塩化アシルをアルゴン下で一時的に保存する。予め塩化カルシウム上で蒸留された、メタノール（１０ｍｌ；２３６ｍｍｏｌ；２０ｅｑ）を徐々に添加する。次いで、反応媒体を、１８時間還流させる。反応混合物が周囲温度に戻った後、過剰のメタノールを蒸発させる。次いで、反応媒体を、ジエチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、１０％塩酸溶液、水、および飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性へ洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、真空下で濃縮する。化合物２４を白色固体の形態で得る（４ｇ；融点５０−５１．５°Ｃ；収率１００％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによる分析は、以下の通りである。
【００９６】
【数２０】
【００９７】
２）不飽和前駆体のシリル化
実施例１に示されるものと同一のプロトコルを行う。不飽和前駆体１７、１８および１９から出発して得られたオルガノシリコン化合物のプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲスペクトルは、以下の通りである。
【００９８】
【数２１】
【００９９】
以下の表IIは、本実施例において得られた式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の構造を概括する。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
実施例３：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物を使用しての固体支持体のシラン化、および組織化自己集合単層の製造
１）固体支持体のシラン化
表面酸化シリコンディスク（surcace-oxidized silicon disk）を、支持体として使用する。ディスクを、その表面から汚染物質（contaminants）を除去しそしてそれを水和させるために、以下の手順にした従って清浄にする：
−新たに調製したクロム（ＶＩ）／硫酸混合物（２．５ｇのＫ2Ｃｒ2Ｏ4；２．５ｍｌの蒸留水；５０ｍｌの硫酸）中で１０分間の浸漬、
−ダストフィルターを備えた層流フード（laminar flow hood）下で、ディスクを脱イオン水に浸漬し、そして２０分間超音波へ供する。このプロセスを、それぞれ５および２分間の超音波処理（sonication）の持続を２回繰り返す、
−ダストフィルターを備えた層流フード下で、ディスクを、不活性でそしてフィルターされた（filtered）雰囲気下で、乾燥させるためにシラン化リアクターへ導入する。リアクターを、１００℃のオイルバス中に４５分間浸漬し、次いでオイルバスから取り出し、そしてその温度を１８℃へ戻す。
【０１０２】
不活性雰囲気下で、所望の量で新たに調製した、実施例１で得られるオルガノシリコン化合物１４を、Ｃ6Ｈ12／ＣＣｌ4／ＣＨＣｌ3（ｖ／ｖ／ｖ：８０／１２／８）混合物のフラクションに溶解する。続いて、溶液中のオルガノシリコン化合物１４を、シリンジで回収し、次いで、溶媒混合物の残余を含むＳｃｈｌｅｎｃｋチューブへ導入し、この全容積は、好適な希釈（１×１０-5〜１×１０-2ｍｏｌ／リットル）のシラン化溶液を作製するように算出されている。溶媒を、それ自体が公知の手順に従って予め乾燥させた。
【０１０３】
シラン化溶液をシリンジでリアクターへ導入し、そしてシリコンディスクを、この溶液中に１６時間浸漬させたままにする。シラン化されたディスクをリアクターから回収し、次いで、クロロホルム（ＨＰＬＣグレード）で洗浄した後、必要に応じて５０〜１２０℃の温度でアニールする。次いで、それを、そして超音波で２分間清浄にし、このプロセスを２回繰り返す。
【０１０４】
２）修飾化表面のキャラクタライゼーション
表面が化合物１４で修飾されている、固体支持体が、上記で得られた。オルガノシリコン化合物のグラフト化を、共焦点ラマン分析法および赤外分光法を使用することによってモニターする。
【０１０５】
３）表面ヒドロキシルの放出
必要であれば、表面ヒドロキシルを、以下のプロトコルを使用して放出させ得る：シラン化ディスクを、水／エタノール（ｖ／ｖ：１／１）混合物中のＫＯＨ（０．５Ｍ）の溶液に２０分間浸漬させる。次いで、ディスクを超音波で５分間脱塩水中で清浄にする。このプロセスを水中で１回、次いでクロロホルム中で２回繰り返す。
【０１０６】
４）ヒドロキシルの放出後の表面のキャラクタライゼーション
図６は、上記で説明されたシラン化プロトコルに従って、そして表面エステルの鹸化後、支持体へ化合物１４をグラフト化する３つの実験後に得られる赤外スペクトルを示す。透過率（transmission）はｙ軸上に現れ、そして周波数（frequency）（ｃｍ-1）はｘ軸上に現れる。３つのスペクトルは、２９１７および２８５０ｃｍ-1で組織化系（organized system）の特徴的なピークで、重ね合わせられていることに注意する。従って、それから、支持体上へのオルガノシリコン化合物のグラフトは、再現性があり、そして組織化自己集合単層の形成を生じさせることが結論され得る。
【０１０７】
図７は、上記で得られた修飾化表面のラマン分光分析研究を示す。図７ａは、グラフト化支持体の表面の密度を表し、表面の寸法は、ｘ軸およびｙ軸上に現れ（図における７ｍｍは、支持体における１μｍに対応する）、そして密度のスケールは、１３０〜１６５（任意の単位）に目盛りをつけられる（graduated）。この図は、表面の均一性を実証する。図７ｂおよび図７ｃは、支持体の表面の２つの異なるポイントで測定されたラマンスペクトルを示す；ｙ軸は１秒当たりのカウントを示し、そして周波数はｘ軸に現れる。
【０１０８】
従って、赤外およびラマンスペクトルは、明白に、組織化自己集合単層の特徴である、支持体に堆積された膜の均一性および表面上の分子の組織化を示す。赤外スペクトルはまた、膜のグラフト化が完全に再現性であることを示す。
【０１０９】
実施例４：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物を使用しての固体支持体上におけるシラン化の他の例
ガラス顕微鏡スライド（glass microscope slide）を、支持体として使用する。ガラススライドを、２％水性Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標）溶液（Ｐｏｌｙｌａｂｏによってリファレンス１２２４０で販売）中、２時間、２０℃での浸漬、次いで多量の脱イオン水でのリンスによって、清浄にする。ダストフィルターを備えた層流フード下で、ガラススライドを、不活性でそしてフィルターされた（filtered）雰囲気下で、乾燥させるためにグラフト化リアクターへ導入する。リアクターを、１００℃のオイルバス中に４５分間浸漬し、次いで、オイルバスから取り出し、そしてその温度を１８℃へ戻す。
【０１１０】
前記実施例に示されるようにオルガノシリコン化合物１４を使用して調製されたシラン化溶液を、シリンジで、リアクターへ導入し、そしてガラススライドをこの溶液に１６時間浸漬させたままにする。シラン化支持体を、実施例３に記載されるようにリンスする。
【０１１１】
赤外およびラマン分光分析による表面のキャラクタライゼーションは、ここでまた、支持体上における組織化自己集合単層の生成を実証し、同一の結果がまた、化合物１４以外の式（Ｉ）のオルガノシリコン剤で得られる。
【０１１２】
実施例５：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で修飾された固体支持体上での核酸の直接合成
１）組織化自己集合単層で修飾された固体支持体の製造
使用される固体支持体は、実施例３に記載されるプロトコルに従って、オルガノシリコン化合物１４を含む組織化自己集合単層がその上に形成された、酸化シリコン（oxidized silicon）支持体Ｓｉ／ＳｉＯ2である。式（Ｉ）の任意の他のオルガノシリコン化合物も、式（Ｉ）の少なくとも一つのオルガノシリコン化合物を含むオルガノシリコン化合物の任意の混合物として使用され得る。
【０１１３】
支持体上へグラフトされたオルガノシリコン化合物の末端を、実施例３に記載されるように、ＫＯＨの溶液中での支持体の浸漬によってヒドロキシル基へ変換させる。このようにして、表面ヒドロキシル官能基を含む支持体を得る。支持体を、アセトニトリルで清浄にし、そして超音波に１分間供し、その後、合成チャンバに配置する。
【０１１４】
２）この支持体上での核酸の合成
ホスホルアミダイト化学を、当業者に周知の他のタイプの化学（例えば、Ｈ−ホスホネート化学）が使用され得る認識のもとに、ここで使用する。従って、ヌクレオチドを、β−シアノエチルホスホルアミダイトの形態で使用し、種々の窒素含有塩基のアミンは、例えばそして非限定様式で、ベンゾイル、イソブチリルまたはｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチック基で保護されている。ヌクレオチドは、５’位でジメトキシトリチル基で保護されており；しかし、ＵＶイルミネーションによって除去され得る光不安定性（photolabile）基もまた使用され得る（例えば、Peaseらによって、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026で記載されるＭｅＮＰＯＣ）。
【０１１５】
核酸合成は、使用されるホスホルアミダイト化学で、３’→５’方向に行われる。ヌクレオチドをグラフトするための種々の工程は、以下の通りであり、これらの工程の全ては以下のサイクルを構成する：
１．脱トリチル化（detritylation）（２５秒）：ジクロロメタン中３％トリクロロ酢酸；
２．洗浄：無水アセトニトリル；
３．カップリング（１分）：０．１Ｍアミダイトおよび０．４５Ｍのアクチベータ（テトラゾール）の混合液の導入；
４．キャッピング（capping）（１５秒）：（ｉ）無水酢酸／２，６−ルチジン／アセトニトリル（１０ｍｌ／１０ｍｌ／８０ｍｌ）および（ｉｉ）ジメチルホルムアミド中１０％の１−メチルイミダゾール（１０ｍｌ／９０ｍｌ）の混合液の導入；
５．酸化（１５秒）：ヨウ素／ピリジン／テトラヒドロフラン／水（０．５０８ｍｇ／１．６ｍｌ／１５．２ｍｌ／３．２ｍｌ）混合物の導入；
６．キャッピング（１５秒）。
【０１１６】
上記に与えられるサイクルにおいて、脱トリチル化、洗浄、カップリング、キャッピングおよび酸化溶液は、限定的様式で与えられていないことが、明らかに理解される。
【０１１７】
望まれるのと同じくらい多くのサイクルが、生成されるように意図される核酸の長さに依存して、行われ得る。一旦サイクルの最終番号に到達すると、窒素含有塩基は脱保護されて、核酸は周囲温度で一晩３０〜３３％の水性アンモニアでの処理によって脱保護され、その結果、骨格および窒素含有塩基に分布される保護基が切断される。必要に応じて、水性アンモニア不安定性スペーサーアームが、シラン化表面と核酸の一部との間に導入されている場合、核酸のこのフラクションが、支持体から切断されるだろう。
【０１１８】
使用される保護基の性質に依存して、例えば炭酸カリウムを使用する、他の脱保護処理を使用することが可能であり得る。
【０１１９】
支持体を、水、次いでＴＲＩＳ緩衝液（１０ｍＭ ＴＲＩＳ塩基溶液を添加することによってｐＨ７．１へ調整された１０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌの溶液、最終溶液は５０ｍＭのＮａＣｌ濃度を有する）で洗浄し、その後、それをハイブリダイゼーションのために使用し得る。
【０１２０】
実施例６：本発明に従う方法に続いて固体支持体上に直接合成されたオリゴヌクレオチドで行われるハイブリダイゼーション実験
実施例５に記載の組織化自己集合単層で修飾された固体支持体（オルガノシリコン化合物１４の単層が形成されている、酸化シリコン（oxidized silicon）Ｓｉ／ＳｉＯ2、表面官能基はヒドロキシル基に変換されている）を使用する。１０ヌクレオチドＴのスペーサーアームを、オリゴヌクレオチド合成の前に、この修飾化支持体上へグラフトする。
【０１２１】
Ｌ１８５およびＵ２２６と名付けられたオリゴヌクレオチド（２５ヌクレオチドの配列）を、図８ａに例示されるように、この支持体の４点で合成する。図８ｂおよび８ｃは、図８ｂについて０〜１０のスケール（図８ｄ、８ｆおよび８ｈについてのスケールとして役立つ）において、そして図８ｃについて０〜１．５のスケール（８ｅ、８ｇおよび８ｉについてのスケールとして役立つ）において、支持体上に描かれた蛍光強度を示す。
【０１２２】
図８ｄは、蛍光ラベルを含むＬ１８５に相補的なオリゴヌクレオチドの溶液と支持体とを接触させた後、支持体を洗浄した後に、検出された蛍光強度を示す。ハイブリダイゼーションを、５０ｍＭのＮａＣｌを含むＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．１）の存在下、一晩、４６℃で行う。ＴＲＩＳ中のオリゴヌクレオチドＬ１８５の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌである。Ｌ１８５に相補的な各ストランド（strand）は、５’末端に蛍光基Ｃｙ３を有する。配列Ｌ１８５との相補配列のハイブリダイゼーションが、明らかに観察される。図８ｅは、変性後の支持体に対応する：相補配列は、もはや検出されない。
【０１２３】
図８ｆは、Ｌ１８５ストランドに関して上記で示されたのと同一の条件下で、蛍光ラベルを含むＵ２２６に相補的なオリゴヌクレオチドの溶液と支持体とを接触させた後に支持体を洗浄後、検出された蛍光強度を示す。ここでまた、配列Ｕ２２６との相補配列のハイブリダイゼーションが、観察される。図８ｇは、変性後の支持体に対応する：相補配列は、もはや検出されない。
【０１２４】
図８ｈは、蛍光ラベルを含むＬ１８５に相補的なオリゴヌクレオチドの溶液と支持体とをもう一度接触させた後、支持体を洗浄した後に検出された蛍光強度を示す。配列Ｌ１８５との相補配列のハイブリダイゼーションがまた生じる。図８ｉは、変性後の相補配列の非存在を示す。
【０１２５】
これらの実験は、式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で修飾された固体支持体上に直接合成された核酸は［この合成は、本発明の方法に従って行われる］、相補配列との選択的なハイブリダイゼーション反応を生じ得、支持体は、ハイブリダイゼーションおよび変性の数回の連続サイクルにおいて、再使用可能であることを示す。
【０１２６】
実施例７：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で修飾された固体支持体上でのプレ合成された核酸の固定化
１）組織化自己集合単層で修飾された固体支持体の製造
組織化自己集合単層が実施例１に示されるプロトコルに従って調製された式１６のオルガノシリコン化合物を含むという相違を伴って、実施例５のように、手順を行った。式（Ｉ）の任意の他のオルガノシリコン化合物（または、式（Ｉ）の少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含むオルガノシリコン化合物の混合物）が使用され得ることが、明らかに理解され、該式（Ｉ）の化合物は、保護されたカルボン酸官能基を有する。オルガノシリコン化合物の末端は、エステルの加水分解によって（例えば、トリヨードメチルシランまたは濃塩酸の作用下で）、カルボン酸基へ変換される。
【０１２７】
２）この支持体上での核酸の固定化
支持体のカルボン酸官能基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液で活性化する。このように活性化された支持体を、固定化される核酸の溶液と接触させ（トリエチルアミンの存在下、容積で９／１のアセトニトリル／水混合物中１μｇ／μｌ）、この核酸は、アミン官能基で官能化されたスペーサーアームを有する。反応を、周囲温度で、必要に応じて溶液の乾燥まで行う。次いで、支持体をＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．１）で洗浄する。この操作は、アミンとの反応によって反応していない酸官能基をブロックすることを可能にする（キャッピング（capping）反応）。
【０１２８】
上記から明らかなように、本発明は、決して、今より明確に記載された、実行、調製および適用に限定されず；逆に、それは、本発明の文脈および範囲から逸脱することなく、当業者に思いつかれ得る全てのその改変を含む。
【０１２９】
特に、核酸を合成および固定化するための方法のみが記載されたが、本発明に従う方法がまた他の生体分子（特にタンパク質）に適用され得ることが明らかに理解される；この場合、本発明に従う合成方法は、これらの生体分子の基本単位（basic units）を支持体上へグラフトするための連続工程を含み得、それにも関わらず、行われる工程は、核酸に関してより詳細に記載したものと同一である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１、２および３は、ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽和前駆体の合成を例示する。
【図２】 図１、２および３は、ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽和前駆体の合成を例示する。
【図３】 図１、２および３は、ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽和前駆体の合成を例示する。
【図４】 図４は、これらの不飽和前駆体のシリル化を例示する。
【図５】 図５は、ｍ＝０である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽和前駆体を示す。
【図６】 図６は、Ａｕ／Ｓｉ／ＳｉＯ2支持体のシリカ表面上へオルガノシリコン化合物１４をグラフトすることからなる３つの実験後に作製された赤外スペクトルを示す。
【図７】 図７ａは、オルガノシリコン化合物１４がグラフトされているＡｕ／Ｓｉ／ＳｉＯ2支持体の表面のラマン分光分析によって分析された密度を示す；図７ｂおよび７ｃは、この表面の２つの異なるポイントで測定されたラマンスペクトルを示す。
【図８】 図８は、オリゴヌクレオチドＬ１８５およびＵ２２６が合成されている（図８ａ）、式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の単層で修飾されたＡｕ／Ｓｉ／ＳｉＯ2支持体を使用しての、ハイブリダイゼーション（図８ｄ、８ｆおよび８ｈ）および変性（図８ｅ、８ｇおよび８ｉ）からなる連続実験を示す。
本発明は、１以上のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の、核酸を合成または固定化するための使用、およびまた固体支持体上で核酸を合成または固定化するための方法に関する。
【０００２】
無機表面上で化学合成を行うかまたは分子を固定化するために、第一に、無機支持体への有機分子の結合を提供するカップリング剤を表面上へグラフトすることが必要である。
【０００３】
オルガノシリコンカップリング剤が、この目的のために、L.A. CHRISEYら（Nucleic Acids Research, 1996, 24, 15, 3031-3039）および U. MASKOSら（Nucleic Acids Research, 1992, 20, 7; 1679-1684））によって提案されている。しかし、使用される薬剤、すなわち３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランおよび種々のアミノシランは、それらが表面上にランダムにそして非再現的に（nonreproducibly）堆積するという欠点を有する。それらはその上に厚みが制御され得ない不均一な膜を形成し、この膜はまた引き続いての化学処理に対して余り耐久性がなく、膜の不均一性は、実際に、シロキサン結合の乏しい保護を意味する。従って、これらの分子の再現可能なグラフトを得ることは非常に困難である。支持体上にオリゴヌクレオチドを結合または合成する前に、更なる表面反応が、表面での立体障害を減少させるため（例えば、L.A. CHRISEYらによって記載されるように、二官能性ヘテロ環式分子をグラフトすること）、表面をより親水性にするため（U. MASKOSらは、エチレングリコールまたはペンタ−もしくはヘキサエチレングリコールをグラフトすることを記載する）、および／または表面官能基の乏しい反応性を克服するために必要であり、これらはまたそれら自体で制御されない更なる操作である。
【０００４】
A. ULMANは、Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554において、官能化アルキルトリクロロシランタイプのオルガノシリコン化合物を使用する、固体支持体上での組織化自己集合単層の形成を記載した。生体分子を結合させるためのその使用が提案され、これは、この文脈で、チオール官能基での生体分子の修飾およびヘテロ二官能分子での表面の修飾を恐らく必要とする方法である。
【０００５】
従って、本発明者らは、先行技術の欠点を克服し、そして緻密で（dense）そして組織化された（organized）単層膜で修飾された固体支持体上で、生体分子（特に核酸）を合成しそして固定化するための方法を提供する目標を設定した。
【０００６】
本発明の主題は、核酸を合成または固定化するための、式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の使用であり：
【０００７】
【化２】
ここで：
−ｎは、１５〜３５、好ましくは２０〜２５であり、
−ｍは、０または１に等しく、
−Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、互いに同一または異なり得、直鎖または分枝鎖の、Ｃ1〜Ｃ6の飽和アルキル基または加水分解性基からなる群から選択され、Ｘ1、Ｘ2またはＸ3の少なくとも１つは加水分解性基を示し、
−Ａは、基−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k−（ＣＨ2）i−を示し、ここで、ｋは０〜１００、好ましくは０〜５であり、そしてｉは０に等しいかそれより大きい整数、好ましくは０または１を示し、
−ｍ＝０の場合、Ｂは基−ＯＣＯＲ、−ＯＲまたは−ＣＯＯＲあるいはハロゲン原子を示し、Ｒは水素原子あるいは直鎖または分枝鎖のＣ1〜Ｃ6アルキル基を示し、
−ｍ＝１の場合：
・ｋ＝０およびｉ＝０の場合、Ｂは基Ｒ1を示し、
・ｋ＝０およびｉ≧１の場合、Ｂは基−ＯＲ1、−ＯＣＯＲ1、−ＮＲ1Ｒ2、−ＣＯＯＲ1、−ＣＯＮＲ1Ｒ2または−ＳＲ1あるいはハロゲン原子を示し、
・ｋ≧１およびｉ＝０の場合、Ｂは基−Ｒ1、−ＣＯＲ1、−ＣＯＯＲ1または−ＣＯＮＲ1Ｒ2を示し、
・ｋ≧１およびｉ≧１の場合、Ｂは、基−ＯＲ1、−ＯＣＯＲ1、−ＮＲ1Ｒ2、−ＣＯＯＲ1、−ＣＯＮＲ1Ｒ2または−ＳＲ1あるいはハロゲン原子を示し、
・Ｒ1およびＲ2は、同一または異なり得、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽和または不飽和の、１〜２４の炭素原子を含む、必要に応じて置換された炭化水素ベース鎖、あるいは芳香族基を示す。
【０００９】
Ｂが、ｉの値とは関係なく、基−ＯＲ1、−ＯＣＯＲ1または−ＣＯＯＲ1を示す場合、そしてｋ≧１の場合、Ｂは、Protective groups in organic synthesis (T.W. GREEN et al., 2nd edition, Wiley Interscience) に記載される保護基（例えば、環式保護基）のような、ヒドロキシルまたはカルボン酸官能基の保護から得られる任意の基を示し得ることが理解される。
【００１０】
本発明の目的のために、そして引き続いての文章において、用語“核酸”は、等しく、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは修飾された塩基の修飾された骨格を有する核酸（例えば、ホスホジエステル結合の変わりにペプチド結合を含むペプチド核酸（ＰＮＡ））でさえ意味するように意図される。
【００１１】
用語“芳香族”は、１以上のアリール環（例えば、フェニル環）を有する任意の基を意味するように意図される。表現“組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）”は、分子が組織化される分子の集合（assembly）を意味するように意図され、この組織化（organization）は、分子の鎖間の相互作用および強力な結合（cohesion）に起因し、安定でそして秩序化された（ordered）異方性膜を生じさせる(A. ULMAN, Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554)。
【００１２】
固体支持体上に形成された組織化自己集合単層は、化学的および構造的のどちらにも十分に規定されたパラメータを有する均一で緻密な（dense）有機表面を生成することを可能にする。ｎ、ｍ、ｋおよびｉの十分に定義された値についての式（Ｉ）の化合物の自己集合の特性に起因して得られる、この単層の形成は、完全に、各オルガノシリコン化合物について再現可能（reproducible）である。さらに、非常に緻密な、組織化された、自己集合単層の形成は、化学的（酸性または塩基性）処理からシロキサン結合を保護し、これは、表面上で種々の化学反応を行うことを可能にする。
【００１３】
本発明において使用される式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物は、有利なことに、基Ａの性質および使用され得る末端基Ｂの多様性の点から、非常に様々な官能性および大きな反応性を有し、これらの基Ｂが、当然ながら、当業者に周知の有機化学反応に従って望まれるように修飾または官能化されることが可能である。
【００１４】
本発明に従う使用は、特に有利には、選択される式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物によって、支持体上に形成された組織化自己集合単層の均一性および安定性の点から、確実に（reliably）そして再現可能に（reproducibly）、支持体上で核酸を合成または固定化することを可能にする。核酸が、オルガノシリコン化合物と固体支持体との間に現れるシロキサン結合の分解（degradation）なしに、強力な共有結合によって修飾化支持体上で合成または固定化される。
【００１５】
好適な固体支持体は、一般的に、水和表面を有するものおよび／またはヒドロキシル基を提示する表面を有するものである。好ましくは、該支持体は、ガラス、セラミックス（例えば、酸化物タイプのもの）、金属（例えば、アルミニウムまたは金）およびメタロイド（例えば、シリコン）からなる群から選択される。
【００１６】
本発明の目的のために、用語“加水分解性”は、水性媒体中で酸と反応して化合物Ｘ1Ｈ、Ｘ2ＨまたはＸ3Ｈを与え得る任意の基を意味すると意図され、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は式（Ｉ）において定義される通りである。
【００１７】
有利な実施形態によれば、該加水分解性基は、ハロゲン原子、基−Ｎ（ＣＨ3）2および基−ＯＲ’［Ｒ’は直鎖または分枝鎖の、Ｃ1〜Ｃ6飽和アルキル基である］からなる群から選択される。
【００１８】
基Ｂおよび加水分解性基に関して、好適なハロゲン原子は、等しく、フッ素および塩素、臭素またはヨウ素である。
【００１９】
別の有利な実施形態によれば、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが０に等しく、ｋが１または３に等しく、そしてＢが基−ＣＯＣＨ3を示す。
【００２０】
別の有利な実施形態によれば、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが１に等しく、ｋが２に等しく、そしてＢが基−ＣＯＯＣＨ3を示す。
【００２１】
別の有利な実施形態によれば、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが１６、２２または２７に等しく、ｍが０に等しく、そしてＢが基−ＯＣＯＣＨ3を示す。
【００２２】
別の有利な実施形態によれば、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２１に等しく、ｍが０に等しく、そしてＢが基−ＣＯＯＣＨ3を示す。
【００２３】
本発明に従う修飾化固体支持体の使用は、特にＤＮＡチップ（即ち、公知の一セットのＤＮＡが非常に正確な順序で共有結合されている支持体）を製造するために有利であり、これらのチップは多数回再使用可能である。このようなＤＮＡチップは、支持体上に固定化されたＤＮＡの標的核酸またはオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、これらの標的分子の配列を決定すること、または遺伝子発現をモニターすることを可能にする。多くの用途がある：新規の遺伝子および新規の医療品（medical products）を発見すること、診断、毒性研究を行うことなど。
【００２４】
本発明の主題はまた、固体支持体上で核酸を合成するための方法であって、該支持体が、上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）で修飾されていること、および以下の工程：
ａ）上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾された固体支持体を製造すること［ここで、該オルガノシリコン化合物は、それらの末端に、保護されたアミンまたはヒドロキシル官能基を有する］；
ｂ）必要に応じて、該アミンまたはヒドロキシル官能基を脱保護すること；
ｃ）局所様式で（in a localized manner）、ヌクレオチドを、工程ａ）または
ｂ）で得られた修飾化固体支持体へ共有結合させること；
ｄ）同一または異なるヌクレオチドで少なくとも１回工程ｃ）を繰り返すこと、を含むことを特徴とする。
【００２５】
工程ａ）は、有利には、以下の工程：
ｉ）前記固体支持体から汚染物質（contaminants）を除去し、そしてその表面を水和および／またはヒドロキシル化すること、
ｊ）上記に定義される一般式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物を、少なくとも１つの無極性炭化水素ベース溶媒を含む少なくとも２つの溶媒の混合物へ、不活性雰囲気下で、導入すること［該化合物は、１末端に、保護されたアミンまたはヒドロキシル官能基を有する］、
ｋ）工程ｉ）で得られた支持体を、工程ｊ）で調製された溶液中での浸漬によってシラン化すること、
ｌ）必要に応じて、自己集合単層を有する工程ｋ）で得られたシラン化支持体を、５０〜１２０℃の温度で、５分間〜一晩、アニールすること（annealing）、ならびに
ｍ）工程ｋ）またはｌ）で得られた修飾化支持体を、溶媒（好ましくは、極性溶媒）でリンスすること、
によって行われる。
【００２６】
用語、固体支持体の“汚染物質（contaminants）”は、支持体の表面に存在し、そして支持体自体の化学構造の一部でない、任意の化合物（例えば、脂質、ダストまたは他のもの）を意味するように意図される。
【００２７】
固体支持体の性質に従って、工程ｉ）は、１以上の溶媒および／または酸化剤および／またはヒドロキシル化剤（例えば、スルホクロニック（sulfochromic）混合物）、洗剤（例えば、Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標））、オゾンを用いた光化学処理（photochemical treatment）または任意の他の好適な処理を使用して行われ得る。
【００２８】
工程ｊ）において、保護されたアミンまたはヒドロキシル官能基の例として、基−ＮＲ’Ｒ”および−ＯＣＯＲ’が言及され得、ここでＲ’およびＲ”は、アルキル鎖を示す。アミンまたはヒドロキシル官能基の保護から生じる任意の他の基がまた、認識され得る。
【００２９】
工程ｊ）は、有利には、少なくとも１つの無極性炭化水素ベース溶媒および少なくとも１つの極性溶媒の混合液中で行われ得る。この場合、無極性溶媒および極性溶媒の容積比は、好ましくは、７０／３０〜９５／５である。
【００３０】
例として、そして非制限様式で、工程ｊ）の間、使用され得る無極性炭化水素ベース溶媒はシクロヘキサンであり、そして使用され得る極性溶媒はクロロホルムである。
【００３１】
工程ｊ）において、溶媒の混合物中のオルガノシリコン化合物の濃度は、好ましくは、１×１０-5〜１×１０-2ｍｏｌ／リットルである。
【００３２】
支持体をシラン化するための工程ｋ）は、使用される溶媒に従って、１分〜３日の時間の間、そして−１０℃〜１２０℃の温度で、行われ得る。
【００３３】
本発明に従って固体支持体上で核酸を合成するための方法の間、工程ｂ）が、当業者に公知の任意の技術によって、例えば水酸化カリウムでの処理によって行われ得る。工程ｃ）およびｄ）は、ホスホルアミダイト（phosphoramidite）化学によって、または例えばA. ELLINGTON and J.D. POLLARD in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New Yorkによって記載される、当業者に公知のヌクレオチドを共有結合的にカップリングするための任意の他のタイプの化学によって、行われ得る。
【００３４】
本発明に従う合成方法の有利な実施形態によれば、前記オルガノシリコン化合物の末端へ、末端アミンまたはヒドロキシル官能基を有するスペーサーアームをグラフトするための工程が、工程ａ）またはｂ）の後および工程ｃ）の前に行われる。
【００３５】
このようなスペーサーアームは、所望の特性に依存して、電荷、長さおよび極性において可変であり得る。例えば、それらは、帯電した鎖（例えば、脱塩基部位を有するホスホルアミダイトなど）、非帯電親水性鎖（例えば、ポリエチレングリコール）、非帯電疎水性鎖（経てば、アルキル鎖）、または水性アンモニア不安定性基（aqueous ammonia-labile group）を含む鎖（例えば、基−ＳＯ2）を含み得る。
【００３６】
修飾化支持体へヌクレオチドを共有結合的にカップリングするための工程ｃ）は、局所様式で（in a localized manner）、即ち支持体上の所定の場所で、行われる。
【００３７】
工程ｃ）の繰り返しは、望まれる回数だけ行われ得；工程ｃ）は、例えば、収率はこのような数を超えて減少することを知って、約１００回行われ得る。
【００３８】
工程ｃ）およびｄ）においてカップリングされたヌクレオチドは、好ましくは、固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成に関する文献に記載されるように、好適に保護されている。工程ｄ）に引き続いて、固体支持体上で合成された核酸は、任意の好適な化学処理、例えば水性アンモニアによって脱保護され得ることが明瞭に理解される。この処置は、水性アンモニア不安定性スペーサーアームがこれらの核酸とシラン化表面との間に導入されていなければ、支持体からの核酸の切断を伴わない。
【００３９】
本発明の主題はまた、固体支持体上で核酸を固定化するための方法であって、前記支持体が、上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾されていること、および以下の工程：
ａ）上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾された固体支持体を製造すること［ここで、該オルガノシリコン化合物は、それらの末端に、保護されたアミンまたはカルボン酸官能基を有する］；
ｂ）必要に応じて、該アミンまたはカルボン酸官能基を脱保護すること；
ｃ）必要に応じて、該修飾化固体支持体が、末端カルボン酸官能基を有する場合、これらの官能基を活性化すること；
ｄ）工程ａ）、ｂ）またはｃ）で得られた修飾化固体支持体を、局所的に適用された（applied locally）、固定化される核酸（単数または複数）の１以上の極性溶媒中の１以上の溶液と接触させること［該核酸は、それらの末端の１つで、該修飾化固体支持体が必要に応じて保護された末端カルボン酸官能基を有する場合にはアミン官能基で、または該修飾化固体支持体が必要に応じて保護された末端アミン官能基を有する場合には活性化カルボン酸官能基で官能化されているスペーサーアームを有する］；ならびに
ｅ）該核酸が固定されている固体支持体を洗浄すること、
を含むことを特徴とする。
【００４０】
工程ａ）は、有利には、工程ｊ）において、オルガノシリコン化合物が、１末端で、保護されたアミンまたはカルボン酸官能基を有するという相違を伴って、固体支持体上で核酸を合成するための方法に関して上記で記載したように行われる。
【００４１】
カルボン酸官能基を活性化するための工程ｃ）は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはカルボジイミドの溶液、あるいは当業者に公知の任意の他の好適な活性化試薬を使用して行われ得る。
【００４２】
工程ｄ）の間、核酸を可溶化するために、後者の良好な溶解性および溶液の蒸発の制御を可能にする任意の溶液が使用され得ることが明らかに理解される；例として、そして非限定的な様式で、アセトニトリル／水混合物が言及され得る。固定化される核酸の各溶液は、微細堆積（microdeposition）の好適な手段を使用して、支持体上の所定の場所に堆積される。
【００４３】
本発明に従う固定化方法の有利な実施形態によれば、前記オルガノシリコン化合物の末端へ、末端アミンまたはカルボン酸官能基を有するスペーサーアームをグラフトするための工程が、工程ａ）またはｂ）の後および工程ｃ）の前に行われる。好適なスペーサーアームは、上記に記載の通りである。
【００４４】
本発明の主題はまた、前記核酸がＤＮＡである、本発明に従う核酸を固定化するための方法を使用して得られることを特徴とする、ＤＮＡチップである。
【００４５】
本発明に従うＤＮＡチップは、安定であり、そして従って多くのハイブリダイゼーションおよび変性サイクルにおいて再使用され得るという利点を有する。
【００４６】
上記のアレンジメントに加えて、本発明はまた、以下の説明から明らかとなるであろう他のアレンジメントを含み、これは、本発明の文脈で使用され得るオルガノシリコン化合物の合成およびこれらのオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で修飾され固体支持体上での核酸の合成または固定化の実施例、ならびにまた添付の図面を参照する。
【００４７】
しかし、これらの実施例は、本発明の主題の単なる例示のために与えられ、それらは決してその限定を構成しないことが、明らかに理解されるべきである。
【００４８】
実施例１：ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の合成
１）不飽和アルコールの合成（図１）
・マグネシウム化合物２の調製
マグネシウム（１．８ｇ；７０ｍｍｏｌ）を、５００ｍｌの三ツ口丸底フラスコへ、不活性雰囲気下で導入する。前もって７０ｍｌの無水ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）に溶解した、不飽和臭素化誘導体１（１６．３ｇ；７０ｍｍｏｌ）を滴下する。数滴のジブロモエタンが、該マグネシウムを活性化するために必要であり得る。反応混合物を、１時間３０分間還流させ、マグネシウム化合物２を得、これを直ちに使用する。
【００４９】
・リチウムアルコキシド４の調製
ブロモアルコール３（１７．７ｇ；７０ｍｍｏｌ；１ｅｑ）を、不活性雰囲気下で、乾燥２５０ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中、７０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解する。溶液を−７８℃へ冷却し、次いでメチルリチウム（５０ｍｌ；８０ｍｍｏｌ；１．１ｅｑ）を滴下する。リチウムアルコキシド４が得られる。
【００５０】
・不飽和アルコール５の調製
マグネシウム化合物２を−７８℃へ冷却し、次いでヨウ化銅（１．１ｇ；３．５ｍｍｏｌ；０．０５ｅｑ）を添加した。溶液を２５分間−７８℃で攪拌し、次いで紫色が得られるまで、周囲温度へ再加熱する。次いで、溶液を、直ちに−７８℃へ冷却し、そしてアルゴン雰囲気下で中空針（hollow needle）を使用してリチウムアルコキシド４を導入する。溶液を１時間−７８℃で、次いで１８時間周囲温度で攪拌する。過剰メチルリチウムを、エタノールの添加し、続いて１０％塩酸水溶液の添加による酸性媒体中での加水分解によって破壊する。有機相をジエチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水、そして最終的に飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で洗浄する。次いで、有機相を中性へ洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、次いで真空下で濃縮する。生成物をアセトンからの再沈殿で精製する。化合物５を白色固体の形態で得る（１９．８ｇ；融点６１．７−６２．８°Ｃ；収率８７％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００５１】
【数１】
２）エチレングリコールの導入（図２）
・不飽和塩素化誘導体６の合成
上記で得られたアルコール５（１５ｇ；４６ｍｍｏｌ；１ｅｑ）およびピリジン（４０．３６ｍｌ；６ｍｍｏｌ；０．１ｅｑ）を、マグネチックスターラーを備えそして垂直還流冷却器を載せた２５０ｍｌの二ツ口丸底フラスコへ導入する。次いで、塩化チオニル（６ｍｌ；７０ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を滴下する。反応媒体を１時間攪拌し、次いでＯＨバンドが完全に消失するまで還流させる（赤外分光法によってモニターされる）。続いて反応媒体を、加水分解し、次いでジエチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、１０％塩酸溶液、水、次いで飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。化合物６を黄色固体の形態で得、次いでシリカクロマトグラフィー（溶出液：石油エーテル／エーテル、７０／３０ ｖ／ｖ）によって精製し；白色固体を得る（１４ｇ；融点３４．１〜３４．９℃；収率７５％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００５３】
【数２】
・不飽和ヨウ素化誘導体７の合成
不飽和塩素化化合物６（１０．６ｇ；３２ｍｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム（２２ｇ；１４０ｍｍｏｌ；４ｅｑ）を、２５０ｍｌ丸底フラスコ中のアセトン（４０ｍｌ）に可溶化させる（solubilized）。次いで、溶液を１８時間還流させる。次いで、反応媒体をジエチルエーテルで抽出し、エーテル相を合わせ、次いで水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。生成物をアセトンからの沈殿操作によって精製する。化合物７を、黄色固体の形態で得る（１１ｇ；融点４１．１〜４２．０℃；収率８１％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００５５】
【数３】
・不飽和アルコール８の合成
２０ｍｌの無水ＴＨＦ中のエチレングリコール（１１．５ｇ；１８０ｍｍｏｌ；１０ｅｑ）および予め粉末にされた水酸化ナトリウム（３．７ｇ；９０ｍｍｏｌ；５ｅｑ）の溶液を、３０分間還流させる。ヨウ素化化合物７（８ｇ；１８ｍｍｏｌ；１ｅｑ）および硫酸水素テトラブチルアンモニウム（０．６２ｇ；１．８ｍｍｏｌ；０．１ｅｑ）を添加する。次いで、反応媒体を７２時間還流する。周囲温度へ戻した後、塩酸水溶液（１０％、５０ｍｌ）を導入する。次いで、反応媒体をジエチルエーテルで３回抽出し；エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液で２回、水、次いで飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性へ洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。得られた固体をジクロロメタンから再沈殿させ、次いでシリカクロマトグラフィーによって精製する（溶出液：ジクロロメタン／酢酸エチル；ｖ／ｖ：３０／７０）。化合物８を、白色固体の形態で得る（１．４ｇ、融点６１．２〜６２．４℃；収率２１％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００５７】
【数４】
・エステル形態で保護された不飽和アルコール９の合成
不飽和アルコール８（０．９ｇ；２．７ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌの二ツ口丸底フラスコ中、ジクロロメタン（１０ｍｌ）およびトリエチルアミン（０．６ｍｌ；５．４ｍｍｏｌ；２ｅｑ）に懸濁させる。反応媒体を０℃へ冷却し、次いで塩化アセチル（０．５ｍｌ；４ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を、シリンジを使用して滴下する。反応媒体を１５分間０℃で、次いで１時間３０分間周囲温度で攪拌する。続いて、それを加水分解し、次いでジエチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水、次いで飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。化合物９を白色固体の形態で得る（０．９ｇ；収率１００％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００５９】
【数５】
３）３つのエチレングリコール単位の導入（図２）
上記で得られた不飽和ヨウ素化誘導体７およびトリエチレングリコールから出発して、不飽和アルコール１０を得、次いでエステル化して生成物１１を得る。これは、上述と同一のプロトコルに従って行われる。
【００６１】
赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによる生成物１０の分析は、以下の通りである。
【００６２】
【数６】
赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによる生成物１１の分析は、以下の通りである。
【００６４】
【数７】
４）不飽和エステルの調製（図３）
上記で得られた不飽和アルコール１０から出発して、対応の酸および対応のエステルを以下のように調製した。
【００６６】
・酸１２の調製
不飽和アルコール１０（３ｇ；６．６ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中の１０ｍｌのアセトンに懸濁させる。８０ｍｌの２Ｍジョーンズ試薬（BOWDEN et al., J. Chem. Soc., 1946, 39）をこの懸濁液に添加する。懸濁液を２時間還流させる。周囲温度へ戻した後、アセトンを蒸発させ、そして固体を濾別し、次いで水で５回および０℃に冷却したアセトンで３回リンスする。次いで、固体をＴＨＦ／アセトン混合物（ｖ／ｖ：９／１）からの再結晶によって精製し、化合物１２を白色固体の形態で得る（２．９ｇ；収率９４％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００６７】
【数８】
・エステル１３の調製
酸１２（２．９ｇ；６．４ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中、０℃、不活性雰囲気下で、無水トルエン（７ｍｌ）に可溶化させる。塩化オキサリル（１．２２ｇ；９．６ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を滴下し、次いで混合物を周囲温度で２時間攪拌する。次いで、過剰の試薬および溶媒を、真空下で蒸発させる。塩化アシルをアルゴン下で一時的に保存する。予め塩化カルシウム上で蒸留させたメタノール（６ｍｌ；１２８ｍｍｏｌ；２０ｅｑ）を、徐々に添加する。次いで、反応媒体を１８時間還流し、その後周囲温度へ戻し、次いで過剰メタノールを蒸発させる。次いで、反応媒体を３回ジエチルエーテルで抽出する。エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水、および飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。化合物１３を白色固体の形態で得、次いでシリカクロマトグラフィー（溶出液：石油エーテル／エーテル、容積で５０／５０）によって精製する。３００ｍｇの白色固体を得る（収率１０％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００６９】
【数９】
単一エチレングリコール単位を含むアルコール８を使用することによって、対応の酸およびエステルがまた、アルコール１０から出発してここで記載したのと同一のプロトコルに従って得られ得る。
【００７１】
５）不飽和前駆体のシリル化（図４）
エステル９（１５０ｍｇ；０．３３ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下、乾燥Ｓｃｈｌｅｎｋチューブへ導入する。新たに蒸留したトリクロロシラン（０．３ｍｌ；２．２ｍｍｏｌ；６ｅｑ）、無水トルエン（０．３ｍｌ）およびＡＢＣＲによって販売される（リファレンス６８４７８−９２−２）Ｋａｒｓｔｅｄ触媒（ＰＣＯ ７２）の１滴を添加する。次いで、反応媒体を２時間４０℃にする。周囲温度へ戻した後、トルエンおよび過剰なトリクロロシランを、ベーンポンブ（vane pump）（圧力は０．５ｍｍＨｇである）を使用して、減圧下で、蒸発させる。化合物１４を白色固体の形態で得、そしてアルゴン下で保存する（収率９９％）。それは、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが０に等しく、ｋが１に等しく、そしてＢが基−ＣＯＣＨ3を示す、上記に定義される式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物である。
【００７２】
プロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによる化合物１４の分析は、以下の通りである。
【００７３】
【数１０】
化合物１１から出発することによってそして同一のプロトコルを使用することによって、対応のオルガノシリコン化合物１５が得られる。それは、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが０に等しく、ｋが３に等しく、そしてＢが基−ＣＯＣＨ3を示す、式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物である。プロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００７５】
【数１１】
上記で得られた化合物１３から出発することによってそして同一のプロトコルを使用することによって、対応のオルガノシリコン化合物１６が得られる。それは、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが１に等しく、ｋが２に等しく、そしてＢが基−ＣＯＯＣＨ3を示す、式（Ｉ）の化合物である。プロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００７７】
【数１２】
表Ｉは、本実施例において得られた式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の構造を概括する。
【００７９】
【表１】
実施例２：ｍ＝０である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の合成
１）不飽和前駆体の合成（図５）
１−１：基−ＯＣＯＣＨ3を有する不飽和前駆体
・化合物１７
実施例１で得られた不飽和アルコール５（０．９ｇ；２．７ｍｍｏｌ）を、１００−ｍｌの２ツ口丸底フラスコ中、ジクロロメタン（１０ｍｌ）およびトリエチルアミン（０．６ｍｌ；５．４ｍｍｏｌ；２ｅｑ）に懸濁させる。反応媒体を、０℃へ冷却し、次いで塩化アセチル（０．５ｍｌ；４ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）をシリンジを使用して滴下する。反応媒体を、１５分間０℃で、次いで１時間３０分間周囲温度で、攪拌する。続いて、反応媒体を、加水分解させ、次いで３回ジエチルエーテルで抽出する。エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水、および次いで飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮する。化合物１７を、白色固体形態で得る（０．９ｇ；収率１００％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによる分析は、以下の通りである。
【００８１】
【数１３】
・化合物１８
化合物１７の製造と同一のプロトコルを使用することによって、しかし１６炭素原子を有する不飽和アルコールから出発して、化合物１８を得、赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるこの分析は、以下の通りである。
【００８３】
【数１４】
・化合物１９
化合物１７の製造と同一のプロトコルを使用することによって、しかし２７炭素原子を有する不飽和アルコールから出発して、化合物１９を得、赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるこの分析は、以下の通りである。
【００８５】
【数１５】
１−２：臭素化不飽和前駆体
式ＣＨ2＝ＣＨ−（ＣＨ2）xＢｒ［ｘは、３〜２３である］の不飽和臭素化誘導体から出発して、実施例１に記載の化合物２の製造のためのプロトコルに従って、式ＣＨ2＝ＣＨ−（ＣＨ2）xＭｇＢｒのオルガノマグネシウム化合物を得る。化合物５の生成のための実施例１に従うブロモアルコールとのカップリングについてのものと同一の条件下での、二臭素化誘導体Ｂｒ（ＣＨ2）yＢｒ（ｘ＋ｙは、最小１３そして最大３３に等しい）とのそのカップリングは、式２０、２１および２２の不飽和臭素化誘導体を生成する。
【００８７】
化合物２０は、ｘが９に等しい不飽和臭素化誘導体およびｙが１０に等しい二臭素化誘導体を使用して得られる。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００８８】
【数１６】
化合物２１は、ｘが１４である不飽和臭素化誘導体およびｙが１０に等しい二臭素化誘導体を使用して得られる。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００９０】
【数１７】
化合物２２は、ｘが９である不飽和臭素化誘導体およびｙが５に等しい二臭素化誘導体を使用して得られる。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００９２】
【数１８】
１−３：カルボン酸基−ＣＯＯＨを有する不飽和前駆体
実施例１で得られる不飽和アルコール５（１３ｇ；４０ｍｍｏｌ）を、２５０−ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中、４０ｍｌのアセトンに懸濁させる。８０ｍｌのジョーンズ試薬（２Ｍ）を、この懸濁液に添加する。この懸濁液を、２時間還流させる。周囲温度に戻した後、アセトンを蒸発させ、固体を濾過し、次いで水で５回、そして０℃に冷却したアセトンで３回リンスする。次いで、固体をＴＨＦ／アセトン混合物（ｖ／ｖ：９／１）からの再結晶によって精製し、化合物２３を白色固体形態で得る（９．９ｇ；融点７３−７４°Ｃ；収率９４％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。
【００９４】
【数１９】
１−４：メチルエステル基−ＣＯＯＣＨ3を有する不飽和前駆体
上記で得られた酸２３（４ｇ；１１．８ｍｍｏｌ）を、１００−ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中、０℃、不活性雰囲気下で、無水トルエン（２０ｍｌ）に可溶化させる。塩化オキサリル（２ｇ；１７．６ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を滴下して導入し、次いで混合物を周囲温度で２時間攪拌する。次いで、過剰な試薬および溶媒を真空下で蒸発させる。塩化アシルをアルゴン下で一時的に保存する。予め塩化カルシウム上で蒸留された、メタノール（１０ｍｌ；２３６ｍｍｏｌ；２０ｅｑ）を徐々に添加する。次いで、反応媒体を、１８時間還流させる。反応混合物が周囲温度に戻った後、過剰のメタノールを蒸発させる。次いで、反応媒体を、ジエチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、１０％塩酸溶液、水、および飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性へ洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、真空下で濃縮する。化合物２４を白色固体の形態で得る（４ｇ；融点５０−５１．５°Ｃ；収率１００％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによる分析は、以下の通りである。
【００９６】
【数２０】
２）不飽和前駆体のシリル化
実施例１に示されるものと同一のプロトコルを行う。不飽和前駆体１７、１８および１９から出発して得られたオルガノシリコン化合物のプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲスペクトルは、以下の通りである。
【００９８】
【数２１】
以下の表IIは、本実施例において得られた式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の構造を概括する。
【０１００】
【表２】
実施例３：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物を使用しての固体支持体のシラン化、および組織化自己集合単層の製造
１）固体支持体のシラン化
表面酸化シリコンディスク（surcace-oxidized silicon disk）を、支持体として使用する。ディスクを、その表面から汚染物質（contaminants）を除去しそしてそれを水和させるために、以下の手順にした従って清浄にする：
−新たに調製したクロム（ＶＩ）／硫酸混合物（２．５ｇのＫ2Ｃｒ2Ｏ4；２．５ｍｌの蒸留水；５０ｍｌの硫酸）中で１０分間の浸漬、
−ダストフィルターを備えた層流フード（laminar flow hood）下で、ディスクを脱イオン水に浸漬し、そして２０分間超音波へ供する。このプロセスを、それぞれ５および２分間の超音波処理（sonication）の持続を２回繰り返す、
−ダストフィルターを備えた層流フード下で、ディスクを、不活性でそしてフィルターされた（filtered）雰囲気下で、乾燥させるためにシラン化リアクターへ導入する。リアクターを、１００℃のオイルバス中に４５分間浸漬し、次いでオイルバスから取り出し、そしてその温度を１８℃へ戻す。
【０１０２】
不活性雰囲気下で、所望の量で新たに調製した、実施例１で得られるオルガノシリコン化合物１４を、Ｃ6Ｈ12／ＣＣｌ4／ＣＨＣｌ3（ｖ／ｖ／ｖ：８０／１２／８）混合物のフラクションに溶解する。続いて、溶液中のオルガノシリコン化合物１４を、シリンジで回収し、次いで、溶媒混合物の残余を含むＳｃｈｌｅｎｃｋチューブへ導入し、この全容積は、好適な希釈（１×１０-5〜１×１０-2ｍｏｌ／リットル）のシラン化溶液を作製するように算出されている。溶媒を、それ自体が公知の手順に従って予め乾燥させた。
【０１０３】
シラン化溶液をシリンジでリアクターへ導入し、そしてシリコンディスクを、この溶液中に１６時間浸漬させたままにする。シラン化されたディスクをリアクターから回収し、次いで、クロロホルム（ＨＰＬＣグレード）で洗浄した後、必要に応じて５０〜１２０℃の温度でアニールする。次いで、それを、そして超音波で２分間清浄にし、このプロセスを２回繰り返す。
【０１０４】
２）修飾化表面のキャラクタライゼーション
表面が化合物１４で修飾されている、固体支持体が、上記で得られた。オルガノシリコン化合物のグラフト化を、共焦点ラマン分析法および赤外分光法を使用することによってモニターする。
【０１０５】
３）表面ヒドロキシルの放出
必要であれば、表面ヒドロキシルを、以下のプロトコルを使用して放出させ得る：シラン化ディスクを、水／エタノール（ｖ／ｖ：１／１）混合物中のＫＯＨ（０．５Ｍ）の溶液に２０分間浸漬させる。次いで、ディスクを超音波で５分間脱塩水中で清浄にする。このプロセスを水中で１回、次いでクロロホルム中で２回繰り返す。
【０１０６】
４）ヒドロキシルの放出後の表面のキャラクタライゼーション
図６は、上記で説明されたシラン化プロトコルに従って、そして表面エステルの鹸化後、支持体へ化合物１４をグラフト化する３つの実験後に得られる赤外スペクトルを示す。透過率（transmission）はｙ軸上に現れ、そして周波数（frequency）（ｃｍ-1）はｘ軸上に現れる。３つのスペクトルは、２９１７および２８５０ｃｍ-1で組織化系（organized system）の特徴的なピークで、重ね合わせられていることに注意する。従って、それから、支持体上へのオルガノシリコン化合物のグラフトは、再現性があり、そして組織化自己集合単層の形成を生じさせることが結論され得る。
【０１０７】
図７は、上記で得られた修飾化表面のラマン分光分析研究を示す。図７ａは、グラフト化支持体の表面の密度を表し、表面の寸法は、ｘ軸およびｙ軸上に現れ（図における７ｍｍは、支持体における１μｍに対応する）、そして密度のスケールは、１３０〜１６５（任意の単位）に目盛りをつけられる（graduated）。この図は、表面の均一性を実証する。図７ｂおよび図７ｃは、支持体の表面の２つの異なるポイントで測定されたラマンスペクトルを示す；ｙ軸は１秒当たりのカウントを示し、そして周波数はｘ軸に現れる。
【０１０８】
従って、赤外およびラマンスペクトルは、明白に、組織化自己集合単層の特徴である、支持体に堆積された膜の均一性および表面上の分子の組織化を示す。赤外スペクトルはまた、膜のグラフト化が完全に再現性であることを示す。
【０１０９】
実施例４：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物を使用しての固体支持体上におけるシラン化の他の例
ガラス顕微鏡スライド（glass microscope slide）を、支持体として使用する。ガラススライドを、２％水性Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標）溶液（Ｐｏｌｙｌａｂｏによってリファレンス１２２４０で販売）中、２時間、２０℃での浸漬、次いで多量の脱イオン水でのリンスによって、清浄にする。ダストフィルターを備えた層流フード下で、ガラススライドを、不活性でそしてフィルターされた（filtered）雰囲気下で、乾燥させるためにグラフト化リアクターへ導入する。リアクターを、１００℃のオイルバス中に４５分間浸漬し、次いで、オイルバスから取り出し、そしてその温度を１８℃へ戻す。
【０１１０】
前記実施例に示されるようにオルガノシリコン化合物１４を使用して調製されたシラン化溶液を、シリンジで、リアクターへ導入し、そしてガラススライドをこの溶液に１６時間浸漬させたままにする。シラン化支持体を、実施例３に記載されるようにリンスする。
【０１１１】
赤外およびラマン分光分析による表面のキャラクタライゼーションは、ここでまた、支持体上における組織化自己集合単層の生成を実証し、同一の結果がまた、化合物１４以外の式（Ｉ）のオルガノシリコン剤で得られる。
【０１１２】
実施例５：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で修飾された固体支持体上での核酸の直接合成
１）組織化自己集合単層で修飾された固体支持体の製造
使用される固体支持体は、実施例３に記載されるプロトコルに従って、オルガノシリコン化合物１４を含む組織化自己集合単層がその上に形成された、酸化シリコン（oxidized silicon）支持体Ｓｉ／ＳｉＯ2である。式（Ｉ）の任意の他のオルガノシリコン化合物も、式（Ｉ）の少なくとも一つのオルガノシリコン化合物を含むオルガノシリコン化合物の任意の混合物として使用され得る。
【０１１３】
支持体上へグラフトされたオルガノシリコン化合物の末端を、実施例３に記載されるように、ＫＯＨの溶液中での支持体の浸漬によってヒドロキシル基へ変換させる。このようにして、表面ヒドロキシル官能基を含む支持体を得る。支持体を、アセトニトリルで清浄にし、そして超音波に１分間供し、その後、合成チャンバに配置する。
【０１１４】
２）この支持体上での核酸の合成
ホスホルアミダイト化学を、当業者に周知の他のタイプの化学（例えば、Ｈ−ホスホネート化学）が使用され得る認識のもとに、ここで使用する。従って、ヌクレオチドを、β−シアノエチルホスホルアミダイトの形態で使用し、種々の窒素含有塩基のアミンは、例えばそして非限定様式で、ベンゾイル、イソブチリルまたはｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチック基で保護されている。ヌクレオチドは、５’位でジメトキシトリチル基で保護されており；しかし、ＵＶイルミネーションによって除去され得る光不安定性（photolabile）基もまた使用され得る（例えば、Peaseらによって、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026で記載されるＭｅＮＰＯＣ）。
【０１１５】
核酸合成は、使用されるホスホルアミダイト化学で、３’→５’方向に行われる。ヌクレオチドをグラフトするための種々の工程は、以下の通りであり、これらの工程の全ては以下のサイクルを構成する：
１．脱トリチル化（detritylation）（２５秒）：ジクロロメタン中３％トリクロロ酢酸；
２．洗浄：無水アセトニトリル；
３．カップリング（１分）：０．１Ｍアミダイトおよび０．４５Ｍのアクチベータ（テトラゾール）の混合液の導入；
４．キャッピング（capping）（１５秒）：（ｉ）無水酢酸／２，６−ルチジン／アセトニトリル（１０ｍｌ／１０ｍｌ／８０ｍｌ）および（ｉｉ）ジメチルホルムアミド中１０％の１−メチルイミダゾール（１０ｍｌ／９０ｍｌ）の混合液の導入；
５．酸化（１５秒）：ヨウ素／ピリジン／テトラヒドロフラン／水（０．５０８ｍｇ／１．６ｍｌ／１５．２ｍｌ／３．２ｍｌ）混合物の導入；
６．キャッピング（１５秒）。
【０１１６】
上記に与えられるサイクルにおいて、脱トリチル化、洗浄、カップリング、キャッピングおよび酸化溶液は、限定的様式で与えられていないことが、明らかに理解される。
【０１１７】
望まれるのと同じくらい多くのサイクルが、生成されるように意図される核酸の長さに依存して、行われ得る。一旦サイクルの最終番号に到達すると、窒素含有塩基は脱保護されて、核酸は周囲温度で一晩３０〜３３％の水性アンモニアでの処理によって脱保護され、その結果、骨格および窒素含有塩基に分布される保護基が切断される。必要に応じて、水性アンモニア不安定性スペーサーアームが、シラン化表面と核酸の一部との間に導入されている場合、核酸のこのフラクションが、支持体から切断されるだろう。
【０１１８】
使用される保護基の性質に依存して、例えば炭酸カリウムを使用する、他の脱保護処理を使用することが可能であり得る。
【０１１９】
支持体を、水、次いでＴＲＩＳ緩衝液（１０ｍＭ ＴＲＩＳ塩基溶液を添加することによってｐＨ７．１へ調整された１０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌの溶液、最終溶液は５０ｍＭのＮａＣｌ濃度を有する）で洗浄し、その後、それをハイブリダイゼーションのために使用し得る。
【０１２０】
実施例６：本発明に従う方法に続いて固体支持体上に直接合成されたオリゴヌクレオチドで行われるハイブリダイゼーション実験
実施例５に記載の組織化自己集合単層で修飾された固体支持体（オルガノシリコン化合物１４の単層が形成されている、酸化シリコン（oxidized silicon）Ｓｉ／ＳｉＯ2、表面官能基はヒドロキシル基に変換されている）を使用する。１０ヌクレオチドＴのスペーサーアームを、オリゴヌクレオチド合成の前に、この修飾化支持体上へグラフトする。
【０１２１】
Ｌ１８５およびＵ２２６と名付けられたオリゴヌクレオチド（２５ヌクレオチドの配列）を、図８ａに例示されるように、この支持体の４点で合成する。図８ｂおよび８ｃは、図８ｂについて０〜１０のスケール（図８ｄ、８ｆおよび８ｈについてのスケールとして役立つ）において、そして図８ｃについて０〜１．５のスケール（８ｅ、８ｇおよび８ｉについてのスケールとして役立つ）において、支持体上に描かれた蛍光強度を示す。
【０１２２】
図８ｄは、蛍光ラベルを含むＬ１８５に相補的なオリゴヌクレオチドの溶液と支持体とを接触させた後、支持体を洗浄した後に、検出された蛍光強度を示す。ハイブリダイゼーションを、５０ｍＭのＮａＣｌを含むＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．１）の存在下、一晩、４６℃で行う。ＴＲＩＳ中のオリゴヌクレオチドＬ１８５の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌである。Ｌ１８５に相補的な各ストランド（strand）は、５’末端に蛍光基Ｃｙ３を有する。配列Ｌ１８５との相補配列のハイブリダイゼーションが、明らかに観察される。図８ｅは、変性後の支持体に対応する：相補配列は、もはや検出されない。
【０１２３】
図８ｆは、Ｌ１８５ストランドに関して上記で示されたのと同一の条件下で、蛍光ラベルを含むＵ２２６に相補的なオリゴヌクレオチドの溶液と支持体とを接触させた後に支持体を洗浄後、検出された蛍光強度を示す。ここでまた、配列Ｕ２２６との相補配列のハイブリダイゼーションが、観察される。図８ｇは、変性後の支持体に対応する：相補配列は、もはや検出されない。
【０１２４】
図８ｈは、蛍光ラベルを含むＬ１８５に相補的なオリゴヌクレオチドの溶液と支持体とをもう一度接触させた後、支持体を洗浄した後に検出された蛍光強度を示す。配列Ｌ１８５との相補配列のハイブリダイゼーションがまた生じる。図８ｉは、変性後の相補配列の非存在を示す。
【０１２５】
これらの実験は、式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で修飾された固体支持体上に直接合成された核酸は［この合成は、本発明の方法に従って行われる］、相補配列との選択的なハイブリダイゼーション反応を生じ得、支持体は、ハイブリダイゼーションおよび変性の数回の連続サイクルにおいて、再使用可能であることを示す。
【０１２６】
実施例７：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で修飾された固体支持体上でのプレ合成された核酸の固定化
１）組織化自己集合単層で修飾された固体支持体の製造
組織化自己集合単層が実施例１に示されるプロトコルに従って調製された式１６のオルガノシリコン化合物を含むという相違を伴って、実施例５のように、手順を行った。式（Ｉ）の任意の他のオルガノシリコン化合物（または、式（Ｉ）の少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含むオルガノシリコン化合物の混合物）が使用され得ることが、明らかに理解され、該式（Ｉ）の化合物は、保護されたカルボン酸官能基を有する。オルガノシリコン化合物の末端は、エステルの加水分解によって（例えば、トリヨードメチルシランまたは濃塩酸の作用下で）、カルボン酸基へ変換される。
【０１２７】
２）この支持体上での核酸の固定化
支持体のカルボン酸官能基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液で活性化する。このように活性化された支持体を、固定化される核酸の溶液と接触させ（トリエチルアミンの存在下、容積で９／１のアセトニトリル／水混合物中１μｇ／μｌ）、この核酸は、アミン官能基で官能化されたスペーサーアームを有する。反応を、周囲温度で、必要に応じて溶液の乾燥まで行う。次いで、支持体をＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．１）で洗浄する。この操作は、アミンとの反応によって反応していない酸官能基をブロックすることを可能にする（キャッピング（capping）反応）。
【０１２８】
上記から明らかなように、本発明は、決して、今より明確に記載された、実行、調製および適用に限定されず；逆に、それは、本発明の文脈および範囲から逸脱することなく、当業者に思いつかれ得る全てのその改変を含む。
【０１２９】
特に、核酸を合成および固定化するための方法のみが記載されたが、本発明に従う方法がまた他の生体分子（特にタンパク質）に適用され得ることが明らかに理解される；この場合、本発明に従う合成方法は、これらの生体分子の基本単位（basic units）を支持体上へグラフトするための連続工程を含み得、それにも関わらず、行われる工程は、核酸に関してより詳細に記載したものと同一である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１、２および３は、ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽和前駆体の合成を例示する。
【図２】 図１、２および３は、ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽和前駆体の合成を例示する。
【図３】 図１、２および３は、ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽和前駆体の合成を例示する。
【図４】 図４は、これらの不飽和前駆体のシリル化を例示する。
【図５】 図５は、ｍ＝０である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽和前駆体を示す。
【図６】 図６は、Ａｕ／Ｓｉ／ＳｉＯ2支持体のシリカ表面上へオルガノシリコン化合物１４をグラフトすることからなる３つの実験後に作製された赤外スペクトルを示す。
【図７】 図７ａは、オルガノシリコン化合物１４がグラフトされているＡｕ／Ｓｉ／ＳｉＯ2支持体の表面のラマン分光分析によって分析された密度を示す；図７ｂおよび７ｃは、この表面の２つの異なるポイントで測定されたラマンスペクトルを示す。
【図８】 図８は、オリゴヌクレオチドＬ１８５およびＵ２２６が合成されている（図８ａ）、式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の単層で修飾されたＡｕ／Ｓｉ／ＳｉＯ2支持体を使用しての、ハイブリダイゼーション（図８ｄ、８ｆおよび８ｈ）および変性（図８ｅ、８ｇおよび８ｉ）からなる連続実験を示す。
Claims (10)
- 核酸を合成または固定化するための、式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の使用：
−ｎは、２２に等しく、
−ｍは、１に等しく、
−Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、塩素原子を示し、
−Ａは、基−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k−（ＣＨ2）i−を示し、ここで、ｋは１又は３に等しく、そしてｉは０に等しく、および
−Ｂは、基−ＣＯＣＨ3を示す。 - 核酸を合成または固定化するための、式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の使用：
−ｎは、２２に等しく、
−ｍは、１に等しく、
−Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、塩素原子を示し、
−Ａは、基−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k−（ＣＨ2）i−を示し、ここで、ｋは２に等しく、そしてｉは１に等しく、および
−Ｂは、基−ＣＯＯＣＨ3を示す。 - 核酸を合成または固定化するための、式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の使用：
−ｎは、１６、２２または２７に等しく、
−ｍは、０に等しく、
−Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、塩素原子を示し、
−Ａは、基−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k−（ＣＨ2）i−を示し、ここで、ｋは０〜１００であり、そしてｉは０に等しいかそれより大きい整数を示し、および
−Ｂは、基−ＯＣＯＣＨ3を示す。 - 核酸を合成または固定化するための、式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の使用：
−ｎは、２１に等しく、
−ｍは、０に等しく、
−Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、塩素原子を示し、
−Ａは、基−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k−（ＣＨ2）i−を示し、ここで、ｋは０〜１００であり、そしてｉは０に等しいかそれより大きい整数を示し、および
−Ｂは、基−ＣＯＯＣＨ3を示す。 - 前記固体支持体が、ガラス、セラミックス、金属およびメタロイドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
- ＤＮＡチップを製造するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
- 固体支持体上で核酸を固定化するための方法であって、前記支持体が、請求項２または４に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾されていること、および以下の工程：
ａ）請求項２または４に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾された固体支持体を製造すること；
ｂ）必要に応じて、−ＣＯＯＣＨ 3 官能基を脱保護すること；
ｃ）必要に応じて、末端カルボン酸官能基を活性化すること；
ｄ）工程ａ）、ｂ）またはｃ）で得られた修飾化固体支持体を、局所的に適用された（applied locally）、固定化される核酸（単数または複数）の１以上の極性溶媒中の１以上の溶液と接触させること［該核酸は、それらの末端の１つに、アミン官能基で官能化されているスペーサーアームを有する］；ならびに
ｅ）該核酸が固定されている固体支持体を洗浄すること、
を含むことを特徴とする、方法。 - 工程ａ）が以下の工程：
ｉ）前記固体支持体から汚染物質を除去し、そしてその表面を水和および／またはヒドロキシル化すること、
ｊ）請求項２または４に定義される一般式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物を、少なくとも１つの無極性炭化水素ベース溶媒を含む少なくとも２つの溶媒の混合物へ、不活性化雰囲気下で、導入すること、
ｋ）工程ｉ）で得られた支持体を、工程ｊ）で調製された溶液中での浸漬によってシラン化すること、ならびに
ｌ）必要に応じて、自己集合単層を有する工程ｋ）で得られたシラン化支持体を、５０〜１２０℃の温度で、５分間〜一晩、アニールすること、ならびに
ｍ）工程ｋ）またはｌ）で得られた修飾化支持体を、溶媒でリンスすること、
によって行われることを特徴とする、請求項７に記載の方法。 - 前記オルガノシリコン化合物の末端へ、末端アミン官能基を有するスペーサーアームをグラフトするための工程が、工程ａ）またはｂ）の後および工程ｃ）の前に行われることを特徴とする、請求項７または請求項８に記載の方法。
- 前記核酸がＤＮＡである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法を使用して得られることを特徴とする、ＤＮＡチップ。
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