JP2003504375A - 光反応性オリゴマー複合体の固相合成のための安定なキノン及び光反応性ケトンホスホルアミドエステル試薬の合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、光反応性部位において集結するオリゴマーの固相合成を自動化するように設計された、安定なキノン−及び光反応性ケトンホスホルアミドエステル試薬の分野に関する。 【解決手段】 本発明は、合成オリゴマーを炭素含有重合体へ共有結合によりカップリングすることを試みる二つの方法を提供する。第一の方法では、エチレングリコールリンカーを介して電子親和性反応基に結合した、アントラキノン又はベンゾフェノン分子から成る光プローブを、ＵＶ光に短時間曝露させて重合体表面にカップリングさせ、この重合体に結合した電子親和性基と親核性アミノアルキルＯＮ類を反応させて、これらのオリゴマーを固定化した。第二の方法は、アントラキノンオリゴマー又はベンゾフェノンオリゴマーの自動化された固相合成を含み、アントラキノンオリゴマー類又はベンゾフェノンオリゴマー類を含む水溶液を弱いＵＶ光で照射することにより、アントラキノンオリゴマー類及びベンゾフェノンオリゴマー類が、アントラキノン部位又はベンゾフェノン部位とこの溶液が塗布された表面との間の共有結合を介して、重合体表面に結合した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、光反応性部位において終結するオリゴマーの固相合成を自動化する
ように設計された、安定なキノン−及び光反応性ケトンホスホルアミドエステル
試薬の分野に関する。

【０００２】

【従来の技術】

オリゴヌクレオチド類（ＯＮ類）に対するレポーター基の付着、又は、その他
の複合体化は、得られる官能化ＯＮ類が、診断薬又は治療薬として大きなポテン
シャルを示すため、多くの研究の対象となってきた（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ
、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ」、 Ｖｏｌ．７， 編集Ｅ．Ｔ．Ｋｏｏｌ、編集主幹Ｄ．Ｂａｒ
ｔｏｎ及びＫ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、１９９９、１５３−２
５０）。例えば、アントラキノンに結合したＯＮ類（アントラキノン−ＯＮ類）
及びそれらの誘導体は、二重鎖構造の位置特異的な修飾、開裂及び架橋の研究目
的と同様、インターカレーションを介して相補的ＯＮ類に対する親和性を増すこ
とを目的に調製されてきた（Ｋ．Ｍｏｒｉら、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．、１９８９
、２４９、２１３−２１８；Ｓ．Ｍ．Ｇａｓｐｅｒ及びＧ．Ｂ．Ｓｃｈｕｓｔｅ
ｒ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９７、１１９、１２７６２−１２７７
１；Ｌ．Ｇ．Ｐｕｓｋａｓら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ、１９９５、１４、９６７；Ｈ．Ｋａｎｇ及びＳ．Ｅ．Ｒｏｋｉｔａ；Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９６、２４、３８９６−３９０２）。ア
ントラキノンオリゴマーのもう一つの興味ある応用は、重合体表面へのオリゴマ
ーの、共有結合による固定化である。プラスチックの精密濾過板、マイクロチッ
プ及びマイクロ粒子のような種々の表面へのオリゴマーの固定化（Ｊａｃｏｂｓ
ｅｎ，Ｍ．Ｈ．及びＫｏｃｈ，Ｔ． ＷＯ９６／３１５５７号、１９９６）が種
々の手段によって達成されており、そして、診断アッセイと疾病スクリーニング
アッセイの分野において急速に広がっている技術の基礎を成している（Ｆ．Ｎ．
Ｒｅｈｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９９、２７、６
４９−６５５；Ｐ．Ｗ．Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１９９９、２７、１７１９−１７２７；Ｇ．Ｒａｍｓａｙ、Ｎａｔｕｒｏ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８、１６、４０−４４）。

【０００３】 化学的手段によって、アントラキノンをオリゴマーに共有結合によって付着さ
せる二つの方法が、これまでに開発されている。第一の方法は、活性化されたア
ントラキノン誘導体と、事前に合成した遊離の第一アミン基のような反応基を含
有するオリゴマーのカップリングを含む。この方法はＫａｎｇとＲｏｋｉｔａに
よって示され、ＤＮＡの位置特異的及び光誘起的アルキル化を研究するために、
５’−末端アントラキノンオリゴデオキシヌクレオチド類（ＯＤＮ類）を合成し
た（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６、２４、３８９６−３９０
２）。２−（３−プロピオン酸）−１，４−ジメチルアントラキノンのＮ−ヒド
ロキシコハク酸イミドエステルと、標準的な自動化された固相合成によって得ら
れた、５’−アミノヘキサメチレンが結合したＯＤＮとのカップリングによって
、ジメチルアントラキノン−ＯＤＮ複合体が合成された。また、アントラキノン
−ＯＮ類も、「アミノリンカー」で修飾された核酸塩基又は炭水化物部位を含有
するＯＮ類と、活性化されたアントラキノン誘導体の反応によって調製されてい
る（Ｔｅｌｓｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９、１１１、７２２
６−７２３２；Ａｋｉｒａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１９９
３、４、４９９−５０８）。

【０００４】 他の方法は、アントラキノンを、自動化された固相合成に使用し得るシントン
に変換する、例えば、アントラキノンをホスホルアミドエステル試薬へカップリ
ングすることを含む。アントラキノン−オリゴマーの全合成は自動化された合成
装置上で実行できるため、構成ブロックの入手のし易さによっては、この直接導
入が最も効率的な方法であるかどうか、議論の余地がある。

【０００５】 直接導入を介したＯＮ類へのアントラキノン誘導体の付着は、５’−Ｏ−ＤＭ
Ｔ（４，４’−ジメトキシトリチル）、３’−Ｏ−ホスホルアミドエステルヌク
レオシド試薬の２’−Ｏ位置にアントラキノン基を結合させることによって、試
みられた。Ｋ．Ｙａｍａｎａら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１９
９６、７、７１５−７２０）は、アントラキノン−ＯＮ類の自動化された固相合
成に使用される５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−アントラキノ
ニルメチル）ウリジン−３’−Ｏ−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホ
スホルアミドエステルの合成を報告した。

【０００６】 Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
Ｃｈｅｍ．１９９７、７、１８６９−１８７４）は、３’−５’アミド結合を含
有するヌクレオシドの二量体類の合成を述べており、この場合、窒素原子は、ポ
リメチレンリンカーを介してアントラキノン分子に結合される。この二量体の５
’−Ｏ位置のＤＭＴ−保護及び３’−Ｏ位置のホスフィチル化により、アントラ
キノン−ＯＮ類の自動化された固相合成に好適な試薬が得られた。

【０００７】 アントラキノン部位を有する非塩基性の擬似ヌクレオシドが、Ｋ．−Ｙ．Ｌｉ
ｎ及びＭ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉによって調製された（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．、１９９１、１９、３１１１−３１１４及び米国特許第５，２１４
，１３６号）。２−クロロアントラキノン及びジエタノールアミンから出発して
、アントラキノンジオール誘導体を得、それをＤＭＴのＨ−リン酸エステル試薬
に変換し、引き続いて、複数回、ＯＤＮ類に組み込んだ。

【０００８】 上記の試薬は、オリゴマーの種々の位置にアントラキノン官能基を導入するこ
とを可能にする。

【０００９】 ヌクレオシド由来のものではなく、自動化された固相合成を用いて、オリゴマ
ーの５’−末端位置にアントラキノンを導入するためのみに開発された、ホスホ
ルアミドエステル試薬の２、３の例が報告されている。

【００１０】 Ｋ．Ｍｏｒｉら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８９、２４９、２１３−２１８
）は、抗−ＨＩＶ活性の５’−結合アントラキノン−ＯＤＮ類の合成について述
べており、この場合、アントラキノン誘導体が、エチルピペラジニル又はヘキサ
メチレンリンカーを介してオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）に結合される
。この５’−結合アントラキノン−ＯＤＮ類は、新しく調製されたアントラキノ
ン−エチルピペラジニルホスホルアミドエステル（収率６５％で得られた）、又
は、アントラキノンヘキサメチレン結合ホスホルアミドエステルを、標準的な自
動化された固相合成を用いて、ＯＤＮ配列の５’−末端へカップリングすること
によって得られた。

【００１１】 また、このアントラキノン−エチルピペラジニル−ホスホルアミドエステル試
薬のことが、ＷＯ９０／１２８０２号にも述べられている。このアントラキノン
ホスホルアミドエステルは、Ｋ．Ｍｏｒｉらによって記載されたものと同じ手順
を用いて合成された。すなわち、１−クロロアントラキノン及び１−（２−ヒド
ロキシエチル）ピペラジンを反応させて、１−（１−（２−ヒドロキシエチル）
ピペラジニル）アントラキノンを得、それを、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルア
ミンの存在下で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミドクロリドによってホス
フィチル化して、アントラキノン−エチルピペラジニルホスホルアミドエステル
を得た。このアントラキノンホスホルアミドエステルを、それ以上精製せずに、
哺乳動物の遺伝子発現又はウイルス活性の減衰や破壊に使用される、５’−結合
アントラキノン−ＯＤＮ類の自動化された固相合成に使用した。

【００１２】 Ｓ．Ｍ．Ｇａｓｐｅｒ及びＧ．Ｂ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．、１９９７、１１９、１２７６２−１２７７１）は、酸化損傷が二本鎖
ＤＮＡ中を拡散し得るという事実を確立する目的で、５’−結合アントラキノン
−ＯＤＮ類の合成を記載している。この目的のために、二つのアントラキノンホ
スホルアミドエステル、すなわち、Ｎ−エチル−及びＮ−ペンチル−２−アント
ラキノンカルボキシアミド−ホスホルアミドエステルを合成した。この二つのホ
スホルアミドエステルをアントラキノン−２−カルボニルクロリドから合成し、
それを２−アミノ−１−エタノール又は５−アミノ−ペンタノールと反応させて
、それぞれＮ−（２−ヒドロキシエチル）−及びＮ−（５−ヒドロキシペンチル
）−２−アントラキノンカルボキシアミドを得た。これらのカルボキシアミドと
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホルアミドクロリドとの反応により、カラム
クロマトグラフィーの後で、濃い暗赤色油状物として、対応するホスホルアミド
エステルが得られた。固相合成における最終段階として、これらのアントラキノ
ンホスホルアミドエステルを、ＯＤＮ類の５’−ＯＨ末端へカップリングするこ
とによりアントラキノン−ＯＤＮ複合体が得られた。

【００１３】 自動化された固相合成を用いたアントラキノン−オリゴマー複合体の大規模合
成には、容易に入手できて比較的安定な、アントラキノンシントンが必要である
。安定なアントラキノンホスホルアミドエステル試薬を合成する最初の試みで、
上記のタイプの試薬が不安定であることが分かった。

【００１４】 Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルアミドエステル及びテトラ
ゾールを用いた、Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）−２−アントラキノンカルボ
キシアミドのアントラキノンホスホルアミドエステル誘導体の合成が、実施例１
に記載されている。このホスホルアミドシアノエチルの単離を試みたが分解した
。この反応混合物を濾過した後の粗生成物を、一日以内に、直接、ＤＮＡ合成装
置上で使用しても分解した。次いで、エチルジイソプロピルアミンの存在下（実
施例２を参照）又は実施例１に記載したものと同じ手順で、Ｎ−（２−ヒドロキ
シエチル）アントラキノンカルボキシアミドとＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホル
アミドクロリド２−シアノエチルの反応によって、このＮ−（２−ヒドロキシエ
チル）アントラキノンカルボキシアミドのホスホルアミドシアノエチル類似体を
調製することを試みたところ、フラッシュクロマトグラフィーの後で、明黄色泡
状体が最初に得られた。この物質を真空下で一晩乾燥したところ、暗褐色のシロ
ップ状となり、分解したことが分かった。上記アントラキノンホスホルアミドエ
ステル試薬の全てが、調製後直ちに使用しなければならないという事実は、アン
トラキノン−オリゴマー複合体の大規模な合成を行う上であまり好適ではない。

【００１５】

【発明の解決しようとする課題】

本発明は、オリゴマーの自動化された固相合成用に設計された、一般式Ｉ：

【００１６】

【化７】

【００１７】 （式中、Ｙ及びＹ’は、各々独立に、所望により置換されたＣ_１−６アルキルか
ら選ばれるか、又は、Ｙ及びＹ’は、それらが結合する窒素と共に非芳香族Ｎ−
複素環を形成し； Ｗは酸素及び硫黄から選ばれ； Ｘは、所望により置換されたＣ_１−６アルキル及び所望により置換されたベン
ジルから選ばれ； Ｒ^Ｎは、水素、Ｃ_１−４アルキル、所望により置換されたベンジル、所望によ
り置換されたキノン及びヌクレオシドから選ばれ；そして、 Ｑは、所望により置換されたベンゾフェノンのような、所望により置換された
キノン及び所望により置換された光反応性ケトンから選ばれる。） で表される、安定なホスホルアミドエステル試薬に関する。

【００１８】 また、本発明は、以下のフラグメント：

【００１９】

【化８】

【００２０】 （式中、Ｑ及びＲ^Ｎは、上記式（Ｉ）に定義された通りであり；Ｗ及びＷ’は
、独立に酸素及び硫黄から選ばれ；そしてＶは、所望により置換されたＣ_１−６ アルキル、所望により置換されたベンジル、水素、Ｌｉ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋及びＮ
Ｈ_４ ^＋から選ばれる。） を含むオリゴマーにも関する。

【００２１】 更に、本発明は、一般式ＩＩ：

【００２２】

【化９】

【００２３】 （式中、Ｙ及びＹ’は、各々独立に、所望により置換されたＣ_１−６アルキル
から選ばれ、又は、Ｙ及びＹ’は、それらが結合する窒素と共に非芳香族Ｎ−複
素環を形成し； Ｘは、所望により置換されたＣ_１−６アルキル及び所望により置換されたベン
ジルから選ばれ； Ｗは、酸素及び硫黄から選ばれ； Ｑは、所望により置換されたキノン及び所望により置換された光反応性ケトン
から選ばれ； ｎは１から１０の整数であり；そして、 ｍは０又は１である。） で表される、安定なホスホルアミドエステル試薬にも関する。

【００２４】 また、本発明は、以下のフラグメント：

【００２５】

【化１０】

【００２６】 （式中、Ｑ、ｎ及びｍは上記式（ＩＩ）に定義された通りであり； Ｗ及びＷ’は、独立に酸素及び硫黄から選ばれ；そして、 Ｖは、所望により置換されたＣ_１−６アルキル、所望により置換されたベンジ
ル、水素、Ｌｉ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋及びＮＨ_４ ^＋から選ばれる。） を含むオリゴマーにも関する。

【００２７】

【課題を解決するための手段】

本出願人は、合成オリゴマーを炭素含有重合体へ共有結合によりカップリング
することを試み、二つの方法で成功した。その第一の方法では、エチレングリコ
ールリンカーを介して電子親和性反応基に結合した、アン トラキノン又はベンゾフェノン分子から成る光プローブを、ＵＶ光に短時間曝露
させて重合体表面にカップリングさせた。次いで、この重合体に結合した電子親
和性基と親核性アミノアルキルＯＮ類を反応させて、これらのオリゴマーを固定
化した。

【００２８】 第二の方法は、アントラキノンオリゴマー又はベンゾフェノンオリゴマーの自
動化された固相合成を含むものであった。アントラキノンオリゴマー類又はベン
ゾフェノンオリゴマー類を含む水溶液を弱いＵＶ光で照射することにより、アン
トラキノンオリゴマー類及びベンゾフェノンオリゴマー類が、アントラキノン部
位又はベンゾフェノン部位とこの溶液が塗布された表面との間の共有結合を介し
て、重合体表面に結合した。

【００２９】 本発明は、上記の欠点を有しない、驚くほど安定な、キノン−及び光反応性ケ
トンホスホルアミドエステル試薬の合成についてのものである。これらの新規な
試薬は、市販品として入手できる出発物質から簡便に合成される。前記の５’−
末端アントラキノンで標識化したホスホルアミドエステルとは逆に、本発明に従
ったホスホルアミドエステル試薬は、安定な油状物として単離され、反応性を失
うことなく−２０℃で数カ月も貯蔵でき、そして、標準的な自動化された固相合
成を用いてオリゴマー中に組み込まれ得る。同様に、本発明に従ったベンゾフェ
ノンホスホルアミドエステルは、安定な固体物質として単離され、反応性を失う
ことなく−２０℃で数カ月も貯蔵でき、そして、標準的な自動化された固相合成
を用いて、オリゴマー中に組み込まれ得る。

【００３０】 上記のように、本発明は、例えば、一般式Ｉ：

【００３１】

【化１１】

【００３２】 （式中、Ｙ及びＹ’は、各々独立に、所望により置換されたＣ_１−６アルキル
を表わしてよく、又は、Ｙ及びＹ’は、それらが結合する窒素と共に非芳香族Ｎ
−複素環を形成してよい。） で表される、安定なホスホルアミドエステル試薬に関する。

【００３３】 可能なＹ及びＹ’の中で、Ｙ及びＹ’が、それぞれエチル又はイソプロピルを
表すか、又は、Ｙ及びＹ’が、共にピロリジノ、ピペリジノ又はモルホリノ基を
表す場合が特に興味深いといえ、そして、Ｙ及びＹ’が、共にイソプロピルを表
す場合が特に興味深いといえる。

【００３４】 置換基Ｘは、所望により置換されたＣ_１−６アルキル及びベンジルから選ばれ
る。所望により置換されたＣ_１−６アルキルの例は、メチル、２−シアノエチル
、２−（４−ニトロフェニル）エチル、２−（２−ピリジル）エチル、２−（４
−ピリジル）エチル及び２−（Ｃ_１−６−アルキルスルホニル）エチルであり、
そしてその中でも、２−シアノエチルが現在のところ最も好ましい。

【００３５】 Ｗは酸素及び硫黄から選ばれ、この場合、酸素が最も好ましい。

【００３６】 Ｒ^Ｎは、水素、及び、メチル、エチル及びイソプロピルのようなＣ_１−４アル
キル、所望により置換されたベンジル、好適なリンカー、例えば、メチレンとポ
リメチレンを介して結合した、所望により置換されたキノン及びメチレンとポリ
メチレンリンカーを介して５’−Ｃで結合したヌクレオシドから選ばれ、好まし
くはＲ^Ｎは水素を表す。

【００３７】 Ｑは、所望により置換されたキノン、及び、所望により置換された光反応性ケ
トンから選ばれるグループを表す。

【００３８】 「キノン」の用語は、−ＣＨ_２−基が−Ｃ（＝Ｏ）−によって置換されている
ジヒドロ芳香族系であると理解される。この意味では、「キノン」は、１〜５個
の縮合炭素環を含むジ−又はテトラヒドロ芳香族系から誘導されるキノンを包含
する。そのようなキノンを表す例は、１，４−ベンゾキノン、１，２−ベンゾキ
ノン、ナフトキノン、アントラキノン、フェナントレンキノン、アリザリン、ル
ビアジン、ルシジン、ダムナカンラル、ムンジスチン（ｍｕｎｊｉｓｔｉｎ）、
クリソファノール、フラングラーエモジン、アロエーエモジン、モリンドン及び
コパレオラチン（ｃｏｐａｒｅｏｌａｔｉｎ）から誘導される。上記のように、
キノンは所望により置換されていてもよいが、現在、非置換キノン、特に、非置
換型のアントラセン及びフェナントレンキノンが、特別に好ましいと考えられて
いる。

【００３９】 特に興味を引く光活性ケトンの例は、アセトフェノン、ベンゾフェノン及びア
ントロン（ａｎｔｈｏｒｏｎｅ）状複素環、つまり、１０−位置の基が酸素、硫
黄又はＮＨで置換されたアントロンである。これらの光活性ケトンは、後述する
ように、所望により置換されてよい。特に興味ある光活性ケトンは、ベンゾフェ
ノンとアセトフェノンであり、その中で、非置換ベンゾフェノンが、現在、最も
好ましい。

【００４０】

【発明の実施の形態】

本発明の好ましい態様において、ホスホルアミドエステルは、以下の構造：

【００４１】

【化１２】

【００４２】 を有する。

【００４３】 本発明の好ましい態様において、ホスホルアミドエステルは以下の構造：

【００４４】

【化１３】

【００４５】 を有する。

【００４６】 例えば、ＯＮ類又はＯＤＮ類のようなオリゴマーにカップリングさせると、本
発明の試薬から新規な種類のオリゴマー類が得られる。このように、本発明は、
更に、以下のフラグメント：

【００４７】

【化１４】

【００４８】 （式中、Ｑ及びＲ^Ｎは、上記の式（Ｉ）で定義された通りであり； Ｗ及びＷ’は、独立に、酸素及び硫黄から選ばれ； Ｖは、所望により置換されたＣ_１−６アルキル、所望により置換されたベンジ
ル、水素、Ｌｉ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋及びＮＨ_４＋から選ばれ；そして、 「オリゴマー」は後述する定義の意味を有する。 好ましい態様において、Ｑはアントラキノンを表し、Ｒ^Ｎは水素を表し、Ｗ及
びＷ’は共に酸素を表し、そしてＶは水素を表す。） を含むオリゴマーにも関する。

【００４９】 また、本発明は、式ＩＩ：

【００５０】

【化１５】

【００５１】 （式中、Ｙ及びＹ’は、各々独立に、所望により置換されたＣ_１−６アルキル
を表してよく、又は、Ｙ及びＹ’は、それらが結合する窒素と共に非芳香族Ｎ−
複素環を形成する。） で表される、ホスホルアミドエステル試薬にも関する。

【００５２】 可能なＹ及びＹ’の中で、Ｙ及びＹ’が各々エチル又はイソプロピルを表し、
又は、Ｙ及びＹ’が、共にピロリジノ、ピペリジノ又はモルホリノ基を表す場合
が特に興味深いといえ、そして、Ｙ及びＹ’が、共にイソプロピルを表す場合が
特に興味深いといえる。

【００５３】 置換基Ｘは、所望により置換されたＣ_１−６アルキル及びベンジルからなる群
から選ばれる。所望により置換されたＣ_１−６アルキルの例は、メチル、２−シ
アノエチル、２−（４−ニトロフェニル）エチル、２−（２−ピリジル）エチル
、２−（４−ピリジル）エチル及び２−（Ｃ_１−６−アルキルスルホニル）エチ
ルであり、その中でも２−シアノエチルが、現在、最も好ましい。

【００５４】 Ｗは酸素及び硫黄から選ばれ、ここで、酸素が最も好ましい。

【００５５】 Ｑは、所望により置換されたキノン及び所望により置換された光反応性ケトン
から選ばれるグループを表す。そのようなキノンを表す例は、フェナントレンキ
ノン、１，４−ベンゾキノン、１，２−ベンゾキノン、ナフトキノン、アントラ
キノン、アリザリン、ルビアジン、ルシジン、ダムナカンラル、ムンジスチン（
ｍｕｎｊｉｓｔｉｎ）、クリソファノール、フラングラーエモジン、アロエーエ
モジン，モリンドン及びコパレオラチン（ｃｏｐａｒｅｏｌａｔｉｎ）から誘導
される。上記のように、キノンは所望により置換されていてよいが、非置換キノ
ン、特に、非置換型のアントラセン及びフェナントレンキノンが、特別に好まし
いと現在考えられている。

【００５６】 特に興味を引く、所望により置換された光活性ケトンの例は、ベンゾフェノン
、アミノ−、ヒドロキシル−、ハロゲン−、アシル−、ニトロ−及びシアノベン
ゾフェノンであり、これらの中で、非置換ベンゾフェノンが、現在、最も好まし
い。

【００５７】 ｎは、１から１０の整数である。ｎが１、２、３又は４のような１から４の範
囲の整数である変数が、特に有用であると、現在、考えられている。

【００５８】 ｍは、０又は１である。

【００５９】 好ましい態様において、Ｙ及びＹ’は共にイソプロピルであり、そして、Ｘは
２−シアノエチルを表す。

【００６０】 一般式ＩＩのホスホルアミドエステル試薬をオリゴマーの末端にカップリング
させると、以下のフラグメント：

【００６１】

【化１６】

【００６２】 （式中、Ｑ、ｎ及びｍは、式（ＩＩ）で先に定義された通りであり； Ｗ及びＷ’は、独立に酸素及び硫黄から選ばれ；そして、 Ｖは、所望により置換されたＣ_１−６アルキル、所望により置換されたベンジ
ル、水素、Ｌｉ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋及びＮＨ_４ ^＋から選ばれ；そして、 「オリゴマー」は後記の意味を有する。 好ましい態様において、Ｑはアントラセン又はフェナントレンキノンを表し、
Ｗ及びＷ’は共に酸素を表し、Ｖは水素であり、ｎは１であり、そして、ｍは０
である。） を含有するオリゴマーが得られる。このように、本発明は、更に、このフラグメ
ントを含むオリゴマーにも関する。

【００６３】 また、一般式Ｉ及びＩＩのホスホルアミドエステル試薬が、５’→３’から合
成されるオリゴマーの３’−ＯＨ末端にカップリングされ得ることも理解される
べきであろう。

【００６４】 ホスホルアミドエステル試薬の調製 好ましい態様において、アントラキノンホスホルアミドエステルは、以下の手
順によって合成された。

【００６５】 アントラキノンホスホルアミドエステル３の合成は、図１に示されるように、
市販品として入手できるアントラキノン−２−カルボン酸（１）を出発物質とし
て、二つの工程で実施された。ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジ
メチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸エステル（ＢＯＰ）の存在下
で、化合物１を３−アミノ−１−プロパノールとカップリングさせて、アミド２
を得た。次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミドクロリド−２−シアノ
エチルを用いた２のホスフィチル化によって、水洗（ａｑｕｅｏｕｓ ｗｏｒｋ
ｕｐ）後に、アントラキノンホスホルアミドエステル３を赤色油として得た。粗
生成物３を最少量の無水塩化メチレンに再溶解し、次いで、激しく撹拌した石油
エーテル中に０℃で沈殿させて、明黄色の粉体として３を得た。この生成物３を
真空下で一晩乾燥し、窒素中、−２０℃で貯蔵した。

【００６６】 アントラキノンホスホルアミドエステル５の合成は、図１に示されるように、
市販品として入手できる２−（ヒドロキシメチル）アントラキノン（４）を出発
物質とする一つのステップで実施された。３の調製と同じ手順を用いて、２−（
ヒドロキシメチル）ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミ
ノ）アントラキノン（４）のホスフィチル化により、対応するホスホルアミドエ
ステル５を黄色油として得、それを無水アセトニトリルと共蒸発させて、黄色固
体物質として５を得た。

【００６７】 これに代わる方法として、２−（ヒドロキシメチル）アントラキノン（４）を
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルアミド−２−シアノエチル及
びテトラゾールと反応させ、濾過及び水洗後、明黄色固体物質として、ホスホル
アミドエステル５を得た。

【００６８】 ホスホルアミドエステル３は、多くのアントラキノン−ＯＤＮ複合体用の自動
化された固相合成に使用されている。ジーン・アッセンブラー・スペシャル（Ｇ
ｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｓｐｅｃｉａｌ（登録商標））合成装置上での自
動化された固相合成における最終段階として、０．１Ｍ溶液を用いて５分間のカ
ップリング時間で、ホスホルアミドエステル３を、ＯＤＮの５’−末端に直接、
又は、５’−ヘキサエチルオキシグリコールスペーサー（Ｓｐａｃｅｒ（登録商
標））を介して、ＯＤＮにカップリングさせた。もう一つのチミジンヌクレオシ
ド（Ｔ）残基を試験的配列である５’−アントラキノン−Ｔ−３’へカップリン
グすることを試みたが、完全に失敗した（４，４’−ジメトキシトリチルの放出
が観察されなかった）ので、このカップリング効率は９８％を越えると推定され
た。合成されたアントラキノンオリゴヌクレオチドのこの二つの一般タイプを、
図２に示す。

【００６９】 好ましい態様において、ベンゾフェノンホスホルアミドエステルのような、所
望により置換された光反応性ケトンホスホルアミドエステルが、以下の手順によ
って合成された。

【００７０】 アントラキノンホスホルアミドエステル８の合成は、市販品として入手できる
ベンゾイル安息香酸（６）を出発物質として、二つのステップで実施された。ベ
ンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキ
サフルオロリン酸エステル（ＢＯＰ）の存在下で、化合物６を３−アミノ−１−
プロパノールとカップリングさせて、アミド７を得た。次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソ
プロピルホスホルアミドクロリド２−シアノエチルを用いた７のホスフィチル化
によって、ベンゾフェノンホスホルアミドエステル８を、淡黄色油として得た。
更に精製することなくこの油を使用し、窒素中、−２０℃で貯蔵した。

【００７１】 図３に、ベンゾフェノンホスホルアミドエステル試薬の合成を示す。ベンゾフ
ェノン−オリゴヌクレオチド複合体の調製のためのその応用は、図２に概略が示
されたアントラキノンオリゴヌクレオチド複合体に対するのものと類似していた
。

【００７２】 ホスホルアミドエステル８は、多くのアントラキノン−ＯＤＮ複合体のための
自動化された固相合成に使用されている。ジーン・アッセンブラー・スペシャル
（Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｓｐｅｃｉａｌ（登録商標））合成装置上で
の自動化された固相合成における最終段階として、０．２Ｍ溶液を用いて、５分
間のカップリング時間で、ホスホルアミドエステル８をＯＤＮの５’−ＯＨ末端
に直接、又は、５’−ヘキサエチルオキシグリコールスペーサー（Ｓｐａｃｅｒ
（登録商標））を介して、ＯＤＮにカップリングさせてよい。

【００７３】 ５’−アントラキノン又は５’−ベンゾフェノンを持つＤＮＡオリゴマーは、
照射によって固体支持体上に共有結合的に固定化でき、この固定化されたオリゴ
マーは、相補的ＤＮＡオリゴマーを効率的に捕捉する。

【００７４】 図７及び８に示されるように、ＡＱオリゴマーとＢＰオリゴマーの両者共、明
らかに濃度依存型の信号を発する。非相補的配列を使用した場合は、何の信号も
検出できなかった。アントラキノンと、ＡＱ及びＢＰオリゴマーのような、所望
により置換された光反応性ケトンオリゴマー類は、共に照射によって固体表面に
共有結合によって付着することができ、そして、このようにして付着したオリゴ
マー類は、それらの相補的ターゲットＤＮＡオリゴマー類にハイブリッド化でき
ると結論できる。

【００７５】 定義 本明細書において、「Ｃ_１−６アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルのような、
１から６個の炭素原子を有する、直鎖状、環状又は分岐状の炭化水素基を意味し
、好ましい「Ｃ_１−６アルキル」の例は、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ
チル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシ
ルで、特に、エチルである。同様に、「Ｃ_１−４アルキル」は、メチル、エチル
、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルのような
、１から４個までの炭素原子を有する、直鎖状、環状又は分岐状の炭化水素基を
意味する。

【００７６】 本明細書において、つまり、「アルキル」、「キノン」及び「光反応性ケトン
」の用語とも関連して、「所望により置換された」という用語は、問題の基が１
又は数回、好ましくは１〜４回、ヒドロキシル、アミノ、ハロゲン、アシル、ニ
トロ及びシアノ、Ｃ_１−６−アルコキシ、Ｃ_１−６−アルキル（キノン及び光反
応性ケトンの場合にのみ有効）、ホルミル、カルボキシル、Ｃ_１−６−アルコキ
シカルボニル、Ｃ_１−６−アルキルカルボニル、アリール、アリーロキシカルボ
ニル、アリールカルボニル、ヘテロアリール、 モノ−及びジ（Ｃ_１−６−アル
キル）アミノ、カルバモイル、モノ−及びジ（Ｃ_１−６−アルキル）アミノカル
バモイル、アミノ−Ｃ_１−６−アルキルアミノカルボニル、モノ−及びジ（Ｃ_{１ −６} −アルキル）アミノ−Ｃ_１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ_１−６−
アルキルカルボニルアミノ、カルバミドから選ばれた基で置換されてもよく、こ
こで、Ｃ_１−６−アルキル、アリール及びヘテロアリールは、１〜５回、好まし
くは１〜３回、ヒドロキシル、アシル、Ｃ_１−４−アルキル、Ｃ_１−４−アルコ
キシ、ニトロ、シアノ、アミノ又はハロゲンで置換されてよいことを意味する。

【００７７】 「ハロゲン」には、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素が含まれる。

【００７８】 本明細書において、「オリゴマー（類）」という用語は、オリゴヌクレオチド
類（ＯＮ類）、オリゴデオキシヌクレオチド類（ＯＤＮ類）及びそれらの誘導体
を意味し、例えば、ロックドヌクレオシド類似体類（ＬＮＡ類）のように炭水化
物部位において修飾されたＯＮ類／ＯＤＮ類、チオリン酸エステル、アミドリン
酸エステル及びメチルホスホン酸エステルのような、結合しているリン酸ジエス
テルにおいて修飾されたＯＮ類／ＯＤＮ類、複素環式塩基において修飾されたＯ
Ｎ類／ＯＤＮ類、そしてペプチド核酸類（ＰＮＡ類）のように「骨格」において
修飾されたＯＮ類／ＯＤＮ類をいう。オリゴマーは、１〜１０００単位、例えば
、１〜１０００ヌクレオチド、好ましくは１〜２００単位、より好ましくは５〜
３０単位を形成することができ、各オリゴマーは、異なった種類の単位、例えば
ＯＤＮ−ＬＮＡ複合体を含んでもよい。「オリゴマー」という用語は、また、３
’−ＯＨ末端の５’→３’から合成されたオリゴマー類と同様に、５’−ＯＨ末
端の３’→５’から合成されたオリゴマー類を意味することも理解されるべきで
ある。

【００７９】

【実施例】

実施例１ Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）−２−アントラキノンカルボアミド（１９３
ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルを用いて一度蒸発させて乾燥さ
せ、そして窒素中で無水アセトニトリル（５ｍｌ）中に懸濁させた。この懸濁液
にＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルアミド２−シアノエチル（
１５０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）とテトラゾール（０．４３Ｍアセトニトリル溶
液１．０ｍｌ、０．４３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を撹拌し、１０℃で
１時間加熱し、室温で一晩撹拌し、そして、^３１Ｐ−ＮＭＲでこのリン試薬の全
てが反応したことを示す（１２３及び１３２ｐｐｍでの信号が消え、生成物の信
号は１４６．４ｐｐｍである）まで、４０℃で更に（通常３〜４時間）加熱した
。この反応混合物（濃厚スラリー）を窒素中で濾過し（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｏｌ
ｙ−Ｐｒｅｐカラムを充填剤として使用）、そして、残留物を無水アセトニトリ
ルで洗浄して、濾液を約５ｍｌとなるようにした。この溶液（ホスホルアミドエ
ステルにして約０．１Ｍ）を、その日の内にＤＮＡ合成装置上で直接使用した。
ホスホルアミドエステルは、室温下、溶液中でゆっくり分解し、そして、単離を
試みたが分解した。

【００８０】 実施例２ 無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍｌ）中の、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−アン
トラキノンカルボアミド（５００ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）の窒素下での懸濁液
に、ジイソプロピルアミン（１．０ｍｌ、５．７４ｍｍｏｌ）を添加し、続いて
、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミドクロリド２−シアノエチル（０．３８
ｍｌ、１．７０ｍｍｏｌ）を滴下しながら添加した。得られた明黄色溶液を室温
で３０分間撹拌し、次いで、トリエチルアミン（１ｍｌ）を含有する酢酸エチル
（１０ｍｌ）中に注いだ。この混合物をＮａＨＣＯ_３飽和水溶液（２×５ｍｌ）
と塩水（２×５ｍｌ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）し、減圧下で蒸発させた
。残留物を、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチ
ル：石油エ−テル：トリエチルアミン＝４５：４５：１０）にかけ、６４０ｇの
黄色シロップを得たが、それは、高真空下で一晩乾燥させた後に、暗赤色ガムに
変わった。

【００８１】 Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−アントラキノンカルボアミド（５１０ｍ
ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルア
ミド２−シアノエチル（０．５５ｍｌ、１．７３ｍｍｏｌ）とテトラゾール（０
．４５Ｍアセトニトリル溶液３．６５ｍｌ、１．６４ｍｍｏｌ）で、無水ＣＨ_２ Ｃｌ_２（２０ｍｌ）中、室温で１２０分間処理し、この反応混合物を濾過し、水
洗し、溶媒を蒸発させた後、黄色い泡状体を得たが、それは、高真空下で一晩乾
燥させた後に、分解して暗褐色シロップになった。

【００８２】 実施例３ Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−２−アントラキノンカルボアミド（２）の
調製 ＤＭＦ（１３０ｍｌ）中、アントラキノン−２−カルボン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ
、１０．００ｇ、３９．６４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、攪拌下、（ベンゾトリアゾ
ール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオ
ロリン酸エステル（１７．５４ｇ、３９．６６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（
１１．０５ｍｌ、７９．２８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物（最初は明
緑色溶液）を室温で１０分間攪拌した後、３−アミノ−１−プロパノール（３．
３４ｍｌ、４３．６７ｍｍｏｌ）を滴下するように添加した。この反応混合物（
明茶色溶液）を室温暗所で１７時間攪拌した。この溶液を、若干の氷を含む水（
３００ｍｌ）中に細流状態で注いだ。沈殿した物質を濾過し、沸騰９６％エタノ
−ル（約２００ｍｌ）からの再結晶によって単離し、そして、標題の化合物２を
明黄色固体として得た（６．９３ｇ、収率５７％）。 ^１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．７４（２Ｈ、ｑｕｉ
ｎｔｅｔ、Ｊ＝６．５２Ｈｚ、ＣＨ_２）、３．２５−３．４４（２Ｈ、ｍ、ＣＨ _２ ）、３．５０（２Ｈ、ｂｒｏａｄ ｔ、Ｊ＝５．８０Ｈｚ、ＣＨ_２）、４．５
３（１Ｈ、ｂｒｏａｄ ｓ、ＯＨ）、７．７６−８．００（２Ｈ、ｍ、Ａｒ）、
８．０４−８．３６（４Ｈ、ｍ、Ａｒ）、８．５６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．５５Ｈ
ｚ、Ａｒ）、８．８９（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．４２Ｈｚ、ＮＨ） ^１３Ｃ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄσ）δ：３２．３２、３６．９
６、５８．６８、１２５．５０、１２６．８３、１２６．８５、１２７．０５、
１３２．７９．１３３．０４、１３３．０８、１３４．４５、１３４．６６、１
３９．４９、１６４．６２、１８２．１１

【００８３】 実施例４ Ｎ−（３−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ）
プロピル）−２−アントラキノンカルボアミド（３）の調製 Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−２−アントラキノンカルボアミド（２）（
１．００ｇ、３．２３ｍｍｏｌ）を、窒素中で無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍｌ）に
懸濁させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２４ｍｌ、７．１２ｍ
ｍｏｌ）を攪拌しながら添加し、続いて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミ
ドクロリド２−シアノエチル（０．７２ｍｌ、３．２３ｍｍｏｌ）を滴下しなが
ら添加した。得られた少し濁った反応混合物を室温で２５分間撹拌した。この混
合物を濾過して、トリエチルアミン（１０ｍｌ）を含有する酢酸エチル（１００
ｍｌ）で希釈し、そして、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液（２×２０ｍｌ）で洗浄した
。この有機溶液を乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）し、減圧下で蒸発させた。残留物を最少
量のＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、激しく攪拌した氷冷軽質石油エーテル（２００ｍｌ
）中に滴下しながら添加した。沈殿した黄色粉末を濾過して集め、高真空下で一
晩乾燥し、３を得た（１．２６ｇ、収率７７％）。この化合物は、窒素中−２０
℃で数ヶ月間、著しい分解を起こさずに貯蔵できた。 ^１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：１．１７（ｄ、Ｊ＝６．８６
Ｈｚ、ＣＨ_３）、１．８７−２．１５（ｍ、ＣＨ_２）、２．７０（ｔ、Ｊ＝５．
７２Ｈｚ、ＣＨ_２）、３．４１−４．０４（ｍ、ＣＨ_２ 、ＣＨ）、７．１７（
ｂｒｏａｄ ｔ、Ｊ＝５．４９Ｈｚ、ＮＨ）、７．７６−７．８７（ｍ、Ａｒ）
、８．２４−８．４１（ｍ、Ａｒ）、８．５９（ｄ、Ｊ＝１．６５Ｈｚ、Ａｒ） ^１３Ｃ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：２０．４３、２０．５４、
２４．６９、３０．２２、３０．３３、３８．５３、４３．０３、４３．２３．
５８．１９、５８．５１、６２．４５、６２．７４、１１７．９０、１２５．０
４、１２７．３９、１２７．８３、１３３．１５、１３３．４２、１３４．３９
，１３５．０４，１３９．８０，１６５．５７，１８２．５０^３１ Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１４８．４９

【００８４】 実施例５ ２−［２−シアノ］エトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシメチル
）］アントラキノン（５）の調製 無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（４２ｍｌ）中、２−（ヒドロキシメチル）アントラキノン
（Ｆｌｕｋａ、１．００ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、窒素雰囲気下で攪拌
しながら、（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルアミド２−シア
ノエチル（１．３３ｍｌ、４．２０ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、テトラゾール
（ＣＨ_３ＣＮ中０．４５Ｍ、８．８６ｍｌ）を滴下しながら添加した。この反応
混合物を室温で９０分間攪拌し、得られた塩を濾過した。この濾液をＣＨ_２Ｃｌ _２ （５０ｍｌ）で希釈し、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液（２×２０ｍｌ）と塩水（２
０ｍｌ）で洗浄した。この有機溶液を乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）し、減圧下で蒸発さ
せた。残留した黄色固体物質を無水ＣＨ_３ＣＮと共に共蒸発させ、高真空下で一
晩乾燥させて、５を明黄色固体として得た（１．８４ｇ、収率１００％）。 １Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：１．２３（ｄ、Ｊ＝６．９６
Ｈｚ、ＣＨ_３）、２．６９（ｔ、Ｊ＝６．４１Ｈｚ、ＣＨ_２）、３．６５−３．
７５（ｍ、ＣＨ）、３．８４−３．９７（ｍ、ＣＨ_２ ）、４．８２−４．９５
（ｍ、ＣＨ_２）、７．７７−７．８２（ｍ、Ａｒ）、８．２７−８．３２（ｍ、
Ａｒ） ^１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：２０．２９、２０．３５、
２４．５０、２４．５７、４３．１３、４３．２６、５８．３２、５８．５１．
６４．４８、６４．６６、１１７．４０、１２５．０３、１２７．０４、１２７
．４１、１３２．０１、１３２．２１、１３２．４８、１３３．３７、１３３．
３９，１３３．８９、１３３．９６，１３４．０７，１４５．９５、１４６．０
３，１８２．６８，１８２．８９ ^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１４９．７６

【００８５】 実施例６ ５’−末端アントラキノン−ＯＮ類の調製 最初に、ＤＮＡ−合成装置ファルマシア・ジーン・アッセンブリー・スペシャ
ル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｐｌｅｒ Ｓｐｅｃｉａｌ（登
録商標））上で、このプロトコール（０．２μｍｏｌ又は１．３μｍｏｌスケー
ル）に従った標準的なホスホルアミドエステルのカップリング条件と、標準的な
２’−デオキシヌクレオシドＣＰＧ、又は、ポリスチレン固体支持体を用いて、
非修飾ＯＤＮ配列を合成した。まだこの合成装置上にある間に、０．１Ｍ溶液を
用いて、カップリング時間５分で、ＯＤＮ配列の５’−ＯＨ末端をホスホルアミ
ドエステル試薬（３）又は（５）とカップリングさせた。もう一つのチミジンヌ
クレオシド（Ｔ）残基を、試験的配列の５’−アントラキノン−Ｔ−３’へカッ
プリングすることを試みたが、完全に失敗した（４，４’−ジメトキシトリチル
の放出が観察されなかった）ので、カップリング効率は９８％を超えると推定さ
れた。

【００８６】 本合成が完了した後に、所望のアントラキノン−ＯＤＮを固体支持体から開裂
し、３２％のＮＨ_４ＯＨを用いて５５〜６０℃で１０〜１５時間の培養によって
核酸塩基の保護基を除去した。粗アントラキノン−ＯＤＮ−複合体を、逆相ＨＰ
ＬＣ（Ｃ−１８、１００オングストローム、１５ｍ、３００×３．９ｍｍ内径）
により、勾配が１００％、０．０５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．４
）から１００％Ｈ_２Ｏ（５０％）／ＣＨ_３ＣＮ（５０％）、ｖ／ｖの条件で精製
した。

【００８７】

【表１】

【００８８】 実施例７ 光固定化されたアントラキノン−ＯＤＮ−複合体を、ミクロタイタープレート中
で効率的かつ特異的に相補的ＯＤＮ類とハイブリッド化する。 アントラキノン−ＯＤＮ−複合体１−６（表１を参照）、非修飾コントロール
ＯＤＮ−Ａ（５’−ａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇ−３’）及びＯＤＮ−Ｂ
（５’−ｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ−３’）を、記載された通りに合
成した。全てのＯＤＮ類を、最終濃度が０．１μＭとなるように０．２ＭのＬｉ
Ｃｌ中で希釈し、ウエルあたり１００μＬを、ミクロタイタープレート（ＭＴＰ
、Ｎｕｎｃ、Ｐｏｌｙｓｏｒｐ）に分配した。このＯＤＮ溶液を、弱いＵＶ光で
１５分間照射した。照射の後、このＭＴＰを３００μＬの脱塩水で４回洗浄した
。１００μＬ／ウエルの０．００４μＭの相補的なビオチン化オリゴマー、５’
−ビオチン−ｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔ−３’（ビオチン−相補的ＯＤ
Ｎ−Ａ）、又は、５’−ビオチン−ａｃｔｇｇｃｃｇｔｃｇｔｔｔｔａｃ−３’
（ビオチン−相補的ＯＤＮ−Ｂ）を、室温にて２時間で、２×ＳＳＣＴ（３０ｍ
Ｍクエン酸塩、０．３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅ
ｅｎ２０）中にて、固定化したオリゴマーにハイブリッド化させた。３００μＬ
の１×ＳＳＣＴ（１５ｍＭクエン酸塩、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０、０
．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で３回、そして、リン酸塩で緩衝処理され
た塩水（ＰＢＳＴ、０．１５ＭのＮａ^＋、ｐＨ７．２、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔ
ｗｅｅｎ２０）で１回洗浄した後、このＭＴＰに、１μｇ／ｍＬワサビダイコン
ペルオキシダーゼを接合したストレプトアビジン（Ｐｉｒｃｅ）を、１００μＬ
／ウエルで添加した。このＭＴＰを、室温にて３０分間培養し、そして、３００
μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。

【００８９】 １００μＬの基材溶液（０．１ｍＬのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液、ｐＨ５．
０、０．６６ｍｇ／ｍＬ、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド、０．０１
２％（ｖ／ｖ）Ｈ_２Ｏ２）を添加することによって、ウエルのペルオキシダーゼ
活性を評価し、０．５ＭのＨ_２ＳＯ_４を１００μＬ添加して３０分後に反応を停
止し、そして、ミクロタイタープレート読み取り器において、４９２ｎｍでの吸
光度を測定した。

【００９０】 図４に示すように、アントラキノン−ＯＤＮ−複合体１−６（表１を参照）は
、それらに特異的な相補的なビオチン化されたオリゴマーを、非常に効率的に、
かつ、対応する非修飾コントロール−ＯＤＮ捕捉プローブＡ及びＢよりも著しく
良好に捕捉する。これら捕捉プローブが、それらに無関係な相補的なビオチン化
されたＯＤＮ類と共に培養された場合は、何の信号も観察されない。

【００９１】 実施例８ アントラキノン−ＯＮ複合体アレー（ａｒｒａｙ）を用いた一塩基多形（ＳＮＰ
）の検出 アレイイット・スポッティング溶液（ＡｒｒａｙＩｔ（登録商標）、Ｔｅｌｅ
ｃｈｅｍ社、ロット９９３０１）の４つの溶液を調製した。溶液１（ポジティブ
コントロール）：７μＭのＯＮ７（表１）、溶液２（ネガティブコントロール）
：純粋なスポッティング溶液（Ｎｅｇ）、溶液３（野生型捕捉プローブ）：７μ
ＭのＯＮ８（表１）及び溶液４（変異体の捕捉プローブ）：７μＭのＯＮ９（表
１）。

【００９２】 Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈ ＰｉｘＳｙｓ ３５００スポッティングロボ
ットを、ミクロタイタープレートからシラン化されたスライド上にこれら４種の
溶液を配列（ａｒｒａｙ）するようにプログラムした。これらのスポットは、各
々３０ｎＬとし、４×４配列（ａｒｒａｙ）で１ｍｍ離した位置とし、各溶液の
４つのレプリカは以下のテンプレートに従った。

【００９３】

【００９４】 スポッティングに続き、これらスポットを室温で１０分間、乾燥し、次に、上
下両方の光とガラス板ホルダーを用いてＵＶ光を３０分間、ＵＬＳ−２０−２照
射器中で照射した。最後に、これらのスライドを、ＭｉｌｌｉＱ水（２５スライ
ド当たり約１００ｍｌ）で３×１０分洗浄した。

【００９５】 ハイブリッド化の評価においては、試料、レポーター系及びポジティブコント
ロールを後述のように種々に組合せて、６個のスポットスライドを培養した。２
つの合成５０量体−ＯＤＮを試料として用いた：一つは変異体（ＭＴ）、もう一
方は野生型（ＷＴ）である、問題のＳＮＰを含む遺伝子のヌクレオチド配列を示
す。いずれかの５０量体試料が、固定化捕捉プローブにハイブリッド化されたか
どうかを検出するため、変異体及び野生型の５０量体の両者に共通の配列に相補
的で、かつ、５’位置においてビオチンでマーキングした２５量体のＯＤＮ検出
プローブを使用した。Ｃｙ５−標識化ストレプトアビジン（ＳＡ／Ｃｙ５）と共
に培養することによって、ビオチンの存在が検出された。ポジティブコントロー
ルとして、ＯＮ７に相補的で、かつ、５’−末端にＣｙ５蛍光団でマーキングし
たＯＤＮ（Ｐｏｓ−Ｃｙ５：３’−ｃｔａａｇａｔｔｔｔｃｔｇｃａｔａｇｃａ
ｔｇｃａｔｔａａｔ−Ｃｙ５−５’）を使用した。

【００９６】 これらのスライドを、２０μＬのハイブリッド化混合物を用いて、カバースラ
イドをかけて３７℃で３０分間培養した。以下の６種のハイブリッド化混合物を
使用した（全て２×ＳＳＣ）。

【００９７】 1． ０．１μＭの「同型接合体」野生型試料： ３．６μＬ ＷＴ５０量体（Ｓｔｏｃｋ：２．８μＭ） ４７．２μＬ ＯＤＮ−Ｂｉｏ（Ｓｔｏｃｋ：１．０６μＭ） １．０μＬ Ｐｏｓ−Ｃｙ５（Ｓｔｏｃｋ：１．０μＭ） ４０μＬ ５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（２×ＳＳＣ最終） ８．２μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水

【００９８】 ２． ０．１μＭの「同型接合体」変異体試料： ７．１μＬ ＭＴ５０量体（Ｓｔｏｃｋ：１．４μＭ） ４７．２μＬ ＯＤＮ−Ｂｉｏ（Ｓｔｏｃｋ：１．０６μＭ） １．０μＬ Ｐｏｓ−Ｃｙ５（Ｓｔｏｃｋ：１．０μＭ） ４０μＬ ５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（２×ＳＳＣ最終） ４．７μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水

【００９９】 ３． ０．１μＭの「異型接合体」試料： ３．６μＬ ＷＴ５０量体（Ｓｔｏｃｋ：２．８μＭ） ７．１μＬ ＭＴ５０量体（Ｓｔｏｃｋ：１．４μＭ） ４７．２μＬ ＯＤＮ−Ｂｉｏ（Ｓｔｏｃｋ：１．０６μＭ） １．０μＬ Ｐｏｓ−Ｃｙ５（Ｓｔｏｃｋ：１．０μＭ） ４０μＬ ５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（２×ＳＳＣ最終） １．１μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水

【０１００】 ４． ０．１μＭの「異型接合体」試料、Ｐｏｓ−Ｃｙ５： ３．６μＬ ＷＴ５０量体（Ｓｔｏｃｋ：２．８μＭ） ７．１μＬ ＭＴ５０量体（Ｓｔｏｃｋ：１．４μＭ） ４７．２μＬ ＯＤＮ−Ｂｉｏ（Ｓｔｏｃｋ：１．０６μＭ） ４０μＬ ５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（２×ＳＳＣ最終） ２．１μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水

【０１０１】 ５． ０．０１μＭのポジティブコントロールのみ： １．０μＬ Ｐｏｓ−Ｃｙ５（Ｓｔｏｃｋ：１．０μＭ） ４０μＬ ５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（２×ＳＳＣ最終） ５９μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水

【０１０２】 ６． ０．５μＭの検出オリゴのみ： ４７．２μＬ ＯＤＮ−Ｂｉｏ（Ｓｔｏｃｋ：１．０６μＭ） ４０μＬ ５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（２×ＳＳＣ最終） １２．８μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水

【０１０３】 ハイブリッド化に続いて、室温にて１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（約５０ｍｌ
ｐｒ、６スライド）で３×５分間スライドを洗浄し、２０μＬのＳＡ／Ｃｙ５
（２×ＳＳＣで２．５μｇ／ｍＬ）で、カバ−スライドをかけて室温にて３０分
間ハイブリッド化した。最後に、これらスライドを、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤ
Ｓ（６スライド当たり約５０ｍｌ）で３×５分間洗浄し、乾燥し、そして共焦点
レーザースキャナーで読み取った（図５）。このレーザースキャナーからのＴＩ
ＦＦ像を、専用の画像解析ソフトウエアを用いて解析し、得られた棒グラフを図
６に表す。本図は、ＡＱオリゴ類が、高品質のオリゴヌクレオチドアレー（ａｒ
ｒａｙ）の効率的な生産に使用できることを、明らかに示している。

【０１０４】 前記の６つの走査の各々は、一つの配列（ａｒｒａｙ）を表す（図５）。各配
列（ａｒｒａｙ）は個別に解析され、個々のスライド上で実施される。試料との
ハイブリッド化の前に、ＡＱ−オリゴヌクレオチドの一つの配列（ａｒｒａｙ）
がスライド上に並べられ、そして、ＵＶ照射を介して固定化されている。配列（
ａｒｒａｙ）上にスポットが並べられた後のテンプレートを以下に表により示す
。

【０１０５】

【０１０６】 ここで、Ｎｅｇはネガティブコントロールを表し、ＯＮ８は変異体捕捉プロー
ブであり、ＯＮ７はポジティブコントロールであり、そして、ＯＮ９は野生型の
捕捉プローブである。このパタ−ンが各スライド上で４回（２×２）繰返される
。

【０１０７】 ここで解析された６個の試料は次の通りである： １．ポジティブコントロールを含む同型野生型 「野生型スポット」及び「ポジティブコントロールスポット」のみがこのスラ
イド上で点灯し、このようにして、解析される試料の「遺伝子型」が同型の野生
型であることが決定可能である。 ２．ポジティブコントロールを含む同型変異体 「変異体スポット」と「ポジティブコントロールスポット」のみがこのスライ
ド上で点灯し、このようにして、解析される試料の「遺伝子型」が同型の変異体
であることが決定可能である。 ３．ポジティブコントロールを含む異型複合体 「野生型スポット」、「変異体スポット」及び「ポジティブコントロールスポ
ット」のいずれもがこのスライド上で点灯し、このようにして、解析される試料
の「遺伝子型」が不均一な野生型であることが決定可能である。 ４．ポジティブコントロールを含まない異型複合体 ３）におけると同様、「野生型スポット」、「変異体スポット」の両者がこの
スライド上で点灯し、このようにして、解析される試料の「遺伝子型」が異型の
野生型であることが決定可能である。調製中にポジティブコントロールオリゴマ
ーが試料に添加されなかったので、「ポジティブコントロールスポット」は点灯
せず、このようにして、ポジティブコントロールスポットへの試料の「クロスト
ーク」（ｃｒｏｓｓ ｔａｌｋ）／非特異的ハイブリッド化が除外可能である。
５．ポジティブコントロール単独 ハイブリッド化中に試料が存在しないため、ポジティブコントロールスポット
のみが点灯し、このようにして、ポジティブコントロールと「野生型」及び「変
異体スポット」の間の「クロストーク」（ｃｒｏｓｓ ｔａｌｋ）が除外可能で
ある。 ６．ブランク（ネガティブコントロール） １つのアレーが、試料とコントロールを含まない緩衝液を用いてハイブリッド
化される場合、いずれのスポットからも何の信号も得られない。

【０１０８】 スライド１、２及び３中の変異体及び野生型のスポットからの信号強度を、専
用プログラム（Ｏｐｔｉｑｕａｎｔ）を用いて定量し、そして、図６において棒
グラフで提示した。

【０１０９】 実施例９ （Ｉ）Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−２−ベンゾフェノンカルボアミド（
７）の調製 ４−ベンゾイル安息香酸（Ｆｌｕｋａ、＞９８％、５．０ｇ、２２ｍｍｏｌ）
のＨＰＬＣグレードＤＭＦ（７０ｍｌ）溶液に、ＢＯＰ（１０．２６ｇ、２３．
２０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（５．８８ｍｌ、４２．１９ｍｍｏｌ）を添
加し、そして、得られた混合物を室温で１０分間攪拌した。３−アミノ−１−プ
ロパノール（１．７８ｍｌ、２３．２７ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を
、室温で一晩攪拌した。この暗黄色溶液を水（４００ｍｌ）に注ぎ、生成物を酢
酸エチル（３×２５０ｍｌ）で抽出した。集めた有機層を、塩水（１００ｍｌ）
で洗浄し、乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、減圧下で蒸発させた。放置して固化させた
残留黄色シロップを酢酸エチルとヘキサンから再結晶し、白色固体物質として化
合物７を得た（２．３８ｇ、収率３８％）。 ^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：１．８３（２Ｈ、ｑｕｉｎｔ
ｅｔ、Ｊ＝５．８６Ｈｚ、ＣＨ_２）、３．６５（２Ｈ、“ｑ”、Ｊ＝５．８５Ｈ
ｚ、ＣＨ_２）、３．７６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．６８Ｈｚ、ＣＨ_２）、７．４６−
７．８９（９Ｈ、ｍ、Ａｒ）^１３ Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：３１．６０、３７．６６、６
０．１４、１２６．８１、１２８．３０、１２９．８８、１３２．７９、１３６
．７５．１３７．４１、１３９．８６、１８７．２９、１９５．９３

【０１１０】 （II）Ｎ−（３−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ
キシ）プロピル）−２−ベンゾフェノンカルボアミド（８）の調製 アルコ−ル７（５００ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を窒素中で無水ＣＨ_２Ｃｌ_２ （１５ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルア
ミド２−シアノエチル（０．５６ｍｌ、１．７６ｍｍｏｌ）とテトラゾール（０
．４５ＭのＣＨ_３ＣＮ溶液３．８０ｍｌ、１．７１ｍｍｏｌ）を添加し、この反
応混合物を、室温で１２０分間攪拌した。形成した固体物質（テトラゾリウム塩
）を濾過して取り出し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍｌ）で水洗した。集めた透明濾液
を、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液（２×３０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４ ）、減圧下で蒸発させた。粗生成物を高真空下で乾燥させ、淡黄色油状物として
ホスホルアミド８を得た（８１２ｍｇ、収率９５％）。それを、更なる精製を行
わずに使用した。 ^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１４８．４５

【０１１１】 ホスホルアミドエステル８（ホスホルアミドエステル７を、Ｎ，Ｎ−ジイソプ
ロピルエチルアミンの存在下で、Ｎ，Ｎ−ホスホルアミドクロリド２−シアノエ
チルでホスフィチル化することによって得られた）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２又はトルエ
ンからヘキサン中に沈殿させようと試みたが、不可能であった。これは本物質が
本質的に油状物質であることを示す。しかしながら、ホスホルアミドエステル８
は、窒素中、−２０℃で数週間、そしておそらく数ヶ月間、分解することなく保
存できる。

【０１１２】 実施例１０ ５’−末端ベンゾフェノン（ＢＰ）−オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）
複合体の調製 ＥＸＰＥＤＩＴＥ（登録商標）８０００ＤＮＡ合成装置上で、以下の二つのＢ
Ｐ−ＯＤＮ複合体を合成した。 （１） ５’−ＢＰ−ＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_３−ＨＥＧ−ｇｔａａａａｃｇａｃ
ｇｇｃｃａｇｔ−３’ （２） ５’−ＢＰ−ＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_３−ＨＥＧ−ａａｃａｇｃｔａｔｇ
ａｃｃａｔｇ−３’

【０１１３】 本合成装置（０．２μｍｏｌスケール）のプロトコルに従って、標準的なホス
ホルアミドエステルのカップリング条件、および、標準的な２’−デオキシヌク
レオシドＣＰＧ固体支持体を用いて、上記オリゴヌクレオチド配列を調製した。
まだ本合成装置上にある間に、ＣＨ_３ＣＮ中、０．１Ｍ溶液を用い、標準カップ
リング時間（１００秒）で、ＯＤＮの５’−ＯＨ末端をベンゾフェノンホスホル
アミドエステル試薬８とカップリングさせた。もう一つのチミジンヌクレオシド
残基の試験的配列：５’−ＢＰ−ｔ−３’へのカップリングを試みたが失敗した
（４，４’−ジメトキシトリチルの放出が観察されなかった）ので、カップリン
グ効率は９８％を超えると推定された。

【０１１４】 上記ＢＰ−ＯＤＮを固体支持体から開裂させ、ブロックを解き、そして前述の
ように精製した（実施例６参照）。

【０１１５】 オリゴデオキシヌクレオチドを含有するベンゾフェノン組成物を、ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦにより検証した。

【０１１６】 ５’アントラキノン又は５’ベンゾフェノンを有するＤＮＡオリゴマーを、照
射によって固体支持体上に共有結合により固定化することができ、そして、この
固定化されたオリゴマーは、相補的ＤＮＡオリゴマーを効率的に捕捉する。

【０１１７】 アントラキノン（ＡＱ）及びベンゾフェノン（Ｂ）オリゴヌクレオチドを水で
希釈し、その濃度を２６０ｎｍで求めた。 タイプＡオリゴマー：ＡＱ１−Ｃ３−配列（表１のエントリー４）、ＡＱ１−
Ｃ３−ＨＥＧ−配列（表１のエントリー５）、ＡＱ１−Ｃ３−ＨＥＧ−２−配列
（表１のエントリー６）、ＡＱ２−Ｃ３−配列（表１のエントリー１０）及びＢ
Ｐ−Ｃ３−配列（実施例１０のオリゴ１）。 タイプＢオリゴマー：ＡＱ１−Ｃ３−配列（表１のエントリー４）、ＡＱ１−
Ｃ３−ＨＥＧ−配列（表１のエントリー２）、ＡＱ１−Ｃ３−ＨＥＧ２−配列（
表１のエントリー３）、ＡＱ２−Ｃ３−配列（表１のエントリー１１）及びＢＰ
−Ｃ３−配列（実施例１０のオリゴ２）。 ０．２ＭのＮａＣｌ（１２．５μＭ）中で所望のオリゴ濃度に希釈し、更に、
０．２ＭのＮａＣｌ中で５倍に希釈（２．５，０．５、０．１、０．０２、０．
００４、０．００８μＭ）した。各オリゴマーに対し，各濃度毎に１００μＬを
ミクロタイターウエルに分配した。固定化は、ミクロタイタープレート（ＭＴＰ
）の上方１０ｃｍから弱いＵＶ光を１５分間照射する手順で実施した。次いで、
このＭＴＰを３×３００μＬ／ウエルの脱塩水で洗浄した。

【０１１８】 ２μＭの相補的ビオチン化オリゴヌクレオチド（タイプＡオリゴマー：５’−
ビオチン−ＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴ−３’及びタイプＢオリゴマー：
５’−ビオチン−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ−３’に相補的）を固定
化したオリゴヌクレオチドに、１００μＬ／ウエルの２×ＳＳＣＴ（３０ｍＭク
エン酸塩、０．３ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ
２０）中にて、３７℃、６０分間でハイブリッド化した。このＭＴＰを３×３０
０μＬ／ウエルのリン酸塩で緩衝処理した塩水（１×ＰＢＳＴ、０．１５＋、ｐ
Ｈ ７．２、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、１×ＰＢＳＴ
中で希釈した、１００μＬ／ウエル、１μＬ／ｍｌのワサビダイコンペルオキシ
ダーゼと複合体化したストレプトアビジンと、３７℃にて１５分間培養した。３
×３００μＬ／ウエルの１×ＰＢＳＴで洗浄した後、０．６６ｍｇのｏ−フェニ
レンジアミン、０．１Ｍのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液、ｐＨ５．０及び、０．
０１２％のＨ_２Ｏ２（１００μＬ／ウエル）の添加に続いて、簡便な熱量終点測
定を行った。１００μＬ／ウエルの０．５Ｍ、Ｈ_２ＳＯ_４を添加し、９０秒後に
反応を停止し、ミクロタイタープレートの読み取り機で４９２ｎｍにおける吸光
度を測定した。

【０１１９】 図７及び８に示すように、ＡＱオリゴマーとＢＰオリゴマーは、共に、明らか
に濃度依存型信号を発する。非相補的配列を用いた場合は、何の信号も検出でき
なかった。本発明者らは、ＡＱ及びＢＰオリゴマーの両者を、照射によって固体
表面に共有結合によって類似した効率で付着することができ、そして、このよう
にして付着したオリゴマーを、それらの相補的ターゲットＤＮＡオリゴマーにハ
イブリッド化できると結論づける。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、アントラキノンホスホルアミドエステル３及び５の合成を示す。

【図２】 図２は、合成したアントラキノンオリゴヌクレオチドの２つの一般タイプの合
成を示す。

【図３】 図３は、ベンゾフェノンホスホルアミドエステル試薬の合成を示す。

【図４】 図４は、吸光度測定により各捕捉プローブのオリゴマー捕捉を示す図である。

【図５】 図５は、共焦点レーザースキャナーで走査した一つの配列（ａｒｒａｙ）を表
す。

【図６】 図６は、レーザースキャナーからのＴＩＦＦ像を、専用の画像解析ソフトウエ
アを用いて解析し、得られた棒グラフを示す。

【図７】 図７は、タイプＡ配列の、０．２Ｍ塩化ナトリウム中での、アントラキノンと
ベンゾフェノンがカップリングしたオリゴヌクレオチドの関数としての、固定化
効率を示す。

【図８】 図８は、タイプＢ配列の、０．２Ｍ塩化ナトリウム中での、アントラキノンと
ベンゾフェンがカップリングしたオリゴヌクレオチドの関数としての、固定化効
率を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式Ｉ： 【化１】 （式中、Ｙ及びＹ’は、各々独立に、所望により置換されたＣ_１−６アルキルか
   ら選ばれるか、又は、Ｙ及びＹ’は、それらが結合する窒素と共に非芳香族Ｎ−
   複素環を形成し； Ｗは、酸素及び硫黄から選ばれ； Ｘは、所望により置換されたＣ_１−６アルキル及び所望により置換されたベン
   ジルから選ばれ； Ｒ^Ｎは、水素、Ｃ_１−４アルキル、所望により置換されたベンジル、所望によ
   り置換されたキノン及びヌクレオシドから選ばれ；そして、 Ｑは所望により置換されたキノン及び所望により置換された光反応性ケトンか
   ら選ばれる。） で表されるホスホルアミドエステル試薬。
2. 【請求項２】 Ｒ^Ｎが水素である、請求項１に記載の試薬。
3. 【請求項３】 Ｑがキノン又は所望により置換されたベンゾフェノンである
   、請求項１又は２に記載の試薬。
4. 【請求項４】 キノンがアントラキノンである、請求項３に記載の試薬。
5. 【請求項５】 キノンがフェナントレンキノンである、請求項３に記載の試
   薬。
6. 【請求項６】 Ｑがベンゾフェノンである、請求項３に記載の試薬。
7. 【請求項７】 Ｙ及びＹ’が、エチル及びイソプロピル、特にイソプロピル
   から選ばれる、請求項１〜６のいずれかに記載の試薬。
8. 【請求項８】 Ｙ及びＹ’が共にイソプロピルである、請求項７に記載の試
   薬。
9. 【請求項９】 Ｙ及びＹ’が、それらが結合する窒素と共にモルホリノ環
   を形成する、請求項１〜６のいずれかに記載の試薬。
10. 【請求項１０】 Ｘが２−シアノエチルを表わし、そしてＷが酸素を表わす
    、請求項１〜９のいずれかに記載の試薬。
11. 【請求項１１】 下記式： 【化２】 で表される、請求項１に記載の試薬。
12. 【請求項１２】 下記式： 【化３】 で表される、請求項１に記載の試薬。
13. 【請求項１３】 下記のフラグメント： 【化４】 （式中、Ｒ^Ｎは水素、Ｃ_１−４アルキル、所望により置換されたベンジル、所望
    により置換されたキノン及びヌクレオシドから選ばれ； Ｑは、所望により置換されたキノン及び所望により置換された光反応性ケトン
    から選ばれ； Ｗ及びＷ’は独立に酸素及び硫黄から選ばれ；そして、 Ｖは所望により置換されたＣ_１−６アルキル、所望により置換されたベンジル
    、水素、Ｌｉ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋及びＮＨ_４ ^＋から選ばれる。） を含むオリゴマー。
14. 【請求項１４】 Ｒ^Ｎが水素であり、そして、Ｑがアントラキノン及び所望
    により置換されたベンゾフェノンから選ばれる、請求項１３に記載のオリゴマー
    。
15. 【請求項１５】 Ｒ^Ｎが水素であり、そして、Ｑがフェナントレンキノンで
    ある、請求項１３に記載のオリゴマー。
16. 【請求項１６】 Ｒ^Ｎが水素であり、そして、Ｑがベンゾフェノンである、
    請求項１３に記載のオリゴマー。
17. 【請求項１７】 次式ＩＩ： 【化５】 （式中、Ｙ及びＹ’は、各々独立に、所望により置換されたＣ_１−６アルキルか
    ら選ばれるか、又は、Ｙ及びＹ’は、それらが結合する窒素と共に非芳香族Ｎ−
    複素環を形成し； Ｘは、所望により置換されたＣ_１−６アルキル及び所望により置換されたベン
    ジルから選ばれ； Ｗは酸素及び硫黄から選ばれ；Ｑは、所望により置換されたキノン及び所望に
    より置換された光反応性ケトンから選ばれ； ｎは１から１０の整数であり；そして、 ｍは０又は１である。） で表されるホスホルアミドエステル試薬。
18. 【請求項１８】 下記のフラグメント： 【化６】 （式中、Ｑ、Ｗ、Ｗ’、Ｖ、ｎ及びｍは、請求項１６に定義されたとおりである
    。） を含むオリゴマー。
19. 【請求項１９】 Ｑがアントラキノンであり、ｍが０であり、そしてｎが１
    である、請求項１８に記載のオリゴマー。
20. 【請求項２０】 Ｑが所望により置換されたベンゾフェノンであり、ｍが０
    であり、そしてｎが１である、請求項１８に記載のオリゴマー。
21. 【請求項２１】 Ｑがフェナントレンキノンであり、ｍが０であり、そして
    ｎが１である、請求項１８に記載のオリゴマー。
22. 【請求項２２】 Ｑがベンゾフェノンであり、ｍが０であり、そしてｎが１
    である、請求項１８に記載のオリゴマー。