ES2240413T3 - Procedimiento de sintesis de inmovilizacion de acidos nucleicos sobre un soporte solido silanizado. - Google Patents
Procedimiento de sintesis de inmovilizacion de acidos nucleicos sobre un soporte solido silanizado.Info
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Abstract
Uso, para la síntesis o la inmovilización de ácidos nucleicos, de un soporte sólido modificado por una monocapa autoensamblada organizada que comprende al menos un compuesto organosilícico que responde a la fórmula (I) en la cual - n está comprendido entre 15 y 35, - m es igual a 0 o a 1, - X1, X2 y X3, que pueden ser iguales o diferentes entre sí, se seleccionan en el grupo constituido por los grupos alquilo saturado en C1- a C6, lineales o ramificados, y los grupos hidrolizables, representando al menos uno de X1, X2 y X3 un grupo hidrolizable. - . A representa el grupo ¿O-(CH2-CH2-O)k-(CH2)i- en el que k está comprendido entre 0 y 100 e i representa un número entero superior o igual a 0, - en el caso en que m = 0, entonces B representa un grupo ¿OCOR, -OR, -COOR o un átomo de halógeno, representando R un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo en C1 a C6, lineal o ramificado, - en el caso en que m = 1: u si k =0 e i = 0, entonces B representa un grupo R1, u si k = 0 e i = 1, entonces B representa un grupo ¿OR1, -OCOR1, -NR1R2, -COOR1, -CONR1R2, -SR1 o un átomo de halógeno, u si k = 1 e i = 0, entonces B representa un grupo ¿R1, -COR1, -COOR1 o ¿CONR1R2, u si k = 1 e i = 1, entonces B representa un grupo ¿OR1, -OCOR1, -NR1R2, -COOR1, -CONR1R2, -SR1 o un átomo de halógeno, u R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno, una cadena hidrocarbonada eventualmente sustituida, saturada o insaturada y lineal o ramificada, que comprende de 1 a 24 átomos de carbono, o un grupo aromático.
Description
Procedimiento de síntesis y de inmovilización de
ácidos nucleicos sobre un soporte sólido silanizado.
La presente invención se refiere a la
utilización, para la síntesis o la inmovilización de ácidos
nucleicos, de un soporte sólido modificado por una monocapa
auto-ensamblada organizada de uno o varios
compuestos organosilícicos, así como a procedimientos de síntesis y
de inmovilización de ácidos nucleicos sobre un soporte sólido.
Para efectuar síntesis químicas o inmovilizar
moléculas sobre una superficie mineral, es en primer lugar necesario
injertar en ésta, agentes de acoplamiento que van a garantizar la
fijación de las moléculas orgánicas sobre el sustrato mineral.
Se han propuesto con este objetivo, agentes de
acoplamiento organosilícicos, por L.A. CHRISEY et al.
(Nucleic Acids Research, 1996, 24, 15,
3031-3039) y U. MASKOS et al., (Nucleic
Acids Research, 1992, 20, 7, 1679-1684).
Los agentes utilizados, a saber el
3-glicidoxipropiltrimetoxisilano y diferentes
aminosilanos, presentan sin embargo el inconveniente de depositarse
de manera aleatoria y no reproducible en la superficie. Forman en
ésta una película no homogénea cuyo espesor no puede ser controlado,
película que además es poco robusta respecto de tratamientos
químicos ulteriores, implicando en efecto la
no-homogeneidad de la película una mala protección
de los enlaces siloxánicos. Por lo tanto es muy difícil obtener un
injerto reproducible de estas moléculas. Antes de fijar o de
sintetizar oligonucleótidos sobre el sustrato, son necesarias
reacciones de superficie suplementarias para disminuir el gen
estérico en la superficie (por ejemplo injerto de moléculas
heterocíclicas bifuncionales, como se describe en L.A CHRISEY et
al.), hacer que la superficie sea más hidrófila (U. MASKOS et
al., describen el injerto de etilenglicol, pentanal o
hexaetilenglicol) y/o paliar la baja reactividad de las funciones de
superficie, operaciones suplementarias que, también ellas, tampoco
están dominadas.
A. ULMAN ha descrito en Chem. Rev. 1996,
96 1533.1554, la formación de monocapas autoensambladas
organizadas en soportes sólidos con la ayuda de compuestos
organosilícicos de tipo alquiltriclorosilanos funcionalizados. Se
propone su utilización para la fijación de biomoléculas,
procedimiento que necesita verosímilmente, en este contexto, una
modificación de la biomolécula por una función tiol y una
modificación de la superficie por moléculas heterobifuncionales.
De este modo, los inventores se han marcado como
objetivo, paliar los inconvenientes de la técnica anterior y
proporcionar procedimientos de síntesis y de inmovilización de
biomoléculas, particularmente de ácidos nucleicos, sobre soportes
sólidos modificados por películas monocapas densas y
organizadas.
La presente invención tiene por objeto la
utilización, para la síntesis o la inmovilización de ácidos
nucleicos, de un soporte sólido modificado por una monocapa
autoensamblada organizada que comprende al menos un compuesto
organosilícico que responde a la fórmula (I)
en la
cual
- -
- n está comprendido entre 15 y 35, preferiblemente entre 20 y 25,
- -
- m es igual a 0 o a 1,
- -
- X_{1}, X_{2} y X_{3}, que pueden ser iguales o diferentes entre sí, se seleccionan en el grupo constituido por los grupos alquilo saturado en C_{1}- a C_{6}, lineales o ramificados, y los grupos hidrolizables, representando al menos uno de X_{1}, X_{2} y X_{3} un grupo hidrolizable.
- -
- A representa el grupo -O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{k}-(CH_{2})_{i}- en el que k está comprendido entre 0 y 100, preferiblemente entre 0 y 5, e i representa un número entero superior o igual a 0, preferiblemente igual a 0 o a 1,
- -
- en el caso en que m = 0, entonces B representa un grupo -OCOR,-OR, -COOR o un átomo de halógeno, representando R un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo en C_{1} a C_{6}, lineal o ramificado,
- -
- en el caso en que m = 1:
- \bullet
- si k = 0 e i = 0, entonces B representa un grupo R_{1},
- \bullet
- si k = 0 e i \geq 1, entonces B representa un grupo -OR_{1}, -OCOR_{1}, -NR_{1}R_{2}, -COOR_{1}, -CONR_{1}R_{2}, -SR_{1} o un átomo de halógeno,
- \bullet
- si k \geq 1 e i = 0, entonces B representa un grupo -R_{1}, -COR_{1}, -COOR_{1} o -CONR_{1}R_{2},
- \bullet
- si k \geq 1 e i \geq 1, entonces B representa un grupo -OR_{1}, -OCOR_{1}, -NR_{1}R_{2}, -COOR_{1}, -CONR_{1}R_{2}, -SR_{1} o un átomo de halógeno,
- \bullet
- R_{1} y R_{2}, que pueden ser iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno, una cadena hidrocarbonada eventualmente sustituida, saturada o insaturada y lineal o ramificada, que comprende de 1 a 24 átomos de carbono, o un grupo aromático.
Cuando B representa un grupo -OR_{1},
-OCOR_{1}o -COOR_{1}, indiferentemente de los valores de i, y
cuando k \geq 1, entonces se entiende que B puede representar todo
grupo resultante de la protección de una función hidroxilo o ácido
carboxílico, tal como los grupos protectores descritos en
Protective groups in organics synthesis (T. W. GREENE et
al., segunda edición, Wiley Interscience), por ejemplo un grupo
protector cíclico.
En el sentido de la presente invención y en lo
que sigue, se entiende por "ácidos nucleicos" tanto
oligonucleótidos como ADN o ARN, o también ácidos nucleicos con
esqueleto o bases modificados, tales como los ácidos nucleicos
peptídicos (PNA: Peptide Nucleic Acids) que hacen intervenir enlaces
peptídicos en lugar de los enlaces fosfodiésteres.
Se entiende por "aromático" todo grupo que
posee uno o diversos núcleos arilo, por ejemplo un núcleo fenilo. Se
entiende por "monocapa autoensamblada organizada" un conjunto
de moléculas en el cual las moléculas están organizadas,
organización debida a interacciones y a una fuerte cohesión entre
las cadenas de las moléculas, dando lugar a una película
anisotrópica estable y ordenada (A. ULMAN, Chem. Rev., 1996,
96, 1533-1554).
Una monocapa autoensamblada organizada formada
sobre un soporte sólido permite la obtención de una superficie
orgánica densa, homogénea y de parámetros bien definidos tanto
química como estructuralmente. La formación de esta monocapa,
obtenida gracias a las propiedades de autoensamblado de los
compuestos de fórmula (I) para valores de n, m, k e i bien
definidos, es perfectamente reproducible para cada compuesto
organosilícico. Además, la formación de una monocapa autoensamblada
organizada, muy densa, protege los enlaces siloxánicos respecto de
los tratamientos químicos (ácidos o básicos),lo que permite
realizar reacciones químicas variadas sobre esta superficie.
Los compuestos organosilícicos de fórmula (I)
utilizados en la presente invención presentan ventajosamente
funcionalidades muy variadas y una gran reactividad, en atención a
la naturaleza del grupo A y a la diversidad de los grupos B
terminales utilizables, pudiendo, por supuesto, estos grupos B,
modificarse y funcionalizarse a voluntad según las reacciones de
química orgánica bien conocidas por el experto en la técnica.
La uso según la presente invención permite, de
manera particularmente ventajosa y mediante los compuestos
organosilícicos de fórmula (I) seleccionados, sintetizar o
inmovilizar ácidos nucleicos sobre un soporte de manera fiable y
reproducible en atención a la homogeneidad y a la estabilidad de la
monocapa autoensamblada organizada formada sobre el soporte. Los
ácidos nucleicos se sintetizan o inmovilizan sobre el soporte
modificado por enlaces covalentes fuertes, sin degradación de los
enlaces siloxánicos desarrollados entre los compuestos
organosilícicos y el soporte sólido.
Soportes sólidos apropiados son, de manera
general, aquellos cuya superficie está hidratada y/o aquellos cuya
superficie presenta grupos hidroxilo. Preferiblemente, dicho
soporte se selecciona en el grupo constituido por los vidrios,
cerámicas (por ejemplo de tipo óxido), metales (por ejemplo el
aluminio o el oro) y metaloides (tal como el silicio).
En el sentido de la presente invención, se
entiende por "hidrolizable" todo grupo capaz de reaccionar con
un ácido en medio acuoso de manera a proporcionar los compuestos
X_{1}H, X_{2}H o X_{3}H, siendo X_{1}, X_{2} y X_{3}
tal como se definen en la fórmula (I).
Según una realización ventajosa, dicho grupo
hidrolizable se selecciona en el grupo constituido por los átomos de
halógeno, siendo el grupo -N(CH_{3})_{2} y los
grupos -OR', R'' un grupo alquilo saturado en C_{1} a C_{6},
lineal o ramificado.
En lo relativo a los grupos B y los grupos
hidrolizables, átomos de halógeno apropiados son tanto flúor como
cloro, bromo o yodo.
Según otra realización ventajosa, X_{1},
X_{2} y X_{3} representan átomos de cloro, n es igual a 22, m
es igual a 1, i es igual a 0, k es igual a 1 o a 3 y B representa
un grupo -COCH_{3}.
Según otra realización ventajosa, X_{1},
X_{2} y X_{3} representan átomos de cloro, n es igual a 22, m
es igual a 1, i es igual a 1, k es igual a 2 y B representa un
grupo -COOCH_{3}.
Según otra realización ventajosa, X_{1},
X_{2} y X_{3} representan átomos de cloro, n es igual a 16, 22
o 27, m es igual a 0 y B representa un grupo -OCOCH_{3}.
Según otra realización ventajosa, X_{1},
X_{2} y X_{3} representan átomos de cloro,n es igual a 21, m es
igual a 0 y B representa un grupo -COOCH_{3}.
La utilización de soportes sólidos modificados
según la presente invención es particularmente ventajosa para la
preparación de chips de ADN, a saber soportes sobre los cuales se
fijan, de manera covalente, un conjunto de ADN de secuencias
conocidas en un orden muy preciso, pudiendo reutilizarse estos chips
varias veces. Tales chips de ADN permiten, por hibridación de los
ADN inmovilizados sobre el soporte con ácidos nucleicos u
oligonucleótidos diana, determinar la secuencia de estas moléculas
diana o seguir la expresión de genes. Las aplicaciones son
numerosas: descubrimiento de nuevos genes, de nuevos fármacos,
realización de diagnósticos, estudios de toxicidad, etc.
La presente invención tiene igualmente por objeto
un procedimiento de síntesis de ácidos nucleicos sobre un soporte
sólido, caracterizado porque dicho soporte está modificado por una
monocapa autoensamblada organizada que comprende al menos un
compuesto organosilícico que responde a la fórmula (I) tal como se
ha definido anteriormente, y porque comprende las siguientes
etapas:
- a)
- preparación de un soporte modificado por una monocapa autoensamblada organizada que comprende al menos un compuesto organosilícico que responde a la fórmula (I) tal como se ha definido anteriormente, en el que dichos compuestos organosilícicos presentan en su extremo una función hidroxilo o amina protegida;
- b)
- eventualmente, desprotección de la función hidroxilo o amina;
- c)
- acoplamiento covalente, de manera localizada, de un nucleótido sobre el soporte modificado obtenido en la etapa a) o b):
- d)
- reiteración de la etapa c) al menos una vez con nucleótidos idénticos o diferentes.
Por "contaminantes" del soporte sólido, se
entiende todo compuesto tal como grasa, polvos u otros, presente en
la superficie del soporte y que no forma parte de la estructura
química del propio soporte.
Según la naturaleza del soporte sólido, la etapa
I) se puede efectuar con la ayuda de uno o diversos disolventes y/o
oxidantes y/o hidroxilantes (por ejemplo un mezclador sulfocrómico),
de un detergente (por ejemplo Hellmanez®), de un tratamiento
fotoquímico con ozono o cualquier otro tratamiento apropiado.
Durante la etapa j), a título de ejemplos de
funciones hidroxilo o amina protegida, se pueden citar los grupos
-OCOR' y -NR'R'', en los que R' y R'' representan cadenas alquilo.
Cualquier otro grupo resultante de la protección de una función
hidroxilo o amina también se puede considerar.
La etapa j) puede realizarse ventajosamente en
una mezcla de al menos un disolvente hidrocarbonado no polar y de al
menos un disolvente polar. En este caso, las proporciones
volumétricas de disolvente no polar y de disolvente polar están
preferiblemente comprendidas entre 70/30 y 95/5.
A título de ejemplos y de manera no limitativa,
durante la etapa j), un disolvente hidrocarbonado no polar
utilizable es el ciclohexano y un disolvente polar utilizable es el
cloroformo.
Durante la etapa j) la concentración del
compuesto organosilícico en la mezcla de disolventes está
preferiblemente comprendida entre 1.10^{-5} y 1.10^{-2}
mol/litro.
La etapa k) de silanización del soporte se puede
efectuar durante un tiempo comprendido entre 1 minuto y 3 días y a
una temperatura comprendida entre -10ºC y 120ºC según los
disolventes utilizados.
Durante el procedimiento de síntesis de ácidos
nucleicos sobre un soporte sólido según la presente invención, la
etapa b) se puede realizar por cualquier técnica conocida por el
experto en la técnica, por ejemplo por un tratamiento con potasa.
Las etapas c) y d) se pueden realizar por la química de los
fosforamiditas o por cualesquiera otras químicas que permitan el
acoplamiento covalente de nucleótidos conocidas por el experto en la
técnica, descritas por ejemplo en A. ELLINGTON y J.P. POLLARD en
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons
Inc., Nueva York.
Según una realización ventajosa del procedimiento
de síntesis según la invención, una etapa de injerto, en el extremo
de dichos compuestos organosilícicos, de brazos espaciadores que
llevan funciones hidroxilo o amina terminal se efectúa después de la
etapa a) o b) y antes de la etapa c).
Tales brazos espaciadores pueden ser de carga,
longitud y polaridad variables según las propiedades deseadas. Por
ejemplo, pueden comprender una cadena cargada (tal como un
fosforamidita con un sitio abásico), una cadena hidrófila no cargada
(tal como un polietilenglicol), una cadena hidrófoba no cargada (tal
como una cadena alquilo), o también una cadena que comprende un
grupo lábil al amoniaco (tal como el grupo -SO_{2}).
La etapa c) de acoplamiento covalente de un
nucleótido sobre el soporte modificado se realiza de manera
localizada, es decir en un lugar determinado del soporte.
La reiteración de la etapa c) se puede realizar
tantas veces como se desee; se puede, por ejemplo, efectuar la etapa
c) un centenar de veces, sabiendo que el rendimiento disminuye más
allá de tal número.
Los nucleótidos acoplados en las etapas c) y d)
están preferiblemente protegidos de manera adecuada, tal como se
describe en la bibliografía relativa a síntesis oligonucleotídicas
sobre soportes. Ulteriormente a la etapa d), se entiende que los
ácidos nucleicos sintetizados sobre el soporte sólido se pueden
desproteger por todo tratamiento químico apropiado, por ejemplo
amoniaco. Este tratamiento no se acompaña de una escisión de los
ácidos nucleicos del soporte, salvo si un brazo espaciador lábil al
amoniaco se ha introducido entre estos ácidos nucleicos y la
superficie silanizada.
La presente invención tiene igualmente por objeto
un procedimiento de inmovilización de ácidos nucleicos sobre un
soporte sólido, caracterizado porque dicho soporte está modificado
por una monocapa autoensamblada organizada que comprende al menos un
compuesto organosilícico que responde a la fórmula (I) tal como se
define anteriormente, y porque comprende las siguientes etapas:
- a)
- preparación de un soporte sólido modificado por una monocapa autoensamblada organizada que comprende al menos un compuesto organosilícico que responde a la fórmula (I) tal como se define anteriormente, en el que dichos compuestos organosilícicos presentan en su extremo una función ácido carboxílico o amina protegida.
- b)
- Eventualmente, desprotección de la función ácido carboxílico o amina;
- c)
- Eventualmente, en el caso en el que el soporte sólido modificado lleva funciones ácido carboxílico terminal, activación de estas funciones;
- d)
- Puesta en contacto del soporte sólido modificado obtenido en la etapa a), b) o c) con una o diversas soluciones aplicadas localmente, en uno o diversos disolventes polares, ácido(s) nucleico(s) que hay que inmovilizar, llevando dichos ácidos nucleicos en uno de sus extremos un brazo espaciador funcionalizado, bien por una función amina, en el caso en que el soporte sólido modificado lleva funciones ácido carboxílico terminal eventualmente protegida, o bien por una función ácido carboxílico activada, en el caso en que el soporte sólido modificado lleva funciones amina terminal eventualmente protegida; y
- e)
- Lavado del soporte sólido sobre el cual se inmovilizan dichos ácidos nucleicos.
La etapa a) se realiza ventajosamente como se
indica anteriormente en relación con el procedimiento de síntesis de
ácidos nucleicos sobre un soporte sólido, con una diferencia
aproximada, durante la etapa j), el compuesto organosilícico
presenta en un extremo una función ácido carboxílico o amina
protegida.
La etapa c) de activación de las funciones ácido
carboxílico se puede, por ejemplo, efectuar con la ayuda de una
solución de N-hidroxisuccinimida o de carbodiimida,
o también cualquier otro reactivo de activación conveniente y
conocido por el experto en la técnica.
Durante la etapa d), se entiende que, para
solubilizar los ácidos nucleicos, se podría utilizar toda solución
que permite una buena solubilidad de estos últimos y un control de
la evaporación de la solución; se puede citar, a título de ejemplo
y de manera no limitativa, una mezcla acetonitrilo/agua. Cada
solución de ácido nucleico que hay que inmovilizar se deposita en un
lugar determinado del soporte por un medio adaptado de
microdeposición.
Según una realización ventajosa del procedimiento
de inmovilización conforme a la invención, una etapa de injerto, en
el extremo de dichos compuestos oganosilícicos, de brazos
espaciadores que llevan funciones ácido carboxílico o amina terminal
se efectúa después de la etapa a) o b) y antes de la etapa c). Se
describen tal como anteriormente unos brazos espaciadores
convenientes.
La presente invención tiene, además, por objeto
un chip de ADN, caracterizado porque se obtiene por el procedimiento
de inmovilización de ácidos nucleicos según la presente invención,
en el que dichos ácidos nucleicos son ADN.
El chip de ADN según la invención presenta la
ventaja de ser estable y por lo tanto poderse reutilizar en
numerosos ciclos de hibridación y de desnaturalización.
Además de las disposiciones que anteceden, la
invención comprende también otras disposiciones que se desprenderán
de la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos de síntesis
de compuestos organosilícicos utilizables en el marco de la
presente invención y de síntesis o de inmovilización de ácidos
nucleicos sobre soportes sólidos modificados por una monocapa
autoensamblada organizada de estos compuestos, así como a los
dibujos anexos, en los cuales:
- las figuras 1, 2 y 3 ilustran la síntesis de
precursores insaturados de los compuestos organosilícicos de fórmula
(I) en la cual m = 1,
- la figura 4 ilustra la sililación de estos
precursores insaturados,
- la figura 5 representa precursores insaturados
de compuestos organosilícicos de fórmula (I) en la cual m = 0,
- la figura 6 representa espectros infrarrojos
realizados después de tres experimentos de injerto del compuesto
organosilícico 14 sobre la superficie de sílice de sustratos
Au/Si/SiO_{2},
- la figura 7a representa la densidad, analizada
por espectroscopia Raman, de la superficie del sustrato
Au/Si/SiO_{2} sobre el cual se injertan los compuestos
organosilícicos 14; las figuras 7b y 7c representan los espectros
Raman en dos puntos diferentes de esta superficie, y
- la figura 8 representa experimentos sucesivos
de hibridación (figuras 8d, 8f y 8h) y de desnaturalización (figuras
8e, 8g y 8i) a partir de sustratos Au/Si/SiO_{2} modificados por
una monocapa de compuestos organosilícicos de fórmula (I) sobre el
cual los oligonucleótidos L 185 y U226 han sido sintetizados (figura
8a).
Se ha de entender, sin embargo, que estos
experimentos se proporcionan únicamente a título ilustrativo del
objeto de la invención, del cual no constituyen de manera alguna
una limitación.
En un matraz de tres bocas de 500 ml, bajo
atmósfera inerte, se introduce magnesio (1,8 g; 70 mmol). El
derivado bromado insaturado 1 (16,3 g; 70 mmol), previamente
disuelto en 70 ml de THF (tetrahidrofurano) anhidro, se añade gota a
gota. Algunas gotas de dibromoetano pueden ser necesarias para
activar el magnesio. La mezcla de reacción se lleva a reflujo
durante 1h 30 mn con el fin de obtener el magnesiano 2, que se
utilizará inmediatamente.
En un matraz de tres bocas seco de 250 ml, bajo
atmósfera inerte, el bromo-alcohol 3 (17,7 g; 70
mmol; 1eq.) se disuelve en 70 ml de THF anhidro. La solución se
enfría a -78ºC y a continuación se añade gota a gota metillitio (50
ml; 80 mmol; 1,1 eq.). Se obtiene alcoholato de litio 4.
El magnesiano 2 se enfría a -78ºC, y a
continuación se añade yoduro de cobre (1,1 g; 3,5 mmol; 0,05 eq.).
La solución se agita durante 25 minutos a -78ºC, y a continuación se
calienta a temperatura ambiente hasta obtener un color púrpura. La
solución se enfría inmediatamente a -78ºC y el alcoholato de litio 4
se introduce con la ayuda de una cánula en atmósfera de argón. La
solución se agita durante 1 h a -78ºC y a continuación durante 18 h
a temperatura ambiente. El exceso de metillitio se destruye por
adición de etanol, seguido de una hidrólisis en medio ácido por
adición de una solución acuosa de ácido clorhídrico al 10%. La fase
orgánica se extrae tres veces con éter dietílico. Las fases éter se
reúnen, se lavan con una solución de ácido clorhídrico al 10% con
agua y finalmente con una solución acuosa saturada de NaHCO_{3}.
La fase orgánica se lava a continuación hasta neutralidad, se seca
sobre NgSO_{4} y a continuación se concentra a vacío. El producto
se purifica por reprecipitación en acetona. El compuesto 5 se
obtiene en forma de un sólido blanco (19,8 g; punto de fusión de
61,7-62,8ºC; rendimiento del 8,7%). Su análisis por
infrarrojos y RMN del protón y del carbono 13 es el siguiente.
IR(v(cm^{-1})); 3330; 3079; 2919;
2851; 1642.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
6,0-5,7 (m; 1H); 5,1-4,7 (m; 2H);
3,6 (t; 2H); 2,2-1,9 (m; 2H) y
1,7-1,2 (m, 37 H en el que 1H intercambiable en
D_{2}O).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
139,3; 113,8; 62,8; 33,6-25,8 (19
CH_{2}).
El alcohol 5 obtenido anteriormente (15 g; 46
mmol; 1 eq.) y piridina (40,36 ml; 6 mmol; 0,1 eq.) se introducen en
un matraz de dos bocas de 250 ml, equipado con una agitación
magnética y rematado por un refrigerante ascendente. Se añade a
continuación cloruro de tionilo (6 ml; 70 mmol; 1,5 eq.) gota a
gota. El medio de reacción se agita durante 1 hora y a continuación
se lleva a reflujo hasta la completa desaparición de la banda OH
(seguida por espectroscopia infrarroja). El medio de reacción se
hidroliza a continuación y después se extrae tres veces con éter
dietílico. Las fases éter se reúnen, se lavan con una solución de
ácido clorhídrico al 10%, con agua, y a continuación con una
solución saturada en NaHCO_{3}. La fase éter se lava a
continuación hasta neutralidad, se seca sobre MgSO_{4} y se
concentra a vacío. El compuesto 6 se obtiene en forma de un sólido
amarillo, y a continuación se purifica por cromatografía sobre
sílice (eluyente: éter de petróleo/éter, v/v 70/30); se obtiene un
sólido blanco (14g; punto de fusión de 34,1-34,9º;
rendimiento del 75%). Su análisis por infrarrojos y RMN del protón y
del carbón 13 es el siguiente.
IR (dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3076; 2917;
2849; 1641.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
6,0-5,7 (m; 1H); 5,1-4,7 (m; 2H);
3,5-3,3 (t; 2H); 2,2-1,9 (m; 2H) y
1,7-1,2 (m, 36 H).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
139,3; 113,8; 33,8-25,6 (20 CH_{2}).
En un matraz 250 ml, el compuesto clorado
insaturado 6 (10,6 g; 32 mmol) y yoduro sódico (2 g; 140 mmol; 4
eq.) se solubilizan en acetona (40 ml). La solución se lleva
entonces a reflujo durante 18 h. El medio de reacción se extrae con
éter dietílico, las fases se reúnen y a continuación se lavan con
agua, se secan sobre MgSO_{4} y se concentran a vacío. El producto
se purifica por precipitaciones en acetona. El compuesto 7 se
obtiene en forma de un sólido amarillo (11 g; punto de fusión de
41,1-42,0ºC; rendimiento del 81%). Su análisis por
infrarrojos y RMN del protón y del carbono 13 es el siguiente.
IR (dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3076; 2917;
2849; 1641.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
6,0-5,7 (m; 1H); 5,1-4,7 (m; 2H);
3,2-3,0 (t; 2H); 2,2-1,9 (m; 2H) y
1,7-1,2 (m, 36 H).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
139,3; 113,8; 33,8-25,6 (20 CH_{2}).
Una solución de etilenglicol (11,5 g; 180 mmol;
10 eq.) y sosa previamente reducida a polvo (3,7 g; 90 mmol; 5 eq.)
en 20 ml de THF anhidro se lleva a reflujo durante 30 minutos. Se
añade el compuesto yodado 1 (8 g; 18 mmol; 1 eq.) y
tetrabutil-hidrogenosulfato de amonio (0,62 g; 1,8
mmol; 0,1 eq.). El medio de reacción se lleva a continuación a
reflujo durante 72 horas. Después de la vuelta a temperatura
ambiente, se introduce una solución acuosa de ácido clorhídrico
(10%, 50 ml). El medio de reacción se extrae a continuación tres
veces con éter dietílico; las fases éter se reúnen, se lavan dos
veces con una solución de ácido clorhídrico al 10%, con agua, y a
continuación con una solución saturada en NaHCO_{3}. La fase éter
se lava a continuación hasta neutralidad, se seca sobre MgSO_{4}
y se concentra a vacío. El sólido obtenido se reprecipita en
diclorometano, y a continuación se purifica por cromatografía sobre
sílice(eluyente: diclorometano/acetato de etilo; v/v 30/70).
El compuesto 8 obtenido en forma de un sólido blanco (1,4 g; punto
de fusión de 61,2-62,4ºC; rendimiento del 21%). Su
análisis por infrarrojos y RMN del protón y del carbono 13 es el
siguiente.
IR (dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3330; 3080;
2917; 2849; 1643.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
6,0-5,7 (m; 1H); 5,1-4,7 (m; 2H);
3,75-3,65 (m; 2H); 3,55-3,4 (m; 4H);
2,2-1,9 (m; 2H) y 1,7-1,0 (m, 37 H
del cual 1H intercambiable en D_{2}O).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
139,2; 113,8; 71,7 (2 CH_{2}); 63,7; 33,6-25,8
(19 CH_{2}).
En un matraz de dos bocas de 100 ml, el alcohol
insaturado 8 (0,9 g; 2,7 mmol) se suspende en diclorometano (10 ml)
y trietilamina (0,6 ml; 5,4 mmol; 2eq.). El medio de reacción se
enfría a 0ºC y a continuación se añade cloruro de acetilo (0,5 ml; 4
mmol; 1,5 eq.) gota a gota con la ayuda de una jeringa. El medio de
reacción se agita durante 15 minutos a 0ºC y a continuación 1 h 30
minutos a temperatura ambiente. A continuación se hidroliza y
después se extrae tres veces con éter dietílico. Las fases éter se
reúnen, se lavan con una solución de ácido clorhídrico al 10%, con
agua, y a continuación con una solución saturada en NaHCO_{3}.
Entonces la fase éter se lava hasta neutralidad, se seca sobre
MgSO_{4}, y se concentra a vacío. El compuesto 9 se obtiene en
forma de un sólido blanco (0,9 g; rendimiento del 100%). Su
análisis por infrarrojos y RMN del protón y del carbono 13 es el
siguiente.
IR (dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 30780;
2917; 2849; 1643.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
6,0-5,7 (m; 1H); 5,1-4,7 (m; 2H);
4,25-4,15 (m; 2H); 3,60-3,50 (t;
2H); 3,45-3,35 (t; 2H); 2,2-1,9 (m;
5H) y 1,7-1,2 (m, 36H).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
172,0; 139,2; 113,8; 71,5; 68,5; 63,7; 33,6-25,8
(19 CH_{2}); 21,0.
A partir del derivado yodado insaturado 7
obtenido anteriormente y detrietilenglicol, se obtiene un alcohol
insaturado 10, y a continuación se esterifica para obtener el
producto 11, y esto según los mismos protocolos expuestos
anteriormente.
El análisis del producto 10 por infrarrojos y RMN
del protón y del carbono 13 es el siguiente. IR (dispersión en KBr)
v (cm^{-1}); 3380; 3079; 2919; 2850; 1641. RMN ^{1}H
(CDCl_{3}): \delta (ppm)); 5,9-5,7 (m; 1H);
5,1-4,7 (m; 2H); 4,3-4,2 (t; 2H);
3,7-3,4 (m; 10H); 3,4-3,3 (t; 2H);
2,2-1,9 (m; 2H) y 1,7-1,2 (m, 37 H
en el que 1H intercambiable en D_{2}O). RMN ^{13}H (CDCl_{3}):
\delta (ppm)); 139,3; 114,0; 71,6-68,2; (6
CH_{2}); 63,6; 33,6-25,8 (19
CH_{2}).
El análisis del producto 11 por infrarrojos y RMN
del protón y del carbono13 es el siguiente. IR (dispersión en KBr)
v (cm^{-1}); 3079; 2919; 2850; 1750; 1641. RMN ^{1}H
(CDCl_{3}): \delta (ppm)); 5,9-5,7 (m; 1H);
5,1-4,7 (m; 2H); 4,3-4,2 (t; 2H);
3,7-3,4 (m; 10H); 3,4-3,3 (t; 2H);
2,2-1,9 (m; 5H) y 1,7-1,2 (m, 36 H).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 171,5; 139,3; 114,0;
71,6-68,3; (6 CH_{2}); 63,6;
33,6-25,8 (19 CH_{2}); 21,0.
A partir del alcohol insaturado 10 obtenido
anteriormente, se han preparado el ácido y el éster correspondientes
como sigue.
En un matraz de tres bocas de 100 ml, se suspende
el alcohol insaturado 10 (3 g; 6,6 mmol) en 10 ml de acetona. A esta
suspensión se añaden 80 ml de reactivo de Jones 2M (BOWDEN et
al., J. Chem. Soc., 1946, 39) La suspensión se
lleva a reflujo durante 2 horas. Después de la vuelta a temperatura
ambiente, la acetona se evapora, se filtra el sólido y a
continuación se aclara 5 veces con agua y 3 veces con acetona
enfriada a 0ºC. El sólido se purifica a continuación por
recristalización en una mezcla THF/acetona (v/v; 9/1) para
proporcionar el compuesto 12 en forma de un sólido blanco (2,9 g;
rendimiento del 94%). Su análisis por infrarrojos y RMN del protón y
del carbono 13 es el siguiente.
IR (dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3370; 3080;
2917; 2849; 1701; 1643.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 11,2
(s, ancho); 6,0-5,7 (m; 1H);
5,1-4,7 (m; 2H); 4,1-4,0 (s; 2H);
3,6-3,3 (m; 10H); 2,2-1,9 (m; 2H) y
1,7-1,0 (m, 36H).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
172,1; 139,1; 114,0; 71,6-68,7; (5
CH_{2}); 63,5; 33,6-25,8 (19
CH_{2}).
En un matraz de tres bocas de 100 ml, se
solubiliza el ácido 12 (2,9 g; 6,4 mmol) en tolueno anhidro (7 ml)
en atmósfera inerte a 0ºC. Se introduce cloruro de oxalilo (1,22 g;
9,6 mmol; 1,5 eq.) gota a gota y a continuación la mezcla se agita a
temperatura ambiente durante dos horas. El exceso de reactivo y el
disolvente se evaporan a continuación a vacío. El cloruro de acilo
se almacena temporalmente en argón. Se añade lentamente metanol (6
ml; 128 mmol; 20 eq.) previamente destilado en cloruro de calcio. El
medio de reacción se lleva a continuación a reflujo durante 18 horas
antes de ser devuelto a temperatura ambiente, y después el exceso de
metanol se evapora. El medio de reacción se extrae entonces tres
veces con éter dietílico. Las fases éter se reúnen, se lavan con una
solución de ácido clorhídrico al 10%, con agua y con una solución
saturada en NaHCO_{3}. LA fase éter se lava a continuación hasta
neutralidad, se seca sobre MgSO_{4} y se concentra a vacío. El
compuesto 13 se obtiene en forma de un sólido blanco, y a
continuación se purifica por cromatografía sobre sílice (eluyente:
éter de petróleo/éter, 50/50 en volumen). Se obtienen 300 mg de un
sólido blanco (rendimiento del 10%). Su análisis por infrarrojos y
RMN del protón y del carbono 13 es el siguiente.
IR (dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3080; 2917;
2849; 1742; 1643.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
6,0-5,7 (m; 1H); 5,1-4,7 (m; 2H);
4,1-4,0 (s; 2H); 3,6-3,3 (m; 13);
2,2-1,9 (m; 2H) y 1,7-1,0 (m,
36H).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
171,8; 139,1; 114,0; 71,6-68,7; (5
CH_{2}); 63,6; 51,7; 33,6-25,8 (19
CH_{2}).
Se entiende por supuesto que utilizando el
alcohol 8 que comprende un solo residuo etilenglicol, los ácidos y
los ésteres correspondientes se podrían obtener también según los
mismos protocolos que se describen en la presente memoria
descriptiva a partir del alcohol 10.
En un tubo schlenk seco, se introduce en
atmósfera inerte, el éster 9 (150 mg; 0,33 mmol). Se añaden
triclorosilano recién destilado (0,3 ml; 2,2 mmol; 6eq.), tolueno
anhidro (0,3 ml) así como una gota de catalizador de Kärsted (PCO
72), comercializado por ABCR (referencia
68478-92-2). El medio de reacción se
lleva entonces a 40ºC durante 2 horas. Después de la vuelta a
temperatura ambiente, el tolueno y el exceso de triclorosilano se
evaporan a presión reducida con la ayuda de una bomba de paleta
(presión de 0,5 mm de Hg). El compuesto 14 e obtiene en forma de un
sólido blanco y se almacena en argón (rendimiento del 99%). Se trata
de un compuesto organosilícico de fórmula (I) tal como la definida
anteriormente, en la cual X_{1}, X_{2} y X_{3} representan
átomos de cloro, n es igual a 2, m es igual a 1, i es igual a 0, k
es igual a 1 y B representa un grupo -COCH_{3}. El análisis del
compuesto 14 por RMN del protón y del carbono 13 es el
siguiente.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
4,25-4,15 (m; 2H); 3,60-3,50 (t;
2H); 3,45-3,35 (t; 2H); 2,2-1,9 (m;
3H) y 1,7-1,0 (m, 42 H).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
171,0; 71,56-68,5; 63,76; 31,9-22,2
(21 CH_{2}); 21,0.
Partiendo del compuesto 11 obtenido anteriormente
y utilizando el mismo protocolo, se obtiene el compuesto
organosilícico 15 correspondiente. Se trata de un compuesto
organosilícico de fórmula (I) en la cual X_{1}, X_{2} y X_{3}
representan átomos de cloro, n es igual a 22, m es igual a 1, i es
igual a 0, k es igual a 3 y B representa un grupo -COCH_{3}.
Su análisis por RMN del protón y del carbono 13
es el siguiente. RMN ^{1}H(CDCl_{3}): \delta (ppm));
4,3-4,2 (t; 2H); 3,7-3,4 (m; 10H);
3,4-3,3 (t; 2H); 2,2-1,9 (s; 3H) y
1,7-0,9 (m, 42 H). RMN ^{13}H (CDCl_{3}):
\delta (ppm)); 171,2; 71,6-68,1 (6
CH_{2}); 63,6; 31,9-22,3 (21
CH_{2}); 21,0.
Partiendo del compuesto 13 obtenido anteriormente
y utilizando el mismo protocolo, se obtiene el compuesto
organosilícico 16 correspondiente. Se trata de un compuesto de
fórmula (I) en la cual X_{1}, X_{2} y X_{3} representan
átomos de cloro, n es igual a 22, m es igual a 1, i es igual a 1, k
es igual a 2 y B representa un grupo -COOCH_{3}. Su análisis por
RMN del protón y del carbono 13 es el siguiente. RMN ^{1}H
(CDCl_{3}): \delta (ppm)); 4,1-4,0 (s; 2H);
3,6-3,3 (m; 13H); 1,7-0,9 (m, 42
H). RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 171,0;
71,6-68,8 (6 CH_{2}); 51,7;
31,9-22,3 (21 CH_{2}).
La siguiente tabla recapitula la estructura de
los compuestos organosilícicos de fórmula (I) obtenidos en el
presente ejemplo.
* Compuesto
17
En un matraz de dos bocas de 100 ml, el alcohol
insaturado 5 obtenido en el ejemplo 1 (0,9 g; 2,7 mmol) se suspende
en diclorometano (10 ml y trietilamina (0,6 ml; 5,4 mmol; 2 eq.).
El medio de reacción se enfría 0ºC, y a continuación se añade gota a
gota cloruro de acetilo (0,5 ml; 4 mmol; 1,5 eq.) con la ayuda de
una jeringa. El medio de reacción se agita durante 15 minutos a 0ºC,
y después 1 hora 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación
se hidroliza el medio de reacción, y a continuación se extrae tres
veces con éter dietílico. Las fases éter se reúnen, se lavan con
una solución de ácido clorhídrico al 10%, con agua, y a continuación
con una solución saturada en NaHCO_{3}. La fase éter se lava a
continuación hasta neutralidad, se seca sobre MgSO_{4} y se
concentra a vacío. El compuesto 17 se obtiene en forma de un sólido
blanco (0,9 g; rendimiento del 100%). Su análisis por infrarrojos y
RMN del protón y del carbono 13 es el siguiente.
IR(dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3079;
2919; 2850; 1740; 1641.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
5,9-5,7 (m; 1H); 5,1-4,7 (m; 2H);
4,1-3,9 (t; 2H); 2,2-1,9 (m; 5H) y
1,7-1,0 (m, 36 H).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
171,1; 139,3; 114,0; 64,7; 33,6-25,8 (19
CH_{2}); 21,0.
* Compuesto
18
Utilizando el mismo protocolo que para la
obtención del compuesto 17, pero partiendo de un alcohol insaturado
que comprende 16 átomos de carbono, se obtiene el compuesto 18, cuyo
análisis por infrarrojos y RMN del protón y del carbono 13 es el
siguiente.
IR(dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3080;
2923; 2853; 1742; 1643. RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
5,9-5,7 (m; 1H); 5,1-4,7 (m; 2H);
4,1-4,0 (t; 2H); 2,1-1,9 (m; 5H) y
1,7-1,1 (m, 24 H). RMN ^{13}H (CDCl_{3}):
\delta (ppm)); 171,1; 139,3; 114,0; 64,8;
33,6-25,8 (13 CH_{2}); 21,2.
* Compuesto
19
Utilizando el mismo protocolo que para la
obtención del compuesto 17, pero partiendo de un alcohol insaturado
que comprende 27 átomos de carbono, se obtiene el compuesto 19, cuyo
análisis por infrarrojos y RMN del protón y del carbono 13 es el
siguiente.
IR(dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3080;
2923; 2853; 1742; 1643. RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
5,9-5,7 (m; 1H); 5,1-4,7 (m; 2H);
4,1-4,0 (t; 2H); 2,1-1,9 (m; 5H) y
1,7-1,1 (m, 46 H). RMN ^{13}H (CDCl_{3}):
\delta (ppm)); 171,1; 139,3; 114,0; 64,8;
33,6-25,8 (24 CH_{2}); 21,1.
A partir de derivados bromados insaturados de
fórmula CH_{2}=CH-(CH_{2})_{x}Br, estando x
comprendido entre 3 y 23, y siguiendo el protocolo de obtención del
compuesto 2 tal como se describe en el ejemplo 1, se obtienen
organomagnesianos de fórmula
CH_{2}=CH-(CH_{2})_{x}MgBr. Su acoplamiento con un
derivado dibromado Br(CH_{2})_{y}Br (siendo y + x
como mínimo igual a 14 y como máximo a 33), en las mismas
condiciones que las del acoplamiento con un bromoalcohol conforme al
ejemplo 1 para la obtención del compuesto 5, conduce a los derivados
bromados insaturados de fórmulas 20, 21 y 22.
El compuesto 20 se obtiene gracias a un derivado
bromado insaturado en el que x es igual a 9 y de un derivado
dibromado en el que y es igual a 10. Su análisis por infrarrojos y
RMN del protón y del carbono 13 es el siguiente:
IR(dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3078; 2922; 2852; 1640.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 5,9-5,7
(m; 1H); 5,1-4,9 (m; 2H); 3,5 (t; 2H);
2,2-1,8 (m; 4H) y 1,6-1,2 (m, 32
H). RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 139,2; 114,1;
33,9-25,7 (19 CH_{2}).
El compuesto 21 se obtiene gracias a un derivado
bromado insaturado en el que x es igual a 14 y de un derivado
dibromado en el que y es igual a 10. Su análisis por infrarrojos y
RMN del protón y del carbono 13 es el siguiente:
IR(dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3080; 2920; 2851; 1642.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 6,0-5,7
(m; 1H); 5,1-4,9 (m; 2H); 3,5 (t; 2H);
2,2-1,8 (m; 4H) y 1,6-1,2 (m, 42
H). RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 138,8; 113,8;
33,9-25,7 (24 CH_{2}).
El compuesto 22 se obtiene gracias a un derivado
bromado insaturado en el que x es igual a 9 y de un derivado
dibromado en el que y es igual a 5. Su análisis por infrarrojos y
RMN del protón y del carbono 13 es el siguiente:
IR(dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3078; 2925; 2854; 1641.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 5,9-5,7
(m; 1H); 5,1-4,9 (m; 2H); 3,5 (t; 2H);
2,2-1,8 (m; 4H) y 1,6-1,2 (m, 22
H). RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 139,2; 114,1;
33,9-25,7 (14 CH_{2}).
En un matraz de tres bocas de 250 ml, se suspende
en alcohol insaturado 5 obtenido en el ejemplo 1 (13 g; 40 mmol) en
40 ml de acetona. A esta suspensión se añaden 80 ml de reactivo de
Jones (2M) La suspensión se lleva a reflujo durante 2 horas. Después
de la vuelta a temperatura ambiente, la acetona se evapora, se
filtra el sólido y a continuación se aclara 5 veces con agua y 3
veces con acetona enfriada a 0ºC. El sólido se purifica a
continuación por recristalización en una mezcla THF/acetona (v/v;
9/1) para proporcionar el compuesto 23 en forma de un sólido blanco
(9,9 g; punto de fusión de 73-74ºC; rendimiento del
94%). Su análisis por infrarrojos y RMN del protón y del carbono 13
es el siguiente.
IR (dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3370; 3080;
2917; 2849; 1707; 1643.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 11,2
(s, ancho, 1 H)); 6,0-5,7 (m; 1H);
5,1-4,9 (m; 2H); 2,4 (t; 2H);
2,2-2,0 (m; 2H) y 1,9-1,1 (m, 34 H).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 172,0; 139,3; 113,8;
33,6-25,8 (19 CH_{2}).
En un matraz de tres bocas de 100 ml, se
solubiliza el ácido 23 obtenido anteriormente (4 g; 11,8 mmol) en
tolueno anhidro (20 ml) en atmósfera inerte a 0ºC. Se introduce
cloruro de oxalilo (2 g; 17,6 mmol; 1,5 eq.) gota a gota y a
continuación la mezcla se agita a temperatura ambiente durante dos
horas. El exceso de reactivo y el disolvente se evaporan a
continuación a vacío. El cloruro de acilo se almacena temporalmente
en argón. Se añade lentamente metanol (10 ml; 236 mmol; 20 eq.)
previamente destilado en cloruro de calcio. El medio de reacción se
lleva a continuación a reflujo. Después de la vuelta del medio de
reacción a temperatura ambiente, el exceso de metano se evapora. El
medio de reacción se extrae entonces tres veces con éter dietílico.
Las fases éter se reúnen, se lavan con una solución de ácido
clorhídrico al 10%, con agua y con una solución saturada en
NaHCO_{3}. La fase éter se lava a continuación hasta neutralidad,
se seca sobre MgSO_{4} y se concentra a vacío. El compuesto 24 se
obtiene en forma de un sólido blanco (4 g, punto de fusión de
50-51,5ºC; rendimiento del 100%), Su análisis por
infrarrojos y RMN del protón y del carbono 13 es el siguiente.
IR (dispersión en KBr) v (cm^{-1}); 3080; 2917;
2849; 1742; 1643.
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta (ppm));
6,0-5,7 (m; 1H); 5,1-4,7 (m; 2H);
3,6 (t; 13); 2,4-2,3 (t; 2H);
2,2-2,0 (m, 2H) y 1,9-1,1 (m, 34 H).
RMN ^{13}H (CDCl_{3}): \delta (ppm)); 172,3; 139,3; 114,0;
51,5; 33,6-25,8 (19 CH_{2}).
Se procede según el mismo modo operativo que el
indicado en el ejemplo 1. Los espectros RNM del protón y del carbono
13 de los compuestos organosilícicos obtenidos a partir de los
precursores insaturados 17, 18 y 19 son los siguientes:
- a partir del precursor 17: RMN ^{1}H
(CDCl_{3}): \delta (ppm)); 4,1-3,9 (t; 2H); 2,1
(s, 3H); 1,7-0,9 (m, 42 H). RMN ^{13}H
(CDCl_{3}): \delta (ppm)); 171,2; 64,7;
31,9-22,3 (21 CH_{2}); 21,0.
- a partir del precursor 18: RMN ^{1}H
(CDCl_{3}): \delta (ppm)); 4,1-3,9 (t; 2H); 2,1
(s, 3H); 1,7-0,9 (m, 30 H). RMN ^{13}H
(CDCl_{3}): \delta (ppm)); 171,2; 64,7;
31,9-22,3 (15 CH_{2}); 21,0.
- a partir del precursor 19: RMN ^{1}H
(CDCl_{3}): \delta (ppm)); 4,1-3,9 (t; 2H); 2,1
(s, 3H); 1,7-0,9 (m, 52 H). RMN ^{13}H
(CDCl_{3}): \delta (ppm)); 171,2; 64,7;
31,9-22,3 (26 CH_{2}); 21,0.
La siguiente tabla II recapitula la estructura de
los compuestos organosilícicos de fórmula (I) obtenidos en el
presente ejemplo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utiliza un disco de silicio, oxidado en
superficie, como sustrato. El disco se limpia según el siguiente
procedimiento, con el fin de eliminar los contaminantes de su
superficie e hidratarlo.
- -
- inmersión en una mezcla sulfocrómica recién preparada (2,5 g de K_{2}Cr_{2}O_{4}; 2,5 ml de agua destilada; 50 ml de ácido sulfúrico) durante 10 minutos,
- -
- bajo una campana de flujo laminar equipada con filtros de polvos, el disco se sumerge en el agua permutada y se somete a ultrasonidos durante 20 minutos. Este proceso se repite dos veces con duraciones de sonicación de 5 y 2 minutos respectivamente,
- -
- bajo una campana de flujo laminar equipada con filtros de polvos, el disco se introduce en el reactor de silanización para secarse, en atmósfera inerte y filtrarse. El reactor se sumerge durante 45 minutos en un baño de aceite a 100ºC y a continuación se retira del baño de aceite y su temperatura se lleva a 18ºC.
El compuesto organosilícico 14 obtenido en el
ejemplo 1, recién preparado en una cantidad deseada, en atmósfera
inerte, se solubiliza en una fracción de una mezcla
C_{6}H_{12}/CCl_{4}/CHCl_{3} (v/v/v: 80/12/8). El compuesto
organosilícico 14 disuelto se toma a continuación con la jeringa y
después se introduce en un tubo schlenk que contiene el resto de la
mezcla de disolvente cuyo volumen total se ha calculado para
obtener una solución de silanización de dilución adecuada (entre
1.10^{-5} y 1.10-2 mol/litro). Los disolventes se
han secado previamente según procedimientos de por sí conocidos.
La solución de silanización se introduce, con una
jeringa, en el reactor y el disco de silicio permanece sumergido en
esta solución durante 16 horas. El disco silanizado se retira del
reactor, y a continuación se recuece eventualmente, después de haber
sido lavado con cloroformo (HPLC grade), a una temperatura
comprendida entre 50 y 120ºC. A continuación se limpia con
ultrasonidos durante 2 minutos, proceso repetido dos veces.
Se ha obtenido anteriormente un soporte sólido
cuya superficie está modificada por el compuesto 14. El control del
injerto de los compuestos organosilícicos se realiza utilizando la
espectroscopia infrarroja y laespectroscopia Raman confocal.
Si es necesario, los hidroxilos de superficie se
pueden liberar utilizando el siguiente protocolo: el disco
silanizado se sumerge en una solución de KOH (0,5 M) en una mezcla
agua/etanol (v/v: 1/1) durante 20 minutos. El disco se limpia a
continuación con ultrasonidos durante 15 minutos en agua
desmineralizada. Este proceso se repite una vez en el agua y una
segunda vez en cloroformo.
La figura 6 representa espectros de infrarrojo
realizados después de tres experimentos de injerto del compuesto 14
sobre el soporte, según el protocolo de silanización expuesto
anteriormente y después de la saponificación de los ésteres de
superficie. La transmitancia figura en la ordenada y la frecuencia
(cm^{-1}) en la abscisa. Se subraya que los tres espectros se
superponen, con picos característicos de un sistema organizado a
2917 y a 2850 cm^{-1}. De este modo, se puede concluir que el
injerto del compuesto organosilícico sobre el soporte se puede
reproducir y dar lugar a la formación de una monocapa autoensamblada
organizada.
La figura 7 representa estudios espectroscópicos
Raman de la superficie modificada obtenida anteriormente. La figura
7a es representativa de la densidad de la superficie del sustrato
injertado, figurando las dimensiones de la superficie en la abscisa
y en la ordenada (7 mm en la figura corresponden a 1 \mum en el
sustrato), estando la escala de las densidades graduada de 130 a 165
(unidades arbitrarias). Esta figura demuestra la homogeneidad de la
superficie. Las figuras 7b y 7c representan los espectros Raman
tomados en dos puntos diferentes de la superficie del sustrato; la
ordenada representa golpes por segundo y la frecuencia figura en la
abscisa.
Los espectros infrarrojo y Raman muestran por lo
tanto sin ambigüedad la homogeneidad de la película depositada sobre
el sustrato así como la organización de las moléculas en la
superficie, característica de una monocapa autoensamblada
organizada. El espectro infrarrojo muestra también que el injerto de
la película es perfectamente reproducible.
Se utiliza una lámina de vidrio de microscopio
como sustrato. La lámina de vidrio se limpia por inmersión en una
solución acuosa de Hellmanex® al 2% (comercializada por Polylabo con
la referencia 12240) durante 2 horas a 0ºC, y a continuación se
lleva a cabo un aclarado abundante con agua permutada. Bajo una
campana de flujo laminar equipada con filtros de polvo, la lámina de
vidrio se introduce en el reactor de injerto para secarse, bajo
atmósfera inerte y filtrada. El reactor se sumerge durante 45
minutos en un baño de aceite a 100ºC, y a continuación se retira del
baño de aceite y su temperatura se lleva a 18ºC.
La solución de silanización, preparada con la
ayuda del compuesto organosilícico 14 como se indica en el ejemplo
anterior, se introduce, con una jeringa, en el reactor y la lámina
de vidrio permanece sumergida en esta solución durante 16 horas. El
aclarado del sustrato silanizado se efectúa como se describe en el
ejemplo 3.
La caracterización de la superficie por
espectroscopia infrarroja y Raman demuestran también la obtención de
una monocapa autoensamblada organizada sobre el sustrato,
obteniéndose los mismos resultados con agentes organosilícicos de
fórmula (I), distintos del compuesto 14.
El soporte sólido utilizado es un sustrato de
silicio oxidado Si/SiO_{2} sobre el cual se ha formado una
monocapa autoensamblada organizada que comprende el compuesto
organosilícico 14, según el protocolo indicado en el ejemplo 3. Se
podría utilizar también, cualquier otro compuesto organosilícico de
fórmula (I), así como cualquier mezcla de compuestos
organosilícicos que comprenda al menos un compuesto organosilícico
de fórmula (I).
Los extremos de los compuestos organosilícicos
injertados sobre el soporte se convierten en grupos hidroxilo por
inmersión del sustrato en una solución de KOH, como se indica en el
ejemplo 3. Se obtiene de este modo un sustrato que comprende
funciones hidroxilo de superficie. Este sustrato se limpia en
acetonitrilo y se somete a ultrasonidos durante 1 minuto antes de
ser colocado en la célula de síntesis.
Se utiliza aquí la química de los fosforamiditas,
sabiendo que se podrían utilizar otras químicas bien conocidas por
el experto en la técnica, tal como la química de los
H-fosfonatos. Los nucleótidos se utilizan por lo
tanto en forma de
\beta-cianoetil-fosforamiditas,
estando protegidas las aminas de las diferentes bases nitrogenadas,
por ejemplo y de manera no limitativa, por grupos benzoilo,
isobutirilo o tertiobutilfenoxiacético. Los nucleótidos están
protegidos en posición 5' por un grupo dimetoxitritilo; se podrían
sin embargo utilizar también grupos fosfolábiles (tales como el
MeNPOC descrito por PEASE et al., en Proc. Natl. Acad.
Sci. Estados Unidos, 1994, 91,
502-5026), que se podrían eliminar por iluminación
ultravioleta.
La síntesis de ácidos nucleicos se realiza, con
la química de los fosforamiditas utilizada, en el sentido 3'- 5'.
Las diferentes etapas de injerto de un nucleótido son las
siguientes, constituyendo el conjunto de estas etapas un ciclo:
- 1.-
- destritilación (25 segundos): ácido tricloroacético al 3% en diclorometano;
- 2.-
- lavado: acetonitrilo anhidro;
- 3.-
- acoplamiento (1 minuto): introducción de una mezcla de amidita 0,1 M y de un activador (tetrazol) 0,45 M:
- 4.-
- encapsulación (15 segundos): introducción de una mezcla de (i) anhidro acético/2,6-lutidina/actonitrilo (10 ml/10ml/80 ml) y de (ii) 1-metil-imidazol al 10% en dimetilformamida (10 ml/90 ml);
- 5.-
- oxidación (15 segundos): introducción de una mezcla yodo/piridina/tetrahidrofurano/agua 0,508 mg/1,6 ml/15,2 ml/3,2 ml);
- 6.
- encapsulación (15 segundos).
Se entiende, por supuesto, que en el ciclo dado
anteriormente, las soluciones de detritilación, lavado,
acoplamiento, encapsulación y oxidación no se dan a título
limitativo.
Se pueden efectuar tantos ciclos como se desee,
según la longitud del ácido nucleico que se desee obtener. Una vez
alcanzado el número final, las bases nitrogenadas se desprotegen y
el ácido nucleico se desprotege mediante un tratamiento con amoniaco
al 30-33% durante una noche a temperatura ambiente,
de manera a escindir los grupos protectores repartidos sobre el
esqueleto y las bases nitrogenadas. Eventualmente, si un brazo
espaciador lábil al amoniaco se ha introducido entre una parte de
los ácidos nucleicos y la superficie silanizada, esta fracción de
los ácidos nucleico se escindirá del soporte.
Según la naturaleza de los grupos protectores, se
pueden utilizar otros tratamientos de desprotección, por ejemplo con
la ayuda de carbonato potásico.
El sustrato se lava con agua y a continuación con
tampón TRIS (solución de TRIS HCl 10 mM ajustada a pH 7,1 por
adición de solución de TRIS base 10 mM, teniendo la solución final
una concentración de NACl de 50 mM) antes de poder utilizarse para
una hibridación.
Se utiliza un soporte sólido modificado por una
monocapa autoensamblada organizada tal como se describe en el
ejemplo 5 (silicio oxidado Si/SiO_{2} sobre el cual se forma una
monocapa de compuestos organosilícico 14, habiendo sido convertidas
las funciones de superficie en grupos hidroxilos). Un brazo
espaciador de 10 nucleótidos T se injerta sobre este soporte
modificado antes de la síntesis oligonucleotídica.
En cuatro puntos de este soporte se efectúan
síntesis de oligonucleótidos denominados L185 y U226 (secuencias de
25 nucleótidos), como se muestra en la figura 8a. Las figuras 8b y
8c indican, en una escala de 0 a 10 para la figura 8b (valiendo
esta escala para las figuras 8d, 8f y 8h) y en una escala de 0 a 1,5
para la figura 8c (valiendo esta escala para las figuras 8e, 8g y
8i), las intensidades de fluorescencia determinadas sobre el
soporte.
La figura 8d representa la intensidad de
fluorescencia determinada después de haber puesto en contacto el
soporte con una solución de un oligonucleótido complementario a 46ºC
durante una noche en presencia de un tampón TRIS pH 7,1, que
comprende 50 mM de NaCl. La concentración de oligonucleótido L185 en
el TRIS es de 0,01 mg/ml. Cada tramo complementario de L 185 lleva
un grupo fluorescente Cy3 en el extremo 5'. Se observa bien una
hibridación de la secuencia complementaria con la secuencia L 185.
La figura 8e corresponde al soporte después de la desnaturalización:
la secuencia complementaria ya no se detecta.
La figura 8f representa la intensidad de
fluorescencia determinada después de haber puesto en contacto el
soporte con una solución de oligonucleótido complementario del U226
que comprende marcadores de fluorescencia, después de haber lavado
el soporte, en las mismas condiciones que se indican anteriormente
en relación con el tramo L185. Se observa también una hibridación de
la secuencia complementaria con la secuencia U226. La figura 8g
corresponde al soporte después de la desnaturalización: la secuencia
complementaria ya no se detecta.
La figura 8h representa la intensidad de
fluorescencia determinada después de haber puesto de nuevo en
contacto el soporte con una solución de un oligonucleótido
complementario del L185 que comprende marcadores de fluorescencia,
después de haber lavado el soporte. La hibridación de la secuencia
complementaria con la secuencia L185 se produce de nuevo. La figura
8i muestra la ausencia de la secuencia complementaria después de la
desnaturalización.
Estos experimentos muestran que los ácidos
nucleicos sintetizados por vía directa sobre un soporte sólido
modificado por una monocapa autoensamblada organizada de compuestos
organosilícicos de fórmula (I), síntesis efectuada conforme al
procedimiento según la presente invención, pueden dar lugar a
reacciones de hibridación selectiva con secuencias complementarias,
pudiendo reutilizarse el soporte a lo largo de diversos ciclos
sucesivos de hibridación y de desnaturalización.
Se procede como en el ejemplo 5, con la
diferencia de que la monocapa autoensamblada organizada comprende el
compuesto organosilícico de fórmula 16 preparado según el protocolo
indicado en el ejemplo 1. Se entiende que se podría utilizar
cualquier otro compuesto organosilícico de fórmula (I) (o una
mezcla de compuestos organosilícicos que comprende al menos un
compuesto organosilícico de fórmula (I), llevando dicho compuesto de
fórmula (I) una función ácido carboxílico protegida. Los extremos
de estos compuestos organosilícicos se convierten en grupo ácido
carboxílico por hidrólisis de los ésteres (por ejemplo bajo la
acción del triyodometilsilano o del ácido clorhídrico
concentrado).
Las funciones ácidos carboxílicos del soporte se
activan por una solución de N-hidroxisuccinimida. El
soporte activado de este modo se pone en contacto con una solución
del ácido nucleico que hay que inmovilizar (1 \mug/\mul en una
mezcla acetonitrilo/agua 9/1 en volumen, en presencia de
trietilamina), llevando este ácido nucleico un brazo espaciador
funcionalizado por una función amina. La reacción se efectúa a
temperatura ambiente, eventualmente hasta el secado de la solución.
El soporte se lava a continuación con un tampón TRIS pH 7,1. Esta
operación permite el bloqueo de las funciones ácidos que no hubiesen
reaccionado por la reacción con una amina (reacción de
encapsulación).
Claims (18)
1. Uso, para la síntesis o la inmovilización de
ácidos nucleicos, de un soporte sólido modificado por una monocapa
autoensamblada organizada que comprende al menos un compuesto
organosilícico que responde a la fórmula (I)
en la
cual
- -
- n está comprendido entre 15 y 35,
- -
- m es igual a 0 o a 1,
- -
- X_{1}, X_{2} y X_{3}, que pueden ser iguales o diferentes entre sí, se seleccionan en el grupo constituido por los grupos alquilo saturado en C_{1}- a C_{6}, lineales o ramificados, y los grupos hidrolizables, representando al menos uno de X_{1}, X_{2} y X_{3} un grupo hidrolizable.
- -
- A representa el grupo -O-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{k}-(CH_{2})_{i}- en el que k está comprendido entre 0 y 100 e i representa un número entero superior o igual a 0,
- -
- en el caso en que m = 0, entonces B representa un grupo -OCOR,-OR, -COOR o un átomo de halógeno, representando R un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo en C_{1} a C_{6}, lineal o ramificado,
- -
- en el caso en que m = 1:
- \bullet
- si k = 0 e i = 0, entonces B representa un grupo R_{1},
- \bullet
- si k = 0 e i \geq 1, entonces B representa un grupo -OR_{1}, -OCOR_{1}, -NR_{1}R_{2}, -COOR_{1}, -CONR_{1}R_{2}, -SR_{1} o un átomo de halógeno,
- \bullet
- si k \geq 1 e i = 0, entonces B representa un grupo -R_{1}, -COR_{1}, -COOR_{1} o -CONR_{1}R_{2},
- \bullet
- si k \geq 1 e i \geq 1, entonces B representa un grupo -OR_{1}, -OCOR_{1}, -NR_{1}R_{2}, -COOR_{1}, -CONR_{1}R_{2}, -SR_{1} o un átomo de halógeno,
- \bullet
- R_{1} y R_{2}, que pueden ser iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno, una cadena hidrocarbonada eventualmente sustituida, saturada o insaturada y lineal o ramificada, que comprende de 1 a 24 átomos de carbono, o un grupo aromático.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque n está comprendido entre 20 y 25.
3. Uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, caracterizado porque k está comprendido
entre 0 y 5.
4. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicho
soporte sólido se selecciona en el grupo constituido por los
vidrios, cerámicas, metales y metaloides.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicho
grupo hidrolizable se selecciona en el grupo constituido por los
átomos de halógeno, el grupo (-N(CH_{3})_{2}, y
los grupos -OR', siendo R' un grupo alquilo saturado en C_{1} a
C_{6}, lineal o ramificado.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque X_{1},
X_{2}, X_{3} representan átomos de cloro, n es igual a 22, m es
igual a 1, i es igual a 0, k es igual a 1 ó a 3 y B representa un
grupo -COCH_{3}.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque X_{1},
X_{2}, X_{3} representan átomos de cloro, n es igual a 22, m es
igual a 1, i es igual a 1, k es igual a 2 y B representa un grupo
-COOCH_{3}.
8. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque X_{1},
X_{2}, X_{3} representan átomos de cloro, n es igual a 16, 22 ó
27, m es igual a 0 y B representa un grupo -OCOCH_{3}.
9. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque X_{1},
X_{2}, X_{3} representan átomos de cloro, n es igual a 21, m es
igual a 0 y B representa un grupo -COOCH_{3}.
10. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores para la preparación de chips de ADN.
11. Procedimiento de síntesis de ácidos nucleicos
sobre un soporte sólido, caracterizado porque dicho soporte
está modificado por una monocapa autoensamblada organizada que
comprende al menos un compuesto organosilícico que responde a la
fórmula (I) tal como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, y porque comprende las siguientes
etapas:
- a)
- preparación de un soporte modificado por una monocapa autoensamblada organizada que comprende al menos un compuesto organosilícico que responde a la fórmula (I) tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichos compuestos organosilícicos presentan en su extremo una función hidroxilo o amina protegida;
- b)
- eventualmente, desprotección de la función hidroxilo o amina;
- c)
- acoplamiento covalente, de manera localizada, de un nucleótido sobre el soporte modificado obtenido en la etapa a) o b):
- d)
- reiteración de la etapa c) al menos una vez con nucleótidos idénticos o diferentes.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque la etapa a) se realiza por las
siguientes etapas:
- i)
- eliminación de los contaminantes del soporte e hidratación y/o hidroxilación de su superficie,
- j)
- introducción en una mezcla de al menos dos disolventes que comprende al menos un disolvente hidrocarbonado no polar, en atmósfera inerte, de un compuesto organosilícico de fórmula general (I) tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, presentado dicho compuesto en un extremo una función hidroxilo o amina protegida;
- k)
- silanización del soporte obtenido en la etapa i) por inmersión en la solución preparada en la etapa j)
- l)
- eventualmente, recocido del soporte silanizado obtenido en la etapa k), llevando la monocapa autoensamblada, a una temperatura comprendida entre 50 y 120ºC, para una duración de 5 minutos a una noche, y
- m)
- aclarado del soporte modificado obtenido en la etapa k) o l) con la ayuda de un disolvente.
13. Procedimiento según la reivindicación 11 o la
reivindicación 12, caracterizado porque una etapa de injerto,
en el extremo de dichos compuestos organosilícicos, de brazos
espaciadores de las funciones hidroxilo o amina terminal se efectúa
después de la etapa a) o b) y antes de la etapa c).
14. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque los
nucleótidos acoplados en la etapa c) están protegidos y porque la
etapa d) va seguida de una etapa de desprotección del ácido nucleico
sintetizada.
15. Procedimiento de inmovilización de ácidos
nucleicos sobre un soporte sólido, caracterizado porque dicho
soporte está modificado por una monocapa autoensamblada organizada
que comprende al menos un compuesto organosilícico que responde a
la fórmula (I) tal como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, y porque comprende las siguientes
etapas:
- a)
- preparación de un soporte sólido modificado por una monocapa autoensamblada organizada que comprende al menos un compuesto organosilícico que responde a la fórmula (I) tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichos compuestos organosilícicos presentan en su extremo una función ácido carboxílico o amina protegida.
- b)
- Eventualmente, desprotección de la función ácido carboxílico o amina;
- c)
- Eventualmente, en el caso en el que el soporte sólido modificado lleva funciones ácido carboxílico terminal, activación de estas funciones;
- d)
- Puesta en contacto del soporte sólido modificado obtenido en la etapa a), b) o c) con una o diversas soluciones aplicadas localmente, en uno o diversos disolventes polares, ácido(s) nucleico(s) que hay que inmovilizar, llevando dichos ácidos nucleicos en uno de sus extremos un brazo espaciador funcionalizado, bien por una función amina, en el caso en que el soporte sólido modificado lleva funciones ácido carboxílico terminal eventualmente protegidas, o bien por una función ácido carboxílico activada, en el caso en que el soporte sólido modificado lleva funciones amina terminal eventualmente protegida; y
- e)
- Lavado del soporte sólido sobre el cual se inmovilizan dichos ácidos nucleicos.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque la tapa a) se realiza por las
siguientes etapas:
- i)
- eliminación de los contaminantes del soporte e hidratación y/o hidroxilación de su superficie,
- j)
- introducción en una mezcla de al menos dos disolventes que comprende al menos un disolvente hidrocarbonado no polar, en atmósfera inerte, de un compuesto organosilícico de fórmula general (I) tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, presentado dicho compuesto en un extremo una función ácido carboxílico o amina protegida;
- k)
- silanización del soporte obtenido en la etapa i) por inmersión en la solución preparada en la etapa j), y
- l)
- eventualmente, recocido del soporte silanizado obtenido en la etapa k), llevando la monocapa autoensamblada, a una temperatura comprendida entre 50 y 120ºC, para una duración de 5 minutos a una noche, y
- m)
- aclarado del soporte modificado obtenido en la etapa k) o l) con la ayuda de un disolvente.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 o la
reivindicación 16, caracterizado porque una etapa de injerto,
en el extremo de dichos compuestos organosilícicos, de brazo
espaciador que lleva funciones ácido carboxílico o amina terminal
se efectúa después de la etapa a) o b) y antes de la etapa c).
18. Chip de ADN, caracterizado porque se
obtiene pro el procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, en el que dichos ácidos nucleicos son
ADN.
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