KR100827449B1 - 광분해성 화합물과 상기 화합물이 커플링된 올리고머프로브 어레이용 기판, 올리고머 프로브 어레이 및 이의제조 방법 - Google Patents

광분해성 화합물과 상기 화합물이 커플링된 올리고머프로브 어레이용 기판, 올리고머 프로브 어레이 및 이의제조 방법 Download PDF

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하정환
김경선
김원선
류만형
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Abstract

본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 광분해성 화합물에 관한 것이다.
하기 화학식으로 표시되는 광분해성 화합물.
Figure 112007033713468-pat00001
(단, 상기 X는
Figure 112007033713468-pat00002
또는
Figure 112007033713468-pat00003
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 할로겐, 하이드록실기,
Figure 112007033713468-pat00004
,
Figure 112007033713468-pat00005
Figure 112007033713468-pat00006
,
Figure 112007033713468-pat00007
또는
Figure 112007033713468-pat00008
이고,
상기 B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실이고,
상기 R3는 수소, 아미노기, 알킬기 또는 포스핀이고
상기 R4는 수소, 하이드록실기, -OR5 또는 -SR5이고, 상기 R5는 알킬, 알케닐, 아세탈 또는 실릴에테르기이고,
상기 R6은 알킬기, 페닐기, 또는 황이고,
상기 p는 0 내지 5이고,
상기 q는 0 내지 10이다.)
광분해성 보호기, 올리고머 프로브 어레이, 기판

Description

광분해성 화합물과 상기 화합물이 커플링된 올리고머 프로브 어레이용 기판, 올리고머 프로브 어레이 및 이의 제조 방법{photolabile compound, oligomer probe array and substrate for oligomer probe array with the same and the method of fabricating the same}
도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 실시예들에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판의 단면도들이다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 실시예들에 따른 올리고머 프로브 어레이의 단면도들이다.
도 3a 내지 도 3e는 본 발명의 제3 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판의 제조 방법을 설명하기 위한 공정 중간 단계 구조물들의 단면도들이다.
도 4a 내지 도 4e는 본 발명의 제2 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이의 제조 방법을 설명하기 위한 공정 중간 단계 구조물들의 단면도들이다.
도 5는 조사(irradiation) 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 올리고머 프로브로 25mer의 올리고 핵산을 사용한 경우에 있어서의 올리고머 프로브 어레이의 CCD측정 결과이다.
(도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명)
100: 올리고머 프로브 어레이 110: 기판
120: 프로브 셀 액티브 130: 프로브 셀 분리 영역
140: 링커 150: 작용기
152: 광분해성 화합물의 광분해성 보호기
165: 올리고머 프로브
본 발명은 광분해성 보호기를 포함하는 광분해성 화합물 및 광분해성 보호기와 커플링된 올리고머 프로브 어레이용 기판 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
올리고머 프로브 어레이란 실리콘 웨이퍼 기판 등의 고체상 지지체에 올리고머 프로브를 고집적 미세배열(High Density arraying)한 것을 말한다.
올리고머 프로브 어레이에 여러 생체 고분자, 즉 올리고머 프로브를 집적하여 올리고머 프로브 어레이를 형성하는 방법에는 여러 방법이 있으며, 현재도 새로운 방법들이 제안되고 있다.
올리고머 프로브 어레이는 예를 들면, 광분해성 보호기(photolabile protecting groups)에 의해 보호되어 있는 작용기가 고정되어 있는 기판 상에 광 조사를 통해 특정 영역의 보호기를 탈기하여 작용기를 노출한 후 올리고뉴클레오티드와 폴리펩티드, 펩티드 핵산(PNA, peptide nucleic acid) 등과 같은 올리고머 프로브를 기판에 커플링하는 방법으로 제조될 수 있다. 광리소그라피에 의해 모노머를 인-시츄(in-situ) 합성하는 방법으로 제조하거나, 스팟팅(spotting) 등의 방법 에 의해 미리 합성된 올리고머 프로브를 기판에 커플링시키는 방법으로 제조할 수 있다.
광분해성 보호기란 일정 빛의 노광에 의해 탈보호(deprotection)되기 전까지 반응성있는 작용기를 보호하는 기를 말한다. 현재 널리 알려져 있는 대표적인 광분해성 보호기로 니트로베라트릴옥시카보닐(NVOC), 니트로피페로닐옥시카보닐(NPOC), α-메틸니트로베라트릴옥시카보닐(MeNVOC), 1-피레닐메틸옥시카보닐(PyMOC), α-메틸니트로피페로닐옥시카보닐(MeNPOC, 2-(3,4-methylenedioxy-2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl), 디니트로페닐알킬술포닐(dinitrophenylalkylsulfonyl), 2-(2-니트로페닐)프로필옥시카르보닐(NPPOC, 2-(2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl) 등이 있다.
올리고머 프로브 어레이의 제조시 광분해성 보호기가 사용될 수 있으며, 이러한 광분해성 보호기의 종류에 따라 광분해 반응 속도가 달라질 수 있다. 따라서 전체적인 반응 수율을 높이기 위하여 올리고머 프로브 어레이의 제조에 적합한 광분해성 보호기를 제공할 수 있는 광분해성 화합물을 개발하고자 하는 노력이 계속되고 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 광분해 반응속도를 증가시킬 수 있는 새로운 광분해성 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 반응 수율이 향상된 올리고머 프로브 어레이용 기판 및 올리고머 프로브 어레이를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 상기 광분해성 화합물, 올리고머 프로브 어레이용 기판 및 올리고머 프로브 어레이의 제조 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 실시예들에 따른 광분해성 화합물은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
<화학식 1>
Figure 112007011583087-pat00009
(단, 상기 X는
Figure 112007011583087-pat00010
또는
Figure 112007011583087-pat00011
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 할로겐, 하이드록실기,
Figure 112007011583087-pat00012
,
Figure 112007011583087-pat00013
Figure 112007011583087-pat00014
,
Figure 112007011583087-pat00015
또는
Figure 112007011583087-pat00016
이고,
상기 B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실이고,
상기 R3는 수소, 아미노기, 알킬기 또는 포스핀이고,
상기 R4는 수소, 하이드록실기, -OR5 또는 -SR5이고, 상기 R5는 알킬, 알케닐, 아세탈 또는 실릴에테르기이고,
상기 R6은 알킬기, 페닐기, 또는 황이고,
상기 p는 0 내지 5이고,
상기 q는 0 내지 10이다.)
상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판은 기판 및 기판에 직접 또는 링커를 개재하여 하기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기가 커플링될 수 있다.
<화학식 2>
Figure 112007011583087-pat00017
(단, 상기 X는
Figure 112007011583087-pat00018
또는
Figure 112007011583087-pat00019
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 직접 또는 링커를 개재하여 기판과 커플링되거나 올리고머 프로브와 커플링되는 사이트(site)이다.)
상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이는 올리고머 프로브, 올리고머 프로브와 커플링된 활성화 영역과 올리고머 프로브가 커플링되지 않은 비활성화 영역을 포함하는 기판 및 비활성화 영역에서 기판과 커플링된 상기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기를 포함한다.
상기 또 다른 기술적 과제를 해결하기 위한 광분해성 화합물의 제조 방법은
Figure 112007011583087-pat00020
와 포스겐 유도체 및 Y를 커플링시켜 하기 화학식 1로 표시되는 광분 해성 화합물을 제조 하는 것을 포함한다.
Figure 112007011583087-pat00021
(단, 상기 X는
Figure 112007011583087-pat00022
또는
Figure 112007011583087-pat00023
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 할로겐, 하이드록실기,
Figure 112007011583087-pat00024
,
Figure 112007011583087-pat00025
,
Figure 112007011583087-pat00026
,
Figure 112007011583087-pat00027
또는
Figure 112007011583087-pat00028
이고,
상기 B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실이고,
상기 R3는 수소, 아미노기, 알킬기 또는 포스핀이고,
상기 R4는 수소, 하이드록실기, -OR5 또는 -SR5이고, 상기 R5는 알킬, 알케닐, 아세탈 또는 실릴에테르기이고,
상기 R6은 알킬기, 페닐기, 또는 황이고,
상기 p는 0 내지 5이고,
상기 q는 0 내지 10이다.)
상기 또 다른 기술적 과제를 해결하기 위한 올리고머 프로브 어레이용 기판의 제조 방법은 기판을 제공하고, 기판에 직접 또는 링커를 개재하여 하기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기를 커플링하는 것을 포함한다.
<화학식 2>
Figure 112007011583087-pat00029
(단, 상기 x는
Figure 112007011583087-pat00030
또는
Figure 112007011583087-pat00031
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 직접 또는 링커를 개재하여 기판과 커플링되거나 올리고머 프로브와 커플링 되는 사이트이다.)
상기 또 다른 기술적 과제를 해결하기 위한 올리고머 프로브 어레이 제조 방법은 상기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기에 의해 보호되고 올리고머 프로브의 제1 모노머와 커플링할 수 있는 작용기가 있는 기판을 제공하고, 기판을 선택적으로 노광시켜 선택된 영역에서 광분해성 보호기를 탈보호하고, 탈보호된 기판의 작용기와 제1 모노머를 커플링시키는 것을 포함한다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
따라서, 몇몇 실시예에서, 잘 알려진 공정 단계들, 잘 알려진 구조 및 잘 알려진 기술들은 본 발명이 모호하게 해석되는 것을 피하기 위하여 구체적으로 설명되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 포함한다(comprises) 및/또는 포함하는(comprising)은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자 이외의 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 의미로 사용한다. 그리고, ″및/또는″은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 또, 이하 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
또한, 본 명세서에서 기술하는 실시예들은 본 발명의 이상적인 예시도인 단면도 및/또는 개략도들을 참고하여 설명될 것이다. 따라서, 제조 기술 및/또는 허용 오차등에 의해 예시도의 형태가 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 도시된 특정 형태로 제한되는 것이 아니라 제조 공정에 따라 생성되는 형태의 변화도 포함하는 것이다. 또한 본 발명에 도시된 각 도면에 있어서 각 구성 요소들은 설명의 편의를 고려하여 다소 확대 또는 축소되어 도시된 것일 수 있다.
본 발명의 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 실시예들에 따른 광분해성 화합물은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
<화학식 1>
Figure 112007011583087-pat00032
(단, 상기 x는
Figure 112007011583087-pat00033
또는
Figure 112007011583087-pat00034
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 할로겐, 하이드록실기,
Figure 112007011583087-pat00035
,
Figure 112007011583087-pat00036
,
Figure 112007011583087-pat00037
,
Figure 112007011583087-pat00038
또는
Figure 112007011583087-pat00039
이고,
상기 B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 또는 우라실이고,
상기 R3는 수소, 아미노기, 알킬기 또는 포스핀이고,
상기 R4는 수소, 하이드록실기, -OR5 또는 -SR5이고, 상기 R5는 알킬, 알케닐, 아세탈 또는 실릴에테르기이고,
상기 R6은 알킬기, 페닐기, 또는 황이고,
상기 p는 0 내지 5이고,
상기 q는 0 내지 10이다.)
상기 화학식에서 Y를 제외한 부분은 광분해성 보호기라 할 수 있고, 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.
<화학식 2>
Figure 112007011583087-pat00040
(단, 상기 X는
Figure 112007011583087-pat00041
또는
Figure 112007011583087-pat00042
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 직접 또는 링커를 개재하여 기판과 커플링되거나 또는 올리고머 프로브와 커플링되는 사이트이다.)
광분해성 보호기(photolabile protective group)는 올리고머 프로브 어레이를 인시츄로 광리소그라피를 이용하여 합성하는 경우에 사용될 수 있다. 광분해성 보호기가 상기 Y와 커플링된 경우, 보다 엄밀하게는 상기 Y의 작용기와 광분해성 보호기가 커플링된 경우, 상기 Y는 보호(protection)되었다라고 할 수 있다. 보호된 Y는 UV 또는 가시광선의 조사에 의해 탈보호(deprotection)된다. 탈보호란 광분해성 보호기가 상기 Y를 이탈하여, 상기 Y의 작용기가 노출된 것을 말할 수 있다. 광분해성 보호기에 의해 보호되는 반응성 있는 작용기로 예를 들어, 하이드록실기, 아미노기, 황화기 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않음은 물론이다.
광분해성 보호기는 기본적으로 분해하는 빛의 파장이 340nm 이상의 긴 파장에서 분해가 이루어져야 한다. 왜냐하면 340nm보다 짧은 파장에서는 핵산 염기에 손상이 일어날 가능성이 많아지기 때문이다.
이러한 보호와 탈보호 과정을 반복하여, 원하는 올리고머 프로브의 서열을 가진 올리고머 프로브 어레이를 형성할 수 있다. 올리고머 프로브 어레이가 보다 정확한 측정, 높은 반응 수율을 가지려면 광분해성 보호기의 탈보호가 빠른 시간에 일어나는 것이 좋다. 즉 광분해성 보호기의 반감기가 짧을수록 반응 수율이 높아진다. 그 밖에도 광분해성 보호기는 열에 대한 안정성이 좋아야 하며, 반응 수율과 관련하여 광분해가 짧은 시간에 일어나는 것이 좋다.
이하 실험예에서 상술하게될 표 1 및 도 5 내지 도 6의 조사 실험 결과를 참조하면, 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기는 종래 사용되는 광분해성 보호기들, 예를 들어 α-메틸니트로피페로닐옥시카보닐(MeNPOC), 2-(2-니트로페닐)프로필 옥시카르보닐(NPPOC) 등보다도 조사(irradiation)시의 반감기가 짧고 반응 수율이 높다.
이하, 상기 Y에 대하여 설명한다. 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기가 상기 Y와 결합하여 광분해성 화합물을 형성할 수 있다.
상기 Y는 이탈기(leaving group) 예를 들어, 할로겐 또는 하이드록실기일 수 있다. Y가 할로겐 또는 하이드록실기인 경우, 이후 뉴클레오사이드, 펩티드 핵산, 링커 등과 커플링하여 올리고머 프로브 어레이의 제조 등에 사용될 수 있다.
한편, 상기 Y는
Figure 112007011583087-pat00043
, 또는
Figure 112007011583087-pat00044
일 수 있다.
(단, 상기 B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 또는 우라실이고,
상기 R3는 수소, 아미노기, 알킬기 또는 포스핀이고,
상기 R4는 수소, 하이드록실기, -OR5 또는 -SR5이고, 상기 R5는 알킬, 알케닐, 아세탈 또는 실릴에테르기이이다.)
더욱 바람직하게는, 상기 R3가 수소 또는 하기 화학식의 포스파이트 아마이드기(phosphite amide group)인 광분해성 화합물일 수 있다. 리보스 당 및 디옥시리보스 당의 3′부분 또는 5′의 OH기는 자유롭게 있거나 보호기로 보호될 수 있는 데 R3가 하기 화학식의 포스파이트 아마이드기인 경우가 바람직한 것으로 밝혀져 있다.
Figure 112007011583087-pat00045
또는
Figure 112007011583087-pat00046
(단, 상기 R7은 같거나 다른 독립적인 선형 또는 가지가 있는 탄소수 1 내지 4의 알킬 라디칼을 가진다.)
이러한 광분해성 화합물의 상기 R4는 O-메틸 라디칼, O-에틸 라디칼, O-아릴 라디칼, O-테트라하이드록피라닐, O-메톡시테트라하이드로피라닐 라니칼, O-t-부틸다이메칠실릴 라디칼일 수 있다.
상기 Y는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드일 수 있고, 공지의 퓨린 및 피리미딘 염기뿐 아니라 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함할 수 있다. 또, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 종래의 리보스당(ribofuranose) 및 디옥시리보스당(deoxyrifofuranose)을 포함할 뿐만 아니라 하나 이상의 하이드록실기가 할로겐 원자 또는 지방족으로 치환되거나 에테르 등의 작용기가 커플링된 변형된 당을 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드, 그리고 이들의 유도체에 광분해성 보호기가 커플링되어 광분해성 화합물 이 될 수 있다.
상기 Y는
Figure 112007011583087-pat00047
,
Figure 112007011583087-pat00048
또는
Figure 112007011583087-pat00049
일 수 있다.
(단, 상기 B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실이고,
상기 R6은 알킬기, 페닐기, 또는 황이고,
상기 p는 0 내지 5이고, 상기 q는 0 내지 10이다.)
바람직하게 상기 q는 3 내지 10일 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예들에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판에 대해 설명한다. 도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 실시예들에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판의 단면도들이다.
도 1a를 참고하면, 본 발명의 제1 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판(100)은 기판(110) 및 기판(110)에 직접 커플링된 하기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기를 포함한다.
<화학식 2>
Figure 112007011583087-pat00050
(단, 상기 X는
Figure 112007011583087-pat00051
또는
Figure 112007011583087-pat00052
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 직접 기판과 커플링되는 사이트이다.)
올리고머 프로브 어레이란 실리콘 웨이퍼 기판 등의 고체상 지지체에 올리고머 프로브를 고집적 미세배열(High Density arraying)한 것을 말한다. 올리고머 프로브에 대하여는 후술한다. 올리고머 프로브 어레이용 기판(100)이란 올리고머 프로브 어레이를 제조하기 위하여 제공될 수 있는 기판을 말할 수 있다.
기판(110) 올리고머의 혼성화(hybridization) 과정 동안 원하지 않는 비특이적 커플링을 최소화 나아가 실질적으로 0으로 할 수 있는 물질로 이루어질 수 있다. 나아가, 기판(110)은 가시광 및/또는 UV 등의 광원에 투명한 물질로 이루어질 수 있다. 기판은 가요성(flexible) 또는 강성(rigid) 기판일 수 있다. 가요성 기판은 나일론, 니트로셀룰로오스 등의 멤브레인 또는 플라스틱 필름 등일 수 있다. 강성 기판은 실리콘 기판, 소다 석회 유리와 같은 투명 유리 기판 등일 수 있다. 실리콘 기판 또는 투명 유리 기판의 경우에는 혼성화 과정 동안 비특이적 커플링이 거의 일어나지 않는 장점이 있다. 또, 투명 유리 기판의 경우에는 가시광 및/또는 UV 등의 광원에 투명해서 형광 물질의 검출에 유리하다. 실리콘 기판 또는 투명 유리 기판은 반도체 소자의 제조 공정 또는 LCD 패널의 제조 공정에서 이미 안정적으로 확립되어 적용되는 다양한 박막의 제조 공정 및 사진 식각 공정 등을 그대로 적용할 수 있다는 장점이 있다.
기판(110)에 화학식 2로 표시되는 커플링된 광분해성 보호기(170)는 상술한 화학식 1로 표시되는 광분해성 화합물에서 설명한 광분해성 보호기와 실질적으로 동일하므로, 그 설명은 생략한다.
화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기를 포함하는 올리고머 프로브 어레이용 기판(100)은 이후, 올리고머 프로브 등과 커플링하여 타겟 샘플과의 반응 수율을 높일 수 있다. 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기의 반감기가 짧고, 탈보호가 용이하기 때문이다.
이하, 도 1b를 참고하여 본 발명의 제2 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판(101)에 대하여 설명한다. 도 1b는 본 발명의 제2 실시예에 따른 올리고 머 프로브 어레이용 기판의 단면도이다. 본 실시예의 올리고머 프로브 어레이용 기판(101)은 도 1b에 나타낸 바와 같이, 제1 실시예의 올리고머 프로브 어레이용 기판(100)과 다음을 제외하고는 기본적으로 동일한 구조를 갖는다. 이하의 실시예들에서 앞서 설명한 구성요소의 구조 재료 등과 중복되는 경우, 그 설명을 생략하거나 간략화하기로 한다.
제2 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판(101)은 기판(110), 기판과 커플링된 링커(140, linker molecule) 및 링커(140)와 커플링된 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기(170)를 포함한다.
기판(110)상에 형성된 링커(140)를 포함하는 올리고머 프로브 어레이용 기판(101)은 이후, 올리고머 프로브와 커플링시에 기판(110)과 올리고머 프로브의 커플링을 매개(linker molecule)할 수 있고, 이후 타겟 샘플과의 혼성화에 필요한 공간적 마진을 제공할 수 있다. 도 1b에는 기판(110)과 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기의 커플링을 매개하는 링커(140)를 예시하고 있으나, 혼성화를 위한 공간적 마진을 제공하는 스페이서(spacer)의 역할을 할 수 있다. 링커(140)는 기판, 올리고머 프로브 등과 커플링할 수 있는 작용기를 가질 수 있고, 예를 들어 실란링커, 나노 입자(nano particle), 다이아조 케토기를 포함하는 중간막일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 기판(110)과 광분해성 보호기(170) 사이에 링커(140)가 게재됨으로써, 올리고머 프로브 어레이용 기판(101)을 사용한 올리고머 프로브 어레이의 반응 수율이 증가될 수 있다.
도 1c를 참고하여 본 발명의 제3 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판(102)에 대하여 설명한다. 도 1c는 제3 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판의 단면도이다. 본 실시예의 올리고머 프로브 어레이용 기판(102)은 도 1c에 나타낸 바와 같이, 제1 실시예의 올리고머 프로브 어레이용 기판(100)과 다음을 제외하고는 기본적으로 동일한 구조를 갖는다.
제3 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판(102)는 3차원의 표면을 포함한 기판(112), 기판(112) 상에 커플링된 광분해성 보호기(170)를 포함한다. 기판(112)의 표면이 3차원이므로, 올리고머 프로브 어레이용 기판(102)은 이후에 올리고머 프로브가 보다 고밀도로 집적될 수 있으며, 이는 디자인룰은 감소시키고 반응 수율은 증가시킨다.
다음으로, 첨부된 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예들에 따른 올리고머 프로브 어레이에 대해 설명한다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 실시예들에 따른 올리고머 프로브 어레이의 단면도이다
도 2a를 참고하면, 본 발명의 제1 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이(200)는 올리고머 프로브(160) 및 올리고머 프로브(160)에 커플링된 활성화 영역(A)과 올리고머 프로브(160)가 커플링되지 않은 비활성화 영역(B)을 포함하는 기판(111) 및 비활성화 영역(B)에서 기판(111)과 커플링된 하기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기를 포함한다.
<화학식2>
Figure 112007011583087-pat00053
(단, 상기 X는
Figure 112007011583087-pat00054
또는
Figure 112007011583087-pat00055
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 직접 또는 링커를 개재하여 기판에 커플링되는 사이트이다.)
기판(111)은 제1 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판(100)의 기판(110)과 실질적으로 동일하므로, 이에 대한 설명은 생략한다. 다만, 기판(111)은 올리고머 프로브(160)가 커플링된 활성화영역(A)과 올리고머 프로브(160)가 커플링되지 않은 비활성화 영역(B)을 포함한다는 점이, 올리고머 프로브 어레이용 기판(100)의 기판(110)과 다르다.
기판(111)의 활성화 영역(A)에 커플링된 올리고머 프로브(160)는 공유 결합된 두 개 이상의 모노머로 이루어진 폴리머(polymer)로서, 분자량이 대략 1000 이하의 것을 지칭할 수 있으나, 상기 수치에 한정되는 것은 아니다. 올리고머는 약 2 내지 500개의 모노머, 바람직하기로는 5 내지 30개의 모노머를 포함할 수 있다. 모노머는 올리고머 프로브 어레이에 고정된 프로브의 종류에 따라 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 아미노산, 펩티드 등이 될 수 있다.
뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 공지의 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함할 뿐만 아니라, 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함할 수 있다. 또, 뉴클레오 사이드 및 뉴클레오타이드는 종래의 리보스 및 디옥시리보스 당을 포함할 뿐만 아니라, 하나 이상의 하이드록실기가 할로겐 원자 또는 지방족으로 치환되거나 에테르, 아민 등의 작용기가 결합한 변형된 당을 포함할 수 있다.
아미노산은 자연에서 발견되는 아미노산의 L-, D-, 및 비키랄(nonchiral)형 아미노산 뿐 아니라, 변형 아미노산(modified amino acid), 또는 아미노산 유사체(analog) 등일 수 있다.
펩티드는 아미노산의 카르복실기와 다른 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합에 의해 생성된 화합물을 지칭한다.
도 2a에는 올리고머 프로브(160)로, 올리고머 프로브 1(161)과 올리고머 프로브 2(162)를 포함하는 것을 예시하고 있다. 올리고머 프로브를 구성하는 모노머는 각기 다른 서열의 모노머로 형성될 수 있다. 올리고머 프로브(160)가 핵산인 경 우를 예로 들면, 올리고머 프로브1(161)은 AGCTA... 올리고머 프로브2(162)는 GACT...등이 될 수 있다. 광분해성 보호기(170)는 올리고머 프로브(160)를 형성하는 제조 공정에서 사용되지만, 올리고머 프로브(160)가 완성되면 광분해성 보호기(170)는 제거되므로, 최종 구조물 형태인 도 2a의 올리고머 프로브(160)에서는 도시되지 않는다.
광분해성 보호기(170)는 잡음률(signal to noise)을 향상시키기 위해, 올리고머 프로브(160)가 커플링되지 않는 비활성화 영역(B)은 캡핑될 수 있다. 비활성화 영역(B)의 기판 표면, 예를 들어 SiOH 및 COH기 등은 비활성 캡핑시켜 올리고머 프로브(160)의 노이즈로 작용하지 않도록 할 수 있다. 비활성 캡핑은 SiOH 및 COH기를 아세틸화시킬 수 있는 캡핑기(150)를 사용하여 수행할 수 있다. 다만, 광분해성 보호기(170)가 소량 남아, 비활성 영역(B)의 기판 표면과 커플링될 수 있다.
올리고머 프로브 어레이(200)는 활성화 영역(A)과 비활성화 영역(B)을 포함하는 기판(111)을 포함하기 때문에, 향상된 잡음률(SNR, signal to noise)을 나타내고 적은 디자인룰에서도 원하는 검출 강도를 나타낼 수 있다.
이하, 도 2b를 참고하여 본 발명의 제2 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이(201)에 대하여 설명한다. 도 2b는 제2 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이의 단면도이다. 제2 실시예의 올리고머 프로브 어레이(201)는 제1 실시예에 의한 올리고머 프로브 어레이(200)와 다음을 제외하고는 기본적으로 동일한 구조를 갖는다.
제2 실시예에 의한 올리고머 프로브 어레이(201)는 링커를 개재하여 올리고머 프로브(160)와 커플링되어 있다. 올리고머 프로브(160)이 커플링된 활성화 영역(A)에서는 링커(140)가 개재되어 활성화 영역(A)과 올리고머 프로브(160)가 커플링되어 있고, 올리고머 프로브가 커플링되지 않는 비활성화 영역(B)에는 광분해성 보호기(170)가 커플링된 링커(140)가 커플링되어 있다. 링커(140)는 올리고머 프로브의 커플링을 매개(linker molecule)할 수 있고, 이후 타겟 샘플과의 혼성화에 필요한 공간적 마진을 제공할 수 있다. 도 2b에는 기판(111)의 활성화 영역과 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기의 커플링을 매개하는 링커(140)를 예시되고 있고, 사용되는 링커(140)는 혼성화를 위한 공간적 마진을 제공하는 스페이서(spacer)의 역할을 할 수 있다. 링커(140)는 기판, 올리고머 프로브 등과 커플링할 수 있는 작용기를 가질 수 있고, 예를 들어 실란링커, 나노 입자(nano particle), 다이아조 케토기를 포함하는 중간막일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 기판(111)의 활성화 영역(A)과 올리고머 프로브(160) 사이에 링커(140)가 게재됨으로써, 반응 수율이 증가될 수 있다. 링커(140)는 캡핑기(150)로 비활성 캡핑되어 향상된 잡음률을 나타낼 수 있다.
이하, 도 2c를 참고하여 본 발명의 제3 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이(202)에 대하여 설명한다. 도 2c는 제3 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이의 단면도이다. 제3 실시예의 올리고머 프로브 어레이(202)는 제2 실시예에 의한 올리고머 프로브 어레이(201)와 다음을 제외하고는 기본적으로 동일한 구조를 갖는다.
제3 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이(202)는 3차원의 표면을 포함한 기판(112), 기판(112) 상에 커플링된 광분해성 보호기(170)를 포함한다. 기판(112)의 표면이 3차원이므로, 올리고머 프로브 어레이용 기판(202)은 이후에 올리고머 프로브(160)가 보다 고밀도로 집적될 수 있으며, 그 결과 디자인룰은 감소되고 반응 수율은 증가될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예들에 따른 광분해성 화합물의 제조 방법에 대하여 설명한다.
본 발명의 광분해성 화합물은
Figure 112007011583087-pat00056
와 포스겐 유도체 및 Y를 커플링시키는 것을 포함한다.
<화학식 1>
Figure 112007011583087-pat00057
(단, 상기 X는
Figure 112007011583087-pat00058
또는
Figure 112007011583087-pat00059
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 할로겐, 아이드록실기,
Figure 112007011583087-pat00060
,
Figure 112007011583087-pat00061
,
Figure 112007011583087-pat00062
,
Figure 112007011583087-pat00063
또는
Figure 112007011583087-pat00064
이고,
상기 B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실이고,
상기 R3는 수소, 아미노기, 알킬기 또는 포스핀이고,
상기 R4는 수소, 하이드록실기, -OR5 또는 -SR5이고, 상기 R5는 알킬, 알케닐, 아세탈 또는 실릴에테르기이고,
상기 R6은 알킬기, 페닐기, 또는 황이고,
상기 p는 0 내지 5이고,
상기 q는 0 내지 10이다.)
우선,　상기 반응식 1에 따라 할로니트로페닐기(halonitrophenyl)를 가진 화합물을 합성할 수 있다.
<반응식 1>
Figure 112007011583087-pat00065
출발물질인 3-아미노아세토페논(3'-aminoacetophenone)을 메틸트리플루오로아세테이트(methyl trifluoroacetate)를 가지고 메탄올 용매 하에서 반응시켜 보호된 2번 화합물을 합성한 후 황산과 질산을 이용하여 질산화 반응을 할 수 있다. 그런 후 암모니아수를 이용하여 탈보호(deprotection) 하여 4번 화합물을 얻은 후 잔트마이어 반응(Sandmeyer reaction)을 통해 5번 화합물을 얻는다. 계속적으로 보로 하이드라이드나트륨(sodium borohydride)을 가지고 반응시켜 6번 화합물을 얻는다. 각각의 단계는 실리카겔 관 크로마토그라피를 이용하여 분리한다.
이후, 반응식 2에 따라 팔라듐 커플링(palladium coupling) 유도체를 형성할 수 있다.
<반응식 2>
Figure 112007011583087-pat00066
팔라듐 촉매(palladium catalyst)를 이용하여 다양한 작용기가 커플링된 유도체를 합성할 수 있다. 특히 페노보로닉산(phenylboronic acid)유도체를 이용하여 다양한 유도체를 합성할 수 있다. 계속적인 팔라듐 촉매를 이용하여 비편재화된 유도체를 합성할 수 있다.
다음으로, 반응식 3에 따라 오르토-(1-알키닐)벤잘디민(o-(1-alkynyl)benzaldimines)유도체와 아릴 할라이드(aryl halide)와의 반응을 1 기압(atm), CO 존재하에서 팔라듐 촉매 반응을 이용하여 이소퀴놀린(isoquinolines)유도체를 합성한다. 다음의 화합물의 합성방법은 [J.O.C 2002,67,86-94, Richard C, Larock]에 기재되어 있다.
<반응식 3>
Figure 112007011583087-pat00067
다음으로 상기 과정에서 형성된 알코올을 반응식 4 및 반응식 5와 같이, 포스겐(phosgene)유도체와 반응시켜 옥시카르보닐 클로라이드(oxycarbonyl chloride)를 포함하는 광분해성 화합물을 얻을 수 있다.
<반응식 4>
Figure 112007011583087-pat00068
<반응 식 5>
Figure 112007011583087-pat00069
바람직하게는 비극성 유기 용매에서 ―20℃ 내지 +25 ℃에서 반응시키게 된다. 포스겐 뿐만 아니라 다이포스겐(diphosgene, chloroformic acid trichloromethyl ester) 또는 트리포스겐(bistrichloromethyl carbonate)이 포스겐 유도체처럼 사용될 수 있다.
이후, 상기 반응식 4 및 상기 반응식 5에서 얻은 결과물에 상기 화학식에서 상기 Y를 커플링시킨다.
반응식 6 및 반응식 7을 참고하여, 상기 화학식에서 상기 Y가
Figure 112007011583087-pat00070
, 또는
Figure 112007011583087-pat00071
인 경우의 제조방법에 대하여 서술한다.
<반응식 6>
Figure 112007011583087-pat00072
<반응식 7>
Figure 112007011583087-pat00073
다시말해, 클로로카르본산 에스테르기를 가지는 광분해성 보호기를 뉴클레오사이드와 반응시킨다.
디클로로메탄(dichloromethane)과 극성의 유기 용매로 구성된 용매 혼합물 선택한 임의의 염기와 함께 ―60℃ 내지 +25℃에서 상기 뉴클레오사이드와 광분해성 보호기의 클로로카르본산 에스테르를 반응시킬 수 있다. DMF 또는 피리딘은 극성 유기 용매로 선호되며 피리딘이 사용되는 경우 다른 염기의 추가는 필요하지 않다. 그러나 디클로로메탄/DMF 용매 혼합물이 사용된다면 피리딘, 트리에틸아민(trietyl amine) 또는 에틸 디이소프로필아민(ethyl diisopropyl amine)과 같은 피리딘 염기가 바람직하다. 반응이 진행되는 동안 방출되는 수소원자를 화학적으로 제거(scavenge)하기 위함이다. 피리딘에 또는 DMF에 대한 디클로로메탄의 혼합 비율은 정밀하게 말할 수 있는 것은 아니나 피리딘 또는 DMF 각각의 부피에 대해 디클로로메탄의 부피가 각각 1 또는 3배가 되는 것이 바람직하다.
반응식 4의 광분해성 보호기는 용매(DMF)에 녹인 후 적절한 반응 온도하에서 뉴클레오사이드를 피리딘 또는 DMF/염에 용해시킨 둥근바닥 플라스크에 천천히 적가한다. 클로로카르본산 에스테르(광분해성보호기)에 대한 핵산의 몰 비율은 화학양론(stoichiometry)에 따라 일대일로 맞출 수 있다. 바람직하게는 클로로카르본산 에스테르의 양을 늘려서 클로로카르본산 에스테르에 대한 뉴클레오사이드의 몰비율을 일대일 또는 일대이로 조정할 수 있다.
5시간에서 6시간 정도 지나 반응이 완료될 때쯤 본 발명의 뉴클레오사이드는 알려진 방법에 의해 분리, 정제될 수 있다. 예를 들어 디클로로메탄으로 희석 한 후 염을 세척하여 염을 제거하고 유기상(organic phase)에 의해 건조시킨 후 용액의 농축 또는 결정화 및 이어서 실리카 겔 크로마토그래피(silica gel chromatography)와 같은 공지된 방법에 따라 분리하거나 정제할 수 있다. 이러한 방법으로 약 70 낸지 80%의 수율을 가진 고순도의 뉴클레오사이드 유도체를 얻는게 가능하다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따라 하기 화학식의 포스포라미디트(phosphoramidite)는 공지된 방법에 따라 뉴클레오사이드 유도체의 3'위치(R3 위치)에 도입하는 것도 가능하다.
Figure 112007011583087-pat00074
, 또는
Figure 112007011583087-pat00075
(단, 상기 R7은 같거나 다른 독립적인 선형 또는 가지가 있는 탄소수 1 내지 4의 알킬 라디칼을 가진다.)
일반적으로 이 반응은 0℃ 내지 25℃에서 적절한 포스핀(phosphine)을 1H 테트라졸(1H tetrazol)을 촉매로 사용하여 디클로로메탄 및 아세토니트릴(acetonitrile)를 포함하는 용매 혼합물에서 반응시킨다. 1H 테트라졸에 대한 포스핀의 몰비율은 2 내지 4배로 맞춰질 수 있다. 아세토니트릴에 대한 디클로로메탄의 정량적인 비율은 상대적으로 임계적이지 않고 바람직하게는 1대1 내지 4대1이 선호된다.
이하 도면 1a 내지 3e를 참조하여, 본 발명의 실시예들에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판의 제조 방법에 대하여 설명한다.
우선, 제1 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판(100)은 기판(110)을 제공하고, 기판(110)에 앞서 설명한 방법으로 제조한 화학식 2로 표시되는 화학 구조를 포함하는 광분해성 보호기(170)를 커플링시켜서 제조할 수 있다.
제2 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판(101)은 기판(110)을 제공하고, 기판에 광분해성 보호기(170)가 커플링된 링커(140)를 커플링시키켜서 제조할 수 있다. 링커(140)는 기판(110)의 표면이 SiOH인 경우, SiOH보다 올리고머 프로브 또는 모노머와 커플링 반응성이 좋은 작용기(150), 예를 들어 COH기를 가질 수 있다.
이하, 제3 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판(102)에 대하여 설명한다. 제3 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이용 기판(102)은 기판(110)을 제공하고, 기판(110)의 표면을 3차원으로 형성하고, 형성된 기판(112) 상에 광분해성 보호기(170)를 커플링하는 것을 포함한다.
도 3a 내지 도 3e를 참고하여, 기판(110)의 표면을 3차원으로 형성하는 것에 대하여 보다 자세히 설명한다.
도 3a 내지 도 3e는 본 발명의 제3 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이(102)의 제조 방법을 설명하기 위한 공정 중간 단계 구조물들의 단면도들이다.
도 3a에 예시된 바와 같이, 먼저 기판(110) 상에 기판(110)의 상면 또는 기판(110) 내에 3차원의 표면을 형성하기 위해, 기판(110) 상에 포토레지스트막(PRa)을 형성할 수 있다.
이때 기판 표면에는 도면에 도시되지는 않았으나, 기판(110) 상에 안정적으로 형성한 물질을 도포하여 보다 3차원 패턴을 용이하게 형성할 수 있다. 기판(110)의 상 및 기판(110) 내에 3차원 패턴을 형성하기 위해서 PE-TEOS막, HDP 산화막 또는 P-SiH4 산화막, 열산화막 등의 실리콘 산화막, 하프늄 실리케이트, 지르코늄 실리케이트 등의 실리케이트, 실리콘 질화막, Z늄산질화막 등의 금속 산질화막, 티타늄 산화막, 탄탈륨 산화막, 알루미늄 산화막, 하프늄 산화막, 지르코늄 산화막, ITO 등의 금속 산화막, 폴리이미드, 폴리아민, 금, 은, 구리, 팔라듐 등의 금속, 또는 폴리스티렌, 폴리아크릴산, 폴리비닐 등의 폴리머를 이용할 수 있다.
이때, 투영(projection) 노광기를 사용하여 포토레지스트막(PRa)을 노광한다. 투영 노광기는 기판(110)의 표면에 원하는 3차원 패턴을 형성할 수 있도록 디자인된 마스크(180)를 사용한다. 마스크(180)로는 투명 기판(182) 상에 프로브 셀 액티브를 정의하는 차광 패턴(184)이 형성되어 바둑판 형태의 노광 영역을 가지는 마스크가 예시되어 있으나 차광 패턴(184)의 형태는 사용하는 포토레지스트막(PRa)의 종류에 따라 변화될 수 있음은 물론이다.
도 3b에 예시된 바와 같이, 노광된 포토레지스트막(PRa)을 현상하여 포토레지스트 패턴(PRa')을 형성한 후 이를 식각 마스크로 하여 기판(110)의 표면을 변경 시킨다.
도 3c에 예시된 바와 같이, 일차적으로 표면이 변경된 기판(112a)의 상면 또는 기판(112a) 내에 보다 정교한 3차원의 표면을 형성하기 위해, 변경된 기판(112a) 상에 포토레지스트막(PRb)을 형성할 수 있다.
이때, 투영(projection) 노광기를 사용하여 포토레지스트막(PRb)을 노광한다. 사용되는 마스크(190)로 바둑판 형태의 노광 영역을 가지는 마스크가 예시되어 있으나 차광 패턴(194)의 형태는 사용하는 포토레지스트막(PRb)의 종류에 따라 변화될 수 있음은 물론이다.
도 3d 및 도 3e에 예시된 바와 같이, 노광된 포토레지스트막(PRb)을 현상하여 포토레지스트 패턴(PRb')을 형성한 후 이를 식각 마스크로 하여 기판(112a)의 표면을 변경시켜 3차원의 표면을 가지는 기판(112)을 제조할 수 있다.
도 3a 내지 도 3e에서는 마스크(180, 190)를 두번 사용하여 노광하였으나 마스크를 사용하는 횟수 및 마스크의 패턴이 다양하게 변형될 수 있음은 물론이다.
이후, 계속하여 광분해성 보호기(170)를 도 3e의 결과물인 기판의 표면에 커플링시킨다.
다음으로, 도 2a 및 도 4a 내지 4e를 참조하여 제1 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이(200)의 제조 방법에 대하여 설명한다.
제1 실시예에 따른 올리고머 프로브 어레이(200)는 하기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기(170)에 의해 보호되고 올리고머 프로브(160)의 제1 모노머(161a)와 커플링할 수 있는 작용기가 있는 기판(111)을 제공하고, 기판(111)을 선택적으로 노광시켜 선택된 영역(C)에서 광분해성 보호기(170)를 탈보호하고, 탈보호된 기판(111)의 작용기와 제1 모노머(161a)를 커플링시키는 것을 포함한다.
<화학식 2>
Figure 112007011583087-pat00076
(단, 상기 X는
Figure 112007011583087-pat00077
또는
Figure 112007011583087-pat00078
이고,
상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
상기 Y는 올리고머 프로브 또는 올리고머 프로브의 모노머와 커플링되는 사이트이다.)
도 4a 내지 도 4e는 제1 실시예에 의한 올리고머 프로브 어레이의 제조 방법을 설명하기 위한 공정 중간 단계 구조물들의 단면도들이다.
일단, 도 4a에 예시된 바와 같이, 상기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기(170)에 의해 보호되고 올리고머 프로브(도 2a의 160참조)의 제1 모노머(도 4c의 161a 참조)와 커플링할 수 있는 작용기가 있는 기판(110)을 제공한다.
다음으로, 도 4b에 예시된 바와 같이, 기판(110)을 차광 패턴(284)을 포함하는 마스크(280)에 의해 선택적으로 노광시켜 선택된 영역(C)에서 광분해성 보호기(170)를 탈보호시킨다.
도 4c예 예시된 바와 같이, 노광된 영역(C)에 탈보호된 기판 표면에는 광분해성 보호기(170)가 커플링된 제1 모노머(161a)를 커플링시킨다. 인-시츄로 올리고뉴클레오타이드 프로브를 합성하는 경우를 예로 든다면, 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C)이나 우라실(U) 중 어느 하나를 염기로 갖는 뉴클레오타이드를 포스포르아미디트 모노머로 할 수 있다. 예를 들어, 올리고머 프로브1(도 2a의 161 참조)는 AGCTA... 올리고머 프로브 2(도 2a의 162 참조)는 GACT...서열을 가질 수 있다. 도 4c에 예시된 바와 같이 올리고머 프로브1(도 2a의 161 참조)의 제1 모노머(161a)는 아데닌을 염기로 가지며 광분해성 보호기(170)가 커플링된 뉴클레오타이드 포스포르아미디트 모노머일 수 있다.
계속해서, 포스포아미디트와 5'-히드록시기 사이의 결합에 의해 생성된 포스파이트 트리에스터(phosphate trimester)를 포스페이트(phosphate)구조로 변환하기 위해 산화(oxidation)시킨다. 비활성 캡핑에는 예컨대, 아세틱 언하이드리드 및/또는 N-메틸이미다졸이 사용될 수 있다. 산화에는 예컨대 요오드가 사용될 수 있다.
올리고머 프로브(160)가 커플링되지 않은 비활성화 영역(B)은 도 2a에 예시된 바와 같이, 캡핑기(150)로 비활성 캡핑할 수 있다.
한편 도4c의 구조물에 고정되어 있는 뉴클레오타이드 포스포르아미디트 모노머(161a)는 다른 뉴클레오타이드 포스포르아미디트 모노머와 공유 또는 비공유 결합으로 커플링될 수 있는 작용기를 포함하며, 이는 광분해성 보호기(170)로 보호되어 있다. 따라서, 기판(110)의 상면에 형성된 작용기를 중심으로 살펴보면 광분해성 보호기(170)에 의해 보호된 작용기를 포함하는 뉴클레오타이드 포스포르아미디트 모노머(161a)가 고정된 영역(C)나 그 외 광분해성 보호기(170)에 의해 보호된 작용기를 포함하는 기판(110) 표면이 각각 광분해성 보호기(170)에 의해 보호된 점은 실질적으로 동일하다. 즉 도 4c의 구조물은 기판(110)의 상면에 형성된 커플링과 관계되는 작용기를 기준으로 할 때, 도 4a의 구조물과 실질적으로 동일하다.
계속하여, 도 4d에서 보듯이, 노광하고자 하는 영역(D1, D2)을 노광하여, 노광된 영역(D1, D2)의 광분해성 보호기(170)을 탈보호시킨다. 올리고머 프로브 1(도 2a의 161참조)의 제2 모노머(도 4e의 161b 참조)과 올리고머 프로브 2(도 2a의 162 참조)의 제1 모노머(도 4e의 162a 참조)가 동일한 물질인 경우, 차광 패턴(294)을 포함하는 마스크(290)에 의해 동시에 노광하여 광분해성 보호기(170)를 탈보호시킬 수 있다.
도 4e에서 보듯이 노광된 영역(D1, D2)에서는 광분해성 보호기(170)의 탈보호가되어 뉴클레오타이드 포스포르아미디트와 커플링할 수 있는 작용기가 노출되므로, 예를 들어, 구아닌을 염기로 하는 뉴클레오타이드 포스포르아미디트가 모노머로 커플링될 수 있다. 이때의 뉴클레오타이드 포스포르 아미디트 모노머(161b, 162a)는 각각 광분해성 보호기(170)가 커플링될 수 있다. 기판(110)의 상면에 형성된 커플링과 관계되는 작용기를 기준으로 보면, 도4c의 구조물과 실질적으로 동일하다.
즉, 도4e를 참고하면, 올리고머 프로브1(161)에서는 AG까지, 올리고머 프로브2(162)는 G까지 형성되고, 기판(110)의 상면에 커플링과 관계된 작용기는 광분해성 보호기(170)에 의해 보호될 수 있다. 계속해서, 포스포아미디트와 5'-히드록시기 사이의 결합에 의해 생성된 포스파이트 트리에스터(phosphate trimester)를 포스페이트(phosphate)구조로 변환하기 위해 산화(oxidation)시킨다. 비활성 캡핑에는 예컨대, 아세틱 언하이드리드 및/또는 N-메틸이미다졸이 사용될 수 있다. 산화에는 예컨대 요오드가 사용될 수 있다.
따라서, 다른 염기를 갖는 뉴클레오타이드 포스포르아미디트 모노머를 커플링하기 위해 수행되는 공정은 도4a 내지 도4c를 참조하여 설명한 방법들과 실질적으로 동일할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
상기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기(170)는 반감기가 짧고 반응 수율이 높을 수 있다. 활성화 영역(A)과 비활성화 영역(B)으로 나누어져있어서, 잡음률이 향상될 수 있다.
다음으로, 제 2실시예에 의한 올리고머 프로브 어레이(201)의 제조 방법에 대하여 설명한다.
제2 실시예에의한 올리고머 프로브 어레이(201)의 제조 방법은 제1 실시예의 올리고머 프로브 어레이(200)의 제조 방법과 다음을 제외하고는 기본적으로 동일한 구조를 갖는다.
제2 실시예에 의한 올리고머 프로브 어레이(201)는 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기에 의해 보호되고 올리고머 프로브의 제1 모노머와 커플링할 수 있는 작용기가 있는 기판(111)을 제공하고, 기판(111)을 선택적으로 노광시켜 선택된 영역에서 광분해성 보호기(170)를 탈보호하고, 탈보호된 기판의 작용기와 링커를 커플링시키고, 커플링된 링커(140)와 올리고머 프로브의 1 모노머를 커플링시키는 것을 포함한다.
다음으로, 제 3실시예에 의한 올리고머 프로브 어레이(202)의 제조 방법에 대하여 설명한다.
제3 실시예에 의한 올리고머 프로브 어레이(202)의 제조 방법은 제1 실시예의 올리고머 프로브 어레이(200)의 제조 방법과 다음을 제외하고는 기본적으로 동일한 구조를 갖는다.
제3 실시예에 의한 올리고머 프로브 어레이(202)는 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기에 의해 보호되고 올리고머 프로브의 제1 모노머와 커플링할 수 있는 작용기가 있으면서 3차원의 표면을 가지는 기판(112)을 제공하고, 기판(112)을 선택적으로 노광시켜 선택된 영역에서 광분해성 보호기(170)를 탈보호하고, 탈보호된 기판의 작용기와 링커를 커플링시키고, 커플링된 링커(140)와 올리고머 프로브의 1 모노머를 커플링시키는 것을 포함한다.
3차원의 표면을 가지는 올리고머 프로브 어레이(202)의 기판을 3차원으로 형성하는 것은 올리고머 프로브 어레이용 기판(102)의 제조 방법과 실질적으로 동일하다.
본 발명에 관한 보다 상세한 내용은 다음의 구체적인 실험예들을 통하여 설명하며, 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기 술적으로 유추할 수 있는 것이므로 설명을 생략한다.
실험예 1- 할로니트로페닐 화합물 합성( halonitrophenyl compound )
a) 3-아세틸- 트리플루오르아세틸아미노벤젠 (3- Acetyl -trifluoroacetylaminobenzene) 합성
100mL 둥근바닥 플라스크에 출발물질인 3-아미노아세토펜(3'-aminoacetophenone) 10mmol을 메탄올 용매 하에 녹인 후 메틸트리플루오르아세테이트(methyl trifluoroacetate, 1.2eq)를 가지고 30분 동안 상온에서 적가한 후 계속적으로 2시간 동안 교반 했다. 반응이 완결되었음을 TLC로 확인한 후 소량의 물을 이용하여 반응을 종결했다. 그런 후 용매를 감압 하에 제거하고 남은 잔류물을 에틸아세테이트(ethylacetate, 50mL)로 녹이고 물(30mL, 2회)로 씻은 후 무수황산나트륨으로 건조하고 감압 증류하여 원하는 3-아세틸-트리플루오르아세틸아미노벤젠(85%)을 갈색오일로 얻었다.
Rf=0.39(Hexane/EtOAc=1/1), 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7.70 (s, 1H, NH), 7.33-7.14(m, 4H, aromatic), 2.13(s, 3H)
b)　3-아세틸-4-니트로- 아미노벤젠 (3- Acetyl -4- nitro - aminobenzene ) 합성
출발물질(3-아세틸-트리플루오르아세틸아미노벤젠, 10mmol)을 conc H2SO4(20mL)에 -20℃에서 천천히 첨가한 후 30분간 교반하고 그런 후에 질산을 10분 동안 적가했다. 반응물을 계속적으로 2시간 동안 교반하고 반응이 완료되면 얼음물에 부었다. 얼음물을 에틸아세테이트(ethylacetate, 50mL, 2회)로 추출하고 유기층을 탄산수소나트륨 용액으로 세척한 후 유기층을 무수황산나트륨으로 건조한 후 감압 증류하여 에틸아세테이트를 제거하여 불순하게 얻은 후 conc NH4OH에 넣고 50℃에서 1시간 동안 교반하고 반응물을 로터리(rotary)를 이용하여 증발(evaporation)시키고 EtOAc와 물로 추출 후 실리카겔 관 크로마토그라피(Hexane/EtOAc=3/1)로 원하는 3-아세틸-4-니트로-아미노벤젠을 갈색고체(54%)로 얻었다.
Rf=0.25(Hexane/EtOAc=3/1), 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7.95(m, 1H), 6.44(m, 2H), 3.99(br, 2H, NH2), 2.11(s, 3H)
c) 3-아세틸-4-니트로- 브로모벤젠 (3- Acetyl -4- nitro - bromobenzene )합성
아이스 베스 (Ice bath)에서 출발물질(3-아세틸-4-니트로-아미노벤젠, 10mmol)를 HBr/H2O(100mL, 1/2, v/v)에 넣은 후 아질산나트륨 용액을 천천히 적가했다. 반응물을 60℃에서 2시간 동안 교반하고 반응 종결되면 침전물을 여과하고 여과액을 1N NaOH를 이용하여 중화한 후 EtOAc로 추출하고 무수황산나트륨으로 건조한 후 감압증류하고 실리카겔 관 크로마토그라피(Hexane/EtOAc=2/1)를 이용하여 원하는 3-아세틸-4-니트로-브로모벤젠을 노란색 오일(75%)로 얻었다.
Rf=0.31(Hexane/EtOAc=2/1), 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7.74(d, 1H), 7.52(d, 1H), 7.44(dd, 1H), 2.11(s, 3H)
d) 1-(5- 브로모 -2- 니트로페닐 )에탄올 (1-(5- Bromo -2- nitrophenyl ) ethanol ) 합성
아이스 베스에서 3-아세틸-4-니트로-브로모벤젠(10mmol)을 100mL 투 네크 라 운드 플라스크(two neck round flask)에 넣고 용매 에테르(ether, 30mL)로 녹인 후 수소화붕소나트륨을 천천히 적가했다. 반응물을 상온에서 2시간 동안 교반하고 반응 종결을 TLC로 확인한 후 물(5mL)로 반응을 종결시키고 침전물을 여과하고 여과액을 염화나트륨 용액(30mL, 2회)으로 씻은 후 무수황산나트륨으로 건조한 후 감압 증류하고 실리카겔 관 크로마토그라피(Hexane/EtOAc=2/1)를 이용하여 원하는 1-(5-브로모-2-니트로페닐)에탄올을 노란색 오일(71%)로 얻었다.
Rf=0.33(Hexane/EtOAc=1/3), 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7.73(d, 1H), 7.52(d, 1H), 7.42(dd, 1H), 6.15(m, 1H), 1.79(br, 1H), 1.62(d, 3H)
실험예 2-팔라듐 커플링 ( Palladium coupling ) 유도체 합성
a) 3-(1-하이드록시에틸)-2-니트로-9H- 플루오렌 -9-원(3-(1- hydroxyethyl )-2-nitro-9H-fluoren-9-one)합성
50mL 투 네크 라운드 플라스크(2-nect round flask)를 사용하여 출발물질 니트로 벤젠 유도체(반응식 2 및 반응식 3의 6번 물질, 0.25mmol, 1eq)를 넣은 후 반응용매 DMF(15mL)에 녹인 후 팔라듐 트리씨클로헥실 포스핀(Palladium tricyclohexyl phosphine)을 5mol% 를 넣고 세슘 피발레이트(cesium pivalate)(2eq)를 넣고 2-브로모페닐보론산(2-bromophenylboronic acid) (1.2eq)를 넣은 후 카본 모노옥사이드(carbon monoxide)를 1기압에서 버블링(bubbling)하였다. 그런 후 온도를 서서히 올려 110℃에서 10시간 동안 교반한 후 반응종결을 박막 크로마토그래피(TLC, thin layer chromatography)로 확인하고 반응종결 후 온도를 상온으로 내린 후 반응물에 NH4OH(50mL)와 에틸아세테이트(Ethylacetate) 50mL 로 씻은 후 유기층을 NH4OH(50mL)로 1회 더 세척하였다. 유기층은 무수황산나트륨으로 건조한 후 실리카겔크로마토그라피(EtOAc/Hex=1/1, Rf=0.4)를 이용하여 분리한 후 감압 증류하여 반응식 2에서의 화합물 8을 (노란색오일, 56%) 얻었다. Rf=0.4 (EtOAc/Hex=1/1);1H NMR(CDCl3) δ 7.59(dd, 2H), 7.38(m, 2H), 7.27(m, 2H), 6.17(m, 1H), 1.77(br, 1H), 1.61(d, 3H);IR (KBr, cm-1) 3075, 1600, 1345
b) N-(2- 페닐에티닐벤질리덴 )-t- 부틸아민 (N-(2- Phenylethynylbenzylidene )-t-butylamine) 합성(화합물 12)
투 네크 라운드 플라스크 100mL에 2-브로모벤즈알데하이드(2-Bromobenzaldehyde) 10.0mmol을 넣고 Et3N(40mL)에 녹인 후 페닐아세틸렌(phenylacetylene) 1.2mmol을 첨가하였다. 그런 후 PdCl2(PPh3)2 (2mol%)와 CuI(1mol%)을 첨가한 후 온도를 올려 50도에서 5시간 교반한 후 반응여부를 TLC로 확인하고 반응종결 후 상온으로 냉각하였다. 이후 고체를 여과하고 용매를 감압하에 제거한 후 실리카겔 관 크로마토그라피(EtOAc/Hex=1/10)를 이용하여 분리하여 노란 색 오일(화합물 11, 91%)로 얻었다.
출발물질 2-(phenylethynyl)benzaldehyde(5.0mmol)을 원 네크 라운드 플라스크(one neck round flask)에 넣고 t-BuNH2(6eq)을 넣고 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응종결을 TLC로 확인 후 반응물을 감압증류하고 EtOAc(50mL)로 씻고 무수황산나트륨으로 건조 후 여과하고 감압증류하여 원하는 화합물(12)를 불순하게 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 8.94(s, 1H), 8.12-8.05(m, 1H), 7.54-7.44(m, 3H), 7.33- 7.25(m, 5H), 1.34(s, 9H);IR (CHCl3, cm-1) 3065, 2210, 1644
c) 3-(1-하이드록시에틸)-4-니트로페닐)(2-페닐퀴놀린-3-일)메타논 (3-(1-hydroxyethyl)-4-nitrophenyl)(2-phenylquinolin-3-yl)methanone 합성(화합물 13)
N-t-부틸-o-(페닐에티닐)벤잘디민(N-t-butyl-o-(phenylethynyl)benzaldimine) (1eq)를 투 네크 라운드 플라스크에 넣고 아릴브로마이드(arylbromide)유도체(반응식 3의 화합물 6, 3eq)와 5mol % Pd(PPh3)4, 트리-n-부티라민(tri-n-butylamine) (5eq)을 용매 DMF(15mL)에 녹인 후 110 ℃에서 카본 모노옥사이드(carbon monoxide)를 버블링(bubbling)하였다. 반응 14시간 후 반응 종결을 박막 크로마토그래피로 확인하고 반응종결 후 온도를 상온으로 내렸다. 반응물에 NH4OH(50mL)와 에틸아세테이트(Ethylacetate) (50mL)로 씻은 후 유기층을 NH4OH(50mL)로 1회 더 세척하였다. 유기층은 무수황산나트륨으로 건조한 후 실리카겔크로마토그라피(EtOAc/Hex=1/5, Rf=0.32)를 이용하여 분리한 후 감압증류하여 원하는 화합물 13을 (노란색오일, 41%) 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ 8.22(d, 1H), 7.88(d, 1H), 7.85-7.51(m, 7H), 7.42(dd, 1H), 7.40-7.24(m,3H), 6.15(m, 1H), 1.84(br, 1H), 1.63(d, 3H);IR (CHCl3, cm-1) 3050, 1638, 1544
실험예 3- 옥시카르보닐 클로라이드( oxycarbonyl chloride ) 합성　
투 네크 라운드 플라스크(two neck round flask)에 1-(2-니트로-5-에틸)페 닐)에탄올 유도체를 출발물질(10mmol)로 하여 트리에틸아민(triethylamine, 1.5eq)을 넣고 THF 용액에 녹인 후 트리클로로메틸 클로로포맷(trichloromethyl chloroformate, 3eq)를 THF에 녹인 상태로 0 ℃에서 5분간 적가했다. 반응물을 0 ℃에서 1시간 동안 교반한 후 생성된 침전물을 여과한 후 여과액을 분별 증류하여 원하는 화합물(니트로페닐클로로포르메이트(nitrophenylchloroformate) 유도체)을 얻었다. 　
실험예 　4- 광분해성 보호기를 갖는 뉴클레오사이드 제조
광분해성 보호기와 염기가 커플링된 뉴클레오사이드를 반응시켰다. 먼저 염기가 커플링된 뉴클레오사이드(10mmol)을 건조된 피리딘(pyridine)을 사용하여 3회 로터리 이베포레이터(rotary evaporator)를 이용하여 감압 증류했다. 그런 후 피리딘(20mL)에 녹인 후 -10oC에서 N2(g)하에서 니트로페닐클로로포르메이트(nitrophenylchloroformate) 유도체(10.2mmol)를 천천히 적가했다. 계속적으로 DMAP(0.1eq, in 5mL pyridine)을 첨가하고 교반 막대(stirring bar)를 이용하여 5시간 동안 교반했다. TLC로 반응을 확인하고 반응이 종결되면 피리딘을 감압하에 제거하고 EtOAc(50mL)로 녹인 후 NaHCO3(aq,sat, 50mL)로 1회 씻고 NaCl(aq,sat, 30mL)로 1회 씻은 후 유기층을 Na2SO4로 건조한 후 감압증류하고 실리카겔 관 크로마토그라피를 이용하여 원하는 화합물(Photolabile protective deoxynucleoside)를 얻었다.
a) ((1R, 2R, 4R)-2- 하이드록시 -4-(5- 메틸 -2,4- 디옥소 -3,4- 디하이드로피리미 딘 -(2H)-일)시클로펜틸)메틸-1-(2-니트로-9-옥소-9H-플루오렌-3-일)에틸 카르보네이트 (((1R, 2R, 4R)-2- hydroxy -4-(5- methyl -2,4- dioxo -3,4- dihydropyrimidin -(2H)- yl ) cyclopentyl ) methyl -1-(2-nitro-9-oxo-9H-fluoren-3-yl)ethyl carbonate 합성(반응식 6에서 화합물 18)
Rf=0.32(EtOAc/Hexane=4/1);1H NMR(CDCl3) δ 11.24(br, 1H), 7.63(s, 1H), 7.58(dd, 2H), 7.38(m, 2H), 7.27(m, 2H), 6.11(m, 1H), 5.23(s, 1H), 5.12(s, 1H), 4.31(s, 1H), 3.68(m, 1H), 3.58(m, 2H), 2.23(m, 2H), 1.80(s, 3H), 1.61(d, 3H);IR (KBr, cm-1) 3052, 1612, 1348
b) ((1R, 2R, 4R)-2- 하이드록시 -4-(5- 메틸 -2,4- 디옥소 -3,4- 디하이드로피리미딘 -(2H)-일) 시클로펜틸 ) 메틸 -1-(2-니트로-5-(3- 페닐이소퀴놀린 -4-카르보닐) 페닐 )에틸 카르보네이트 ((1R, 2R, 4R)-2- hydroxy -4-(5- methyl -2,4- dioxo -3,4- dihydropyrimidin -(2H)-yl)cyclopentyl)methyl-1-(2-nitro-5-(3-phenylisoquinoline-4-carbonyl)phenyl)ethyl carbonate )합성(반응식 7의 화합물 20)
Rf=0.35 (EtOAc/Hexane =1/5); 1H NMR(CDCl3) δ 11.03(br, 1H), 8.22(d, 1H), 7.85(d, 1H), 7.85-7.50(m, 8H), 7.42(dd, 1H), 7.43-7.22(m,3H), 6.11(m, 1H), 5.23(s, 1H), 5.14(s, 1H), 4.31(s, 1H), 3.67(m, 1H), 3.56(m, 2H), 2.21(m, 2H), 1.81(s, 3H), 1.62(d, 3H);IR (CHCl3, cm-1) 3054, 1605
실험예 　5- 광분해성 보호기를 갖는 포스포르아미디트 ( Phosphoramidite ) 제조
a) ((1R, 2R, 4R)-2-((2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스피노옥시)-4-(5-메틸-2,4- 디옥소 -3,4- 디하이드로피리미딘 -(2H)-일) 시클로펜틸 ) 메틸 -1-(2-니트로-9-옥소-9H-플루오렌-3-일)에틸 카르보네이트 ((1R, 2R, 4R)-2-((2- cyanoethoxy )( diisopropylamino ) phosphinooxy )-4-(5- methyl -2,4- dioxo -3,4-dihydropyrimidin-(2H)-yl)cyclopentyl)methyl-1-(2-nitro-9-oxo-9H-fluoren-3-yl)ethyl carbonate)(반응식 6의 화합물 19의 합성)
질소하에서 출발물질(18, ((1R, 2R, 4R)-2-하이드록시-4-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-(2H)-일)시클로펜틸)메틸-1-(2-니트로-9-옥소-9H-플루오렌-3-일)에틸 카르보네이트((1R, 2R, 4R)-2-hydroxy-4-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-(2H)-yl)cyclopentyl)methyl-1-(2-nitro-9-oxo-9H-fluoren-3-yl)ethyl carbonate, 10mmol)을 투 네크 라운드 플라스크에 넣고 용매(CH2Cl2, 30mL)에 녹인 후 상온에서 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine, 1.5eq)를 넣고 비스(디이소프로필아미노)-β-시아노에톡시포스페인(bis(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphane, 1.2eq)을 천천히 적가했다. 계속적으로 2시간 동안 교반 후 반응의 완결을 TLC로 확인하고 반응이 종결되면 물(30mL)로 1회 씻은 후 염화나트륨(sat, aq, 30mL)으로 1회 씻고 유기층을 무수황산나트륨으로 건조한 후 감압증류하고 실리카겔 관 크로마토그라피(Hex/EtOAc/Et3N=1/2/0.01)로 원하는 화합물 19를 노란색 고체(72%)로 얻었다.
Rf=0.25 (EtOAc/Hexane =1/5); 1H NMR(CDCl3) δ 8.23(d, 1H), 7.86(d, 1H), 7.85-7.47(m, 8H), 7.42(dd, 1H), 7.40-7.19(m,3H), 6.11(m, 1H), 4.58-4.19(m, 4H), 3.83(m, 1H), 3.67(m, 1H), 3.56(m, 2H), 2.62(m, 2H), 2.21(m, 2H), 1.81(s, 3H), 1.64(d, 3H), 1.21(m, 12H)
b) ((1R, 2R, 4R)-2-(2-시아노에톡시)(디이소프로필아미노)포스피노옥시)-4-(5-메틸-2,4- 디옥소 -3,4- 디하이드로피리미딘 -(2H)-일) 시클로펜틸 ) 메틸 -1-(2-니트로-5-(3- 페닐이소퀴놀린 -4-카르보닐)페닐)에틸 카르보네이트 ((1R, 2R, 4R)-2-(2- cyanoethoxy )( diisopropylamino ) phosphinooxy )-4-(5- methyl -2,4- dioxo -3,4- dihydropyrimidin -(2H)- yl ) cyclopentyl ) methyl -1-(2- nitro -5-(3-phenylisoquinoline-4-carbonyl)phenyl)ethyl carbonate ) 합성(반응식 7의 화합물 21)
화합물 19합성과 같은 방법으로 실험하여 원하는 화합물 21을 노란색 고체로(68%) 얻었다.
Rf=0.31 (EtOAc/Hexane =1/3); 1H NMR(CDCl3) δ 8.24(d, 1H), 7.79(d, 1H), 7.85-7.49(m, 8H), 7.43(dd, 1H), 7.41-7.22(m,3H), 6.17(m, 1H), 4.59-4.18(m, 4H), 3.69(m, 1H), 3.55(m, 2H), 2.25(m, 2H), 2.22(m, 2H), 1.84(s, 3H), 1.62(d, 3H), 1.18(m, 12H)
조사( irradiation )실험
1. 실행
광분해성 보호기와 커플링된 핵산(Photolabile protective deoxynucleoside(dT)) 유도체들을 아세토니트릴(acetonitrile/H2O=95/5(v/v)에 농 도 100uM로 녹인 후 Hg(Xe) ARC lamp를 이용하여 200W로 365nm에서 10초, 20초, 30초, 40초, 50초, 1min간 노광하여 HPLC를 이용하여 탈보호(deprotection)정도를 실험하였다. 조사(irradiation)는 석영셀(quartz cell)에서 진행하였고 각각 시간에 따라 HPLC(Varian MicroPak SP column(C18))를 사용하여 분석하였고 용매는 ACN: H2O=1:1.5로 하였고 유속(flow rate)은 1mL/min로 하였다. 　
비교예 1은 메틸-6-니트로피페로닐옥시카르보닐((MeNPOC, methyl-6-nitroperonyloxycarbonyl)을 광분해성 보호기로 가지는 핵산(deoxythymidine, dT)이다.
비교예 2는 3'-니트로페닐프로필옥시카르보닐(NPPOC, 3'-Nitrophenylpropyloxycarbonyl)을 광분해성 보호기로 가지는 핵산(deoxythymidine, dT)이다.
화합물 1 내지 화합물 2는 다음 화학식으로 표시되는 화합물이다.
<화합물 1>
Figure 112007011583087-pat00079
<화합물 2>
Figure 112007011583087-pat00080
(단, 상기 B는 티미딘이고, 상기 R4는 수소, 상기 R3는
Figure 112007011583087-pat00081
이다.)
도 5는 상기 조사 실험의 결과를 분석한 그래프이고, 표 1은 조사실험의 결과를 수치로 나타낸 표로, 노광시간에 따른 HPLC를 분석 결과를 보여준다.
표 1 조사 실험의 결과
화합물 용매(v/v) 반감기(t1/2,second)
1 비교예 1 ACN/H2O=95/5 37
2 비교예 2 ACN/H2O=95/5 33
3 화합물 1 ACN/H2O=95/5 15
4 화합물 2 ACN/H2O=95/5 14
도 5와 표 1에 의하면, 본 발명에서 합성한 화합물이 기존에 광분해성 보호기로 널리 사용되고 있는 비교예 1(MeNPOC-dT), 비교예 2(NPPOC-dT)가 핵산에 커플링된 형태보다 광분해되는 속도가 빠른 결과를 보였다. 화합물 1 및 화합물 2의 반감기(half-change value)는 비교예 1 및 비교예 2에 비하여 짧다.
형광 강도( intensity ) 측정
8인치 웨이퍼 기판 상에 광분해성 보호기가 붙어있는 포스포르아마디트 모노머(photolabile monomer phosphoramidite)(10mM)를 사용하여 30분 동안 반응 후 캡 핑(Capping), 산화(oxidation)를 진행하였고 노광을 7J에서 실시하여 탈보호(deprotection)하였다. 계속적인 반복을 통해서 25mer의 올리고핵산을 합성한 후 플루오레센(Fluorescein)이 라벨링된 올리고핵산을 혼성화시켰다. 혼성화된 프로브의 형광 강도(intensity)를 CCD(ArrayWorx)를 사용하여 스캐닝(scanning)하였다.
도 5는 올리고머 프로브로 25mer의 올리고 핵산을 사용한 경우에 있어서의 올리고머 프로브 어레이의 CCD측정 결과이다. 도 5를 참고하면, 본 발명에서 합성한 화합물이 기존에 광분해성 보호기로 널리 사용되고 있는 MeNPOC-dT에 비해 형광 강도가 높음을 알 수 있다. 광분해속도, 즉 탈보호 속도가 빠르기 때문에 반응 수율도 높아지고, 그 결과 형광 감도도 상대적으로 높음을 보여준다.
　이상 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 광분해성 화합물은 올리고머 프로브 어레이의 제조 등에 사용될 수 있다. 화학식으로 표시되는 화합물 또는 화학식으로 표시되는 물질이 커플링된 올리고머 프로브 어레이는 포함된 광분해성 보호기의 탈보호가 빠르므로, 올리고머 프로브 어레이 제조 공정에서 사용되는 경우 전체적인 반 응 수율을 증가시킬 수 있다.

Claims (22)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 광분해성 화합물.
    <화학식 1>
    Figure 112007033713468-pat00082
    (단, 상기 X는
    Figure 112007033713468-pat00083
    또는
    Figure 112007033713468-pat00084
    이고,
    상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
    상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
    상기 Y는 할로겐, 하이드록실기,
    Figure 112007033713468-pat00085
    ,
    Figure 112007033713468-pat00086
    ,
    Figure 112007033713468-pat00087
    Figure 112007033713468-pat00088
    ,
    Figure 112007033713468-pat00089
    이고,
    상기 B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 또는 우라실이고,
    상기 R3는 수소, 아미노기, 알킬기 또는 포스핀이고
    상기 R4는 수소, 하이드록실기, -OR5 또는 -SR5이고, 상기 R5는 알킬, 알케닐, 아세탈 또는 실릴에테르기이고,
    상기 R6은 알킬기, 페닐기, 또는 황이고,
    상기 p는 0 내지 5이고,
    상기 q는 0 내지 10이다.)
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 R1은 수소이고, 상기 R2는 메틸기인 광분해성 화합물.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 Y는
    Figure 112007011583087-pat00090
    또는
    Figure 112007011583087-pat00091
    인 광분해성 화합물.
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 R3는 수소 또는 하기 화학식의 포스포르아미디트인 광분해성 화합물.
    Figure 112007011583087-pat00092
    또는
    Figure 112007011583087-pat00093
    (단, 상기 R7은 같거나 다른 독립적인 선형 또는 가지가 있는 탄소수 1 내지 4의 알킬 라디칼을 가진다.)
  5. 제3 항에 있어서,
    상기 R4는 O-메틸 라디칼, O-에틸 라디칼, O-아릴 라디칼, O-테트라하이드록피라닐, O-메톡시테트라하이드로피라닐 라디칼, O-t-부틸다이메칠실릴 라디칼인 광분해성 화합물.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 Y는
    Figure 112007011583087-pat00094
    이고,
    상기 q는 3 내지 10인 광분해성 화합물.
  7. 기판; 및
    상기 기판에 직접 또는 링커를 개재하여 커플링된 하기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기를 포함하는 올리고머 프로브 어레이용 기판.
    <화학식 2>
    Figure 112007011583087-pat00095
    (단, 상기 X는
    Figure 112007011583087-pat00096
    또는
    Figure 112007011583087-pat00097
    이고,
    상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
    상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
    상기 Y는 직접 또는 링커를 개재하여 기판과 커플링되는 사이트이다.)
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 기판은 상기 기판 내 또는 상기 기판 상에 3차원의 표면을 포함하고,
    상기 광분해성 보호기는 상기 기판의 3차원의 표면과 커플링된 올리고머 프로브 어레이용 기판.
  9. 올리고머 프로브;
    상기 올리고머 프로브와 커플링된 활성화 영역과 상기 올리고머 프로브가 커 플링되지 않은 비활성화 영역을 포함하는 기판; 및
    상기 비활성화 영역에서 상기 기판과 커플링된 하기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기를 포함하는 올리고머 프로브 어레이.
    <화학식2>
    Figure 112007011583087-pat00098
    (단, 상기 X는
    Figure 112007011583087-pat00099
    또는
    Figure 112007011583087-pat00100
    이고,
    상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
    상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
    상기 Y는 직접 또는 링커를 개재하여 기판과 커플링되는 사이트이다.)
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 활성화 영역은 3차원의 표면을 포함하는 올리고머 프로브 어레이.
  11. Figure 112007011583087-pat00101
    와 포스겐 유도체 및 Y를 커플링시켜 하기 화학식 1로 표시되는 광분해성 화합물 제조 방법.
    <화학식 1>
    Figure 112007011583087-pat00102
    (단, 상기 X는
    Figure 112007011583087-pat00103
    또는
    Figure 112007011583087-pat00104
    이고,
    상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
    상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
    상기 Y는 할로겐, 하이드록실기,
    Figure 112007011583087-pat00105
    ,
    Figure 112007011583087-pat00106
    ,
    Figure 112007011583087-pat00107
    ,
    Figure 112007011583087-pat00108
    또는
    Figure 112007011583087-pat00109
    이고,
    상기 B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우라실이고,
    상기 R3는 수소, 아미노기, 알킬기 또는 포스핀이고
    상기 R4는 수소, 하이드록실기, -OR5 또는 -SR5이고, 상기 R5는 알킬, 알케닐, 아세탈 또는 실릴에테르기이고,
    상기 R6은 알킬기, 페닐기, 또는 황이고,
    상기 p는 0 내지 5이고,
    상기 q는 0 내지 10이다.)
  12. 제11 항에 있어서,
    상기 포스겐 유도체는 포스겐, 다이포스겐 또는 트리포스겐인 광분해성 화합물 제조 방법.
  13. 제11 항에 있어서,
    상기
    Figure 112007011583087-pat00110
    는
    Figure 112007011583087-pat00111
    와
    Figure 112007011583087-pat00112
    를 팔라듐 촉매하에서 CO와 커플링시켜 제조한 광분해성 화합물 제조 방법.
    (단, 상기 Z는 할로겐이다.)
  14. 제11 항에 있어서,
    상기
    Figure 112007011583087-pat00113
    는
    Figure 112007011583087-pat00114
    와
    Figure 112007011583087-pat00115
    을 팔라듐 촉매하에서 CO와 커플링시켜 제조한 광분해성 화합물 제조 방법.
    (단, 상기 Z는 할로겐이고,
    상기 W는 알킬이다.)
  15. 기판을 제공하고,
    상기 기판에 직접 또는 링커를 개재하여 하기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기를 커플링하는 것을 포함하는 올리고머 프로브 어레이용 기판 제조 방법.
    <화학식 2>
    Figure 112007011583087-pat00116
    (단, 상기 X는
    Figure 112007011583087-pat00117
    또는
    Figure 112007011583087-pat00118
    이고,
    상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
    상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
    상기 Y는 직접 또는 링커를 개재하여 기판과 커플링되는 사이트이다.)
  16. 제15 항에 있어서,
    상기 기판은 상기 기판 내 또는 상기 기판 상에 3차원의 표면을 포함하는 올리고머 프로브 어레이용 기판 제조 방법.
  17. 하기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기가 커플링된 기판을 제공하고,
    상기 기판을 선택적으로 노광시켜 선택된 영역에서 상기 광분해성 보호기를 탈보호하고,
    상기 탈보호된 기판의 상기 작용기와 제1 모노머를 커플링시키는 것을 포함하는 올리고머 프로브 어레이 제조 방법.
    <화학식 2>
    Figure 112008009995880-pat00119
    (단, 상기 X는
    Figure 112008009995880-pat00120
    또는
    Figure 112008009995880-pat00121
    이고,
    상기 R1은 수소, 알킬기 또는 아세틸기이고,
    상기 R2는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 페닐이고,
    상기 Y는 올리고머 프로브의 모노머와 커플링되는 사이트이다.)
  18. 제17 항에 있어서,
    상기 제1 모노머는 상기 화학식 2로 표시되는 광분해성 보호기가 커플링된 올리고머 프로브 어레이 제조 방법.
  19. 제18 항에 있어서,
    상기 탈보호된 기판과 상기 제1 모노머를 커플링시킨후에,
    상기 기판을 선택적으로 노광시켜 선택된 영역에서 상기 광분해성 보호기를 탈보호하고,
    상기 탈보호된 상기 제1 모노머와 상기 광분해성 보호기가 커플링된 제2 모노머를 커플링시키는 것을 더 포함하는 올리고머 프로브 어레이 제조 방법.
  20. 제 17항에 있어서,
    상기 올리고머 프로브는 핵산이고,
    상기 올리고머 프로브의 모노머는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드인 올리고머 프로브 어레이 제조 방법.
  21. 제17 항에 있어서,
    상기 제공된 기판은 상기 링커를 개재하여 상기 광분해성 보호기에 의해 보호된 올리고머 프로브 어레이 제조 방법.
  22. 제17 항에 있어서,
    상기 기판은 상기 기판 내 또는 상기 기판 상에 3차원의 표면을 포함하는 올리고머 프로브 어레이 제조 방법.
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