CN117480008A - 用于dna合成的电接枝膜 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了官能化芳基重氮鎓盐和通过电接枝官能化芳基重氮鎓盐而形成的膜。本申请还提供了用于纯化官能化芳基重氮鎓盐的方法和用于用官能化芳基重氮鎓盐涂覆固体支持物系统的方法。这些涂覆的固体支持物系统能够例如用于寡核苷酸合成方法中。

Description

用于DNA合成的电接枝膜
技术领域
本披露提供了通过电接枝官能化芳基重氮鎓盐而形成的膜。还提供了用于利用涂覆有薄膜的电极进行寡核苷酸合成的方法，这些薄膜是通过电接枝官能化芳基重氮鎓盐而形成的。
背景技术
DNA微阵列领域的快速发展催生了许多用于合成制备DNA的方法。这样的方法包括点样预合成的寡核苷酸、使用掩膜或无掩膜技术的光刻、通过打印试剂的原位合成、以及使用保护性基团的电化学去封闭在电极微阵列上的原位平行合成。寡核苷酸微阵列合成的综述由例如Gao等人,Biopolymers 2004,73:579提供。1991年报告了使用光掩膜技术合成制备肽阵列。该方法于2000年扩展至包括使用光生酸和/或与光敏剂组合进行去封闭的可寻址掩膜(addressable masking)技术。使用光不稳定去封闭的肽微阵列合成的综述由以下提供：Pellois等人,J.Comb.Chem.2000,2:355以及Fodor等人,Science,1991,251:767。点样预合成的肽或分离的蛋白质已用于产生肽阵列。蛋白质或肽阵列的综述由以下提供：Cahill和Nordhoff,Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.2003,83:177。
在CMOS(互补金属氧化物半导体)型电极阵列上的电化学平行DNA合成已经有了描述(Maurer等人,2006,PLoS One.2006年12月20日；1(1):e34；美国专利号10,525,436)。在此应用中，在DNA合成之前，CMOS芯片表面每个铂电极上用吸收的多孔反应层涂覆。DNA合成起始于多孔层上的羟基。DNA合成后，寡聚体留在芯片上，或者寡聚体从芯片表面切割下来。吸收的多孔涂层的一个问题是释放寡聚体的切割时间长。长的切割时间减缓了DNA合成产生并且可能影响DNA的质量。释放的寡聚体可能仍然具有连接至3'-末端的、吸收的经涂覆分子。DNA链的3'-修饰对于一些应用(诸如PCR引物)是一个问题，因为3'-修饰阻断聚合酶延伸。电极上吸收的涂层的另一个问题是在DNA合成期间或当用于多种杂交测定时的降解。
用苯乙醇基团涂覆金电极以用作DNA合成的化学已有了描述(Levrie,2018,Jpn.J.Appl.Physics,04FM01，将其通过引用以其全文并入本文)，其中重氮鎓盐由3mM 4-氨基苯基醇(APE-OH)在酸中利用过量的亚硝酸钠“原位”制备获得。
类似地，APE-OH重氮鎓(Dz)盐沉积在金表面上并且进一步经官能化以制备用于分子印迹的聚合物接枝物(Gam-Derouich,2010,Surf.Int.Anal.1050)。
尽管已经报道了芳基重氮鎓电接枝到铂电极表面上(Bernard等人,2003,Chem.Mater.3450-3462)，但表面涂层没有合适的用于DNA合成或使用标准化学偶联方法附接生物分子的官能接头基团。
本发明通过提供用于利用官能化芳基重氮鎓盐涂覆CMOS芯片中的微电极进行寡核苷酸合成的方法来解决这些挑战。
发明内容
本文提供了用于利用涂覆有薄膜的电极进行寡核苷酸合成的方法和组合物，这些薄膜是通过电接枝官能化芳基重氮鎓盐而形成的。
在一个实施例中，使用官能化芳基重氮鎓盐将包含官能团的薄膜(诸如聚醇膜)直接引入电极表面上以起始DNA合成。根据此实施例的官能化芳基重氮鎓盐具有下式：
Y-R-Ar-N2 +X-，
其中：
Y是官能团；
R是任何有机基团或不存在；并且
X是无机或有机阴离子。
在一些实施例中，Ar选自苯基、二甲苯基、萘基、甲苯基和吲哚基。在一些实施例中，Ar是苯基。
在一些实施例中，Y是-OH、-COOH或-NH2。在一些实施例中，Y是受保护的。例如，在一些实施例中，Y是受保护的-OH、受保护的-COOH或受保护的-NH2。
在一些实施例中，R选自烷基、烯基、芳基和杂芳基。在一些实施例中，R选自直链或支链C1-C16烷基、直链或支链C1-C12烷基、直链或支链C1-C8烷基。在一些实施例中，R选自甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、正丁基、正戊基、异戊基和1,1-二甲基丙基。
在一些实施例中，X是卤素、四氟硼酸根或甲苯磺酸根。
在某些实施例中，这些官能化芳基重氮鎓盐选自由以下项组成的组：4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)、4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(APE-OH重氮鎓盐)和4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-酸重氮鎓盐)。
在一些实施例中，这些官能化芳基重氮鎓盐是纯化的。
在第一个DNA合成偶联循环期间，膜表面上暴露的醇残基与活化的(二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的)核苷亚磷酰胺反应。在合成期间将膜表面上未反应的醇残基进一步封端，并且进一步组装寡核苷酸链。可以将聚醇涂覆的电极进一步用可切割接头官能化，以允许在合成后释放DNA。
在一方面，本发明提供了纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐。在一些实施例中，该纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐选自由以下项组成的组：纯化的4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)、纯化的4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(APE-OH重氮鎓盐)和纯化的4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-酸重氮鎓盐)。
在另一方面，本发明提供了一种用于制备纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐的方法，该方法包括：
a)将起始苯胺溶解在乙醇中并且添加三氟化硼-THF络合物；
b)将所得溶液冷却并且添加亚硝酸叔丁酯；
c)将所得溶液温热至室温；以及
d)直接或以油状物的形式收集沉淀的盐。
在一些实施例中，该方法进一步包括：
e)将沉淀的盐用乙醚洗涤。
在一方面，本发明提供了用于合成寡核苷酸的固体支持物系统，其中该支持物是涂覆有包含官能团的薄膜的电极。在一些实施例中，该薄膜包含羧酸和/或醇官能团。在一些实施例中，该薄膜包含聚醇，优选聚苄醇。在一些实施例中，该薄膜通过电接枝或自发接枝具有下式的官能化芳基重氮鎓盐来形成：
Y-R-Ar-N2 +X-，
其中：
Y是官能团；
R是任何有机基团或不存在；并且
X是无机或有机阴离子。
在一些实施例中，该薄膜包括至少两层。在某些实施例中，该薄膜包括松散外部聚醇(例如，聚苄醇)层和稳定内部羟基层。在一些实施例中，可以用浓氢氧化铵去除松散外部聚苄醇(例如，聚苄醇)层。
在进一步的实施例中，该固体支持物进一步用长间隔物亚磷酰胺分子和/或可切割接头修饰。在一些实施例中，该间隔物可以是分支胺或聚合物胺，诸如PEI或聚-L-赖氨酸。
在一些实施例中，该固体支持物是电极阵列装置，任选地是使用标准CMOS技术制造的。在某些实施例中，该电极是铂、钛或氮化钛电极。
在另一方面，本发明提供了用包含官能团(诸如羧酸或醇官能团)的薄膜涂覆用于合成寡核苷酸的固体支持物系统的方法，该方法包括将该固体支持物用包含芳基重氮鎓盐和电解质的溶液处理，以及任选地给该固体支持物通电，从而产生涂覆的固体支持物。在一些实施例中，使涂覆的固体支持物进一步与重氮鎓单体基团另外的反应性自由基反应以得到多层膜。在一些实施例中，该多层膜包括松散外部聚醇(例如，聚苄醇)层和稳定内部羟基层。在一些实施例中，该涂覆用于合成寡核苷酸的固体支持物系统的方法进一步包括将涂覆的固体支持物用乙腈洗涤。在一些实施例中，该涂覆用于合成寡核苷酸的固体支持物系统的方法进一步包括将涂覆的固体用浓氢氧化铵处理。在一些实施例中，该支持物是电极，任选地是铂、钛或氮化钛电极。在某个实施例中，该支持物是铂电极。在某个实施例中，该芳基重氮鎓盐选自由以下项组成的组：4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)、4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(APE-OH重氮鎓盐)和4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-酸重氮鎓盐)。
在进一步的实施例中，这些方法和组合物可以包含用于合成寡核苷酸的固体支持物系统，其中该支持物包括涂覆有含有官能团的薄膜的电极。在一些实施例中，这些官能团是羧酸和/或醇基团。可以使羧酸基团进一步与氨基醇间隔物分子反应，目的是使末端醇远离固体表面。也可以用这种方法将分支胺或聚合物胺诸如PEI或聚-L-赖氨酸固定到电极表面，以改变电极表面上胺涂层的结构。这允许进一步控制胺基团的表面密度。胺涂覆的固体支持物通常用于自动化DNA合成。可以使用类似的方法引入可切割接头或间隔物分子，以提高胺涂覆的电极上DNA合成的产量和质量。
在实施例中，用于合成寡核苷酸的方法可以包括使用本文所述组合物。DNA合成应用需要高产量的全长产物，其中长度为10-200nt是有价值的。在一种应用中，以微阵列形式合成寡核苷酸池(pool)，其中在设计序列的3’末端有可切割接头。合成后，随后将DNA链从芯片上切割下来并且脱保护以得到在溶液中的寡核苷酸“池”。对于汇集的寡聚体，膜上密度较低(松散)的表面结构提供了更多可用羟基，以在每个电极上起始DNA合成(DNA合成后的产量高)。然而，膜的这种“松散层”是脆弱的，并且不适用于需要探针微阵列保持固定在涂覆的电极上的DNA合成应用。
对于微阵列应用，DNA链不是用3’末端的可切割接头合成的，并且DNA链应保持固定在它们组装所处的电极上的表面涂层上。但是，从“松散”的外层聚醇(例如聚苄醇)上合成的DNA链在乙二胺(EDA)/乙醇脱保护条件下被切割，以去除核苷酸碱基上的保护基团。结果，DNA探针在脱保护过程中被洗掉，并且在用cy-5标记的互补物杂交测定中观察的荧光信号低。我们发现，在DNA合成之前，可以通过热的浓氢氧化铵“剥离”，从电极涂层上去除“松散层”。剥离后的所得层产生稳健的羟基涂覆的膜，该膜适用于DNA合成并且对于用EDA/乙醇进行最终碱基脱保护是稳定的。cy5微阵列杂交测定中的高荧光信号证明合成探针保持固定在电极上。
在一方面，本披露的实施例可以包括制备用于寡核苷酸合成的电极表面的方法，这些方法包括(a)将该电极表面清洁，(b)将重氮鎓盐引入经清洁的电极表面，(c)电接枝该重氮鎓盐以便在经清洁的电极表面上形成聚醇多层膜，其中该多层膜可以包括松散外部聚醇层和内部稳定聚醇层，(d)将该松散外部聚醇层剥离或去除，以及(e)在该内部稳定聚醇层上进行该寡核苷酸合成。
在另一方面，该电极表面可以含有铂、钛或其组合。
在另一方面，该电极表面可以是半导体芯片的表面。
在另一方面，该半导体芯片可以是互补金属氧化物半导体(CMOS)芯片。
在另一方面，可以通过使用等离子体和/或化合物来进行(a)中的清洁。
在另一方面，该等离子体可以是仅氧气等离子体、仅氩气等离子体、氧气等离子体之后是氩气等离子体、或氩气等离子体之后是氧气等离子体。
在另一方面，用氧气等离子体的清洁可以进行约1分钟至约60分钟、约5分钟至约55分钟、约10分钟至约50分钟、约15分钟至约45分钟、约20分钟至约40分钟、约25分钟至约40分钟、约30分钟至约40分钟、约35分钟至约40分钟、约36分钟至约40分钟、约36分钟至约39分钟、约36分钟至约38分钟、或约36分钟至约37分钟，并且用氩气等离子体的清洁可以进行约1分钟至约60分钟、约2分钟至约55分钟、约3分钟至约50分钟、约4分钟至约45分钟、约5分钟至约40分钟、约6分钟至约30分钟、约7分钟至约20分钟、约8分钟至约15分钟、约9分钟至约15分钟、约10分钟至约15分钟、约1分钟至约10分钟；约2分钟至约10分钟、约3分钟至约10分钟、约4分钟至约10分钟、约5分钟至约10分钟、约6分钟至约10分钟、约7分钟至约10分钟、约8分钟至约10分钟、约9分钟至约10分钟、或约6分钟至约7分钟。
在另一方面，该化合物可以是食人鱼溶液、酸、碱、过氧化氢或其组合。
在另一方面，本披露的方法可以进一步包括在步骤(b)之前电化学清洁经等离子体清洁的电极表面。
在另一方面，电化学清洁可以在对甲苯磺酸的存在下进行。
在另一方面，重氮鎓盐的浓度可以是约1mM至约1M、约1mM至约900mM、约1mM至约800mM、约1mM至约700mM、约1mM至约600mM、约1mM至约500mM、约1mM至约400mM、约1mM至约300mM、约5mM至约300mM、约5mM至约250mM、约5mM至约200mM、约5mM至约150mM、约5mM至约100mM、约5mM至约50mM、约10mM至约300mM、约10mM至约250mM、约10mM至约200mM、约10mM至约150mM、约10mM至约100mM、约10mM至约50mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。
在另一方面，电接枝可以在存在或不存在电解质的情况下进行。
在另一方面，电解质可以是四丁基四氟硼酸铵(TBATFB)。
在另一方面，聚醇可以是聚苄醇、聚偶氮苯醇或其组合。
在另一方面，松散外部聚醇层的剥离或去除可以在乙二胺(EDA)和乙醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、氢氧化铵、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇或其组合的存在下进行。
在另一方面，EDA:乙醇的比率可以是1:1。
附图说明
图1显示了用于在电极上电接枝的示例性重氮鎓盐的结构和合成。
图2绘示了用于合成聚苄醇涂覆的铂电极的方法。通过电接枝或自发接枝机制将来自4-氨基苄醇的纯化的重氮鎓盐沉积在铂电极表面上。
图3显示了包含偶氮键和分支结构的多层膜的可能组成。在电化学DNA合成后，支链聚苄醇膜得到高产量的切割寡核苷酸。
图4显示了12,544电极芯片上15聚体微阵列的DNA合成结果。将显微镜载玻片大小的“芯片”与杂交帽组装，以在电极阵列上提供0.12mL的室。向室中填充100mM四丁基四氟硼酸铵电解质中的60mM AB-OH重氮鎓盐溶液。通过经由Pt电极施加负电压进行电接枝，并将周围Pt网格接地。在指定的时间和电压后，将芯片用ACN洗涤并且用于合成15-nt寡核苷酸。使芯片与5’-cy5标记的互补链杂交并且在微阵列扫描仪上成像。将荧光信号(MFU)与原位(水性)涂覆芯片表面的方法进行比较。
图5显示了具有松散层或稳定层的AB-OH Dz涂覆的电极以及它们在DNA合成应用中的效用。
图6显示了15聚体微阵列(94,928电极芯片)的DNA合成结果。在此实验中，在DNA合成之前用氢氧化铵去除膜的外部“松散”层，以产生稳定表面涂层，并改善合成DNA探针的固定性。
图7显示了根据本披露实施例的用于寡核苷酸合成的用芳基重氮鎓涂覆电极阵列的方法。
具体实施方式
在进一步描述本主题披露之前，应当理解，本披露不限于下面描述的本披露的特定实施例，因为这些特定实施例可以变化并且仍然落入所附权利要求书的范围内。还应理解的是，所采用的术语是出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制。相反，本披露的范围将由所附权利要求书来确立。
固体支持物
在一方面，用于寡核苷酸合成的支持物材料可以包括扁平(平面)电极。
扁平电极可以是包含多个单元和表面的密集电极阵列，其中该多个单元中的每个单元包括阳极和周向阴极(网格)，其中每个阳极是可单独寻址电极，并且其中薄反应层被吸附到表面。这种配置通过氧化1,4-二羟基苯在电极上产生酸来进行“脱三苯甲基化”(Maurer等人2006,e34)。通过经由外部电源施加负DC电压，可以使提供给电极的电流反转以充当阴极，用于还原重氮鎓盐。
可以使用标准CMOS技术来制造电极阵列装置。此装置利用环状有源电极和连续周向对电极的交替阵列。在CMOS工艺中，使用铝布线和电极制造半导体硅晶片，并且然后通过溅射另一种金属、金属合金或其他导电材料(诸如导电陶瓷)进行“后加工”。在一些实施例中，金属是贵金属。在某些实施例中，电极是铂、钛或氮化钛。
另一种形式是用排列成行和列的环状电极制成标准电极阵列装置，该电极阵列的每个“单元”被线分隔。单元包括电极和独立地以电子方式单独访问每个电极所需的相关电路系统。在某些实施例中，可以将分隔每个单元的线相对于电极阵列表面(其中电极具有表面暴露)凸起，并且作为阵列范围的对电极网格发挥作用，其中电极在每个电化学合成步骤中接通。
寡核苷酸合成可以在包含多个可单独寻址电极的支持物介质上进行。在某些实施例中，电极是铂、钛或氮化钛电极。
可以使用芳基重氮鎓盐涂覆电极。芳基重氮鎓盐由通式R-Ar-N2 +X-表示，其中R可以是任何有机基团，诸如烷基或芳基，并且X是无机或有机阴离子，诸如卤素、四氟硼酸根或甲苯磺酸根。术语“卤素”表示氯、氟、溴或碘。用于合成芳基重氮鎓四氟硼酸盐的方法是众所周知的。图1显示了使用乙醇作为溶剂、三氟化硼-四氢呋喃络合物和亚硝酸叔丁酯进行重氮化的可再现方法。
在一个实施例中，芳基重氮鎓盐是具有下式的官能化芳基重氮鎓盐：
Y-R-Ar-N2 +X-，
其中：
Y是官能团；
R是任何有机基团或不存在；并且
X是无机或有机阴离子。
在一些实施例中，Ar选自苯基、二甲苯基、萘基、甲苯基和吲哚基。在一些实施例中，Ar是苯基。
在一些实施例中，Y是-OH、-COOH或-NH2。在一些实施例中，Y是受保护的。例如，在一些实施例中，Y是受保护的-OH、受保护的-COOH或受保护的-NH2。
在一些实施例中，R选自烷基、烯基、芳基和杂芳基。在一些实施例中，R选自直链或支链C1-C16烷基、直链或支链C1-C12烷基、直链或支链C1-C8烷基。在一些实施例中，R选自甲基、乙基、异丙基、正丙基、叔丁基、异丁基、正丁基、正戊基、异戊基和1,1-二甲基丙基。
在一些实施例中，X是卤素、四氟硼酸根或甲苯磺酸根。
在一个实施例中，可以使用4-氨基苄醇(AB-OH)的重氮鎓盐和电化学还原(也称为电沉积或电接枝)将羟基涂层应用到电极表面(例如，铂电极表面)。
尽管已经报道了芳基重氮鎓电接枝到铂电极表面上(Bernard等人,2003,Chem.Mater.3450-3462)，但表面涂层没有合适的官能接头基团用于DNA合成或使用标准化学偶联方法附接生物分子。本发明诸位发明人在此表明可以用图1中显示的含有接头基团的芳基重氮鎓盐电接枝铂电极。
本发明诸位发明人已经表明，AB-OH的重氮鎓盐(AB-OH Dz)发生电还原反应，以在电极表面上得到苄醇涂层(参见图2)。表面上的苄醇基团与活化的亚磷酰胺反应以起始DNA合成。为了优化DNA合成性能，在添加第一个3’-核苷之前，表面可以任选地用长间隔物亚磷酰胺分子和可切割接头分子进一步修饰。具有苄醇涂覆的铂电极的CMOS芯片也适用于基于电阵列的测定(Ghindilis,2007,Biosensors and Bioelectronics,1853)。
本发明诸位发明人观察到芳基重氮鎓盐也可以通过“自发接枝”在铂电极上形成稳定苄醇膜。此工艺已被报道用于通过简单地将基底浸入芳基重氮鎓盐的水溶液或乙腈溶液中来涂覆金和镍表面(Mesnage,2012Langmuir 11767)。因此，用AB-OH重氮鎓盐形成初始金属键的两种可能过程和机理显示于图2中。在任一种情况下，最初的单层芳基进一步与另外的反应性自由基或重氮鎓单体基团反应以得到多层膜。
其他人已经表明，金属表面上的电接枝重氮鎓膜由多个“层”构成，这些层包含偶氮键和分支结构，该膜的厚度取决于官能团(Zhang等人2014Z.Phys.Chem.557)。据报道，一些重氮鎓盐的涂覆的厚度为6-7层(5nm)(Bernard等人,2003,Chem.Mater.3450-3462)。尽管在铂电极上的支链聚苄醇膜的结构还不清楚，但是在电化学DNA合成后，固体表面可得到高产量的寡核苷酸。
芳基重氮鎓盐可以在水性条件下(使用亚硝酸钠)或在无水溶剂中(使用亚硝酸叔丁酯)由起始苯胺化合物制备。苯胺的反应迅速，并且芳基重氮鎓盐通常无需纯化“原位”形成。通过此方法获得的APA-酸重氮鎓盐无需纯化即可成功地用于水性电接枝反应。
在合成芳基重氮鎓化合物的过程中形成了副产物，并且使用去除了副产物的纯化的化合物能够改善电接枝。尽管许多纯化的芳基重氮鎓盐是已知的(参见例如，Colleville等人(2014)Org Proc R&D,1128)，但本发明诸位发明人首次报道了纯化的4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)的合成。芳基重氮鎓四氟硼酸盐的纯化通过从反应混合物中沉淀或从乙醚中再沉淀来完成。尚未有报道过色谱方法或结晶方法，并且它们的反应性需要在低温下处理。纯化的APE-OH重氮鎓四氟硼酸盐的NMR数据先前已经有了报道(Gam-Derouich,2010,Surf.Int.Anal.1050)。本发明诸位发明人以良好产率(60％-85％)分离出呈棕色糖浆状的AB-OH和APE-OH重氮鎓盐。通过质子NMR观察到芳族杂质(10％-20％)，但这些化合物在0℃-5℃下储存数月仍能保持稳定。同样，纯化的AB-酸重氮鎓四氟硼酸盐先前已在文献中报道(Doyle和Bryker 1978J.Org.Chem.1572)并且使用本文所述方法容易分离为纯白色固体。当用于电化学DNA合成时，纯化的AB-OH和APE-OH重氮鎓盐具有在电极上提供羟基涂层而无需进一步官能化的优点。稳定的四氟硼酸盐易于储存，以便于制造芯片，并且在涂覆电极时提供附加的控制。
寡核苷酸合成
寡核苷酸的标准合成方法在本领域中是已知的(例如，美国专利号5,750,666、6,111,086、6,008,400和5,889,136)，其中每一个专利都通过引用以其全文并入本文。
支持物结合的寡核苷酸合成依赖于将核苷酸依序添加至生长链的一端。典型地，使第一核苷(在存在的任何环外胺官能团上具有保护基团)附接至固体支持物介质，并且逐步添加活化的亚磷酸酯化合物(其也带有适当的保护基团)以使生长的寡核苷酸延长。
用于固相合成的其他方法可以在Caruthers的美国专利4,415,732；4,458,066；4,500,707；4,668,777；4,973,679；和5,132,418；以及Koster的美国专利4,725,677中找到，将每个专利的内容通过引用以其全文并入本文。
通过向所选电极施加足够的电势，在所选电极处产生能够以电化学方式从分子上的化学官能团中去除保护基团的电化学试剂。当由电极产生的化学试剂起作用以从所选分子中脱保护或去除例如酸或碱不稳定的保护基团时，在所选分子处发生根据本发明的保护基团的去除或“脱保护”。
在本发明的一个实施例中，根据本发明提供了单体核苷酸的末端或接头分子(即，将例如单体或核苷酸与基底“连接”的分子)，其由可通过电化学产生的试剂去除的保护基团保护。使一个或多个保护基团暴露于在电极处电化学产生的试剂，并且从第一选择区域中的单体、核苷酸或接头分子中将其去除以暴露反应性官能团。然后使基底与第一单体或预形成的分子接触，该第一单体或预形成的分子与暴露的一个或多个官能团键合。此第一单体或预形成的分子还可以带有可通过电化学产生的试剂去除的至少一个受保护的化学官能团。
如本文所用，术语“保护基团”(或“封闭基团”)是指本领域已知的不稳定化学部分，其用于在合成程序期间保护羟基、氨基或硫醇基团免于不希望的反应。如本领域已知的保护基团总体描述于T.H.Greene和P.G.M.Wuts,1999,Protective Groups in OrganicSynthesis,第3版,John Wiley&Sons,New York。羟基保护基团的实例包括但不限于苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、甲氧基羰基、叔丁氧基羰基(BOC)、异丙氧基羰基、二苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、2-糠基氧基羰基、烯丙基氧基羰基(Alloc)、乙酰基(Ac)、甲酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基(Bz)、甲基、叔丁基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基(Bn)、对甲氧基苄基二苯基甲基、三苯基甲基(三苯甲基)、4,4'-二甲氧基三苯基甲基(DMT)、取代或未取代的9-(9-苯基)呫吨基(pixyl)、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲硫基甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、和三异丙基甲硅烷基。在一些实施例中，保护基团是DMT。
在一些实施例中，羟基保护基团是甲硅烷基保护基团。甲硅烷基保护基团的实例包括但不限于2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、异丙基二甲基甲硅烷基(IPDMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、四异丙基二亚硅氧烷基(TIPDS)、二叔丁基亚甲硅烷基(DTBS)、和叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)。
然后可以以相同的方式将单体或预形成的分子脱保护以产生第二组反应性化学官能团。随后使第二单体或预形成的分子与基底接触以与第二组暴露的官能团键合，该第二单体或预形成的分子也可以带有至少一个可通过电化学产生的试剂去除的保护基团。可以在合成过程期间的任何时间点将任何未反应的官能团任选地封端。脱保护和键合步骤可以在基底上于该位点处依次重复，直到获得所需的序列和长度的聚合物或寡核苷酸。
键合有至少一个受保护的化学官能团的一个或多个分子的基底可以靠近电极阵列，该阵列与缓冲或清除溶液接触。在向阵列中的所选电极施加足以产生能够对受保护的化学官能团进行脱保护的电化学试剂的电势之后，对靠近所选电极的分子进行脱保护以暴露反应性官能团，从而使它们准备好用于键合。然后使单体溶液或预形成的分子(诸如蛋白质、核酸、多糖和卟啉)的溶液与基底表面接触，并且这些单体或预形成的分子与脱保护的化学官能团键合。
本文所述的方法可以进一步包括使所述单体-官能化支持物介质与封端剂反应；以及任选地用氧化剂处理所述单体-官能化支持物介质。
寡核苷酸合成后，可以从固体支持物介质上释放寡核苷酸或将寡核苷酸固定到固体支持物介质上。这些方法可以包括如下步骤：用有效从支持物介质、优选地从附接至支持物介质的接头切割寡核苷酸的试剂处理寡核苷酸。在一些这样的实施例中，用有效切割寡核苷酸的试剂处理寡核苷酸去除存在于寡核苷酸上的保护基团。在一些实施例中，切割的寡核苷酸在切割位点处具有3’未修饰的末端羟基。在多个实施例中，将固体支持物介质用无水氨处理，持续一段足以切割寡核苷酸的时间。
然后可以通过本领域已知的程序(例如，通过尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法(例如，反相HPLC)、示差沉淀等)制备切割的寡核苷酸。在根据本发明的一些实施例中，将寡核苷酸从固体支持物介质上切割，而5’-OH保护基团仍然在最终核苷上。然后对这种所谓的DMT化(或三苯甲基化(trityl-on))寡核苷酸进行色谱层析，之后通过在有机酸中处理去除DMT基团，之后对寡核苷酸进行脱盐并且进一步纯化以形成最终产物。
寡核苷酸的用途
本文提供的方法和组合物可用于基因组编辑文库(诸如CRISPR gRNA筛选文库和shRNA筛选文库)、靶向测序(诸如杂交捕获或MIP)、诱变文库、用于原位杂交应用的寡聚体的产生、以及用于DNA数据存储的寡聚体池的产生。
电流加源(currentsourcing)
本文所用的术语“电流加源”是指通过调节提供的电压来维持恒定电流，以达到希望的电流，以及将恒定电流施加到电解池。
电压加源(voltagesourcing)
本文所用的术语“电压加源”是指在电解池中设置与输出电流无关的恒定电压，以及向电化学电池施加恒定电压。
电解池
本文所用的术语“电解池”是指电化学电池，这些电化学电池可能需要外部电能源(施加在两个电极之间的电压)来驱动原本不会发生的化学反应。电化学电池可以是能够通过化学反应产生电能或使用电能引起化学反应的装置。例如，使用电能通过电解产生化学反应的电化学电池被称为电解池。
聚醇多层膜
本文所用的术语“聚醇多层膜”是指在电接枝(和自发接枝)过程中可能发生的副反应。在通过与固体支持物接触(自发)或给固体支持物通电而电接枝官能化芳基重氮鎓盐后，重氮鎓单体的自由基可以与表面反应形成单层涂层。此初始单层涂层可以进一步与重氮鎓另外的自由基反应以形成可以含有聚醇(例如，聚苄醇)的多层。此外，多层膜的可能组成可以包含偶氮键和分支结构。
松散外部聚醇层
本文所用的术语“松散外部聚醇层”是指聚醇多层膜的一层，该层对于寡核苷酸合成过程可能不稳定并且可以用化学处理去除。
实例
实例1
芳基重氮鎓四氟硼酸盐的合成。使用文献方法的变型制备这些盐。用旋转蒸发器去除溶剂，并且在高真空泵(<1mm Hg)上进一步干燥几小时。在500MHz Bruker仪器上获得质子NMR谱。
通过将起始苯胺溶解在乙醇中并且添加1.5当量的三氟化硼-THF络合物来制备图1所示的AB-酸、APE-OH和AB-OH的重氮鎓盐。将溶液冷却并且添加1.2当量亚硝酸叔丁酯(参见例如，Colleville等人(2014)Org Proc R&D,1128)。温热至室温后，直接收集盐(AB-酸)或以深棕色油状物收集盐(APE-OH和AB-OH)，并且从乙醚中进一步沉淀。AB-酸重氮鎓四氟硼酸盐以45％的产率分离为白色固体，并且质子NMR与文献值一致(Doyle等人(1979)J.Org.Chem.,1572)，但增加的场强显示芳族质子为双三重峰，而不是报道的双重峰。APE-OH和AB-OH分离为深橙色糖浆，其既可溶于乙腈也可溶于水。当溶解在CD3CN中时，芳基重氮鎓盐的质子NMR谱显示优异的纯度，但缓慢分解为另一种化合物(可能是联苯衍生物，室温下1周后约50％)。在d6-DMSO中分解更快。
4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(APE-OH Dz)。向0.5g(3.64mmol)2-(4-氨基苯基)乙醇在8.6mL乙醇中的搅拌溶液中添加0.6mL BF3·THF络合物(5.46mmol)。将溶液在氩气下在冰浴中冷却，并且添加0.58mL(4.9mmol)亚硝酸叔丁酯。将溶液温热至室温并且搅拌1小时。沉淀出稠密棕色油状物，将其用移液管收集。添加20mL乙醚，并沉淀出更多油状物。通过用20mL乙醚振摇洗涤合并的油状物，并在真空下干燥剩余的橙色糖浆，得到0.46g(53％产率)APE-OH重氮鎓盐。1H NMR(d6-DMSO):δ,ppm 8.58,d,2H,J＝8.7Hz；7.84,d,2H,J＝8.7Hz；4.38,br s,1H；3.72,t,2H,J＝6Hz；2.98,t,2H,J＝6Hz。
4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH Dz)。向0.45g(3.64mmol)(4-氨基苯基)甲醇在9mL乙醇中的搅拌溶液中添加0.6mL BF3·THF络合物(5.46mmol)。将溶液在氩气下在冰浴中冷却，并且添加0.58mL(4.9mmol)亚硝酸叔丁酯。30min后，将溶液温热至室温并搅拌1小时。TLC(10％甲醇/乙酸乙酯)显示没有残留的苯胺(Rf＝0.63，用对甲氧基苯甲醛染色为黄色)，在基线处有棕色斑点。用移液管收集稠密棕色油状物沉淀物。添加10mL乙醚，并沉淀出更多油状物。通过用2x 10mL乙醚振摇洗涤合并的油状物，并将剩余的橙色糖浆溶解在乙腈中并旋转蒸发至干，得到0.69g(85％产率)AB-OH重氮鎓盐。1H NMR(CD3CN):δ,ppm8.46,d,2H,J＝9Hz；7.91,d,2H,J＝9Hz；4.88,s,2H。
4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-酸Dz)。向0.5g(3.64mmol)4-氨基苯甲酸在9mL乙醇中的冰冷溶液中添加0.6mL BF3·THF络合物(5.46mmol)，并添加0.58mL亚硝酸叔丁酯，并于30min后将溶液温热至室温并搅拌1小时。通过过滤收集白色沉淀物，用3x 3mL乙醇洗涤，并且在真空下干燥，得到0.39g(45％产率)AB-酸重氮鎓盐。1H NMR(CD3CN):δ,ppm8.62,双三重峰,2H,J＝9Hz,2Hz；8.46,双三重峰,2H,J＝9Hz,2Hz。
实例2
苄醇涂覆的芯片(12k阵列)的合成。具有12,544个铂电极的阵列的CMOS芯片获自CustomArray。将芯片用氧气等离子体清洁(36分钟)并且在使用前储存在干燥器中。如图2所显示，将13.3mg(60微摩尔)AB-OH Dz的溶液溶解在1mL电解质(0.1M四丁基四氟硼酸铵于无水乙腈中)中。将经等离子体清洁的芯片插入ElectraSenseTMReader的杂交室中(参见Ghindilis等人,Biosensors and Bioelectronics 22(2007)1853-1860)。用(橙色)AB-OHDz溶液填充室(0.12mL)，并且在-2.5伏下给电极通电10分钟。用移液器去除(更深橙色)重氮鎓盐溶液，并且将芯片用5x 1mL乙腈洗涤。在DNA合成之前，将干燥芯片储存在干燥器中。
将显微镜载玻片大小的“芯片”与杂交帽组装，以在电极阵列上提供0.12mL的室。向室中填充入60mM AB-OH重氮鎓盐在100mM四丁基四氟硼酸铵电解质中的溶液。通过经由Pt电极施加负电压进行电接枝，其中周围Pt网格接地。在指定的时间和电压后，将芯片用ACN洗涤并且用于合成15-nt寡核苷酸。使芯片与5’-cy5标记的互补链杂交并且在微阵列扫描仪上成像。将荧光信号(MFU)与原位(水性)涂覆芯片表面的方法进行比较。固定化DNA合成的结果显示在图4中。
实例3
苄醇涂覆的芯片(电接枝，90k阵列)的合成。具有94,928个铂电极的阵列的CMOS芯片获自CustomArray。使用ElectraSense Reader的90k原型重复上述的12k阵列涂覆过程。最初，DNA合成产率非常低。通过用在乙腈中的0.1M对甲苯磺酸电化学清洁芯片(10namp/电极，1min)并且用5x 1mL乙腈冲洗，提高了合成产量。用60mM AB-OH Dz进行电接枝，使用-1.5伏持续20分钟。去除重氮鎓盐溶液，并且将芯片用5x 1mL乙腈洗涤。在DNA合成之前，将干燥芯片储存在干燥器中。经乙腈洗涤的90k芯片的DNA合成结果显示出大量530nm自发荧光，这是与成功的电化学DNA合成相关的现象(未发表的结果)。表1显示的是通过qPCR进一步测量释放的120聚体寡聚体的DNA产量。
表1.
表1中的数据显示，AB-OH Dz涂覆的电极(94,928电极芯片)得到的120聚体寡核苷酸池的DNA合成产量良好。使用260nm吸光度(Nanodrop)或qPCR测定，将产量与先前描述的蔗糖涂覆的电极进行比较。
实例4
“剥离的”苄醇AB-OH涂覆的芯片(90k阵列)的合成。在用EDA/乙醇进行DNA脱保护过程中，合成的DNA链从AB-OH涂覆的DNA芯片上切割下来。这大概是由于DNA的合成是在涂覆电极表面上的羟基涂覆的结构的“松散”层进行的。为了提高固定的DNA的量，通过在0.8mL剥离室(O形密封圈)中将上述AB-OH涂覆的90k芯片用浓氢氧化铵(过夜，65℃)处理来剥离膜的“松散”层。用乙腈进一步洗涤得到“剥离的”AB-OH涂覆的电极，准备用于电化学DNA合成。荧光微阵列分析显示经NH4OH剥离的芯片信号增强10倍，如图6所示。
实例5
用于苄醇涂覆的芯片(90k阵列)的自发接枝方法。在90原型ElectraSense Reader中重复实例3中描述的过程。将芯片组装在0.16mL室中并含0.1M对甲苯磺酸的乙腈(10namp/电极，1min)电化学清洁并且用5x 1mL乙腈冲洗。加入重氮鎓盐溶液(60微摩尔AB-OH Dz溶于1mL含0.1M四丁基四氟硼酸铵的无水乙腈中)，并且将芯片保持在室温下且不给电极通电。用5x 1mL乙腈洗涤后，将干燥芯片像往常一样用浓氨剥离(65℃，过夜)。自发接枝的芯片显示出与电接枝芯片相似的性能，在用EDA/乙醇脱保护之前具有大量530nm自发荧光。使用荧光微阵列分析，所得阵列的信号比电接枝阵列低25％。
实例6
15聚体微阵列的电化学DNA合成。在此实例中，使用CombiMatrixCustomArrayTM12k或90k微阵列DNA合成仪用于从聚苄醇涂覆的芯片组装15聚体寡核苷酸。将每个芯片组装到薄的(0.16mL)流通室中，该室允许泵入和泵出DNA合成试剂，同时通过计算机控制对每个电极进行电子寻址。电化学合成使用亚磷酰胺化学，并在每个偶联步骤中进行二甲氧基三苯基保护基团的电化学去封闭。电化学去封闭涉及开启电极以在电极处产生酸性条件，这些酸性条件足以仅在活性电极处去除保护基团。用于电化学去封闭和自然扩散的溶液中的缓冲剂阻止了在未活化电极处的去封闭(Maurer等人2006PLoS One e34)。二甲氧基三苯甲基保护基团的去除允许添加下一个亚磷酰胺。在设计的15聚体DNA序列的合成之前，将10-dT间隔物直接添加到每个AB-OH涂覆的电极上。dT10间隔物在12k形式和90k形式的微阵列分析中荧光信号都得到了改善。然后，根据需要选择性地将电极脱三苯甲基化，以与下一个添加的核苷亚磷酰胺反应。DNA合成完成后，在0.8mL剥离室(O形密封圈)中用1:1/乙二胺:乙醇(4h，65℃)将芯片脱保护。在冰中冷却后，将芯片取出，用乙腈洗涤，并且干燥储存用于荧光微阵列分析。
实例7
荧光微阵列分析。用固定在每个电极上的相同15聚体DNA序列设计合成微阵列。在5’-末端用cy5荧光染料获得反向互补序列。在电极上的0.12mL杂交室中制备含有cy5寡核苷酸的杂交溶液。在37℃下至少1小时后，去除杂交溶液，并且将芯片用缓冲液洗涤几次。将升降滑片(lifter slip)插到湿电极上，并且将组件插到Molecular Devices GenePix4000或4400荧光扫描仪中。通过在成像过程中调节增益和焦距，每个芯片针对最高信号进行优化。用定制软件处理荧光电极的图像，以测量阵列中每个电极处的荧光信号。图像显示了电极上均匀的斑点分布和均匀的荧光密度。测量平均荧光，并且在图4(12k电极形式)和图6(90k电极形式)中以标准偏差显示。两种阵列的AB-OH涂覆的电极显示出的平均荧光单位约为25,000计数。
实例8
120聚体池的电化学DNA合成。在此实例中，使用CombiMatrix CustomArrayTM90k形式微阵列DNA合成仪从聚苄醇涂覆的芯片组装120聚体寡核苷酸池。将90k芯片插到0.16mL流通合成室中，并且在使用前立即用无水乙腈洗涤。本研究中，将碱基可切割接头亚磷酰胺手动添加到AB-OH Dz涂覆的电极表面。将化学磷酸化试剂(CPR,Glen Research,SterlingVA)溶解于乙腈中以得到0.1M溶液，用等体积的4,5-二氰基咪唑(0.25M DCI于乙腈中)活化，然后立即注射到聚苄醇涂覆的电极上。5min后，去除过量CPR，并且将膜表面上未反应的苄醇基团封端为乙酸酯。在氧化的CPR的电化学脱三苯甲基化之后，如上所述组装每个120聚体序列的剩余核苷酸亚磷酰胺。最后，从所有序列中去除5-末端DMT，并且将芯片在浓氨中脱保护(65℃，过夜)。CPR水解，以从具有3’-磷酸修饰的涂覆电极上释放120聚体寡核苷酸。将氨溶液在SpeedVac(60℃，2h，35mm Hg)上干燥。通过凝胶过滤柱纯化每个池，最终浓度为0.1mM。表1所示为通过qPCR分析确定全长产物的产量。
实例9
汇集的120聚体(90k)的qPCR分析。寡核苷酸的合成池具有可变序列，但制备120聚体对照序列(每个芯片50个电极)作为内部对照。这些序列设计有PCR引物结合位点，以便通过定量PCR进行检测，如表1所示。
实例10
表2.用芳基重氮鎓涂覆电极阵列的示例性方法
表2总结了用芳基重氮鎓涂覆电极阵列以用于寡核苷酸合成的方法。
图7显示了用芳基重氮鎓涂覆电极阵列以用于寡核苷酸合成的方法(70)。寡核苷酸合成芯片(诸如CMOS芯片)的表面可以通过等离子体清洁(71)(例如，36分钟的氧气等离子体，然后是6分钟的氩气等离子体)来清洁。任选地，在即将进行重氮鎓涂覆之前，可以进一步用电化学清洁(72)经等离子体清洁的表面，例如通过在水性体系中的H2SO4溶液中和在有机溶剂(例如，ACN)中的对甲苯磺酸中通过电流加源+10nA持续10秒，然后-10nA持续10秒来脉冲电极，总共6个循环，以确保表面无污染物。在等离子体清洁之后或在等离子体清洁和电化学清洁之后，立即通过在经电化学清洁的表面上电接枝重氮鎓盐(73)(例如，-2.0V持续2分钟以驱动电接枝)来进行重氮鎓涂覆。电接枝后，例如使用DMSO或甲醇从重氮鎓涂覆的表面剥离松散外部聚醇(例如，聚苄醇和/或聚偶氮苯醇)层(74)。在剥离后的重氮鎓涂覆的电极表面上进行寡核苷酸合成(75)。

Claims (64)

1.一种纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐。
2.如权利要求1所述的纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐，其中所述纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐选自由以下项组成的组：纯化的4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)、纯化的4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(APE-OH重氮鎓盐)和纯化的4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-酸重氮鎓盐)。
3.一种用于制备纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐的方法，所述方法包括：
a)将起始苯胺溶解在乙醇中并且添加三氟化硼-THF络合物；
b)将所得溶液冷却并且添加亚硝酸叔丁酯；
c)将所得溶液温热至室温；以及
d)直接或以油状物的形式收集沉淀的盐。
4.如权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括：
e)将沉淀的盐用乙醚洗涤。
5.一种通过如权利要求3或4所述的方法获得的纯化的芳基重氮鎓四氟硼酸盐。
6.一种用于合成寡核苷酸的固体支持物系统，其中所述支持物是涂覆有包含官能团的薄膜的电极，其中所述电极是铂电极、钛电极或氮化钛电极。
7.如权利要求6所述的固体支持物系统，其中所述官能团选自由以下项组成的组：羧酸、醇和氨基。
8.如权利要求6或7所述的固体支持物系统，其中所述官能团是受保护的。
9.如权利要求6所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包含聚醇，优选聚苄醇。
10.如权利要求6至9中任一项所述的固体支持物系统，其中所述薄膜通过电接枝或自发接枝具有下式的官能化芳基重氮鎓盐来形成：
Y-R-Ar-N2 +X-，
其中：
Y是官能团；
R是任何有机基团；并且
X是无机或有机阴离子。
11.如权利要求10所述的固体支持物，其中：
Ar选自苯基、二甲苯基、萘基、甲苯基和吲哚基。
12.如权利要求10或11所述的固体支持物，其中：
Y是任选受保护的-OH、-COOH或-NH2。
13.如权利要求10至12中任一项所述的固体支持物，其中：
R选自烷基、烯基、芳基和杂芳基。
14.如权利要求10至13中任一项所述的固体支持物系统，其中：
X是卤素、四氟硼酸根或甲苯磺酸根。
15.如权利要求10至14中任一项所述的固体支持物系统，其中所述官能化芳基重氮鎓盐选自由以下项组成的组：4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)、4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(APE-OH重氮鎓盐)和4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-酸重氮鎓盐)。
16.如权利要求6至15中任一项所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括至少两层。
17.如权利要求16所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括松散外部聚醇层和稳定内部羟基层。
18.如权利要求17所述的固体支持物系统，其中所述松散外部聚醇层能够用浓氢氧化铵去除
19.如权利要求17或18所述的固体支持物系统，其中所述聚醇是聚苄醇。
20.如权利要求6至19中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物进一步用长间隔物亚磷酰胺分子和/或可切割接头修饰。
21.如权利要求6至20中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物是电极阵列装置，任选地是使用标准CMOS技术制造的。
22.一种用于合成寡核苷酸的固体支持物系统，其中所述支持物是涂覆有包含聚苄醇的薄膜的电极。
23.如权利要求22所述的固体支持物系统，其中所述薄膜通过电接枝或自发接枝具有下式的官能化芳基重氮鎓盐来形成：
Y-R-Ar-N2 +X-，
其中：
Y是任选受保护的-OH；
R是任何有机基团；并且
X是无机或有机阴离子。
24.如权利要求23所述的固体支持物，其中：
Ar选自苯基、二甲苯基、萘基、甲苯基和吲哚基。
25.如权利要求23或24所述的固体支持物，其中：
R选自烷基、烯基、芳基和杂芳基。
26.如权利要求23至25中任一项所述的固体支持物系统，其中：
X是卤素、四氟硼酸根或甲苯磺酸根。
27.如权利要求23至26中任一项所述的固体支持物系统，其中所述官能化芳基重氮鎓盐是4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)。
28.如权利要求22至27中任一项所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括至少两层。
29.如权利要求28所述的固体支持物系统，其中所述薄膜包括松散外部聚苄醇层和稳定内部羟基层。
30.如权利要求29所述的固体支持物系统，其中所述松散外部聚苄醇层能够用浓氢氧化铵去除。
31.如权利要求22至30中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物进一步用长间隔物亚磷酰胺分子和/或可切割接头修饰。
32.如权利要求22至31中任一项所述的固体支持物系统，其中所述固体支持物是电极阵列装置，任选地是使用标准CMOS技术制造的。
33.如权利要求22至32中任一项所述的固体支持物系统，其中所述电极是铂电极、钛电极或氮化钛电极。
34.一种用包含官能团的薄膜涂覆用于合成寡核苷酸的固体支持物系统的方法，所述方法包括将所述固体支持物用包含芳基重氮鎓盐和任选的电解质的溶液处理，以及任选地给所述固体支持物通电，从而产生涂覆的固体支持物。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述涂覆的固体支持物进一步与重氮鎓单体基团另外的反应性自由基反应以得到多层膜。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述多层膜包括松散外部聚醇层和稳定内部羟基层。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述聚醇是聚苄醇。
38.如权利要求34至37中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将涂覆的固体支持物用乙腈洗涤。
39.如权利要求34至38中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将涂覆的固体支持物用浓氢氧化铵处理。
40.如权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述支持物是电极，任选地是铂、钛或氮化钛电极。
41.如权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述芳基重氮鎓盐选自由以下项组成的组：4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)、4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(APE-OH重氮鎓盐)和4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-酸重氮鎓盐)。
42.如权利要求34至41中任一项所述的方法，其中所述芳基重氮鎓盐是纯化的。
43.一种制备用于寡核苷酸合成的电极表面的方法，所述方法包括
(a)将所述电极表面清洁，
(b)将重氮鎓盐引入经清洁的电极表面，
(c)电接枝所述重氮鎓盐以便在经清洁的电极表面上形成聚醇多层膜，
其中所述多层膜包括松散外部聚醇层和稳定内部聚醇层，
(d)将所述松散外部聚醇层剥离，以及
(e)在所述内部稳定聚醇层上进行所述寡核苷酸合成。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述电极表面包括铂、钛或其组合。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述电极表面是半导体芯片的表面。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述半导体芯片是互补金属氧化物半导体(CMOS)芯片。
47.如权利要求43-46中任一项所述的方法，其中通过使用等离子体和/或化合物来进行(a)中的清洁。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述等离子体是仅氧气等离子体、仅氩气等离子体、氧气等离子体之后是氩气等离子体、或氩气等离子体之后是氧气等离子体。
49.如权利要求48所述的方法，其中用所述氧气等离子体的清洁进行约1分钟至约60分钟、约5分钟至约55分钟、约10分钟至约50分钟、约15分钟至约45分钟、约20分钟至约40分钟、约25分钟至约40分钟、约30分钟至约40分钟、约35分钟至约40分钟、约36分钟至约40分钟、约36分钟至约39分钟、约36分钟至约38分钟、或约36分钟至约37分钟，并且用所述氩气等离子体的清洁进行约1分钟至约60分钟、约2分钟至约55分钟、约3分钟至约50分钟、约4分钟至约45分钟、约5分钟至约40分钟、约6分钟至约30分钟、约7分钟至约20分钟、约8分钟至约15分钟、约9分钟至约15分钟、约10分钟至约15分钟、约1分钟至约10分钟；约2分钟至约10分钟、约3分钟至约10分钟、约4分钟至约10分钟、约5分钟至约10分钟、约6分钟至约10分钟、约7分钟至约10分钟、约8分钟至约10分钟、约9分钟至约10分钟、或约6分钟至约7分钟。
50.如权利要求47-49中任一项所述的方法，其中所述化合物是食人鱼溶液、酸、碱、过氧化氢或其组合。
51.如权利要求43所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(b)之前电化学清洁经等离子体清洁的电极表面。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述电化学清洁在对甲苯磺酸的存在下进行。
53.如权利要求43-52中任一项所述的方法，其中所述重氮鎓盐包括下式：
Y-R-Ar-N2 +X-，
其中：
Y是官能团；
R是任何有机基团；并且
X是无机或有机阴离子。
54.如权利要求53所述的方法，其中：
Ar选自苯基、二甲苯基、萘基、甲苯基和吲哚基。
55.如权利要求53或54所述的方法，其中：
Y是任选受保护的-OH、-COOH或-NH2。
56.如权利要求53-55中任一项所述的方法，其中：
R选自烷基、烯基、芳基和杂芳基。
57.如权利要求53-56中任一项所述的方法，其中：
X是卤素、四氟硼酸根或甲苯磺酸根。
58.如权利要求53-57中任一项所述的方法，其中所述重氮鎓盐选自由以下项组成的组：4-(羟甲基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-OH重氮鎓盐)、4-(2-羟乙基)苯重氮鎓四氟硼酸盐(APE-OH重氮鎓盐)和4-羧基苯重氮鎓四氟硼酸盐(AB-酸重氮鎓盐)。
59.如权利要求43-58中任一项所述的方法，其中所述重氮鎓盐的浓度是约1mM至约1M、约1mM至约900mM、约1mM至约800mM、约1mM至约700mM、约1mM至约600mM、约1mM至约500mM、约1mM至约400mM、约1mM至约300mM、约5mM至约300mM、约5mM至约250mM、约5mM至约200mM、约5mM至约150mM、约5mM至约100mM、约5mM至约50mM、约10mM至约300mM、约10mM至约250mM、约10mM至约200mM、约10mM至约150mM、约10mM至约100mM、约10mM至约50mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。
60.如权利要求43-59中任一项所述的方法，其中所述电接枝在存在或不存在电解质的情况下进行。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述电解质是四丁基四氟硼酸铵(TBATFB)。
62.如权利要求43-61中任一项所述的方法，其中所述聚醇是聚苄醇、聚偶氮苯醇或其组合。
63.如权利要求43-62中任一项所述的方法，其中所述松散外部聚醇层的剥离在乙二胺(EDA)和乙醇、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、氢氧化铵、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇或其组合的存在下进行。
64.如权利要求63所述的方法，其中EDA:乙醇的比率是1:1。
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