KR20040063655A

KR20040063655A - 광분해성 연결기가 도입된 생체 분자 분리용 고분자지지체 및 이를 이용한 생체분자의 검출 및 분석방법

Info

Publication number: KR20040063655A
Application number: KR1020030001149A
Authority: KR
Inventors: 이윤식; 김병기; 김용권; 정우재; 김민수; 조수형
Original assignee: 주식회사 비드테크
Priority date: 2003-01-08
Filing date: 2003-01-08
Publication date: 2004-07-14

Abstract

본 발명은 광분해성 연결기(linker)가 도입된 생체 분자 분리용 고분자 지지체 및 이를 이용한 생체분자의 검출 및 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 표면에 생체분자 친화성 물질이 도입된 생체 분자 분리용 고분자 지지체에 있어서, 지지체의 표면과 생체분자 친화성 물질 사이에 광분해성 연결기가 도입된 생체 분자 분리용 고분자 지지체에 대한 것이다.

Description

광분해성 연결기가 도입된 생체 분자 분리용 고분자 지지체 및 이를 이용한 생체분자의 검출 및 분석방법{Polymer Support Which Contains Photo-cleavable Linker and Separation Process for Biological Material Using the Same}

오늘날 바이오센서(biosensor), DNA 칩 어레이(DNA chip array), 단백질 칩 어레이, 바이오일렉트로닉 디바이스(bioelectronic device) 등의 초소형 생물학적 분석 기술 이른바, 바이오칩(biochip) 기술의 발전에 따라, 생물 시료의 전처리 과정, 시료의 분리, 정제 및 분석 등 일련의 과정이 하나의 집적화된 마이크로 칩에서 수행되는 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip, 이하 LOC라 약칭한다) 또는 마이크로-티에이에스 (micro-TAS (Total Analysis System))에 대하여 수많은 연구가 이루어지고 있다.

화학적 또는 생화학적 분석 시스템의 소형화를 그 특징으로 하는 LOC 기술은조작이 간편하고 극소량의 시료로도 분석이 가능하기 때문에 경제적이며, 또한 분석 속도가 매우 빨라서 기존의 마크로 분석 시스템에 비하여 여러 가지 장점이 있다.

이러한 LOC 기술의 발달은 생체분자 분석을 위한 미세 유로 구조물 분야에서 특히 중요한 위치를 차지하는데, 최근 들어서는 비드의 표면 개질을 통하여 다양하게 응용될 수 있고 일반 칩 표면에 비하여 표면적이 넓어서 생화학적 반응에 유리한 마이크로 또는 나노 크기의 비드를 이용한 미세 유로 구조물들이 다수 개발되고 있다.

마이크로 비드는 비드의 표면을 어떠한 성질의 물질로 변화시키는가 또는 특정 생체분자와 특이적으로 결합하기 위하여 어떠한 리간드를 고정시키는가에 따라서 여러 가지 용도로의 응용이 가능하다.

예를 들면, 비드를 미세 구조물에 고정시켜 시료의 농축에 사용하기도 하고(R. D. Oleschuk; L. L. Shultz-Lockyear; Y. Ning; D. J. Harrison, Anal. Chem., 72, 585 (2000): H. Tian; A. F. R. Huhmer; J. P. Landers, Anal. Biochem., 283, 175 (2000)), 면역반응 어세이(K. Sato; M. Yamanaka; T. Odake; H. Kimura; T. Ooi; M. Nakao; T. Kitamori, Anal. Chem., 72, 1144 (2000): K. Sato; M. Tokeshi; H. Kimura; T. Kitamori, Anal. Chem., 73, 1213 (2001): K. Sato; M. Yamanaka; H. Takahashi; M. Tokeshi; H. Kimura; T. Kitamori, 23, 734 (2002)), DNA 분석(H. Andersson; W. van der Wijngaart; G. Steme, Electrophoresis, 22, 249 (2001)) 등에 사용하여 프로테오믹스 분야 또는 질병 진단 등의 분야에 활용할 수도 있다.

상기한 바와 같은 활용을 위하여, 마이크로 비드를 미세 유로 구조물에 고정하여야 하는데, 이를 위하여 댐(weir) 형태의 미세 구조물을 이용하는 방법(K. Sato; M. Yamanaka; T. Odake; H. Kimura; T. Ooi; M. Nakao; T. Kitamori, Anal. Chem., 72, 1144 (2000): K. Sato; M. Tokeshi; H. Kimura; T. Kitamori, Anal. Chem., 73, 1213 (2001): K. Sato; M. Yamanaka; H. Takahashi; M. Tokeshi; H. Kimura; T. Kitamori, Electrophoresis, 23, 734 (2002)), 미세 필터 챔버를 이용하는 방법(H. Andersson; W. van der Wijngaart; G. Steme, Electrophoresis,22, 249 (2001): H. Andersson; W. van der Wijngaart; P. Enoksson; G. Stemme, Sensor. Actuat. B-Chem.,67, 203 (2000): J. Bergkvist; S. Ekstrom; L. Wallman; M. Lofgren; G. Marko-Varga; J. Nilsson; T. Laurell, Proteomics,2, 422 (2002)), 자성 비드를 이용하는 방법(J. W. Choi; T. M. Liakopoulos; C. H. Ahn, Biosens. Bioelectron.,16, 409 (2001): J. W. Choi; K. W. Oh; J. H. Thomas; W. R. Heineman; H. B. Halsall; J. H. Nevin; A. J. Helmicki; H. T. Henderson; C. H. Ahn, Lab Chip,2, 27 (2002)), 반응성 비드를 미세 유로 내에 직접 고정화하는 방법(H. Andersson, W. van der Wijngaart, and G. Steme, Electrophoresis,22, 3876 (2001)) 등의 다양한 방법들이 보고되어 있다.

이러한 마이크로 비드를 이용한 생체 분자의 분석방법은 검출하고자 하는 생체분자 또는 이에 표지된 물질에 따라, 열 렌즈 현미경(thermal lens microscope (TLM))을를 사용하는 방법(K. Sato; M. Yamanaka; T. Odake; H. Kimura; T. Ooi;M. Nakao; T. Kitamori, Anal. Chem., 72, 1144 (2000): K. Sato; M. Tokeshi; H. Kimura; T. Kitamori, Anal. Chem., 73, 1213 (2001): K. Sato; M. Yamanaka; H. Takahashi; M. Tokeshi; H. Kimura; T. Kitamori, Electrophoresis, 23, 734 (2002)), 형광 검출 방법(T. Buranda; J. Huang; V. H. Perez-Luna; B. Schreyer; L. A. Sklar; G. P. Lopez, Anal. Chem., 74, 1149 (2002)), UV/VIS 분광광도계를 이용하는 방법(J. Ruzicka, Analyst,123, 1617 (1998)) 등으로 다양하게 이루어질 수 있다.

한편, 포스트-게놈 시대를 맞이하여, 조직이나 세포 내에 발현되는 단백질을 분석함으로써 유전자의 질병과의 직접적인 연관성을 찾고자 많은 연구가 경주되고 있다.

이러한 단백질 분석 및 기능조사에 현재 가장 널리 쓰이고 있는 방법은 2차원 전기영동법에 의한 단백질의 분리정제이지만, 이 방법은 매우 노동집약적이며 시간이 많이 소요되는 방법이라는 단점이 있다. 2차원 전기영동법 자체만으로도 수 시간에서 수 일이 소요되는 작업이며, 스팟(spot)의 절개(excision), 효소분해반응(digestion) 및 샘플 준비 등의 복잡한 별도의 과정을 필요로 한다.

또한, 상기 2차원 전기영동법은 실험의 재현성이 떨어지고, 로딩(loading)된 단백질 중 20%만을 가시화(visualization)할 수 있으며, 10kD 내지 100kD 범위의 분자량을 갖는 단백질의 분석에 제한된다는 단점이 있다. 또한, 멤브레인 단백질과 같은 소수성의 단백질들은 그 용해도 문제 때문에 분석이 매우 어렵고 서로 다른 방법으로 처리된 프로테옴들의 단백질 패턴이 서로 달라 매우 다양한 패턴을 나타낼 수 있는 것도 단점으로 지적되고 있다.

뿐만 아니라, 2차원 전기영동법에서는 단백질의 로딩양이 일반적으로 200㎍ 내지 250 ㎍ 정도로 제한되며, 분리하고자 하는 단백질들은 화학적으로 성질이 매우 다양하며, 질병과 관련된 정작 중요한 단백질은 매우 적은 농도로 존재하는 경우가 많기 때문에 단백질 분리에 어려움이 크다는 단점이 있다.

상기한 여러 문제들 뿐만 아니라, 종래의 2차원 전기영동법에 의한 단백질 검출 방법에서는 그 측정 농도의 최소 한계를 보이고 있음으로 인해, 최근에는 이러한 2차원 전기영동법을 대체할 수 있는 새로운 방법의 개발이 시도되고 있다.

예를 들면, 2차원 전기영동법에서 분리된 스팟을 검출하기 위해서 사용되는 쿠마시 블루(Coomasie Blue)시약의 경우 10ng 내지 100ng 정도의 검출 최저한계를 보이며 10배 내지 30배의 농도 범위 내에서 단백질의 양에 따라 발색시킬 수 있다. 은염색(Silver staining)방법의 경우 검출한계는 수 나노그램 정도로 낮지만 선형적인 동적 범위(dynamic range)가 10배 범위에 머무르는 단점이 있다.

따라서, 최근에는 검출 최저 한계도 수 나노그램 범위이면서, 선형적 동적 범위(dynamic range)가 1000배 정도인 형광 검출법의 사용이 증대되고 있는 실정이다. 그러나, 이러한 형광검출법 도입으로 인하여 최저 한계는 개선되었다고 하더라도, 이상에서 언급한 2차원 전기영동법의 근본적인 문제점들은 여전히 해소되지 못하고 있다.

최근에 이와 같은 단점들을 극복하고 미량 존재하는 단백질을 생체 시료로부터 쉽게 얻기 위해서 다양한 방법들이 제시되고 있는데, 그들 중의 하나의 예를들면, 일반 불순물을 쉽게 제거하고 검출한도의 문제점을 극복하기 위하여 고체상 추출방법(solid-phase extraction (SPE))을 이용한 생체분자 농축이 개발되었다.

또한, 마이크로 칩에 고체상 추출방법을 적용한 형태의 샘플 전처리 시스템도 개발되었다(R. D. Oleschuk; L. L. Shultz-Lockyear; Y. Ning; and D. J. Harrison, Anal. Chem.,72, 585 (2000)).

이러한 마이크로 칩에 집적화된 고체상 추출방법의 특징은, 그 제작이 용이하고 샘플의 손실을 줄일 수 있게 하며 칩 이외(off-chip)에서 발생할 수 있는 샘플의 오염 문제를 근본적으로 해결할 수 있게 한다.

그러나, 이제까지 보고된 대부분의 고체상 추출방법은 역상 고체기질(reversed-phase solid matrix)을 이용함으로써 특이적 결합력이 아닌 단순 흡착을 이용하여 단백질 또는 펩타이드를 농축하는 기술이기 때문에, 2차원 전기영동법과 같은 사전 분리정제 작업이 필요하다는 문제가 여전히 존재한다.

반면에, 비드 어피니티 크로마토그래피는 생체 시료 혼합물로부터 목표 단백질을 분리해내고 농축하는 강력한 기술이며, 목표 단백질만을 친화성(affinity)에 의하여 리간드가 코팅된 비드에 흡착시키고 그것을 분리해내는 방법을 이용한다.

그러나, 목표 단백질의 비드로부터의 분리과정이 어렵기 때문에 비드 어피니티 크로마토그래피를 마이크로 스케일로 집적화한 연구는 그다지 진행된 바가 없었다. 현재까지 이용되어 왔던 강산성 용액으로 처리하는 방법, 높은 이온 농도의 용액으로 처리하는 방법, 계면활성제나 케이오트로픽 시약(chaotropic agent)을 이용하는 방법 등의 분리 방법은 그 효율성도 문제가 되지만 분리되는 단백질의 기능이 손상된다는 치명적인 단점을 가지고 있다.

따라서, 당업계에서는 단백질의 검출, 분리를 위한 비드 어피니티 크로마토그래피 장치를 마이크로 스케일로 집적화하기 위해 요구되는 기술, 즉 비드에 결합된 단백질을 용이하게 분리해낼 수 있는 새롭고 획기적인 방법의 개발이 시급히 요청되어 왔다.

따라서, 본 발명의 목적은, 단백질의 구조나 기능의 손상이 없이 생체 분자 분리용 고분자 지지체로부터 단백질을 빛의 조사에 의해 분리해낼 수 있도록 고분자 지지체의 표면과 생체분자 친화성 물질 사이에 광분해성 연결기가 도입된 생체 분자 분리용 고분자 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 다양한 종류의 단백질, RNA, DNA 등과 같은 생체 분자들의 혼합물을 각 물질별로 분리, 분석하고 생체 분자들의 혼합물에서 특정 생체 분자를 손상없이 용이하게 검출, 분리해내는 방법을 제공하는 것으로서, 고분자 지지체의 표면과 생체분자 친화성 물질 사이에 광분해성 연결기가 도입된 고분자 지지체를 특정 형상의 미세 유로 구조물에 탑재하는 단계, 상기 미세 유로 구조물에 생체분자 혼합물을 가하는 단계, 상기 생체분자 혼합물 중 상기 고분자 지지체의 생체 분자 친화성 부분과 결합되지 아니한 분자들을 제거하는 단계, 그리고 상기 미세 유로 구조물에 광선을 조사하여 상기 광분해성 연결기를 분해시켜서 고분자 지지체와 특이적으로 결합된 목표 생체분자를 분리시키는 단계를 포함하는 생체분자 검출 또는 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 광선의 조사에 의한 생체 분자 검출 또는 분석 방법에 사용되기에 특히 적합한 특정 형상의 미세 유로 구조물을 제공하는 것으로서, 광선이 투과할 수 있는 투명한 재질로 이루어진 생체 분자의 검출 및 분석에 사용되는 미세 유로 구조물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 광선의 조사에 의한 생체 분자 검출 또는 분석 방법에 사용되기에 특히 적합한 특정 형상의 미세 유로 구조물을 제공하는 것으로서, 원심력을 이용하여 다양한 길이의 채널에 연결된 다수의 유체 패턴에 생체 분자 함유 시료를 투입할 수 있는 원심력조절 원반형 칩을 제공하는 것이다.

도 1a 및 도 1b는 마이크로 비드 또는 고분자 코팅 다공성 채널에 광분해성 연결기를 도입하고 이들을 탑재한 마이크로칩(microchip)을 이용하여 생체 분자를 검출 및 분석하는 과정을 나타낸다.

도 2는 마이크로 비드 또는 다공성 채널의 표면, 스페이서, 광분해성 연결기 및 생체분자 친화성 물질간 결합을 도시한 것이다.

도 3은 고분자로 코팅된 다공성 채널의 주사전자현미경 사진이다.

도 4는 본 발명의 마이크로 비드를 이용하여 단백질 혼합물 내에서 목표 단백질인 HCV RNA 레플리카제(replicase)만을 선택적으로 분리해낸 결과를 나타내는 혼합물 및 각 생체분자의 형광강도 및 피크너비이다.

도 5는 본 발명의 마이크로 비드를 이용하여 단백질 혼합물 내에서 목표 단백질인 HCV RNA 레플리카제(replicase)를 분리해 내고 효소반응기를 거친후 말디-토프 질량분석(MALDI-TOF MS, Matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry)을 수행한 결과이다.

도 6은 마이크로 칩에 미세 고분자 지지체가 탑재된 상태를 보여주는 사진이다.

도 7은 본 발명의 미세 유로 구조물의 확대도이다.

도 8은 본 발명에 사용된 생체분자 다중검출 및 분석을 수행하는 원심력조절 원반형 칩의 모형의 평면도이다.

본 발명의 첫번째 목적은, 표면에 생체분자 친화성 물질을 도입시킨 생체 분자 분리용 고분자 지지체에 있어서, 고분자 지지체의 표면과 생체분자 친화성 물질 사이에 광분해성 연결기가 도입된 것임을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 고분자 지지체를 제공함으로써 달성된다.

본 발명의 생체 분자 분리용 고분자 지지체로는 종래에 이 기술분야에서 사용되고 있는 다양한 종류의 고분자 지지체가 사용될 수 있으며, 특히 적합하게는 일반적으로 친화성 크로마토그래피에서 고정상으로 사용될 수 있는 물질들인 유리, 실리콘, 금속, 플라스틱 뿐만 아니라 실리카(silica), 겔(gel), 고분자 기재(matrix), 마이크로비드(microbead) 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 생체분자 친화성 물질과의 결합이 용이하도록 접촉 표면적이 극대화되는 형상의 소재 즉, 마이크로 비드 또는 다공성 고분자 발포체가 사용될 수 있다. 본 발명의 생체분자 분리용 고분자 지지체의 성상이나 재료는 본 발명의 특징부에 해당하지 아니하며, 광분해성 연결기나 추출하는 스페이서 그룹과의 결합이 가능한 고체상 물질이면 족하다.

본 발명에 사용하기에 적합한 생체 분자 분리용 고분자 지지체는 마이크로 비드 또는 다공성 고분자 발포체로서 그 표면은 아미노기 또는 히드록시기로 수식된 것이고, 0.1 내지 200 마이크로미터 범위의 균일한 크기의 미세 구조로서 상기의 표면에 광분해성 연결기가 결합될 수 있는 것들이다.

본 발명의 광분해성 연결기는 마이크로 비드 또는 다공성 고분자 발포체의 표면과, 특정 생체분자에 대한 친화력을 갖는 생체분자 친화성 물질을 연결하며, 목표 단백질이 생체분자 친화성 물질과 결합한 후 광선의 조사에 의하여 분해되어 목표 단백질을 방출하게 하여주는 화학 구조를 말한다.

본 발명의 광분해성 연결기는 자외선, 가시광선 또는 특정 파장의 레이저 광선 등의 광선의 조사에 의해서 화학적 결합이 분쇄될 수 있는 화학구조이며, 특히 적합하게는 o-니트로-α-페닐로 치환된 벤질(o-nitro-α-phenyl substituted benzyl)기를 포함하는 화합물들이나 본 발명의 범위는 이에 한정되지는 아니한다.

본 발명의 광분해성 연결기들은 고돈 등(K. Gordon, et al., J. Chem. Technol. Biotechnol., 74, 835-851(1999)), 니콜라우스 등(K. C. Nicolaus, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 37(11), 1559-1561(1998)), 귈리어 등(F. Guillier, et al., Chem. Rev., 100, 2091-2157(2000))에 의하여 상세하게 개시되었으며, 이러한 문헌에 개시된 광분해성 연결기들은 모두 본 발명의 광분해성 연결기로 사용될 수 있다.

본 발명의 광분해성 연결기는 특히 바람직하게는 하기의 화합물일 수 있다.

상기 화합물의 카르복시산 부분은 고분자 지지체의 표면과 결합되고, 히드록시부분이 생체분자 친화성 물질에 결합되며, 히드록시부분이 자외선의 조사에 의하여 분해되는데, 이러한 결합 및 분해 기전은 다음과 같다.

본 명세서에서 생체분자란 DNA, RNA, 펩티드, 단백질 등을 포함하며, 생체분자 친화성 물질이란 DNA, RNA, 펩티드, 단백질, 금속 착화합물, 작은 유기 분자(small molecule) 및 긴 알킬사슬 등을 포함한다.

본 발명의 광분해성 연결기를 분해하기 위하여 바람직하게는 250 내지 450nm의 파장의 광선이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 생체 분자 분리용 고분자 지지체의 표면과 광분해성 연결기 사이 또는 광분해성 연결기와 생체분자 친화성 물질 사이에 스페이서(spacer)를 추가로 도입할 수 있다.

본 발명의 스페이서는 생체분자 친화성 물질 또는 광분해성 연결기를 생체 분자 분리용 고분자 지지체의 표면에 고정 또는 흡착시킬 때 표적 생체 분자의 접근성을 증가시키기 위하여 도입되는 화합물로서 알킬, 폴리에틸렌, 생체고분자 또는 합성고분자 등을 포함한다.

보다 상세하게 본 발명에 사용되기에 특히 적합한 스페이서로는 β-알라닌(β-alanine), ε-카프로익 산(ε-caproic acid) 등과 같이 한쪽 말단에 아민기를 갖고 다른 말단에 카르복시기를 갖는 분자들이 단독 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 스페이서는 본 발명의 필수 구성요건에 해당되지 아니한다.

H2N-Y-COOH

Y = -(CH2)n- (단, n 은 1-12 사이의 정수)

= chain 중간에 N, O와 같은 hetero atom을 포함하며 3-10 Å의

길이를 갖는 chain

본 발명의 지지체에 사용될 수 있는 스페이서들은 소이에즈 등(H. Soyez, et al., Adv. Drug Delivery Rev., 21, 81(1996)), 포르토게즈 등(P. S. Portoghese, et al., J. Med. Chem., 34, 1715(1991)), 프로이론 등(I. Freulon, et al., Biochem. J., 354, 671-679(2001))에 의하여 개시된 바 있으나, 본 발명에 사용되는 스페이서가 이들에 개시된 물질들만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 특히 바람직한 스페이서는 β-알라닌(β-alanine) 또는 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid)이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고분자 지지체의 표면과 생체분자 친화성 물질 사이에 광분해성 연결기가 도입된 생체 분자 분리용 고분자 지지체를 특정 형상의 미세 유로 구조물에 탑재하는 단계, 상기 미세 유로 구조물에 생체분자 혼합물을 가하는 단계, 상기 생체분자 혼합물 중 상기 고분자 지지체의 생체 분자 친화성 부분과 결합되지 아니한 분자들을 제거하는 단계, 그리고 상기 미세 유로 구조물에 광선을 조사하여 상기 광분해성 연결기를 분해시켜서 고분자 지지체와 특이적으로 결합된 목표 생체분자를 분리시키는 단계를 포함하는 생체분자 검출 또는 분석방법을 제공함으로써 달성된다.

다양한 생체 고분자 물질이 뒤섞인 혼합물로부터, 특정 생체 분자를 검출 및 분석하기 위하여, 특정 구조의 미세 유로 구조물 내에 본 발명의 광분해성 연결기를 갖는 마이크로 비드 또는 다공성 고분자 지지체를 탑재한 후, 상기의 생체 분자 혼합물을 가하면, 생체 분자 혼합물 중에 존재하는 표적 생체분자와 지지체 표면에 도입된 생체 분자 친화성 물질이 특이적으로 결합하게 된다.

이렇게 표적 생체 분자가 결합된 본 발명의 지지체가 탑재된 상기의 미세 유로 구조물을 완충용액으로 세척하는 등의 방법으로 생체 분자 친화성 물질과 결합되지 아니한 물질들을 제거한 후, 여기에 자외선을 조사하여 광분해성 연결기를 분해시키면 표적 생체 분자만이 특이적으로 배출되므로, 표적 생체 분자를 정교하게 검출 및 분리할 수 있게 된다.

본 발명의 또 다른 목적은 광선이 투과할 수 있는 투명한 재질로 이루어진 생체 분자의 검출 및 분석에 사용되는 미세 유로 구조물을 제공함으로써 달성된다.

본 발명의 마이크로 비드 또는 다공성 마이크로 고분자 지지체는 단백질을 검출 및 분석하기 위한 일반적인 미세 유로 구조물에 탑재될 수 있는데, 이러한 미세 유로 구조물은 가장 바람직하게는 유리-실리콘-유리로 이루어진 세 층 또는 PDMS-유리로 이루어진 두 층의 구조를 갖는다.

이와 같은 구조는 포토레지스트 필름의 도포와 미세 유로구조의 현상화, 미세 유로 구조의 식각 공정등 일반적인 반도체 제작 공정을 이용하여 제작되며, 본 발명의 지지체의 탑재, 생체 분자 혼합물 시료의 주입, 상기 지지체로부터의 생체분자 검출, 자외선 조사 등의 일련의 과정이 수행되는 투명한 유로를 형성하고, 본 발명의 지지체를 포획하여 탑재하기 위하여 기둥 모양의 필터에 의해 형성되는 공간을 갖는다.

본 발명의 미세 유로 구조물은 본 발명의 생체 분자 분리용 고분자 지지체가 탑재되는 1nL 내지 1mL의 크기를 갖는 마이크로 챔버가 중앙에 위치하고 양단에 생체 분자 혼합물 시료 및 배출구로 연결되는 미세 유로를 갖는다.

상기의 생체 분자 혼합물 시료 주입구에는 모세관 튜브와 연결되는 구조물이 부착되어 있으며, 이는 모세관 튜브를 통하여 마이크로 주입 밸브장치, 마이크로 시린지 펌프와 연결된다. 배출구에도 역시 모세관 튜브와 연결되는 구조물이 부착되며, 연결된 모세관 튜브를 통하여 분리되는 생체분자를 검출할 수 있는 장치가 연결되거나 MALDI-TOF MS 분석을 위한 모세관 형태의 효소 반응기가 연결된다.

본 발명의 또 다른 목적은, 원심력을 이용하여 다양한 길이의 채널에 연결된 다수의 유로 구조물에 분리 대상 시료 혼합물을 투입할 수 있는 원반형 생체 분자 분리칩을 제공함으로써 달성된다.

본 발명의 원반형 생체 분자 분리 칩은 원반형 칩의 회전에 의해 발생하는 원심력에 의하여 본 발명의 고분자 지지체를 미세 유로 내에 탑재하고 또한 칩의 회전에 의해 발생하여 혼합물 시료에 가해지는 원심력에 의해 혼합물 시료를 상기의 미세 유로를 통과시키고 표적 생체 분자를 탑재된 본 발명의 지지체에 결합시켜 혼합물로부터 정교하게 분리해낸다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리 범위를 본 실시예로 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1. 광분해성 연결기가 도입된 마이크로 비드의 합성(1)

아미노 폴리에틸렌글리콜이 표면에 수식된 폴리스티렌 마이크로 비드(치환율: 0.1 mmol/g)를 Fmoc으로 보호되어 있는 광분해성 연결기 2당량, BOP 2당량, HOBt 2당량, DIEA 2.5 당량이 포함된 DMF 용액에 넣고 상온에서 교반하여 6시간 반응시켰다. 그 후, 마이크로비드를 필터로 여과하고 DMF, MeOH, DCM의 용매로 10분씩 3번 세척해 주었다. 20% piperidine/NMP 용액으로 10분 + 30분 동안 마이크로 비드를 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.

이와 같이 마련된 광분해성 연결기가 도입된 마이크로 비드를 6-아미노카프로익 산 (N-Fmoc-aminocaproic acid) 3당량, BOP 3당량, HOBt 3당량, DIEA 4 당량이 포함된 DMF 용액에 넣고 상온에서 교반하여 4시간 반응시켰다. 마이크로 비드를 필터로 여과하고 DMF, MeOH, DCM 용매로 10분씩 3번 세척해 주고, 20% piperidine/NMP 용액으로 10분 + 30분 동안 처리하여 마이크로 비드 상의 Fmoc 보호기를 제거하였다.

이와 같이 스페이서가 도입된 광분해성 마이크로비드에 비오틴(d-biotin) 3당량, BOP 3당량, HOBt 3당량, DIEA 4당량이 포함된 DMF 용액을 넣어 상온에서 교반하여 4시간 반응시켰다. 그 후, 비오틴이 도입된 마이크로 비드를 필터로 여과하고 DMF, MeOH, DCM 용매로 10분씩 3번 세척한 후, 진공 건조함으로써 광분해성 비오틴 리간드가 도입된 마이크로 비드를 얻었다. 각각의 커플링 반응의 종결은 피크릭산 적정법 또는 닌히드린 아민 발색 반응을 이용하여 확인하였다.

실시예 2. 광분해성 연결기가 도입된 마이크로 비드의 합성(2)

아미노 폴리에틸렌글리콜이 표면에 수식된 폴리스티렌 마이크로 비드(치환율: 0.1 mmol/g)를 Fmoc으로 보호되어 있는 광분해성 연결기 2당량, BOP 2당량, HOBt 2당량, DIEA 2.5 당량이 포함된 DMF 용액에 넣고 상온에서 교반하여 6시간 반응시켰다. 그 후, 마이크로 비드를 필터로 여과하고 DMF, MeOH, DCM의 용매로 10분씩 3번 세척해 주었다. 20% piperidine/NMP 용액으로 10분 + 30분 동안 마이크로 비드를 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.

이와 같이 마련된 광분해성 연결기가 도입된 마이크로비드를 6-아미노카프로익 산 (N-Fmoc-aminocaproic acid) 3당량, BOP 3당량, HOBt 3당량, DIEA 4 당량이 포함된 DMF 용액에 넣고 상온에서 교반하여 4시간 반응시켰다. 마이크로 비드를 필터로 여과하고 DMF, MeOH, DCM 용매로 10분씩 3번 세척해 주고, 20% piperidine/NMP 용액으로 10분 + 30분 동안 처리하여 마이크로 비드 상의 Fmoc 보호기를 제거하였다.

이와 같이 스페이서가 도입된 광분해성 마이크로 비드에 무수 숙신산(succinic anhydride) 2당량, DIEA 3당량이 포함된 DMF 용액을 넣어 상온에서 교반하여 2시간 반응시켰다. 이렇게 카르복실기가 도입된 마이크로 비드에 N-히드록시숙신 이미드(N-hydroxy succinimide) 5당량, DIC 3당량, DMAP 0.5당량이 포함된 DMF 용액을 넣어주고 상온에서 교반하여 18시간 반응시켰다.

이렇게 활성 에스터로 수식된 마이크로 비드를 DMF, MeOH, DCM 용매로 10분씩 3번 세척한 후, 진공 건조함으로써 광분해성 링커를 포함한 활성 에스터로 수식된 마이크로비드를 얻었다. 여기에 5mM Tris-HCl, pH 7.6, 25mM MgCl₂완충 용액을 가하고 C형 간염 바이러스 내에 존재하는 레프리카제(replicase)에 대해 특별한 친화력을 지닌 아민기를 포함하는 RNA 압타머(aptamer) 0.1-1 당량 넣은 다음, 상온에서 교반하여 1시간 동안 커플링시켰다. 미반응의 활성 에스터 기능기는 1M 에탄올아민으로 1시간 처리해주어 블로킹하였다.

실시예 3. 미세 유로 구조물 제작

일반적인 실리콘 마이크로머시닝을 이용하여 미세 유로 구조물를 제작하였다.

마이크로칩은 유리 커버, 실리콘 채널, 유리 바닥의 세 층으로 이루어지며, 각각 500㎛, 100㎛, 500㎛의 두께이다. 실리콘 채널은 표준 포토 리소그래피 공정과 플라즈마 활성 이온 식각(plasma reactive ion etching (RIE)) 공정을 통해 제작되었다.

반응 챔버의 한 말단에 30 ㎛의 간격으로 16개의 실리콘 마이크로 필라 (30 ×30 ㎛²)를 배열한 후, 파우더블래스팅(powderblasting)으로 유리 커버에 주입구와 배출구를 각각 1 ×1 ㎟의 크기로 형성시키고, 세척과 건조 후에 주입구와 배출구가 생성된 유리 커버를 유리바닥 상에 형성된 실리콘 채널 위에, 2시간 동안 anodic binding 방법으로 접합하였다.

실시예 4. 효소반응기 제작

내경이 100-150 ㎛인 용융 실리카 모세관 내부를 아세톤, 메탄올로 30분씩 흘려주어 세척한 후, 질소를 불어넣어 건조하고 0.2M NaOH 용액으로 30분간 흘려준 후 증류수, 아세톤으로 세척하였다. 30% 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트/acetone 용액을 모세관에 채워 넣은 후, 상온에서 24시간 반응시켰다.

여기에 에틸렌그리콜디메타크릴레이트(EGDMA) 20%(w/w), 메타크릴로일 제파민 500 (methacryloyl Jeffamine 500) 20%(w/w), 1-도데칸올 60%(w/w), 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논 (모노머에 대해 2.5%) 의 혼합물을 시린지로 주입하고 UV를 3분 조사하여 모세관 내에 포러스한 매트릭스를 형성시켰다(도 3). 여기에 30%(v/v) 글루타알데히드 수용액을 주입하고 상온에서 2시간 반응시킨 후, 증류수로 10분간 흘려주어 세척하였다. 여기에 2-10mg/mL 농도의 트립신 용액 (0.5M sodiunm sulfate, 0.1M sodium carbonate, 0.05M benzamidine)을 4시간 흘려주어 트립신을 고정화하였다. 1M 에탄올아민 용액으로 1시간 처리한 후, 증류수로 세척하였다.

실시예 5. 미세 유로 구조물 내에 마이크로 비드 탑재

균일화된 마이크로 비드 서스펜전 용액(0.33 %(w/v) 비드) 10-50㎕를 마이크로 피펫으로 정량하여 마이크로칩의 주입구에 가하고 배출구를 통해 아스피레이터를 이용하여 진공을 잡아줌으로써 마이크로 비드를 마이크로 챔버 안에 탑재하였다. 그 후, 주입구를 통하여 증류수를 흘려주어 마이크로비드를 고밀도로 패킹하였다.

실시예 6. 목표 단백질의 농축 및 분리

단백질의 비특이적 흡착을 방지하기 위하여 0.5%(w/w) BSA 용액을 마이크로비드가 탑재된 미세 유로 구조물에 채워 넣은 후 30분간 방치하고 용액(50mM, pH 7.4)을 5분간 흘려주어 세척하였다. 분석하고자 하는 FITC 형광물질로 표지된 단백질 용액 1-50㎍/mL을 시린지로 미세 유로 구조물에 주입하고 30분 동안 반응시켰다. 50㎕/min의 유속으로 버퍼 용액을 흘려줌으로써 반응하지 않은 단백질을 세척해내었다. 배출구 쪽에 장치된 형광 감지 장치를 통하여 더 이상 형광 신호가 나타나지 않을 때까지 계속 세척 하였다.

버퍼 용액의 주입을 멈추고 마이크로 비드가 채워져 있는 마이크로 챔버 위에 광섬유 장치를 이용하여 UV를 10분 동안 조사하였다. 버퍼용액을 50㎕/min의 유속으로 흘려주어 마이크로비드에 농축된 단백질을 분리시키고 형광 신호를 감지함으로써 정량 분석을 수행하였다. 스트랩타비딘(streptavidin)을 검출할 경우, 인산 완충용액(50mM, pH 7.4), HCV RNA replicase를 검출할 경우, 트리스 버퍼(25mM Tris-HCl, pH 7.6, 25mM MgCl2)를 사용하였다. 도 4는 단백질 혼합물 내에서 목표 단백질만을 분리시킨 결과를 나타낸 것이다.

실시예 7. 효소반응기를 이용한 단백질의 분해 및 MALDI-TOF MS를 이용한 단백질의 확인 분석

분리된 단백질 시료를 상기에서 제작된 모세관형 효소반응기에 3㎕/min의 유속으로 흘려주어 효소분해를 시켜주었다. 이와 같이 효소분해된 샘플을 MALDI 샘플 플레이트에 올려놓고 MS 분석을 통하여 검출된 단백질을 분석하였다. 도 5에 MALDI-TOF MS를 이용한 분석 결과를 나타내었다.

실시예 8. 표적 단백질의 다중 검출 및 분석

상기 실시예 1에서 합성된 1-16가지의 각각의 리간드가 커플링된 비드를 다중분석용 칩의 비드 주입구에 위치시키고, 2000rpm으로 회전을 가하여 원심력으로 상기의 비드를 탑재시킨 후, 비특이적 흡착을 방지하기 위하여 0.5%(w/w)의 BSA 용액을 2000rpm으로 주입하였다. 분석하고자 하는 혼합물 시료를 시료 유로의 주입구에 위치시키고 역시 1000-2000rpm의 회전을 가하여 각각의 리간드와의 반응을 1-30분 동안 수행하였다. 완충용액을 1000rpm으로 주입하여 세척한 후, 자외선을 일부 반응기 또는 전체의 반응기에 조사하여 광분해 반응을 수행하였다. 완충용액을 주입구에 넣고 2000rpm의 원심력을 가하여 농축된 표적 단백질을 각각의 수집 챔버에 넣어 주었다.

본 발명의 광분해성 연결기를 도입시킨 생체 분자 분리용 고분자 지지체를 이용하여 단백질을 검출 및 분석하는 방법은, 종래의 계면활성제법, 강산성 용액을 가하는 방법, 높은 이온 강도를 이용하는 방법 등의 기존의 방법에 비하여 자외선을 조사하는 온화한 조건에서 단백질을 분리시킬 수 있기 때문에, 기존의 방법에서 문제가 될 수 있는 표적 단백질의 변성을 억제할 수 있으며, 분리액에 의한 표적단백질의 오염 문제 없이, 보다 정밀하고 신속하게 단백질을 검출·분석할 수 있다.

또한, 광분해 반응을 이용한 단백질의 분리 방법은, 특이적 결합에 의하여 농축된 단백질만을 검출할 수 있기 때문에, 종래의 방법에서 가장 심각한 문제가 되었던 단백질의 비특이적 흡착에 의한 분석의 어려움을 해결하여 분석의 정밀도 및 신뢰도를 높일 수 있다.

본 발명의 미세 유로 구조물는 광선이 투과할 수 있는 투명한 재질로 이루어져 있어서 본 발명의 광분해성 연결기가 도입된 고분자 지지체를 탑재하여 생체분자를 검출 및 분석하는 용도로 사용하기에 특히 적합하다.

한편, 기존의 랩씨디(labCD)가 동일한 형태의 미세 유로 패턴을 환상으로 배열하여 각각 개별의 랩-온-어-칩 성능을 구현한 것인 반면, 본 발명의 원심력 조절 원반형 칩은 반지름 방향으로의 혼합물 유체의 유동 조작 뿐만 아니라, 중심으로부터 동일한 거리에 있는 반응기 사이에서도 유체의 유동 조작을 수행할 수 있기 때문에, 반응혼합물을 하나의 유로 패턴으로부터 나란히 위치한 다른 소자의 유로 패턴의 입력구에 투입할 수 있도록 한다.

즉, 본 발명의 원심력 조절 원반형 칩은, 여러가지 생체분자를 검출할 수 있는 각각의 고분자 지지체가 하나의 칩에 탑재되어, 다수의 단백질의 검출 및 분석과정을 동시에 수행할 수 있기 때문에, 효율적인 고속 다중분석(High Throughput Screening)에 사용될 수 있다.

Claims

생체분자 친화성 물질을 도입시킨 생체 분자 분리용 고분자 지지체에 있어서, 고분자 지지체의 표면과 생체분자 친화성 물질 사이에 광분해성 연결기가 도입된 것을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 고분자 지지체.
제1항에 있어서, 상기 생체분자가 DNA, RNA, 펩티드 및 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 고분자 지지체.
제1항에 있어서, 상기 생체분자 친화성 물질이 DNA, RNA, 펩티드, 단백질, 금속 착화합물, 작은 유기분자 및 긴 알킬 사슬로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 고분자 지지체.
제1항에 있어서, 상기 고분자 지지체가 마이크로 비드, 다공성 미세 발포체 및 다공성 중공사로로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 고분자 지지체.
제1항에 있어서, 상기 고분자 지지체의 표면이 아미노기 또는 히드록시기로 수식된 것임을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 고분자 지지체.
제1항에 있어서, 상기 광분해성 연결기가 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 것임을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 고분자 지지체.

(I)
제1항에 있어서, 상기 고분자 지지체의 표면과 광분해성 연결기 사이 또는 광분해성 연결기와 생체분자 친화성 물질 사이에 스페이서(spacer)를 추가로 포함하는 것임을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 고분자 지지체.
제7항에 있어서, 상기 스페이서가 β-알라닌(β-alanine) 및 6-아미노카프로익 산(6-aminocaproic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 고분자 지지체.
i) 고분자 지지체의 표면과 생체분자 친화성 물질 사이에 광분해성 연결기가 도입된 고분자 지지체를 미세 유로 구조물 에 탑재하는 단계;

ii) 상기 미세 유로 구조물에 분리 대상 생체 분자 혼합물을 가하는 단계;

iii) 상기 생체분자 혼합물 중 상기 고분자 지지체와 결합되지 아니한 물질들을 제거하는 단계; 그리고

iv) 상기 미세 유로 구조물에 자외선을 가하여 광분해성 연결기를 분해시켜서 상기 고분자 지지체의 생체 분자 친화성 물질과 특이적으로 결합된 표적 생체 분자를 분리해내는 단계

를 포함하는 생체분자 검출 및 분석방법.
생체 분자의 분리 또는 검출에 사용되는 미세 유로 패턴을 갖는 구조물에 있어서, 광선이 투과할 수 있는 투명한 재질로 이루어진 것임을 특징으로 하는 생체 분자의 검출 또는 분석에 사용되는 미세 유로 구조물.
제10항에 있어서, 상기 미세 유로 구조물의 재질이 유리, 실리콘 및 PDMS로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 미세 유로 구조물.
생체 분자 물질의 분리 또는 검출에 사용되는 미세 유로 패턴을 갖는 구조물에 있어서, 구조물의 회전에 의해 발생하는 원심력에 의해 다수의 채널에 연결된 다수의 방사상 유로 패턴에 시료를 투입하는 것을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 미세 유로 구조물.
제11항에 있어서, 상기 생체 분자 분리용 미세 유로 구조물이 광선이 투과할 수 있는 투명한 재질로 이루어진 것임을 특징으로 하는 생체 분자 분리용 미세 유로 구조물.