WO2021125641A1 - 생체환경/외부자극에 의한 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법 - Google Patents

생체환경/외부자극에 의한 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법 Download PDF

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degradable
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healing peptide
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김은하
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아주대학교 산학협력단
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    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling the active release of a self-healing peptide motif by a living environment/external stimulus for hearing enhancement, and more particularly, to a support; bioenvironmental stimulatory degradable linkers; And it relates to a biomedical material for hearing enhancement composed of a self-healing peptide motif and an active release control method of a self-healing peptide motif by a living environment/external stimulus.
  • Biomedical materials including self-healing peptide motifs that can mobilize auditory cells in response to biological environmental stimuli (light, sound waves, pH changes, biochemical substances, etc.) It was confirmed that it was precisely released from the biomedical material, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is a support; bioenvironmental stimulatory degradable linkers; and to provide a biomedical material for hearing enhancement composed of a self-healing peptide motif.
  • Another object of the present invention is to provide a method for controlling the active release of a self-healing peptide motif by the biological environment/external stimulus.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for protecting or treating auditory cell damage comprising the biomedical material for enhancing hearing as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for protecting or treating damage to auditory cells using the biomedical material for enhancing hearing.
  • the present invention is a support; bioenvironmental stimulatory degradable linkers; and a self-healing peptide motif, wherein the bio-environmental stimulus degradable linker provides a biomedical material for enhancing hearing, characterized in that it is positioned between the support and the self-healing peptide motif.
  • the support may be a biodegradable support, a support containing hyaluronic acid, a resin, preferably Wang resin.
  • the bioenvironment stimulus degradable linking group may be at least one selected from a photodegradable linking group, a sonically degradable linking group, a pH-degradable linking group and a biochemical degradable linking group.
  • the photodegradable linking group is a compound represented by the following Chemical Formula 1 (4-[4-(1-hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy]butanoic acid),
  • the biochemical degradable linking group is COOCH 3 -cTCO (trans-cyclooctene) represented by the following formula (3),
  • the pH-decomposable linker may be a hydrazone linker or a disulfide linker.
  • the sonic decomposable connector may be a microbubble.
  • the self-healing peptide motif may be a stem cell mobilizing substance, preferably a substance P (substance P; SP) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an analog thereof. have.
  • the biomedical material for improving hearing comprises the steps of (a) introducing a bioenvironmental degradable connector into a support; and (b) introducing a self-healing peptide motif into the bioenvironmental stimulus-degradable linker.
  • the present invention also provides a method for controlling the active release of a self-healing peptide motif comprising the step of treating the bio-environment/external stimulus to the hearing enhancement bio-medical material.
  • the bioenvironment/external stimulus may be light, sound waves, pH control, or biochemicals.
  • the light can be processed for 1 minute to 240 minutes of light having a wavelength of 250 to 450 nm.
  • the biochemical substance may be tetrazine or a tetrazine derivative.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for protecting or treating auditory cell damage comprising the biomedical material for enhancing hearing as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for protecting or treating auditory cell damage, comprising administering the biomedical material for hearing enhancement to a patient with auditory cell damage.
  • the present invention in one aspect, the support; bioenvironmental stimulatory degradable connector; and a self-healing peptide motif, wherein the bioenvironmental stimulus degradable linker is located between the support and the self-healing peptide motif. It relates to a biomedical material for enhancing hearing.
  • FIG. 1 is a biomedical material for hearing enhancement containing a self-healing peptide motif and a biological environment stimulus (light, sound wave, pH environment, biochemical substance, etc.) sensitive material and an active release control of a self-healing peptide motif by the biological environment/external stimulus
  • an auditory progenitor cell recruitment (recruiting or homing) material is introduced into a biomedical material to which a bioenvironment sensitive material (a bioenvironmental stimulus degradable connector) is connected, and the bioenvironment is sensitized by bioenvironment/external stimuli.
  • a self-healing peptide motif was prepared so that the substance was decomposed and the self-healing peptide was precisely controlled and released.
  • the support may have various forms such as nanoparticles, blocks, and tubes depending on the purpose, but is not limited thereto, and may be prepared in the form of liposomes if necessary.
  • the support may be characterized as a biodegradable polymer, resin, or biomedical material, and in the present invention, Wang resin is preferably used.
  • a support containing hyaluronic acid, which is a natural polymer, or a support for 3D printing technology may be used without limitation.
  • biodegradable polymer examples include polyglycolide, polylactides, polycaprolactones, polytrimethylenecarbonates, polyhydroxybutyrates, poly Hydroxylvalerates, polydioxanones, polyorthoesters, polycarbonates, polytyrosinecarbonates, polyorthocarbonates, polyalkylene oxalates oxalates), polyalkylenesuccinates, poly(malic acid), poly(maleic-anhydride), polypeptides, polydepsipeptides ), polyvinylalcohol, polyesteramides, polyamides, polyanhydrides, polyurethane, polyphosphazenes, polycyanoacrylate ), polyfumarates, poly(amino acid), modified polysaccharides, modified proteins, polymer mixtures thereof, etc.
  • poly(amino acid), modified polysaccharides, modified proteins, etc. are preferably used.
  • the bioenvironmental stimulus degradable linking group may be characterized in that at least one selected from a photodegradable linking group, a sonic degradable linking group, a specific pH-degradable linking group, and a biochemical degradable linking group.
  • the photodegradable linker may use a compound composed of a carboxylic acid moiety bound to the surface of the support and a partial hydroxy moiety bound to a self-healing peptide, and the hydroxy moiety is decomposed by light irradiation to release the self-healing peptide motif.
  • the sonic degradable linker may apply microbubble technology, and a specific pH degradable linker may apply a hydrazone linker or a disulfide linker, and the biochemical degradable linker may be tetrazine. Tetrazine derivatives may be used, but are not limited thereto.
  • the self-healing peptide motif may be a stem cell mobilization material, preferably a substance P (Substance P; SP, FIG. 2) comprising the amino acid of SEQ ID NO: 1 or an analog thereof.
  • Substance P (hereinafter referred to as "SP" interchangeably) is one of the mammalian tachykinins consisting of the 11 amino acid sequence of RPKPQQFFGLM, and is excessively secreted when a wound occurs in the tissue, which is multiplied for wound healing. It is a substance with the ability to induce the recruitment (or 'collection', 'migration promotion') of stem cells with differentiation potential.
  • the biomedical material for enhancing hearing comprises the steps of (a) introducing a bioenvironmental stimulus degradable connector into a support; And (b) introducing a self-healing peptide motif into the bioenvironmental stimulus degradable linker; it may be characterized in that it is prepared by a method comprising.
  • the surface of the support in step (a) may be modified to include an amine group in order to introduce a bioenvironmentally degradable linker, and Fmoc (fluorenylmethyloxycarbonyl protecting group) or t-Boc to protect an amine group before introduction of the bioenvironmentally degradable linker (tert-Butyloxycarbonyl protecting group) can be added.
  • Fmoc fluorenylmethyloxycarbonyl protecting group
  • t-Boc to protect an amine group before introduction of the bioenvironmentally degradable linker
  • SP was introduced into Wang resin using a photocleavable linker as shown in the schematic diagram of FIG. 3 .
  • step (iv) introducing the material P to the photodegradable linker by replacing the nitrophenol portion of the compound of formula 2 introduced into Wang resin in step (iii) with the substance P (substance P; SP);
  • a biomedical material for hearing enhancement was prepared by a method including.
  • the compound represented by Formula 1 serves as a photodegradable linking group, and the photodegradable linking group includes a carboxylic acid moiety and a hydroxy moiety.
  • the carboxylic acid moiety is bound to the surface of the support, the hydroxy moiety is finally bound to the self-healing peptide, and the hydroxy moiety is decomposed by UV irradiation.
  • a light beam having a wavelength of 250 to 450 nm may be used to decompose the photodegradable linking group of the present invention.
  • a biomedical material for decomposing a biochemical substance using a cTCO-tetrazine reaction was prepared.
  • step (iii) introducing cTCO hydrolyzed in step (i) into the Wang resin from which Fmoc has been removed in step (ii);
  • step (V) introducing the substance P into cTCO by replacing the nitrophenol part of the compound of formula 2 introduced into Wang resin in step (iv) with substance P (Substance P; SP); A biomedical material for hearing enhancement was prepared by this method.
  • the present invention relates to an active release control method of a self-healing peptide motif comprising the step of treating a biological environment/external stimulus to a biomedical material for enhancing hearing from another point of view.
  • the bioenvironment/external stimulus may be light, sound waves, pH control, or biochemicals.
  • the emission of a self-healing peptide motif was specifically controlled through light irradiation, and more specifically, light of a wavelength of 250 to 450 nm, preferably of a wavelength of 365 nm.
  • the release of the self-healing peptide motif was controlled by treatment with UV light for 1 minute to 240 minutes.
  • the release of a self-healing peptide motif can be controlled through treatment with tetrazine or a tetrazine derivative.
  • FIG. 10 it was confirmed that Wang resin treated with Tz-Kiz by cTCO-Tz binding reaction was labeled with red fluorescence, which is a self-healing peptide motif-cTCO- When tetrazine is treated with a biomedical material composed of a support, cTCO and tetrazine bind, which means that the self-healing peptide motif can be finally released.
  • the self-healing peptide motif of the present invention can be utilized as a pharmaceutical composition for protection or treatment of auditory cell damage, It can be widely used as a precision release control tool that will be essential to the biomaterial and biotissue restoration industry linked to regenerative medicine in the future.
  • the biomedical material for enhancing hearing of the present invention can be controlled so that the peptide having stem cell or progenitor cell mobilization ability can be precisely released in vivo, so a composition for treatment of various diseases, regeneration or treatment of damaged organs or tissues It can be applied to the composition.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for protecting or treating auditory cell damage comprising the hearing enhancement biomedical material as an active ingredient.
  • the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Parenteral administration for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, may be administered intradermally, but is not limited thereto.
  • the self-healing peptide motif is mixed with water together with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, which may be prepared in an ampoule or vial unit dosage form.
  • the composition may be sterilized and/or contain adjuvants such as preservatives, stabilizing agents, wetting or emulsifying agents, salts and/or buffers for regulating osmotic pressure, and other therapeutically useful substances, and mixing, granulation, in a conventional manner. It can be formulated according to the method of formulation or coating.
  • the dosage for the human body of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, weight, sex, dosage form, health status and disease degree, and based on an adult patient weighing 60 kg, It is generally 0.001 to 1,000 mg/day, preferably 0.01 to 500 mg/day, and may be administered in divided doses once or several times a day at regular time intervals according to the judgment of a doctor or pharmacist.
  • a self-healing peptide motif capable of releasing a self-healing peptide having the ability to mobilize auditory cells in response to stimuli (light, sound waves, pH change, biochemicals, etc.) in the vicinity of the auditory damage site was prepared. Since it was confirmed that the self-healing peptide is precisely released from the biomedical material by environmental stimuli/external stimuli, it can be usefully used in a pharmaceutical composition for protecting or treating auditory cell damage or a method for protecting or treating auditory cell damage.
  • FIG. 1 is a self-healing peptide motif and an active release control of a self-healing peptide motif by a bio-environment/external stimulus and a biomedical material for hearing enhancement containing substances that respond to biological environmental stimuli (light, sound waves, pH environment, biochemicals, etc.) It is a schematic diagram of the method.
  • Substance P is one of the self-healing peptide motifs.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the synthesis process of introducing SP into Wang resin using a photocleavable linker (photocleavable linker).
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a method for controlling the emission of SP from Wang resin through ultraviolet (UV; 365 nm) irradiation.
  • 5 is a graph confirming the increase in the emission of SP according to the UV irradiation time by HPLC.
  • FIG. 6 is a graph confirming the increase in peak intensity and peak area in the HPLC data of SP according to the UV irradiation time.
  • FIGS. 7a to 7c are schematic diagrams showing the synthesis process of introducing SP into Wang resin using cTCO, which is a biochemically degradable linker.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing the reaction of PNP-cTCO-Ala-Wang Resin and NH 2 -KIz to which a fluorescent probe is combined.
  • a biomedical material for enhancing hearing was manufactured in the same manner as in FIG. 3 . All reactions were repeated using two reagents, and after each step reaction, the syringe solution was discarded, and then washed twice for 1 minute each using DCM (Dichloromethane; 300 ⁇ l) and DMF (Dimethylformamide; 300 ⁇ l). carried out. All reactions were performed in 5 ml (6 ml) NORM-JECT® syringes and kept at room temperature.
  • Fmoc-Ala-Wang resin (0.79 mmol/g; 10 mg, 0.0079 mmol) was swelled in DCM (300 ⁇ l) for 10 minutes and then washed. Then, DMF containing 20% piperidine (300 ⁇ l) ⁇ l), the reaction mixture was stirred for 3 minutes, and the solution except for the resin was removed. The above procedure was repeated twice.
  • Photocleavable linker (4-[4-(1-Hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy]butanoic acid; 12 mg, 0.0395 mmol) and HCTU ( O -(6 -Chlorobenzotriazol-1-yl) -N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate; 16.3 mg, 0.0395 mmol) containing DMF (300 ⁇ l) and DIPEA ( N,N- Diisopropylethylamine; 13.8 ⁇ l, 0.079 mmol) After addition, the reaction mixture was stirred for 30 minutes. The above procedure was repeated twice, and the second reaction was performed using DCM (300 ⁇ l) instead of DMF solution. All reactions in step 2 were protected from light.
  • the biomedical material for hearing enhancement prepared in the present invention could control the release of the self-healing peptide motif by light irradiation.
  • UV irradiation was performed in a state in which Wang resin introduced with SP and photodegradable linkers was suspended in a solvent (200 ⁇ l of water), and a hand UV irradiator (SPECTROLINE® Model: ENF-240C/FE, 230 V, 50 Hz, 0.2 Amps) in a 365 nm channel. UV irradiation was maintained in a dark room, and HPLC chromatograms were examined over time (0, 2, 12, 42, 67, 147, 237 min).
  • Figure 5 shows whether the SP peptide bound to Wang resin through a photolytic linker is released by 365 nm UV irradiation from Wang resin, a self-healing peptide motif biomedical new material model, in order to check whether the peptide motif can be precisely controlled release was observed through absorption by time (0 to 240 min) at a wavelength of 235 nm using HPLC, and it was confirmed that SP was emitted by UV irradiation.
  • FIG. 6 is a scatter plot graph showing peak intensity maximum values and AUC area values over time on HPLC for quantitative analysis of self-healing peptide motif precisely controlled release, selective under light irradiation conditions It was confirmed that the SP peptide motif can be precisely controlled and released.
  • the substance P peptide motif was introduced into Wang resin by utilizing cTCO (trans-cyclooctene), which is a biochemical degradability (bioenvironment stimulatory degradability) linking group.
  • cTCO trans-cyclooctene
  • Tz tetrazine
  • the manufacturing process of the biomedical material for hearing enhancement composed of Wang resin-cTOC-SP is as follows.
  • Fmoc-Ala-Wang Resin (1.5 mg, 1.2 ⁇ mol) was swelled in DMF for 30 min, and then washed 3 times with fresh DMF.
  • DIPEA (1.4 ⁇ l, 8.1 ⁇ mol) was added to 50 ⁇ l DMF containing NH2-Ala-Wang Resin from which the protecting group was removed, followed by stirring for 30 minutes.
  • PyBOP benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate; 2.5 mg, 4.9 ⁇ mol
  • COOH-cTCO-OH 1.5 mg, 8.1 ⁇ mol
  • DIPEA 0.4 ⁇ l, 2.4 ⁇ mol
  • substance P 1.8 mg, 1.3 ⁇ mol
  • the mixture was added to 30 ⁇ l DMF containing pre-swelled PNP-cTCO-Ala-Wang Resin, and then reacted for 15 hours.
  • the PNP-cTCO-Ala-Wang Resin prepared in step 4 of Example 2-1 was treated with tetrazine (Tz-KIz) bound to a fluorescent probe ( FIG. 9 ).
  • a self-healing peptide motif capable of releasing a self-healing peptide having the ability to mobilize auditory cells in response to stimuli (light, sound waves, pH change, biochemicals, etc.) in the vicinity of the auditory damage site was prepared. Since it has been confirmed that the self-healing peptide is precisely released from the biomedical material by environmental stimuli/external stimuli, it can be usefully used in a pharmaceutical composition for protection or treatment of auditory cell damage or a method for protecting or treating auditory cell damage. very likely
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of substance P (substance P).

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Abstract

본 발명은 청각증진을 위한 생체환경/외부자극에 의한 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지지체; 생체환경 자극 분해성 연결기; 및 자가힐링 펩타이드 모티브로 구성된 청각 증진용 바이오 메디컬 소재 및 생체환경/외부자극에 의한 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 청각 손상 부위 주변에 있는 생체 환경 자극(광, 음파, pH 변화, 생화학 물질 등)에 감응하여 청각 세포 동원능을 가진 자가힐링 펩타이드를 방출시킬 수 있는 자가힐링 펩타이드 모티브를 제조하였으며, 생체 환경 자극/외부자극에 의해 자가힐링 펩타이드가 바이오 메디컬 소재로부터 정밀하게 방출 되는 것을 확인하였으므로, 청각 세포 손상 보호 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

생체환경/외부자극에 의한 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법
본 발명은 청각증진을 위한 생체환경/외부자극에 의한 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지지체; 생체환경 자극 분해성 연결기; 및 자가힐링 펩타이드 모티브로 구성된 청각 증진용 바이오 메디컬 소재 및 생체환경/외부자극에 의한 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법에 관한 것이다.
선천적 난청 또는 다양한 사회적 유발 원인에 의한 이독성, 돌발성, 노인성 중/고도 난치성 청각 손상 환자가 급증하고 있으며, 전세계 3억 명, 미국 3500만 명 및 한국 5백만 명(완전손상 환자 35만 명/2017)의 환자가 있는 것으로 알려져 있어, 이에 대한 치료 기술 개발이 매우 필요한 실정이다 (2015, Market Trak Vll research).
선천적 또는 사고로 청각 소실된 환자는 대체로 영구적인 난청을 초래하는 경우가 많은데 그 이유는 한번 손상 받은 청각세포나 청각신경은 자발적으로 회복되지 못하기 때문에 완전 질환 치료가 매우 어려운 것으로 알려져 있다. 난치성 청각 소실을 효과적으로 치료하기 위한 청각 재생 연구들이 시도되고 있으며, 체외배양한 다양한 줄기(전구)세포 이식, 유전자 치료가 가능성 있는 치료 방법으로 부각되고 있으나 안전성과 생존효율성 등 극복해야 하는 몇 가지 제약들이 있다.
이러한 제약들을 극복하기 위해 제일 먼저 선행되어야 하는 것이 내이의 구조적 한계를 극복하고 청각세포 및 청각신경의 기능회복을 위한 연구 접근방법이 필요하다.
이에, 본 발명에서는 기존의 청각 치료를 위한 제약점을 극복하기 위해, 청각 전구세포를 동원(recruiting 또는 homing)하여 청각 세포로 분화할 수 있는 조건을 확립하기 위해 예의 노력한 결과, 청각 손상 부위 주변에 있는 생체 환경 자극(광, 음파, pH변화, 생화학 물질 등)에 감응하여 청각세포를 동원시킬 수 있는 자가힐링 펩타이드 모티브를 포함한 바이오 메디컬 소재를 제조하였으며, 생체환경/외부자극에 의해 자가힐링 펩타이드가 바이오 메디컬 소재로부터 정밀하게 방출 되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 지지체; 생체환경 자극 분해성 연결기; 및 자가힐링 펩타이드 모티브로 구성된 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 생체환경／외부자극에 의한 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 유효성분으로 포함하는 청각 세포 손상 보호 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 이용하는 청각 세포 손상 보호 또는 치료방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 지지체; 생체환경 자극 분해성 연결기; 및 자가힐링 펩타이드 모티브로 구성되어 있으며, 상기 생체환경 자극 분해성 연결기는 지지체와 자가힐링 펩타이드 모티브 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 지지체는 생분해성 지지체, 히알루론산 함유 지지체, 레진일 수 있으며, 바람직하게 왕 레진(Wang resin)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 생체환경 자극 분해성 연결기는 광분해성 연결기, 음파 분해성 연결기, pH 분해성 연결기 및 생화학물질 분해성 연결기 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 광분해성 연결기는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(4-[4-(1-hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy]butanoic acid)이며,
[화학식 1]
Figure PCTKR2020017563-appb-I000001
상기 생화학물질 분해성 연결기는 하기 화학식 3으로 표시되는 COOCH3-cTCO(trans-cyclooctene)이며,
[화학식 3]
Figure PCTKR2020017563-appb-I000002
상기 pH 분해성 연결기는 히드라존 연결기(Hydrazone linker) 또는 이황화물 연결기(Disulfide linker)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 음파 분해성 연결기는 마이크로 버블일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 자가힐링 펩타이드 모티브는 줄기세포 동원물질일 수 있으며, 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 물질 P(substance P; SP) 또는 이의 유사체일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재는 (a) 지지체에 생체환경 자극 분해성 연결기를 도입하는 단계; 및 (b) 상기 생체환경 자극 분해성 연결기에 자가힐링 펩타이드 모티브를 도입하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재에 생체환경/외부 자극을 처리하는 단계를 포함하는 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 생체환경/외부 자극은 광, 음파, pH 조절 또는 생화학물질일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 광은 250 내지 450nm의 파장의 광선을 1분 내지 240분 동안 처리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 생화학적 물질은 테트라진 또는 테트라진 유도체일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 유효성분으로 포함하는 청각 세포 손상 보호 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 청각 세포가 손상된 환자에 상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 투여하는 단계를 포함하는 청각 세포 손상 보호 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 일관점에서, 지지체; 생체환경 자극 분해성 연결기; 및 자가힐링 펩타이드 모티브로 구성되어 있으며, 상기 생체환경 자극 분해성 연결기는 지지체와 자가힐링 펩타이드 모티브 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재에 관한 것이다.
도 1은 자가힐링 펩타이드 모티브 및 생체환경자극 (광, 음파, pH 환경, 생화학물질 등) 감응 물질을 함유하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재 및 생체환경／외부자극에 의한 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법에 관한 모식도로, 본 발명에서는 생체환경 감응 물질(생체환경 자극 분해성 연결기)이 연결된 바이오메디컬 소재에 청각전구세포 동원(recruiting 또는 homing) 물질을 도입하여, 생체환경/외부 자극에 의해 생체환경 감응 물질이 분해되어 자가힐링 펩타이드가 정밀 제어 방출 되도록 자가힐링 펩타이드 모티브를 제조하였다.
본 발명에 있어서, 상기 지지체는 목적에 따라 나노입자, 블럭, 튜브 등 다양한 형태를 가질 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니며, 필요에 따라 리포좀 형태로 제조할 수 있다.
상기 지지체는 생분해성 고분자, 레진, 또는 바이오메디컬 소재인 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게 왕 레진(Wang resin)을 사용하였다. 상기 지지체는 또한, 천연 고분자인 히알루론산을 함유한 지지체 또는 3D 프린팅 기술 지지체를 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 생분해성 고분자로는 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리락티드(polylactides), 폴리카프롤락톤(polycaprolactones), 폴리트리메틸렌카보이트(polytrimethylenecarbonates), 폴리히드록시부티레이트(poly-hydroxy-butyrates), 폴리히드록실발레레이트(polyhydroxyvalerates), 폴리디옥사논(polydioxanones), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리티로신카보네이트(polytyrosinecarbonates), 폴리오르토카보네이트(polyorthocarbonate), 옥살산염 폴리알킬렌(polyalkylene oxalates), 숙신산염 폴리알킬렌(polyalkylenesuccinates), 폴리(말산)(poly(malic acid)), 폴리(무수말레산)(poly(maleic- anhydride)), 폴리펩티드(polypeptides), 폴리뎁시펩티드(polydepsipeptides), 폴리비닐알코올(polyvinlylalcohol), 폴리에스테라미드(polyesteramides), 폴리아미드(polyamides), 폴리안히드라이드(polyanhydrides), 폴리우레탄(polyurethanes), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylate), 폴리푸마레이트(polyfumarates), 폴리(아미노산)(poly(amino acid)), 변성 탄수화물(modified polysaccharides), 변성단백질(modified proteins), 이들의 중합체 혼합물등을 사용하는 것이 바람직하고, 이중에서도 폴리글리콜리드 (polyglycolide), 폴리(L-락티드폴리(L-락티드-코-글리콜리드)(poly(L-lactide-co-glycolide)), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) (poly(D,L-lactide-co-glycolide)), 폴리(L-락티드)(poly(L-lactide)), 폴리(D,L-락티드)(poly(D,L-lactide)), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)(poly(L-lactide-co-D,L-lactide)), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리(L-락티드-코-카프롤락톤(poly(L-lactide-co-caprolactone)), 폴리(D,L-락티드-코-카프롤락톤(poly(D,L-lactide-co-caprolactone)), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonate), 폴리(L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(L-lactide-co-trimethylenecarbonate)), 폴리(D,L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(D,L-lactide-co-trimethylene-carbonate)), 폴리디옥사논(polydioxanone), 이들의 공중합체, 이들의 3 원 중합체, 또는 이들의 중합체 혼합물(polymer blends) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생체환경 자극 분해성 연결기는 광분해성 연결기, 음파 분해성 연결기, 특정 pH 분해성 연결기 및 생화학물질 분해성 연결기 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 광분해성 연결기는 지지체 표면에 결합되는 카르복시산 부분 및 자가힐링 펩타이드와 결합되는 부분 하이드록시 부분으로 구성된 화합물을 사용할 수 있으며, 하이드록시 부분이 광 조사에 의해 분해되어 자가힐링 펩타이드 모티브가 방출되게 된다.
상기 음파 분해성 연결기는 마이크로 버블(microbubble) 기술을 적용할 수 있으며, 특정 pH 분해성 연결기는 히드라존 연결기(Hydrazone linker) 또는 이황화물 연결기(Disulfide linker)를 적용할 수 있고, 생화학물질 분해성 연결기는 테트라진 유도체(tetrazine derivatives)를 적용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 자가힐링 펩타이드 모티브는 줄기세포 동원물질일 수 있으며, 바람직하게 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 물질 P(Substance P; SP, 도 2) 또는 이의 유사체인 것을 특징으로 할 수 있다. 물질 P(Substance P, 이하 "SP"로 혼용 표기함)는 RPKPQQFFGLM의 11개의 아미노산 서열로 이루어진 포유류의 타키키닌의 하나로서, 조직 내 상처가 발생했을 때 과량 분비되고, 이는 상처 회복을 위해 다분화능이 있는 줄기세포의 동원(또는 '포집', '이동 촉진')을 유도할 수 있는 능력을 지닌 물질이다.
본 발명에 있어서, 상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재는 (a) 지지체에 생체환경 자극 분해성 연결기를 도입하는 단계; 및 (b) 상기 생체환경 자극 분해성 연결기에 자가힐링 펩타이드 모티브를 도입하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 (a) 단계의 지지체는 생체환경 자극 분해성 연결기를 도입시키기 위해 아민기가 포함되도록 표면을 개질시킬 수 있으며, 생체환경 자극 분해성 연결기 도입 전에 아민기를 보호하기 위해 Fmoc(fluorenylmethyloxycarbonyl protecting group) 또는 t-Boc(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)가 추가될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서는 도 3의 모식도에 나타난 방법과 같이 광 분해성 연결기(photocleavable linker)를 이용하여 SP를 왕 레진(Wang resin)에 도입시켰다.
구체적으로, (i) 알라닌-NH-Fmoc(fluorenylmethyloxycarbonyl protecting group)으로 표면개질되어 있는 왕 레진에 피페리딘(piperidine) 또는 DBU(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)을 처리하여 Fmoc를 제거하는 단계;
(ii) Fmoc가 제거된 왕 레진에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(4-[4-(1-hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy]butanoic acid)를 도입시키는 단계;
[화학식 1]
Figure PCTKR2020017563-appb-I000003
(iii) 상기 (ii) 단계에서 왕레진에 도입된 화학식 1로 표시되는 화합물의 하이드록시 부분에 하기 화학식 2로 표시되는 화합물(4-Nitrophenyl chloroacetate)을 도입시키는 단계; 및
[화학식 2]
Figure PCTKR2020017563-appb-I000004
(iv) 상기 (iii) 단계에서 왕레진에 도입된 화학식 2의 화합물의 나이트로페놀(nitrophenol) 부분을 물질 P(substance P; SP)로 치환시켜 광분해성 연결기에 물질 P를 도입시키는 단계;를 포함하는 방법으로 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 제조하였다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 광분해성 연결기의 역할을 하며, 광분해성 연결기는 카르복시산 부분 및 하이드록시 부분을 포함한다. 카르복시산 부분을 지지체의 표면과 결합되고, 하이드록시 부분이 최종적으로 자가힐링 펩타이드과 결합되며, 하이드록시 부분이 자외선 조사에 의해 분해된다.
본 발명의 광분해성 연결기를 분해하기 위하여 바람직하게는 250 내지 450nm의 파장의 광선이 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서는 도 7a 내지 도 7c의 모식도에 나타난 방법과 같이 cTCO-테트라진 반응을 이용한 생화학물질 분해성 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 제조하였다.
구체적으로, (i) 하기 화학식 3으로 표시되는 COOCH3-cTCO(trans-cyclooctene)의 카르복실기 부분에 하이드록시기를 도입시키는 단계;
[화학식 3]
Figure PCTKR2020017563-appb-I000005
(ii) 알라닌-NH-Fmoc(fluorenylmethyloxycarbonyl protecting group)으로 표면개질되어 있는 왕 레진에 피페리딘(piperidine) 또는 DBU(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)을 처리하여 Fmoc를 제거하는 단계;
(iii) 상기 (ii)단계에서 Fmoc이 제거된 왕 레진에 상기 (i) 단계에서 가수분해된 cTCO를 도입시키는 단계;
(iv) 상기 (iii) 단계에서 왕레진에 cTCO의 하이드록시 부분에 하기 화학식 2로 표시되는 화합물(4-Nitrophenyl chloroacetate)을 도입시키는 단계; 및
[화학식 2]
Figure PCTKR2020017563-appb-I000006
(Ⅴ) 상기 (iv) 단계에서 왕레진에 도입된 화학식 2의 화합물의 나이트로페놀(nitrophenol) 부분을 물질 P(Substance P; SP)로 치환시켜 cTCO에 물질 P를 도입시키는 단계;를 포함하는 방법으로 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 제조하였다.
본 발명의 방법으로 제조한 cTCO-왕 레진에 물질 P가 제대로 결합되었는지 반응물 속의 물질 P의 흡광도(236 nm) 측정을 통해 확인한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 반응이 진행함에 따라 흡광도(236 nm)가 감소되는 것을 확인하였다.
또한, 생화학적 분해성 연결기인 cTCO와 테트라진의 반응성은 PNP-cTCO-Ala-Wang Resin 및 NH2-Kiz 결합을 통해 확인하기 위해, PNP-cTCO-Ala-Wang Resin에 형광프로브가(Fluorogenic probe) 결합된 테트라진(Tz-KIz)을 처리한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, cTCO-Tz 결합 반응에 의해 Tz-Kiz을 처리한 왕 레진이 빨간색 형광으로 라벨링(labeling) 되는 것을 확인하였다.
본 발명은 다른 관점에서 청각 증진용 바이오 메디컬 소재에 생체환경/외부 자극을 처리하는 단계를 포함하는 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 생체환경/외부 자극은 광, 음파, pH 조절 또는 생화학물질인 것을 특징으로 할 수 있다.
광분해성 연결기를 포함하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재인 경우, 구체적으로 광 조사를 통해 자가힐링 펩타이드 모티브의 방출을 제어하였으며, 더 구체적으로는 250 내지 450nm의 파장의 광선, 바람직하게는 365 nm 파장의 자외선을 1분 내지 240분 동안 처리하여 자가힐링 펩타이드 모티브의 방출을 제어하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 구현예에서는, 도 4에 나타난 모식도와 같이, 본 발명에서 제조한 자가힐링 펩타이드 모티브가 광조사에 의해 자가힐링 펩타이드의 방출 제어 가능한지 확인하였다. HPLC 분석을 통해 확인한 결과 도 5 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 특정 환경변화 조건에서 선택적으로 SP 펩타이드 모티브를 정밀 제어하여 방출 할 수 있음을 확인하였다.
또한, 생화학물질 분해성 연결기인 cTCO를 포함하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재인 경우, 테트라진 또는 테트라진 유도체 처리를 통해 자가힐링 펩타이드 모티브의 방출을 제어할 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 구현예에서는, 도 10에 나타난 바와 같이, cTCO-Tz 결합 반응에 의해 Tz-Kiz을 처리한 왕 레진이 빨간색 형광으로 라벨링되는 것을 확인하였으며, 이는 자가힐링 펩타이드 모티브-cTCO-지지체로 구성된 바이오 메디컬 소재에 테트라진을 처리하게되면 cTCO 및 테트라진이 결합하게 되고, 이로 인해 최종적으로 자가힐링 펩타이드 모티브가 방출될 수 있다는 것을 의미한다.
즉, 본 발명에서는 바이오 메디컬 소재로부터 자가힐링 펩타이드 모티브를 정밀 제어 방출 할 수 있는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 자가힐링 펩타이드 모티드는 청각세포 손상 보호 또는 치료용 약학적 조성물로써 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 추후 재생의학에 연계된 생체소재 및 생체조직 복원산업에 필수적으로 도입될 정밀 방출제어 툴(tool)에 널리 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 청각 증진용 바이오 메디컬 소재는 줄기세포 또는 전구세포 동원능이 있는 펩타이드가 생체 내에서 정밀 방출될 수 있도록 제어가 가능하므로, 다양한 질환의 치료용 조성물, 손상된 장기 또는 조직의 재생 또는 치료용 조성물에 적용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 유효성분으로 포함하는 청각 세포 손상 보호 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 자가힐링 펩타이드 모티브를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 청각 세포가 손상된 환자에 상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 투여하는 단계를 포함하는 청각 세포 손상 보호 또는 치료방법을 제공할 수 있다.
상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재에 대한 설명은 상기 기재로 대신한다.
본 발명에서는 청각 손상 부위 주변에 있는 생체 환경 자극(광, 음파, pH 변화, 생화학 물질 등)에 감응하여 청각 세포 동원능을 가진 자가힐링 펩타이드를 방출시킬 수 있는 자가힐링 펩타이드 모티브를 제조하였으며, 생체 환경 자극/외부자극에 의해 자가힐링 펩타이드가 바이오 메디컬 소재로부터 정밀하게 방출 되는 것을 확인하였으므로, 청각 세포 손상 보호 또는 치료용 약학적 조성물 내지 청각 세포 손상 보호 또는 치료방법에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 자가힐링 펩타이드 모티브 및 생체환경자극 (광, 음파, pH 환경, 생화학물질등) 감응 물질을 함유하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재 및 생체환경／외부자극에 의한 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법에 관한 모식도이다.
도 2는 자가힐링 펩타이드 모티브중의 하나인 물질 P(Substance P; SP)의 화학구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 광 분해성 연결기(photocleavable linker)를 이용하여 SP를 왕 레진(Wang resin)에 도입시키는 합성과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 자외선(UV; 365 nm) 조사를 통한 왕 레진으로 부터 SP의 방출제어 방법에 관한 모식도이다.
도 5는 자외선 조사 시간에 따른 SP의 방출 증가를 HPLC로 확인한 그래프이다.
도 6은 자외선 조사 시간에 따른 SP의 HPLC 데이터에서 피크 강도(Peak Intensity) 및 피크 면적(Peak area) 증가를 확인한 그래프이다.
도 7a 내지 도 7c는 생화학적물질 분해성 연결기인 cTCO를 이용하여 SP를 왕 레진(Wang resin)에 도입시키는 합성과정을 나타낸 모식도이다.
도 8은 반응액 속의 SP 흡광도 관찰을 통한 PNP-cTCO-Ala-Wang Resin 및 SP 결합 정도를 확인한 데이터이다.
도 9는 PNP-cTCO-Ala-Wang Resin 및 형광프로브가 결합된 NH2-KIz의 반응을 나타낸 모식도이다.
도 10은 Tz-KIz 반응에 따른 cTCO-왕 레진(cTCO bead)의 형광 정도를 관찰한 데이터이다.
[실시예 1]
광분해성 청각 증진용 바이오 메디컬 소재 제작 및 방출 제어
1-1: 광분해성 청각 증진용 바이오 메디컬 소재 제작
본 발명에서는 도 3과 같은 방법으로 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 제작하였다. 모든 반응은 2개의 시약을 사용하여 반복하여 수행하였으며, 각 단계별 반응 후에 주사기 용액을 버린 다음, DCM(Dichloromethane; 300 ㎕) 및 DMF(Dimethylformamide; 300 ㎕)를 이용하여 2회씩 각각 1분 동안 세척을 수행하였다. 모든 반응은 5 ㎖(6 ㎖) NORM-JECT® 주사기에서 수행되었으며, 실온에서 유지되었다.
<1 단계>
Fmoc-Ala-Wang resin(0.79 mmol/g; 10 mg, 0.0079 mmol을 10분 동안 DCM(300 ㎕)에서 팽윤시킨 다음, 세척하였다. 이어서, 20% 피페리딘(Piperidine)이 포함된 DMF(300 ㎕)에 왕 레진을 첨가한 다음, 반응 혼합물을 3분 동안 교반하고, 레진을 제외한 용액을 제거하였다. 상기 과정을 2번 반복하여 수행하였다.
<2 단계>
상기 보호기가 제거된 왕 레진에 광분해성 링커(Photocleavable linker; 4-[4-(1-Hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy]butanoic acid; 12 mg, 0.0395 mmol) 및 HCTU(O-(6-Chlorobenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate; 16.3 mg, 0.0395 mmol)가 포함된 DMF(300 ㎕) 및 DIPEA(N,N-Diisopropylethylamine; 13.8 ㎕, 0.079mmol)를 첨가한 다음, 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 상기 과정을 두번 반복하여 수행하였으며, 두번째 반응은 DMF 용액 대신 DCM(300 ㎕)을 사용하여 수행하였다. 2단계의 모든 반응은 빛으로부터 보호되었다.
<3 단계>
상기 광분해성 연결기가 도입된 왕레진에 4-니트로페닐 클로로포르메이트(4-Nitrophenyl chloroformate; 6.37 mg, 0.0316 mmol) 및 DIPEA(5.5 ㎕, 0.0316mmol)이 포함된 DMF(300 ㎕)용액을 첨가한 다음, 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 상기 과정을 두번 반복하여 수행하였으며, 두번째 반응은 DMF 용액 대신 DCM(300 ㎕)을 사용하여 수행하였다.
<4 단계>
상기 3단계 반응이 끝난 왕레진에 물질 P(Substance P; 2.5 mg, 0.00186mmol) 및 DIPEA(0.323 ㎕, 0.00186mmol) 포함된 DMF/증류수(100 ㎕/100 ㎕) 용액을 첨가한 다음, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응이 진행됨에 따라 혼합물의 색이 투명하게 변하였으며, 동일한 시약을 사용하여 상기 과정을 두번 반복하여 수행하였다.
1-2: UV 조사에 따른 자가힐링 펩타이드 방출 제어
본 발명에서는 도 4에 나타난 모식도와 같이, 본 발명에서 제조한 청각 증진용 바이오 메디컬 소재가 광조사에 의해 자가힐링 펩타이드 모티브의 방출 제어 가능한지 확인하였다.
자외선 조사는 SP 및 광분해성 연결기가 도입된 왕 레진을 용매(물 200 ㎕)에 현탁시킨 상태에서 수행하였으며, 핸드 UV 조사기(Hand UV irradiator ; SPECTROLINE®Model : ENF-240C/ FE, 230 V, 50 Hz, 0.2 Amps)를 이용하여 365nm 채널에서 수행하였다. 어두운 방에서 UV 조사를 유지하였으며, HPLC 크로마토그램을 시간경과(0, 2, 12, 42, 67, 147, 237 min)에 따라 검사하였다.
도 5는 펩타이드 모티브의 정밀 제어 방출 가능 여부를 확인하기 위하여, 광분해 링커를 통해 왕레진에 결합된 SP 펩타이드가 자가힐링 펩타이드 모티브 바이오 메디컬 신소재 모델인 왕레진으로부터 365 nm UV 조사에 의해 방출되는지의 여부를 HPLC를 활용하여 235 nm 파장에서의 시간별(0 ~ 240 min) 흡광을 통해 관찰한 것으로, UV 조사에 의해 SP가 방출되는 것을 확인하였다.
도 6은 자가힐링 펩타이드 모티브 정밀제어 방출의 정량적 분석을 위해 HPLC 상에서의 피크 인텐시티 멕시멈(peak intensity maximum) 값과 AUC 면적 값을 시간에 따라 나타낸 산점도(scatter plot) 그래프로, 광조사 조건에서 선택적으로 SP 펩타이드 모티브를 정밀 제어하여 방출 할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 2]
생화학물질 분해성 청각 증진용 바이오 메디컬 소재 제작 및 방출 제어
2-1: 생화학물질 분해성 청각 증진용 바이오 메디컬 소재 제작
본 발명에서는 생화학물질 분해성(생체환경 자극 분해성) 연결기인 cTCO(trans-cyclooctene)를 활용하여 물질 P 펩타이드 모티브를 왕 레진(Wang resin)에 도입하였다. cTCO는 테트라진(tetrazine; Tz)과의 반응성이 높아 왕레진-cTOC-SP로 구성된 자가힐링펩타이드 모티브에 테트라진 또는 테트라진 유도체를 처리하게되면 cTCO-Tz 결합에 의해 물질 P가 방출하게 된다.
왕레진-cTOC-SP로 구성된 청각 증진용 바이오 메디컬 소재의 제작과정은 하기와 같다.
<1 단계: cTCO 가수분해>
수산화칼륨(KOH; 12.5 mg, 222.5 μmol)를 50 ㎕ 메탄올(MeOH)에 포함된 COOCH3-cTCO(1.76 mg, 8.9 μmol)에 첨가하였다. 혼합물을 어두운 곳에서 8시간 동안 교반한 다음, 강산성 양이온 교환 수지인 IR120(Amberlite IR-120; 0.1 ㎖)를 첨가하고 1분 동안 추가로 교반하였다. 그 다음, IR120를 여과로 제거하고, 메탄올로 3회 세척한 후, DIPEA(4-(N,N-Dimethylamino)pyridine; 6.2 ㎕, 35.6 μmol)를 첨가한 후, 여액을 감압농축시켜 생성된 미정제물을 정제하지 않고 이후 반응에 사용하였다.
<2 단계: Fmoc-Ala-Wang Resin 보호기 제거>
Fmoc-Ala-Wang Resin(1.5 mg, 1.2 μmol)을 30분 동안 DMF에서 팽윤시킨 다음, 새로운 DMF로 3회 세척하였다. 2M DBU(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)이 포함된 DMF를 상기 왕레진에 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 여과로 레진을 제외한 용액을 제거한 다음, DMF로 3회 세척하였다.
<3 단계: cTCO-Ala-Wang Resin 컨쥬게이션>
DIPEA(1.4 ㎕, 8.1 μmol)를 보호기가 제거된 NH2-Ala-Wang Resin이 포함된 50 ㎕ DMF에 첨가한 다음, 30분 동안 교반하였다. PyBOP(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate; 2.5 mg, 4.9 μmol) 및 상기 1 단계에서 가수분해 시킨 COOH-cTCO-OH(1.5 mg, 8.1 μmol)를 상기 왕레진에 첨가한 다음, 어두운 조건에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 여과로 레진을 제외한 용액을 제거한 다음, DMF로 3회 세척하였다.
<4 단계: PNP-cTCO-Ala-Wang Resin 컨쥬게이션>
4-니트로페닐 클로로포르메이트(4-nitrophenyl chloroformate; 0.7 mg, 3.6 μmol) 및 DIPEA를 cTCO-Wang-Ala Resin(1.0 mg, 0.79 μmol)이 포함된 50 ㎕ DMF(또는 DCM)에 첨가한 다음, 16시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 여과로 레진을 제외한 용액을 제거한 다음, DMF로 3회 세척하였다.
<5 단계: NP-cTCO-Ala-Wang Resin 및 물질 P 컨쥬게이션>
4단계에서 컨쥬게이션 시킨 PNP-cTCO-Ala-Wang Resin(1.0 mg, 1.2 μmol)을 DMF에서 30분 동안 예비 팽윤시킨 후, 여과로 레진을 제외한 용액을 제거한 다음, DMF로 3회 세척하였다.
DIPEA(0.4 ㎕, 2.4 μmol) 및 물질 P(1.8 mg, 1.3 μmol)를 30 ㎕ DMF에 첨가한 다음, 30분 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 예비 팽윤된 PNP-cTCO-Ala-Wang Resin이 포함된 30 ㎕ DMF에 첨가한 다음, 15시간 동안 반응시켰다.
도 8에 나타난 바와 같이, 왕 레진에 물질 P의 도입 여부는 반응물 속의 물질 P의 흡광도(236 nm) 측정을 통해 확인하였으며, 반응이 진행함에 따라 흡광도(236 nm)가 감소되는 것을 확인하였다.
2-2: 테트라진 처리에 따른 자가힐링 펩타이드 방출 제어
생화학적 분해성 연결기인 cTCO와 테트라진의 반응성은 PNP-cTCO-Ala-Wang Resin 및 NH2-Kiz 결합을 통해 확인하였다.
상기 실시예 2-1의 4 단계에서 제조한 PNP-cTCO-Ala-Wang Resin에 형광프로브가(Fluorogenic probe) 결합된 테트라진(Tz-KIz)을 처리하였다 (도 9).
도 10에 나타난 바와 같이, cTCO-Tz 결합 반응에 의해 Tz-Kiz을 처리한 왕 레진이 빨간색 형광으로 라벨링(labeling) 되는 것을 확인하였다.
본 발명에서는 청각 손상 부위 주변에 있는 생체 환경 자극(광, 음파, pH 변화, 생화학 물질 등)에 감응하여 청각 세포 동원능을 가진 자가힐링 펩타이드를 방출시킬 수 있는 자가힐링 펩타이드 모티브를 제조하였으며, 생체 환경 자극/외부자극에 의해 자가힐링 펩타이드가 바이오 메디컬 소재로부터 정밀하게 방출 되는 것을 확인하였으므로, 청각 세포 손상 보호 또는 치료용 약학적 조성물 내지 청각 세포 손상 보호 또는 치료방법에 유용하게 활용할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.
서열번호 1은 물질 P(substance P)의 아미노산 서열을 나타낸다.

Claims (11)

  1. 지지체; 생체환경 자극 분해성 연결기; 및 자가힐링 펩타이드 모티브로 구성되어 있으며, 상기 생체환경 자극 분해성 연결기는 지지체와 자가힐링 펩타이드 모티브 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지지체는 생분해성 지지체, 히알루론산 함유 지지체, 레진인 것을 특징으로 하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재.
  3. 제2항에 있어서, 상기 레진은 왕 레진(Wang resin)인 것을 특징으로 하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생체환경 자극 분해성 연결기는 광분해성 연결기, 음파 분해성 연결기, pH 분해성 연결기 및 생화학물질 분해성 연결기 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재.
  5. 제4항에 있어서, 상기 광분해성 연결기는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(4-[4-(1-hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy]butanoic acid)이며,
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2020017563-appb-I000007
    상기 생화학물질 분해성 연결기는 하기 화학식 3으로 표시되는 COOCH3-cTCO(trans-cyclooctene)이며,
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2020017563-appb-I000008
    상기 pH 분해성 연결기는 히드라존 연결기(Hydrazone linker) 또는 이황화물 연결기(Disulfide linker)인 것을 특징으로 하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재.
  6. 제1항에 있어서, 상기 자가힐링 펩타이드 모티브는 줄기세포 동원물질일 수 있으며, 바람직하게 서열번호 1로 구성되는 물질 P(substance P; SP) 또는 이의 유사체인 것을 특징으로 하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재.
  7. 제1항에 있어서, 상기 청각 증진용 바이오 메디컬 소재는 (a) 지지체에 생체환경 자극 분해성 연결기를 도입하는 단계; 및 (b) 상기 생체환경 자극 분해성 연결기에 자가힐링 펩타이드 모티브를 도입하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 청각 증진용 바이오 메디컬 소재.
  8. 제1항 내지 제7항의 방법 중 어느 한 항의 청각 증진용 바이오 메디컬 소재에 생체환경/외부 자극을 처리하는 단계를 포함하는 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 생체환경/외부 자극은 광, 음파, pH 조절 또는 생화학물질인 것을 특징으로 하는 자가힐링 펩타이드 모티브의 능동형 방출 제어 방법.
  10. 제1항 내지 제7항의 방법 중 어느 한 항의 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 유효성분으로 포함하는 청각 세포 손상 보호 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 청각 세포가 손상된 환자에 제1항 내지 제7항의 방법 중 어느 한 항의 청각 증진용 바이오 메디컬 소재를 투여하는 단계를 포함하는 청각 세포 손상 보호 또는 치료방법.
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