WO2024122726A1 - 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2024122726A1
WO2024122726A1 PCT/KR2022/020647 KR2022020647W WO2024122726A1 WO 2024122726 A1 WO2024122726 A1 WO 2024122726A1 KR 2022020647 W KR2022020647 W KR 2022020647W WO 2024122726 A1 WO2024122726 A1 WO 2024122726A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
cartilage
group
treated
regeneration
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/020647
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
정용지
김은미
연정태
이은주
Original Assignee
(주)케어젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020220171936A external-priority patent/KR20240086941A/ko
Application filed by (주)케어젠 filed Critical (주)케어젠
Publication of WO2024122726A1 publication Critical patent/WO2024122726A1/ko

Links

Images

Definitions

  • the present invention relates to peptides for cartilage regeneration and their uses.
  • This patent application claims priority to Korean Patent Application No. 10-2022-0171936 filed with the Korean Intellectual Property Office on December 9, 2022, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
  • the inventors of the present invention developed a new peptide, which significantly increases various cartilage components such as glycosaminoglycan, collagen, COMP, and aggrecan,
  • the present invention was completed by confirming that it can be usefully used to prevent or treat cartilage diseases and promote cartilage regeneration.
  • One object of the present invention is to provide a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for cartilage regeneration containing a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing the composition for cartilage regeneration.
  • One aspect provides a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • peptide may refer to a linear molecule formed by combining amino acid residues with each other through peptide bonds.
  • the peptide can be prepared according to chemical synthesis methods known in the art, especially solid-phase synthesis technology or liquid-phase synthesis technology (US Patent No. 5,516,891).
  • solid-phase synthesis technology or liquid-phase synthesis technology (US Patent No. 5,516,891).
  • solid-phase synthesis technology or liquid-phase synthesis technology
  • the biologically effective activity includes (a) inducing the production of glycosaminoglycan; (b) Induction of collagen type II Alpha 1 (COL2A1), collagen type and (c) properties such as inducing the production of the regulators Sex determining region Y-Box Transcription Factor 5 (SOX5), Sex determining region Y-Box Transcription Factor 6 (SOX6), or Sex determining region Y-Box Transcription Factor 9 (SOX9). It may represent one or more selected from. Therefore, the peptide can be used for cartilage regeneration.
  • the peptides may be added to N- or C- groups of the peptides to obtain chemical stability, enhanced pharmacological properties (half-life, absorption, potency, potency, etc.), altered specificity (e.g., broad spectrum of biological activity), and reduced antigenicity.
  • a protecting group may be attached to the terminal.
  • the N-terminus of the peptide is an acetyl group, a fluoreonylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, and a myristyl group. group), a stearyl group, a butoxycarbonyl group, an allyloxycarbonyl group, and polyethylene glycol (PEG).
  • the C-terminus of the peptide may be bonded to any one protecting group selected from the group consisting of an amino group (-NH 2 ), a tertiary alkyl group, and azide (-NHNH 2 ). You can. Additionally, the peptide may optionally additionally include a targeting sequence, a tag, a labeled residue, and an amino acid sequence prepared for the specific purpose of increasing half-life or peptide stability.
  • the peptide is artificially synthesized or non-naturally occurring or engineered, and the term “non-naturally occurring or engineered” refers to not being in its natural state. , refers to a state created by applying artificial transformation.
  • the artificial modification includes artificially synthesizing an amino acid sequence by mimicking a plurality of amino acid structures or engineering it to obtain chemical stability, enhanced pharmacological properties, altered specificity, or reduced antigenicity as described above. can do.
  • the term “stability” may mean not only in vivo stability, which protects the peptide from attack by protein cleavage enzymes in vivo, but also storage stability (e.g., room temperature storage stability).
  • composition for cartilage regeneration comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • cartilage regeneration may refer to restoring damaged cartilage tissue or improving cartilage tissue by inducing the production of insufficient cartilage tissue.
  • the “improvement” may mean any action that at least reduces the severity of a parameter, such as a symptom, related to the alleviation or treatment of a condition.
  • the cartilage includes, but is not limited to, hyaline cartilage, fibrocartilage, or elastic cartilage.
  • the cartilage is from the group consisting of articular cartilage, ear cartilage, nasal cartilage, elbow cartilage, meniscus, knee cartilage, costal cartilage, ankle cartilage, tracheal cartilage, laryngeal cartilage and spinal cartilage. There may be more than one selected.
  • the composition for cartilage regeneration includes a peptide consisting of about 20 amino acids or less as an active ingredient, and accordingly, the skin penetration rate of the active ingredient is very excellent, and, for example, can be administered topically. In this case, an effective cartilage regeneration effect can be obtained.
  • the peptide can significantly increase the expression of glycosaminoglycans, COL2A1, COMP, COL11A1, PCP, aggrecan, and regulators SOX5, SOX6, or SOX9, which are substances related to cartilage.
  • the peptide can be used as an active ingredient in a composition for cartilage regeneration (Orthop Res Rev. 2010 September 1; 2010(2): 85-94. doi:10.2147/ORR.S7194, JOSPT Volume 28 Number 4 October 1998).
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage disease, comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of a disease by administering the composition.
  • treatment refers to a treatment for an individual suffering from a disease or at risk of developing a disease, improving the condition of the individual (e.g., one or more symptoms), delaying the progression of the disease, delaying the onset of symptoms, or refers to any form of treatment that provides effects including slowing the progression of symptoms. Accordingly, the terms “treatment” and “prevention” are not intended to imply cure or complete elimination of symptoms.
  • the “subject” refers to a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, refers to mammals such as human or non-human primates, mice, dogs, cats, horses, and cattle.
  • cartilage disease refers to all diseases related to cartilage that require cartilage differentiation or regeneration.
  • the cartilage disease may be one or more selected from the group consisting of cartilage damage, cartilage defects, degenerative intervertebral disc disease, intervertebral disc herniation, degenerative arthritis, fractures, muscle tissue damage, fracture nonunion or joint damage due to trauma, osteomalacia, and chondromalacia. .
  • the cartilage disease may occur in the jaw joint, shoulder joint, elbow joint, wrist joint, finger joint, spinal joint, hip joint, knee joint, ankle joint, or toe joint.
  • the pharmaceutical composition contains a pharmaceutically effective amount of the peptide; and/or may include a pharmaceutically acceptable carrier, but are not limited thereto.
  • the term “pharmaceutically effective amount” may mean an amount sufficient to achieve the cartilage regeneration effect of the pharmaceutical composition.
  • the weight ratio between the peptide and the pharmaceutically acceptable carrier may be, for example, 500:1 to 1:500, and as examples, the weight ratio is 450:1 to 1:450, 400:1 to 1:400, 350:1 :1 to 1:350, 300:1 to 1:300, 250:1 to 1:250, 200:1 to 1:200, 150:1 to 1:150, 100:1 to 1:100, 80:1 to 1:80, 60:1 to 1:60, 40:1 to 1:40, 20:1 to 1:20, 10:1 to 1:10, 8:1 to 1:8, 6:1 to 1 :6, 4:1 to 1:4, or 2:1 to 1:2, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutically acceptable carriers are those commonly used in the preparation of preparations and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, and microcrystalline cellulose. , polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, etc., but are not limited thereto. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the pharmaceutical composition may further include, but is not limited to, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, etc. , but is not limited to this.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be about 0.0001 to 1000 ⁇ g (microgram), about 0.001 to 1000 ⁇ g, about 0.01 to 1000 ⁇ g, about 0.1 to 1000 ⁇ g, or about 1.0 to 1000 ⁇ g per day, but is limited thereto. It may be administered in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity.
  • the pharmaceutical composition is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art to which the invention pertains. It can be manufactured by placing it in a multi-capacity container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of ointments, creams, gels, transdermal agents, cataplasms, patches, pastes, extracts, powders, granules, tablets or capsules. and may additionally include a dispersant and/or stabilizer.
  • the peptide may be contained in nanosomes or nanoparticles to further improve skin penetration or stability problems.
  • the nanosomes can be manufactured with a microfluidizer using lecithin as a raw material and can be contained in lecithin particles. Any method for producing the nanosomes can be used as long as it is known.
  • the size of the nanosome particles is preferably about 30 to 200 nm. If the size of the nanosome particles is less than about 30 nm, skin penetration progresses very quickly and skin side effects may occur, and if it exceeds about 200 nm, skin penetration is not easy to achieve the effect of using the nanosome structure. It can be difficult.
  • Another aspect provides a method of preventing or treating cartilage disease, comprising administering to an individual a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition containing a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient. do.
  • applying As used herein, the terms “applying,” “administering,” and “applying” are used interchangeably and refer to at least partial localization of a composition to a desired area, or route of administration, according to one embodiment. This may mean disposing the composition according to one embodiment into an object.
  • Another aspect provides a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the cosmetic composition contains a cosmetically effective amount of the peptide; and/or may include a cosmetically acceptable carrier, but are not limited thereto.
  • Another aspect provides a method of regenerating cartilage, comprising administering to a subject a composition containing a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the peptide exhibits an excellent cartilage regeneration effect by significantly increasing various cartilage components such as glycosaminoglycan, collagen, COMP, and aggrecan.
  • the peptide can be applied to prevent or treat cartilage diseases and promote cartilage regeneration by significantly increasing various cartilage components such as glycosaminoglycan, collagen, COMP, and aggrecan.
  • Figure 1 shows the results of confirming the cytotoxicity of Peptide-1 to human adipose-derived mesenchymal stem cells (AD-MSC) (a: microscopic image after SRB staining; b: CCK-8 activity test results graph).
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • Figure 2 shows the results confirming the cytotoxicity of Peptide-2 to AD-MSC (a: microscopic image after SRB staining; b: graph of CCK-8 activity test results).
  • Figure 3 shows the results confirming the increase in glycosaminoglycan production after treating AD-MSC with Peptide-1.
  • Figure 4 shows the results confirming the increase in glycosaminoglycan production after treating AD-MSC with Peptide-2.
  • Figure 5 shows the increase in mRNA expression of ECM (extracellular matrix) components after treating AD-MSC with Peptide-1, after 3 days of culture (a), after 7 days of culture (b), and after 14 days of culture (c). This is the result of checking.
  • Figure 6 shows the results confirming the increase in mRNA expression of ECM components after treating AD-MSC with Peptide-2, after 3 days of culture (a), after 7 days of culture (b), and after 14 days of culture (c). .
  • Figure 7 shows the results confirming the increase in expression of the SOX9 gene, an ECM regulator, after treating AD-MSC with Peptide-1.
  • FIG 8 shows the increase in expression of the SOX9 gene, an ECM regulator, after treating AD-MSC with Peptide-2, after 3 days of culture (a), after 7 days of culture (b), and after 14 days of culture (c). This is the confirmed result.
  • Figure 9 shows ECM regulators SOX5, SOX6, and SOX9 proteins after 3 days of culture (a), 7 days of culture (b), and 14 days of culture (c) after treating AD-MSC with Peptide-1. This is a result of confirming the increase in expression.
  • Figure 10 shows ECM regulators SOX5, SOX6, and SOX9 proteins after 3 days of culture (a), 7 days of culture (b), and 14 days of culture (c) after treating AD-MSC with Peptide-2. This is a result of confirming the increase in expression.
  • Figure 11 shows the expression of aggrecan and COL2A1, which are cartilage components, after treating AD-MSC with Peptide-1, 3 days after culture (a), 7 days after culture (b), and 14 days after culture (c). This is the result of confirming the increase.
  • Figure 12 shows the expression of cartilage components aggrecan and COL2A1 after treating AD-MSC with Peptide-2, 3 days after culture (a), 7 days after culture (b), and 14 days after culture (c). This is the result of confirming the increase.
  • Peptide-1 or Peptide-2 listed in Table 1 below was synthesized using an automatic peptide synthesizer (Milligen 9050, Millipore, USA), and these were synthesized using C18 reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) (Waters Associates, USA). The synthesized peptide was purified and isolated. The column used was ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 mm x 100 mm, 1.7 ⁇ m, Waters Co, USA).
  • AD-MSC Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell
  • AD-MSCs were seeded in a 96-well plate at a concentration of about 1.5 x 10 3 cells/well and then cultured in DMEM medium (about 10% FBS + DMEM medium) for about 24 hours. Afterwards, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS, and treated with Peptide-1 or Peptide-2 at different concentrations (about 1, 10, 30, 50, 100, or 200 ⁇ g/ml). After that, about every 3 days, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS, and Peptide-1 or Peptide-2 was added at different concentrations (about 1, 10, 30, 50, 100, or 200 ⁇ g/ml). Processed.
  • CCK-8 Dojindo, CCK-8 kit
  • the culture medium was sampled and the absorbance was measured at a wavelength of about 450 nm using a microplate reader. After measuring the absorbance, the medium from the culture medium in the 96-well plate was removed, and about 60 ⁇ l of 3.7% formalin was added to the 96-well plate to immobilize the cells for about 1 minute.
  • SRB staining solution about 0.2 g of Sulforhodamine B sodium salt (sigma, S9012) dissolved in about 100 ml of double distilled water
  • SRB staining solution about 0.2 g of Sulforhodamine B sodium salt (sigma, S9012) dissolved in about 100 ml of double distilled water
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • AD-MSCs were seeded in a 96-well plate at a concentration of about 1.5 x 10 3 cells/well and then cultured in DMEM medium (about 10% FBS + DMEM medium) for about 24 hours. Afterwards, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS, and Peptide-1 or Peptide-2 was added at different concentrations (Peptide-1: about 30, 50, 100, or 200 ⁇ g/ml; Peptide-2: approximately 50, 100, or 200 ⁇ g/ml).
  • the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS, and Peptide-1 or Peptide-2 was added at different concentrations (Peptide-1: about 30, 50, 100, or 200 ⁇ g/ml; Peptide-2: approximately 50, 100, or 200 ⁇ g/ml) was treated.
  • Peptide-1 about 30, 50, 100, or 200 ⁇ g/ml
  • Peptide-2 approximately 50, 100, or 200 ⁇ g/ml
  • Alcian blue staining solution (about 50 ml of about 3% acetic acid + about 0.5 g of about 1% Alcian blue 8GX; pH 2.5) was added to the fixed cells, and then about 37 Cells were stained by culturing for about 24 hours at a temperature of °C. After cell staining, the staining solution was removed, and the cells were washed with distilled water and dried. The dried cells were observed through a microscope.
  • Peptide-1 and Peptide-2 can promote cartilage differentiation of stem cells or increase the ECM production ability of stem cells to promote cartilage formation or regeneration.
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • AD-MSCs were seeded in a 96-well plate at a concentration of about 1.5 x 10 3 cells/well and then cultured in DMEM medium (about 10% FBS + DMEM medium) for about 24 hours. Afterwards, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS, and treated with Peptide-1 or Peptide-2 at different concentrations (about 30, 50, or 100 ⁇ g/ml). After that, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS every three days, and treated with Peptide-1 or Peptide-2 at different concentrations (about 30, 50, or 100 ⁇ g/ml).
  • the primers used are shown in Table 2 below.
  • Peptide-1 and Peptide-2 can promote cartilage differentiation of stem cells or increase the ECM production ability of stem cells to promote cartilage formation or regeneration.
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • AD-MSCs were seeded in a 96-well plate at a concentration of about 1.5 x 10 3 cells/well and then cultured in DMEM medium (about 10% FBS + DMEM medium) for about 24 hours. Afterwards, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS, and treated with Peptide-1 or Peptide-2 at different concentrations (about 30, 50, or 100 ⁇ g/ml). After that, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS every three days, and treated with Peptide-1 or Peptide-2 at different concentrations (about 30, 50, or 100 ⁇ g/ml).
  • Peptide-1 and Peptide-2 can promote cartilage differentiation of stem cells or increase the ECM production ability of stem cells to promote cartilage formation or regeneration.
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • AD-MSCs were seeded in a 96-well plate at a concentration of about 1.5 x 10 3 cells/well and then cultured in DMEM medium (about 10% FBS + DMEM medium) for about 24 hours. Afterwards, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS, and treated with Peptide-1 or Peptide-2 at different concentrations (about 30, 50, or 100 ⁇ g/ml). After that, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS every three days, and treated with Peptide-1 or Peptide-2 at different concentrations (about 30, 50, or 100 ⁇ g/ml).
  • the medium was removed from the culture medium in a 96-well plate, and the cells were collected.
  • the cell lysate obtained by lysing the collected cells was subjected to Western blotting. It was analyzed by blotting).
  • SOX5-antibody (Santa Cruz, sc-293215, USA)
  • SOX6-antibody (Santa Cruz, sc-393314, USA)
  • SOX9-antibody Cell Signaling, 82630S, USA
  • Peptide-1 and Peptide-2 can promote cartilage differentiation of stem cells or increase the ECM production ability of stem cells to promote cartilage formation or regeneration.
  • AD-MSC adipose-derived mesenchymal stem cells
  • AD-MSCs were seeded in a 96-well plate at a concentration of about 1.5 x 10 3 cells/well and then cultured in DMEM medium (about 10% FBS + DMEM medium) for about 24 hours. Afterwards, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS, and treated with Peptide-1 or Peptide-2 at different concentrations (about 30, 50, or 100 ⁇ g/ml). After that, the medium was replaced with DMEM medium containing about 5% FBS every three days, and treated with Peptide-1 or Peptide-2 at different concentrations (about 30, 50, or 100 ⁇ g/ml).
  • the medium was removed from the culture medium in a 96-well plate, and the cells were collected.
  • the cell lysate obtained by lysing the collected cells was subjected to Western blotting. It was analyzed by blotting).
  • COL2A1-antibody (Santa Cruz, sc-518017, USA) and Aggrecan-antibody (Santa Cruz, sc-33695, USA) were used.
  • Peptide-1 and Peptide-2 can promote cartilage differentiation of stem cells or increase the ECM production ability of stem cells to promote cartilage formation or regeneration.
  • Example 1 50 mg of the peptide of Example 1 was dissolved in 500 ml of distilled water by sufficiently stirring. After mixing the mixture solution with 5 g of lecithin, 0.3 ml of sodium oleate, 50 ml of ethanol, and a little oil phase, adjust the amount with distilled water so that the total amount is 1 L, and then use a microfluidizer. Peptide nanosomes with a size of about 100 nm were prepared by emulsifying them using high pressure.
  • tablets are manufactured by compressing them according to a typical tablet manufacturing method.
  • Capsules are prepared by mixing the following ingredients and filling them into gelatin capsules according to a typical capsule manufacturing method.
  • each ingredient is added and dissolved in purified water, the following ingredients are mixed, purified water is added to adjust the total to 100 ml, and then filled into a brown bottle and sterilized to prepare the liquid.

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 출원은 연골 재생 효과를 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 연골 재생용 조성물, 및 상기 연골 재생용 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
본 발명은 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 특허출원은 2022년 12월 09일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0171936호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
연골 조직의 특성상 넓은 면적이 손상된 경우 자연 치유에 의한 조직 재생이 어렵기 때문에 인공관절, 관절연골 성형술, 미세천공술 등의 외과적 수술을 통한 치료가 이루어져 왔다. 하지만 기존의 방법은 절개로 인한 흉터가 남으며, 내구성이 떨어지는 섬유 연골로의 재생을 초래하는 경우가 많아, 어려운 시술방법에 비해 치료 효과가 떨어지는 문제점을 가지고 있다.
따라서, 수술 과정이 간편하고 빠른 치료 효과를 나타내는, 하이드로겔, 콜라겐 등을 이용한 관절내 투여용 주사액 또는 연골 조직 수복용 조성물 등이 개발되었다 (대한민국 공개특허공보 제2013-0028012호). 그러나 상기 방법은 일시적인 통증 감소는 줄 수 있지만, 연골 조직으로의 재생 유도에는 부족한 점이 있다.
또한, 세포를 이용한 치료법의 경우, 체외에서 배양된 세포를 다시 결손 부위에 이식하여 연골 조직의 재생을 유도하는 방법으로서 자가연골세포 또는 줄기세포 등을 이용한 다양한 치료 방법이 개발되었다 (대한민국 공개특허공보 제2013-0072983호). 하지만 자가연골세포 치료제의 경우, 손상된 부위가 클 때 환자로부터 채취하여 배양된 세포만으로는 치료에 한계가 있으며, 줄기세포 치료제의 경우, 채취 부위에 따른 세포 수와 분화능의 차이, 체외 배양시 세포의 탈분화로 인한 세포 표현형의 변화, 체내 이식 후 연골세포로의 낮은 분화율과 세포 비후와 관련된 유전자 발현으로 세포 사멸과 함께 혈관 침투 유발로 연골세포의 석회화를 초래하는 등의 문제점이 있다.
이러한 기술적 배경 하에, 줄기세포 또는 연골세포의 연골 분화 또는 연골 형성을 촉진시킴으로써, 보다 효과적인 연골-손상 질환의 치료를 가능하게 하는 유효 인자의 개발이 요구되고 있으며, 아직은 미비한 실정이다.
상기한 바와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명의 발명자들은, 신규 펩타이드를 개발하였고, 상기 신규 펩타이드는 글리코사미노글리칸, 콜라겐, COMP, 아그레칸 등의 다양한 연골 성분들을 유의하게 증가시킴으로써, 연골 질환을 예방 또는 치료하고 연골 재생을 촉진시키는데 유용하게 활용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 연골 재생용 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
일 양상은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미할 수 있다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술 또는 액상 합성 기술 (US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다. 본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 펩타이드를 개발하고자 예의 노력한 결과, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 규명하였다. 여기서, 상기 생물학적으로 유효한 활성은 (a) 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 생성 유도; (b) COL2A1(Collagen type II Alpha 1), COL11A1(Collagen type XI Alpha 1), COMP(Cartilage oligomeric matrix protein), PCP(proteoglycan coreprotein) 또는 아그레칸(aggrecan) 생성 유도; 및 (c) 조절인자 SOX5(Sex determining region Y-Box Transcription Factor 5), SOX6(Sex determining region Y-Box Transcription Factor 6) 또는 SOX9(Sex determining region Y-Box Transcription Factor 9)의 생성 유도와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것일 수 있다. 따라서, 상기 펩타이드는 연골 재생을 위한 용도로 활용될 수 있다.
상기 펩타이드는 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group), 아릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있고; 및/또는 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group) 및 아자이드(azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 선택적으로, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 펩타이드는 인위적으로 합성되거나(Artificially synthesized), 또는 비-천연 발생 또는 조작(Non-naturally occurring or engineered)된 것이며, 상기 "비-천연 발생 또는 조작"은 자연 상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적인 변형을 가하여 생성된 상태를 의미한다. 여기서, 상기 인위적인 변형은 복수 개의 아미노산 구조를 모방하여 인위적으로 아미노산 서열을 합성하는 것 또는 전술한 바와 같이 화학적 안정성, 강화된 약리 특성, 변경된 특이성, 또는 감소된 항원성을 획득하기 위하여 조작된 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 상기 펩타이드를 보호하는 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "연골 재생"은 손상된 연골조직을 복원하거나 또는 부족한 연골조직의 생성을 유도하여 연골조직을 개선시키는 것일 수 있다. 상기 "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 상기 연골은 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 및 척추 연골로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
종래의 기능성 펩타이드는 유효한 생물학적 활성에도 불구하고 펩타이드 자체의 크기로 인해, 표적 조직 또는 세포에 효과적으로 유입되지 못하거나 반감기가 짧아 단기간에 체내에서 소멸되는 단점을 보여 주었다. 반면, 일 실시예에 따른 연골 재생용 조성물은 약 20개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하며, 이에 따라, 유효성분의 피부 침투율 등이 매우 우수하고, 예를 들어, 국소적으로 투여하는 경우, 유효한 연골 재생 효과를 얻을 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 연골과 관련된 물질인 글리코사미노글리칸, COL2A1, COMP, COL11A1, PCP, 아그레칸, 조절인자 SOX5, SOX6 또는 SOX9의 발현을 유의하게 증가시킬 수 있는 바, 상기 펩타이드는 연골 재생용 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다(Orthop Res Rev. 2010 September 1; 2010(2): 85-94. doi:10.2147/ORR.S7194, JOSPT Volume 28 Number 4 October 1998).
또 다른 양상은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드 또는 조성물에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여로 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "치료"는 질병을 앓거나 또는 질병이 발병할 위험이 있는 개체에게, 상기 개체의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병 진행의 지연, 증상 발생의 지연 또는 증상 진행의 둔화 등을 포함한 효과를 제공하는 임의의 형태의 치료를 의미한다. 따라서, 상기 "치료" 및 "예방"은 증상의 치유 또는 완전한 제거를 의미하도록 의도되지 않는다.
상기 "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "연골 질환"은 연골 분화 또는 재생을 필요로 하는 연골에 관련된 모든 질환을 의미한다. 상기 연골 질환은 연골손상, 연골결손, 퇴행성 추간판 질환, 추간판 탈출증, 퇴행성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상, 골연화증 및 연골연화증으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 연골 질환은 턱 관절, 어깨 관절, 팔꿈치 관절, 팔목 관절, 손가락 관절, 척추 관절, 엉덩이 관절, 무릎 관절, 발목 관절 또는 발가락 관절에서 발생할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 상기 펩타이드의 약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount); 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량"은 상기 약제학적 조성물의 연골 재생 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미할 수 있다.
상기 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체간 중량비는 예를 들어, 500:1 내지 1:500일 수 있으며, 일례로서, 상기 중량비는 450:1 내지 1:450, 400:1 내지 1:400, 350:1 내지 1:350, 300:1 내지 1:300, 250:1 내지 1:250, 200:1 내지 1:200, 150:1 내지 1:150, 100:1 내지 1:100, 80:1 내지 1:80, 60:1 내지 1:60, 40:1 내지 1:40, 20:1 내지 1:20, 10:1 내지 1:10, 8:1 내지 1:8, 6:1 내지 1:6, 4:1 내지 1:4, 또는 2:1 내지 1:2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 제조 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물의 투여량은 1 일당 약 0.0001 내지 1000 μg (마이크로그램), 약 0.001 내지 1000 μg, 약 0.01 내지 1000 μg, 약 0.1 내지 1000 μg, 또는 약 1.0 내지 1000 μg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 투여될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 연고, 크림, 겔, 경피흡수제, 카타플라스마제, 첩부제, 페이스트제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 및/또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 펩타이드는 피부 투과 문제 또는 안정성 문제를 보다 개선시키기 위하여 나노좀 또는 나노파티클에 함유될 수 있다. 예를 들어, 상기 나노좀은 레시틴을 원료로 사용하여 마이크로플루다이져로 제조될 수 있고, 레시틴 입자 내에 함유될 수 있다. 상기 나노좀의 제조 방법은 공지의 것이라면 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다. 상기 나노좀 입자의 크기는 약 30 내지 200 nm인 것이 바람직하다. 상기 나노좀 입자의 크기가 약 30 nm 미만인 경우에는 피부 침투가 매우 빨리 진행되어 피부 부작용이 발생할 수 있고, 약 200 nm를 초과하는 경우에는 피부 침투가 용이하지 않아 나노좀 구조를 사용하는 효과를 얻기 어려울 수 있다.
또 다른 양상은 치료학적 유효량의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 연골 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 펩타이드, 조성물 등에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "적용하는", "투여하는", 및 "도포하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 실시예에 따른 조성물을 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 것, 또는 투여 경로에 의해 개체 내로 일 실시예에 따른 조성물의 배치하는 것을 의미할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드, 조성물 등에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및/또는 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양상은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 연골을 재생시키는 방법을 제공한다.
상기 펩타이드, 조성물 등에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
일 양상에 따른 펩타이드에 의하면, 글리코사미노글리칸, 콜라겐, COMP, 아그레칸 등의 다양한 연골 성분들을 유의하게 증가시킴으로써, 우수한 연골 재생 효과를 나타낸다.
일 양상에 따른 펩타이드에 의하면, 글리코사미노글리칸, 콜라겐, COMP, 아그레칸 등의 다양한 연골 성분들을 유의하게 증가시킴으로써, 연골 질환을 예방 또는 치료하고 연골 재생을 촉진시키는데 적용할 수 있다.
도 1은 Peptide-1의 지방 유래 중간엽 줄기세포 (Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell: AD-MSC)에 대한 세포 독성을 확인한 결과이다 (a: SRB 염색 후 현미경 촬영 이미지; b: CCK-8 활성 테스트 결과 그래프).
도 2는 Peptide-2의 AD-MSC에 대한 세포 독성을 확인한 결과이다 (a: SRB 염색 후 현미경 촬영 이미지; b: CCK-8 활성 테스트 결과 그래프).
도 3은 Peptide-1을 AD-MSC에 처리한 후, 글리코사미노글리칸의 생성 증가를 확인한 결과이다.
도 4는 Peptide-2를 AD-MSC에 처리한 후, 글리코사미노글리칸의 생성 증가를 확인한 결과이다.
도 5는 Peptide-1을 AD-MSC에 처리한 후, 배양 3일 후 (a), 배양 7일 후 (b), 및 배양 14일 후 (c)에 ECM (extracellular matrix) 성분의 mRNA 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 6은 Peptide-2를 AD-MSC에 처리한 후, 배양 3일 후 (a), 배양 7일 후 (b), 및 배양 14일 후 (c)에 ECM 성분의 mRNA 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 7은 Peptide-1을 AD-MSC에 처리한 후, ECM 조절인자인 SOX9 유전자의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 8은 Peptide-2를 AD-MSC에 처리한 후, 배양 3일 후 (a), 배양 7일 후 (b), 및 배양 14일 후 (c)에 ECM 조절인자인 SOX9 유전자의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 9는 Peptide-1을 AD-MSC에 처리한 후, 배양 3일 후 (a), 배양 7일 후 (b), 및 배양 14일 후 (c)에 ECM 조절인자인 SOX5, SOX6 및 SOX9 단백질의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 10은 Peptide-2를 AD-MSC에 처리한 후, 배양 3일 후 (a), 배양 7일 후 (b), 및 배양 14일 후 (c)에 ECM 조절인자인 SOX5, SOX6 및 SOX9 단백질의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 11은 Peptide-1을 AD-MSC에 처리한 후, 배양 3일 후 (a), 배양 7일 후 (b), 및 배양 14일 후 (c)에 연골 성분인 아그레칸 및 COL2A1의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 12는 Peptide-2를 AD-MSC에 처리한 후, 배양 3일 후 (a), 배양 7일 후 (b), 및 배양 14일 후 (c)에 연골 성분인 아그레칸 및 COL2A1의 발현 증가를 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩타이드의 합성
자동 펩타이드 합성기 (Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 하기의 표 1에 기재된 Peptide-1 또는 Peptide-2를 합성하고, C18 역상 고성능액체크로마토그래피 (HPLC) (Waters Associates, 미국)를 이용하여 이들 합성된 펩타이드를 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 ㎜ x 100 ㎜, 1.7 ㎛, Waters Co, 미국)을 이용하였다.
Figure PCTKR2022020647-appb-img-000001
실시예 2. 세포 독성 여부 확인
지방 유래 중간엽 줄기세포 (Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell: AD-MSC)에 Peptide-1 또는 Peptide-2를 처리하여 세포 독성 여부를 확인하였다.
구체적으로, AD-MSC를 약 1.5 x 103 cells/well의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 약 24시간 동안 DMEM 배지 (약 10% FBS + DMEM 배지)에서 배양하였다. 그 후, 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (약 1, 10, 30, 50, 100, 또는 200 μg/ml) 처리하였다. 그 후, 약 3일마다 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (약 1, 10, 30, 50, 100, 또는 200 μg/ml) 처리하였다. 배양 7일 후 배양액의 약 1/10의 양의 CCK-8 (Dojindo, CCK-8 kit) 용액을 배양액에 처리하고, 약 2시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액을 샘플링하여 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 사용하여 약 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 후, 96-웰 플레이트에 담긴 배양액 중 배지를 제거하고, 약 3.7% 포말린 (Formalin) 약 60 μl를 상기 96-웰 플레이트에 첨가하여 약 1분 동안 세포를 고정화하였다. 세포 고정화 후, 상기 포말린을 제거하고, SRB 염색 용액 (Sulforhodamine B sodium salt (sigma, S9012) 약 0.2 g을 약 100 ml의 2차 증류수에 용해함) 약 70 ul를 고정화된 세포에 첨가한 후 빛을 차단한 상태의 상온 조건에서 오버나잇 배양하여 세포를 염색하였다. 세포 염색 후, 약 1% 아세트산을 이용하여 세포를 세척하고 건조하였다. 건조된 세포를 현미경을 통해 관찰하였다. 상기 펩타이드를 처리하지 않은 실험군 (CON) 및 상기 펩타이드 대신에 덱사메타손 약 100 nM, 아스코르브산 약 50 μM, 프롤린 약 40 μM, TGFβ1 약 10 ng/ml, 및 1X ITS를 포함하는 용액을 처리한 실험군 (CM)을 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, Peptide-1 및 Peptide-2 각각을 약 1 내지 200 μg/ml의 농도로 처리하였을 때, 모든 농도에서 세포 형태의 변화가 발생되지 않았고, 세포 독성을 야기하지 않았음을 확인하였다.
실시예 3. 글리코사미노글리칸 생성 효과 확인
Peptide-1 및 Peptide-2의 연골 재생 (chondrogenesis) 효과를 확인하기 위하여, 지방 유래 중간엽 줄기세포 (Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell: AD-MSC)에 Peptide-1 또는 Peptide-2를 처리하여 연골의 구성성분인 세포외기질 (extracellular matrix: ECM)을 구성하는 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan)의 생성이 증가되는지 확인하였다.
구체적으로, AD-MSC를 약 1.5 x 103 cells/well의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 약 24시간 동안 DMEM 배지 (약 10% FBS + DMEM 배지)에서 배양하였다. 그 후, 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (Peptide-1: 약 30, 50, 100, 또는 200 μg/ml; Peptide-2: 약 50, 100, 또는 200 μg/ml) 처리하였다. 그 후, 약 3일마다 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (Peptide-1: 약 30, 50, 100, 또는 200 μg/ml; Peptide-2: 약 50, 100, 또는 200 μg/ml) 처리하였다. 배양 14일 및 21일 후에 96-웰 플레이트에 담긴 배양액 중 배지를 제거하고, 약 3.7% 포말린 약 60 μl를 상기 96-웰 플레이트에 첨가하여 약 1분 동안 세포를 고정화하였다. 세포 고정화 후, 상기 포말린을 제거하고, Alcian blue 염색 용액 (약 3% 아세트산 약 50 ml + 약 1% Alcian blue 8GX 약 0.5 g; pH 2.5) 약 70 ul를 고정화된 세포에 첨가한 후 약 37℃ 온도 조건에서 약 24시간 동안 배양하여 세포를 염색하였다. 세포 염색 후, 상기 염색 용액을 제거하고, 3차 증류수로 세포를 세척하고 건조하였다. 건조된 세포를 현미경을 통해 관찰하였다. 상기 펩타이드를 처리하지 않은 실험군 (CON) 및 상기 펩타이드 대신에 덱사메타손 약 100 nM, 아스코르브산 약 50 μM, 프롤린 약 40 μM, TGFβ1 약 10 ng/ml, 및 1X ITS를 포함하는 용액을 처리한 실험군 (CM)을 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, AD-MSC에 Peptide-1 또는 Peptide-2를 처리하는 경우, 처리된 펩타이드의 농도 의존적으로 글리코사미노글리칸의 생성이 증가될 수 있고, 이로 인해, 연골의 구성성분인 ECM의 생성이 촉진될 수 있음을 확인하였다. 이로 인해, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 연골의 형성 또는 재생을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.
이러한 결과는, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 줄기세포의 연골 분화를 촉진시키거나, 줄기세포의 ECM 생성능을 증가시켜 연골의 형성 또는 재생을 촉진시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 4. ECM 성분의 mRNA 발현 증가 확인
Peptide-1 및 Peptide-2의 연골 재생 (chondrogenesis) 효과를 확인하기 위하여, 지방 유래 중간엽 줄기세포 (Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell: AD-MSC)에 Peptide-1 또는 Peptide-2를 처리하여 연골의 구성성분인 세포외기질 (extracellular matrix: ECM)의 생성과 관련된 유전자인 COL2A1 (Collagen type II Alpha 1), COL11A1 (Collagen type XI Alpha 1), COMP (Cartilage oligomeric matrix protein), PCP (proteoglycan core protein), 및 ACAN (aggrecan) 유전자의 발현이 증가되는지 확인하였다.
구체적으로, AD-MSC를 약 1.5 x 103 cells/well의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 약 24시간 동안 DMEM 배지 (약 10% FBS + DMEM 배지)에서 배양하였다. 그 후, 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (약 30, 50, 또는 100 μg/ml) 처리하였다. 그 후, 약 3일마다 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (약 30, 50, 또는 100 μg/ml) 처리하였다. 배양 3일 후, 7일 후, 및 14일 후에 각각 96-웰 플레이트에 담긴 배양액 중 배지를 제거하고 세포를 수집하였고, 수집된 세포로부터 RNA를 분리하였다. cDNA 합성 키트 (Intron, Korea)를 사용하여 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성한 후, hCOL2A1, hCOMP, hCOL11A1, hPCP, 및 hACAN의 프라이머와 PCR pre-mix (Intron, Korea)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다. 상기 펩타이드를 처리하지 않은 실험군 및 상기 펩타이드 대신에 덱사메타손 약 100 nM, 아스코르브산 약 50 μM, 프롤린 약 40 μM, TGFβ1 약 10 ng/ml, 및 1X ITS를 포함하는 용액을 처리한 실험군 (CM)을 대조군으로 사용하였다.
Figure PCTKR2022020647-appb-img-000002
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, AD-MSC에 Peptide-1을 처리하는 경우, 처리된 펩타이드의 농도 의존적으로 연골의 구성성분인 ECM의 생성과 관련된 유전자인 COL2A1, COMP, 및 COL11A1 유전자의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, AD-MSC에 Peptide-2를 처리하는 경우, 처리된 펩타이드의 농도 의존적으로 연골의 구성성분인 ECM의 생성과 관련된 유전자인 COL2A1, COMP, COL11A1, PCP, 및 ACAN 유전자의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 이로 인해, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 연골의 구성성분인 ECM의 생성을 촉진시킬 수 있고, 그 결과 연골의 형성 또는 재생을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.
이러한 결과는, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 줄기세포의 연골 분화를 촉진시키거나, 줄기세포의 ECM 생성능을 증가시켜 연골의 형성 또는 재생을 촉진시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 5. ECM 조절인자 SOX9의 mRNA 발현 유도 효과 확인
Peptide-1 및 Peptide-2의 연골 재생 (chondrogenesis) 효과를 확인하기 위하여, 지방 유래 중간엽 줄기세포 (Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell: AD-MSC)에 Peptide-1 또는 Peptide-2를 처리하여 연골의 구성성분인 세포외기질 (extracellular matrix: ECM)의 생성을 조절하는 유전자인 SOX9 (Sex determining region Y-Box Transcription Factor 9) 유전자의 발현이 증가되는지 확인하였다.
구체적으로, AD-MSC를 약 1.5 x 103 cells/well의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 약 24시간 동안 DMEM 배지 (약 10% FBS + DMEM 배지)에서 배양하였다. 그 후, 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (약 30, 50, 또는 100 μg/ml) 처리하였다. 그 후, 약 3일마다 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (약 30, 50, 또는 100 μg/ml) 처리하였다. 배양 3일 후, 7일 후, 및 14일 후에 각각 96-웰 플레이트에 담긴 배양액 중 배지를 제거하고 세포를 수집하였고, 수집된 세포로부터 RNA를 분리하였다. cDNA 합성 키트 (Intron, Korea)를 사용하여 분리된 RNA로부터 cDNA를 합성한 후, hSOX9의 프라이머와 PCR pre-mix (Intron, Korea)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다. 상기 펩타이드를 처리하지 않은 실험군 및 상기 펩타이드 대신에 덱사메타손 약 100 nM, 아스코르브산 약 50 μM, 프롤린 약 40 μM, TGFβ1 약 10 ng/ml, 및 1X ITS를 포함하는 용액을 처리한 실험군 (CM)을 대조군으로 사용하였다.
Figure PCTKR2022020647-appb-img-000003
그 결과, 도 7 및 8에 나타낸 바와 같이, AD-MSC에 Peptide-1 또는 Peptide-2를 처리하는 경우, 처리된 펩타이드의 농도 의존적으로 연골의 구성성분인 ECM의 생성을 조절하는 유전자인 SOX9 유전자의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 이로 인해, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 연골의 구성성분인 ECM의 생성을 촉진시킬 수 있고, 그 결과 연골의 형성 또는 재생을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.
이러한 결과는, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 줄기세포의 연골 분화를 촉진시키거나, 줄기세포의 ECM 생성능을 증가시켜 연골의 형성 또는 재생을 촉진시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 6. ECM 조절인자 SOX5, SOX6 및 SOX9의 발현 유도 효과 확인
Peptide-1 및 Peptide-2의 연골 재생 (chondrogenesis) 효과를 확인하기 위하여, 지방 유래 중간엽 줄기세포 (Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell: AD-MSC)에 Peptide-1 또는 Peptide-2를 처리하여 연골의 구성성분인 세포외기질 (extracellular matrix: ECM)의 조절과 관련된 SOX5 (Sex determining region Y-Box Transcription Factor 5), SOX6 (Sex determining region Y-Box Transcription Factor 6), 및 SOX9 (Sex determining region Y-Box Transcription Factor 9) 단백질의 발현이 증가되는지 확인하였다.
구체적으로, AD-MSC를 약 1.5 x 103 cells/well의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 약 24시간 동안 DMEM 배지 (약 10% FBS + DMEM 배지)에서 배양하였다. 그 후, 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (약 30, 50, 또는 100 μg/ml) 처리하였다. 그 후, 약 3일마다 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (약 30, 50, 또는 100 μg/ml) 처리하였다. 배양 3일 후, 7일 후, 및 14일 후에 각각 96-웰 플레이트에 담긴 배양액 중 배지를 제거하고 세포를 수집하였고, 수집된 세포를 용해시켜 얻어진 세포 용해물 (lysate)을 웨스턴 블롯팅 (Western blotting)하여 분석하였다. 분석을 위해 SOX5-항체 (Santa Cruz, sc-293215, USA), SOX6-항체 (Santa Cruz, sc-393314, USA), 및 SOX9-항체 (Cell Signaling, 82630S, USA)를 사용하였다. 상기 펩타이드를 처리하지 않은 실험군 및 상기 펩타이드 대신에 덱사메타손 약 100 nM, 아스코르브산 약 50 μM, 프롤린 약 40 μM, TGFβ1 약 10 ng/ml, 및 1X ITS를 포함하는 용액을 처리한 실험군 (CM)을 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, AD-MSC에 Peptide-1 또는 Peptide-2를 처리하는 경우, 처리된 펩타이드의 농도 의존적으로 연골의 구성성분인 ECM의 조절과 관련된 SOX5, SOX6, 및 SOX9 단백질의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 이로 인해, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 연골의 구성성분인 ECM의 생성을 촉진시킬 수 있고, 그 결과 연골의 형성 또는 재생을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.
이러한 결과는, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 줄기세포의 연골 분화를 촉진시키거나, 줄기세포의 ECM 생성능을 증가시켜 연골의 형성 또는 재생을 촉진시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 7. 아그레칸 및 COL2A1의 발현 촉진 효과 확인
Peptide-1 및 Peptide-2의 연골 재생 (chondrogenesis) 효과를 확인하기 위하여, 지방 유래 중간엽 줄기세포 (Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell: AD-MSC)에 Peptide-1 또는 Peptide-2를 처리하여 연골의 구성성분인 세포외기질 (extracellular matrix: ECM)을 구성하는 COL2A1 (Collagen type II Alpha 1) 및 Aggrecan 단백질의 발현이 증가되는지 확인하였다.
구체적으로, AD-MSC를 약 1.5 x 103 cells/well의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후, 약 24시간 동안 DMEM 배지 (약 10% FBS + DMEM 배지)에서 배양하였다. 그 후, 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (약 30, 50, 또는 100 μg/ml) 처리하였다. 그 후, 약 3일마다 배지를 약 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, Peptide-1 또는 Peptide-2를 농도별로 (약 30, 50, 또는 100 μg/ml) 처리하였다. 배양 3일 후, 7일 후, 및 14일 후에 각각 96-웰 플레이트에 담긴 배양액 중 배지를 제거하고 세포를 수집하였고, 수집된 세포를 용해시켜 얻어진 세포 용해물 (lysate)을 웨스턴 블롯팅 (Western blotting)하여 분석하였다. 분석을 위해 COL2A1-항체 (Santa Cruz, sc-518017, USA) 및 Aggrecan-항체 (Santa Cruz, sc-33695, USA)를 사용하였다. 상기 펩타이드를 처리하지 않은 실험군 및 상기 펩타이드 대신에 덱사메타손 약 100 nM, 아스코르브산 약 50 μM, 프롤린 약 40 μM, TGFβ1 약 10 ng/ml, 및 1X ITS를 포함하는 용액을 처리한 실험군 (CM)을 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 11 및 12에 나타낸 바와 같이, AD-MSC에 Peptide-1 또는 Peptide-2를 처리하는 경우, 처리된 펩타이드의 농도 의존적으로 연골의 구성성분인 ECM을 구성하는 COL2A1 및 Aggrecan 단백질의 발현이 증가되었음을 확인하였다. 이로 인해, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 연골의 구성성분인 ECM의 생성을 촉진시킬 수 있고, 그 결과 연골의 형성 또는 재생을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.
이러한 결과는, Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 줄기세포의 연골 분화를 촉진시키거나, 줄기세포의 ECM 생성능을 증가시켜 연골의 형성 또는 재생을 촉진시킬 수 있음을 시사한다.
상기 실험 결과를 종합하면, 일 실시예에 따른 Peptide-1 및 Peptide-2 각각은 모두 연골 재생을 유도하는 효과를 지니고 있음을 알 수 있었다.
제형예 1. 펩타이드 나노좀의 제조
상기 실시예 1의 펩타이드 50 mg을 증류수 500 ml로 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트 (sodium oleate) 0.3 ml, 에탄올 50 ml 그리고 약간의 유상과 함께 혼합한 후， 총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞춰 준 다음， 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 펩타이드 나노좀을 제조하였다.
제형예 2. 약학적 제제
2-1. 산제의 제조
하기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
본 발명의 펩타이드 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
2-2. 정제의 제조
하기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
본 발명의 펩타이드 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
2-3. 캡슐제의 제조
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 하기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
본 발명의 펩타이드 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
2-4. 주사제의 제조
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 하기의 성분 함량으로 제조한다.
본 발명의 펩타이드 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·2H2O 26 mg
2-5. 액제의 제조
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 하기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100 ml로 조절한 후, 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
본 발명의 펩타이드 10 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group), 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group), 아릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol: PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것인, 펩타이드.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드의 C-말단은 아미노기(amino group, -NH2), 삼차 알킬기(tertiary alkyl group), 및 아자이드(azide, -NHNH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 보호기와 결합된 것인, 펩타이드.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드는 하기와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것인, 펩타이드:
    (a) 글리코사미노글리칸 생성 유도;
    (b) COL2A1, COMP, COL11A1, PCP 또는 아그레칸 생성 유도; 및
    (c) SOX5, SOX6 또는 SOX9의 생성 유도.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 재생용 조성물.
  6. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 연골 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 펩타이드는 나노좀의 형태로 제형화된 것인, 약제학적 조성물.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 연골 질환은 연골손상, 연골결손, 퇴행성 추간판 질환, 추간판 탈출증, 퇴행성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상, 골연화증 및 연골연화증으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 약제학적 조성물.
PCT/KR2022/020647 2022-12-09 2022-12-16 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도 WO2024122726A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220171936A KR20240086941A (ko) 2022-12-09 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
KR10-2022-0171936 2022-12-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024122726A1 true WO2024122726A1 (ko) 2024-06-13

Family

ID=91379488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/020647 WO2024122726A1 (ko) 2022-12-09 2022-12-16 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024122726A1 (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019103203A1 (ko) 신규 펩티드 및 이를 포함한 조성물
CN101370821B (zh) 新型肽及其用途
KR101368607B1 (ko) 메타스틴 유도체 및 그의 용도
WO2020171285A1 (ko) 대기오염물질에 의한 피부 손상 방지 및 항노화용 펩타이드와 이의 용도
WO2019177312A1 (ko) 염증 감소능 및 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 촉진능을 가지는 이중 기능성 펩타이드 및 이의 용도
WO2022215946A1 (ko) 세포 투과성 펩타이드 변이체 및 이의 용도
CN102482323B (zh) 新型肽及其应用
WO2021206328A1 (ko) 신규 재조합 엑소좀 및 그의 용도
WO2024122726A1 (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2024122727A1 (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2024122720A1 (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2024122721A1 (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2023027317A1 (ko) 편도 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 근육 감소 관련 질환 치료용 조성물
WO2024122717A1 (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2024122716A1 (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2024122718A1 (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2024122719A1 (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2024122723A1 (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2024122722A1 (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도
WO2022015106A1 (ko) 종양괴사인자-자극된 유전자 6을 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2021107473A1 (ko) 온도안정성 및 단백질 분해효소 저항성을 향상시킨 fgf2 폴리펩타이드 및 그 용도
EP1267916B1 (de) Arzneimittel enthaltend tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (timp-2) als osteoanabol wirksame substanz
CN114805489A (zh) 一类用于修复皮肤损伤或黏膜损伤的多肽及其应用
WO2020138674A1 (ko) 근육 이완용 조성물
KR20240086941A (ko) 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도