KR100952891B1

KR100952891B1 - 광분해성 올리고머를 이용한, 복수의 생체분자에 대한신호의 동시 검출 방법

Info

Publication number: KR100952891B1
Application number: KR1020070132593A
Authority: KR
Inventors: 홍효봉; 정명애; 정상돈; 윤형중
Original assignee: 한국전자통신연구원
Priority date: 2007-12-17
Filing date: 2007-12-17
Publication date: 2010-04-16
Also published as: KR20090065139A

Abstract

본 발명은 광분해성 올리고머를 이용한, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해, 미량으로 존재하는 복수의 표적생체분자들에 대한 신호의 동시 검출에 있어, 상기 표적생체분자들을 포획하고, 상기 포획한 표적생체분자 각각에 대해 길이 및 염기 서열 중 하나 이상이 상이한 표적생체분자 식별용 광분해성 올리고머가 표지된 나노 입자를 결합시킨 후, 광조사하여 분리한 상기 올리고머를 동시에 분석 기기에 적용하고 이로써 복수의 표적생체분자에 대한 신호를 동시에 획득할 수 있음에 따라, 표적생체분자 자체가 아닌 이에 선택적인 올리고머로써 신호를 획득함에 따른 분석 시료의 안정성 및 수득 데이터의 높은 신뢰성, 또한 미량의 시료에 대한 검출 신호의 증폭 효과를 갖는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법이 제공된다.

광분해성 올리고머, 생체분자, 신호

Description

광분해성 올리고머를 이용한, 복수의 생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법 {HIGH THROUGHPUT SIGNAL DETECTING METHOD FOR MULTIPLE BIOMOLECULES USING PHOTOLYTIC OLIGOMERS}

본 발명은 광분해성 올리고머를 이용한, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 정보통신부 및 정보통신연구진흥원의 IT원천기술개발사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다[과제관리번호: 2006-S-074-02, 과제명: 나노 입자를 이용한 고성능 바이오 센서 시스템].

미량의 생체 물질을 검출, 분석하는 것은 생명공학, 화학공학 및 의학 등 바이오 기술이 사용되는 분야에 있어서 매우 중요한 일이다.

그 중 DNA 분석의 경우, 그 자체가 단백질보다 매우 안정적이어서 분리 및 분석하기에 용이한 점이 있으며, 또한 1980년대에 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)이 고안된 후 특정 DNA의 일부를 손쉽게 증폭할 수 있게 되어 목표 유전자에 대한 연구가 손쉽게 되었다.

그러나, 단백질의 경우는 고유의 아미노산 서열뿐만 아니라 3차원적 또는 4차원적 구조를 이룰 때에서야 비로소 단백질 고유의 특성을 갖게 되고, 질병의 원 인이 되는 단백질의 경우는 구조의 변화 시 활성을 가지게 되는 경우가 있어, DNA와 같이 증폭하여 분석하거나 동시에 분석하는 일이 매우 힘든 실정이다. 특히, DNA 비해 안전성이 상대적으로 약한 단백질의 경우, 이의 보관 중이나 심지어는 분석 중에 완충액의 농도나 온도에 따라 활성이 바뀌어버리는 문제점이 발생하기도 한다.

생체 내 미량의 단백질, 일례로서 정상적인 생물 유체 내에 존재하는 자유 사이토카인(cytokine) 또는 케모카인(kemokine)의 농도를 분석하는 방법 중 가장 광범위하게 사용되는 ELISA의 경우, 항원과 1차 항체는 동일 몰 비로 결합하며, 검출 한계가 약 6 피코몰(picomole)인 것으로 알려져 있다. 따라서, 통상적인 효소결합면역흡착분석법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)으로는 정상적인 인간 혈장 내의 인터루킨-8(IL-8)을 검출할 수 없다고 알려져 있다. 또한, 상기 ELISA는 항원 및 1차 항체의 결합 여부를, 서양고추냉이 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase, HRP) 등과 같은 별도의 효소 또는 발광 물질등이 표지(labeling)된 2차 항체를 사용하여, 전기적인 신호나 광신호를 획득하여 분석한다. 상기와 같은 별도의 효소 또는 발광 물질 등을 표지(labeling)한 2차 항체를 사용하는 경우, 분석에 필요한 시간 및 비용이 상승하고, 사용하는 물질들이 생체 물질들이기 때문에 보관 시간 및 방법에 따라 분석 결과가 다르게 나타나는 단점이 존재한다. 또한, 단백질이 극미량(일반적으로 femto mole/ml 미만) 존재하는 경우는 직접적인 분석이 불가능하므로 추가적으로 시료를 더 많이 확보하고, 크로마토그래피(chromatography) 방법 등을 사용하여 시료의 농도를 높여 분석하고 있으며, 이 를 위해 인력 및 시간 등이 소요되는 단점이 있다. 또한, 상기의 ELISA를 포함하는 대부분의 단백질 분석 방법은 반응 과정 중 분석하고자 하는 단백질 자체가 변성되어, 반응을 거친 단백질에 대한 추가적인 분석은 이론적으로 거의 불가능하다고 할 수 있다.

상기와 같은 검출 한계의 극복을 위한 시도의 일례로서, 나노입자 기재의 바이오-바코드(bio-bar-code) DNA를 이용하여 증폭된 신호를 확보하고자 한 바가 개시된 바 있다 (Nam JM et al ., Science, 2003; 301: 1884). 그러나, 상기 선행기술은 바이오-바코드 DNA의 분리와 결합에 융해 온도(Tm)를 이용해야 하므로 시스템 전체의 온도를 상승, 하강시켜야 하는 필요가 발생하며, 이로 인해 항원-항체 반응에 의한 결합이 붕괴될 수 있다. 또한, 금 자성입자에 결합하는 분자로는 설프하이드릴기(-SH)를 갖는 물질에 한정되므로, 유연한 운용이 어렵다.

혈액이나 생체 시료 중에 포함되어 있는 다양한 종류의 특정 단백질(바이오마커)을 분석하는 방법중에서 현재까지 가장 널리 사용되고 있는 방법은 ELISA, 질량분석법(Mass spectrometry), 화학적 발색 또는 형광 분석방법 등이 있다. 또한 이러한 방법들을 응용하여 한꺼번에 많은 수의 바이오마커를 분석할 수 있는(HIGH THROUGHTPUT ANALYSIS) DNA 칩, 단백질칩, 시스템온칩(System on Chip, SoC), 랩온어칩(Lab on a Chip, LoC) 등의 기술들이 개발되어 왔다. 그러나, 이들 기술은 효과적인 반면, 대부분 발광(형광)을 이용한 분석 방법이므로 발광(형광) 유무(on/off)로서의 검출은 쉽지만, 색이나 발광의 정도를 분석하는 것은 장비의 상태나 분석자의 주관에 많이 의존하고 있는 실정이라, 정량화가 매우 어렵다는 단점 을 가지고 있다. 상기 기술을 위한 장치는 그 자체의 개발 면에서는 눈부시게 발전해왔으나, 이들 장치에 적용하는 실제 혈액 또는 체액 등의 시료로부터 다양한 종류의 표적분자들을 선택적으로 분리하는 방법적인 부분에 대해서는 상대적으로 개발 속도가 느린 실정이다. 즉, 실제 시료에 포함되어 있는 방해 물질(지질, 탄수화물, 복수의 유/무기질) 등을 제거하는데 걸리는 시간, 비용 및 노력이 많이 들고, 분리하는 단계가 매우 복잡하기 때문에, 동시에 여러 표적을 분석하기는 어려운 실정이다.

상기한 방법을 이용하여 다수의 생체 물질을 동시에 검출하고자 하는 경우, 각각 다른 색상으로 발광하는 다수의 형광 표지가 필요하게 된다. 그런데, 이렇게 다수의 색상이 동시에 발광하는 경우, 포토 블리칭(photobleaching) 현상이 발생할 수 있다. 또한, 종래의 형광 표지는 광학적으로 협소한 여기(excitation)와 방출 밴드(emission band)를 갖는 단점이 있고, 생체 물질과 결합하는 경우, 생체 물질의 활성에 부정적인 영향을 끼치기도 하는 등의 많은 한계를 가지고 있는 실정이다.

따라서, 이러한 종래의 표지 방법의 문제를 극복하고, 동시에 다수의 생체 물질을 검출하는 보다 안정적이고 정확한 방법이 요구되고 있다.

한편, 생체물질 분석에 있어, DNA에 편입될 수 있는 광분해성 물질들이 생체 물질의 연결자(linker)로서 이용되고 있으며, 그 이유는 하기와 같다. 연결자에 결합된 해당 생체 물질을 분리해야 할 경우, 일반적인 DNA 연결자는 화학반응 및 열에 의한 분리를 요구하여 해당 생체 물질이 변성될 가능성에 노출되는데 반하여, 광분해성 물질은 일정 범위의 광을 조사하는 것으로 쉽게 분리되므로 분석 대상 물질의 변성이 최소화되는 장점이 있다. 둘째는, 비드나 기판에서 상기 생체 물질을 분리하는 경우, 일반적인 DNA 연결자는 DNA의 혼성화(hybridization) 또는 탈혼성화(dehybridization)를 위한 일정 시간을 요구하는데 반하여, 광분해성 물질을 포함하는 연결자는 최장 수분 내에 분석 대상 물질을 분리해낼 수 있기 때문이다.

이에, 본 발명자들은 생체분자들을 포획하고, 상기 포획한 생체 분자 각각에 대해 길이 또는 염기 서열 중 하나 이상이 상이한 광분해성 올리고머가 표지된 나노 입자들을 결합시키는 것을 포함하는 검출 방법을 이용함으로써, 복수의 표적생체분자에 대한 특이적 신호들을 동시에, 간편하게 검출할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 복수의 생체 분자, 특히 단백질에 대한 신호의 동시 검출에 있어, 상기 포획한 표적생체분자 각각에 대해 길이 또는 염기 서열 중 하나 이상이 상이한 표적생체분자 식별용 광분해성 올리고머가 표지된 나노 입자들을 결합시킨 후, 광조사하여 분리한 상기 올리고머로부터 생체 분자 각각에 대한 신호를 동시에 획득할 수 있는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적의 달성을 위하여, 본 발명은

샘플 내, 복수의 표적생체분자를 이들 각각에 대한 프로브로 포획하는, 포획 단계;

길이 및 염기서열 중 하나 이상이 상이한 표적생체분자 식별용 광분해성 올리고머 및 상기 표적생체분자에 대한 포획자가 결합된 나노입자를 상기 포획된 표적생체분자에 각각 결합시키는, 결합 단계; 및

광조사에 의하여, 상기 나노입자와 결합한 광분해성 올리고머의 결합부위를 분해하고, 상기 분해에 의하여 수득한 올리고머 각각에 대한 신호를 검출하는, 신호 검출 단계;

를 포함하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법으로서,

상기 신호 검출 단계는, 크로마토그래피, 및 DNA 어레이 중 선택되는 하나 이상의 방법으로 표적생체분자에 대한 신호를 검출하는 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법을 제공한다.

상기 검출 방법은, 상기 신호 검출 단계에서 검출된 신호로부터 상기 표적생체분자 각각에 대한 농도를 판독하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이하에서는 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명의 신호 검출 방법은, 샘플 내의 대상 표적생체분자의 포획으로 시작되며, 상기 포획을 위한 프로브(probe)의 제조는 하기와 같다. 본 발명에서 프로브는 샘플 내의 표적생체분자를 1차로 포획하는 제1 포획자를 포함하는 복합체를 의미한다. 본 발명의 일실시예에서 상기 프로브는 각 표적 생체 분자에 대해, 결합물질 고정화수단으로 피복된 자성입자와, 상기 결합물질 고정화수단에 결합하는 결합물질을 갖는 제1 포획자를 포함하는 것을 특징으로 하나, 본 발명이 상기의 구성으로 제한되는 것은 아니다.

상기 자성입자는, 내부에 산화철 등을 포함하여 외부자기장에 대해 자화되는 특성을 띠는 폴리머인 것이 바람직하고, 폴리스티렌인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 자성입자의 표면은 상기 제1 포획자를 고정화시킬 수 있도록 결합물질 고정화 수단으로 개질되어 있음이 바람직하다.

상기 자성입자와 제1 포획자를 결합시키기 위해, 상기 제1 포획자를 상기 자성입자의 표면에 고정된 결합물질 고정화 수단에 화학결합하는 제1 결합물질로 표지한다. 본 발명에 따른 결합물질 고정화 수단은 비오틴, 스트렙트아비딘, 아비 딘, 압타머(aptamer), 렉틴(lectin), DNA, RNA, 리간드, 조효소(coenzyme), 무기이온, 효소보조인자(cofactor), 당, 지질 및 기질을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일실시예에서는 결합물질 고정화 수단으로서 스트렙트아비딘이 사용되었고, 이에 대한 결합물질로서, 스트렙트아비딘에 대해 강한 친화력으로 결합하는 비오틴이 사용되었으나, 이에 한정되는 것은 아니며 결합물질 고정화수단의 치환에 따라 그에 적절히 화학결합하는 물질로 조정될 수 있다.

본 발명의 결합물질은 본 발명의 포획자에 존재하는 기능기, 예를 들어 일차 아민기, 설프하이드릴(sulfhydryl)기, 카르보닐기, 카르복시기를 포함하는 기능기에 표지될 수 있는 물질이라면 한정되지 않는다. 상기 기능기와 반응하여 결합물질을 표지할 수 있는 물질의 일부 예는 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일차 아민기와 반응하는 물질로는 이미도에스테르(imidoester) 화합물, N-하이드록시숙신이미드 등을 들 수 있고, 설프하이드릴기와 반응하는 물질로는 말레이미드(Malemide), 할로아세틸류(Haloacetyls), 피리딜 디설파이드(pyridyl disulfide) 등을 들 수 있으며, 카르보닐기와 반응하는 물질로는 카르보디이미드(carbodiimides)류 등을 들 수 있고, 카르복시기와 반응하는 물질로는 일차 아민류 또는 히드라지드류(Hydrazides) 등을 들 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 자성입자가 제1 결합물질 고정화수단으로서 스트렙트아비딘으로 피복되어 있으므로, 상기 스트렙트아비딘과 강한 친화력을 갖는 비오틴을 본 발명의 포획자에 표지하는 비오티닐화(biotinylation)를 채택함에 있어, 포획자의 일차 아민기와 반응하 는 N-하이드록시숙신이미드를 이용하여, 결합 물질인 비오틴을 표지하였다.

본 발명에서 포획자는, 표적생체분자를 포획하기 위한 물질로서, 표적생체분자에 대해 항원-항체 반응으로 결합하는 생체분자라면 모두 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서는, 포획자로서 DcR3, 알파-페토-단백질(α-feto-protein) 및 ENO1 항원에 대한 항체, 구체적으로는 항-DcR3, 항-알파-페토-단백질 및 항-ENO1를 사용하였으나, 만약 상기 항체인 항-DcR3, 항-알파-페토-단백질 및 항-ENO1을 표적생체분자로서 분석하고 싶다면, 항원인 DcR3, 알파-페토-단백질 및 ENO1을 포획자로서 사용할 수 있다. 따라서, 상기 표적생체분자와 상기 포획자는 상호간 항원-항체 반응으로 결합할 수 있는 분자, 예를 들어 면역원이 될 수 있는 단백질, 펩티드, 합텐 및 상기 단백질, 펩티드 및 합텐에 대한 항체일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

다음으로, 샘플 내 표적생체분자가 상기 프로브의 포획자와 결합될 수 있는 조건 하에서 상기 프로브에 샘플을 접촉시켜, 프로브-표적생체분자 복합체를 생성한다.

본 발명에 따른 샘플은 배양된 바이러스, 박테리아, 세포 또는 조직 유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 프로브-표적생체분자 복합체 특이적인 신호의 검출을 위한, 광분 해성 올리고머를 표지하기 위해, 광분해성 올리고머가 결합된 나노입자 복합체를 제조한다. 본 발명에 있어, '표적생체분자 식별용 나노입자'란, 항원-항체 결합을 위한 부위가 상기 제1 포획자가 인식하는 부위와 동일하거나 상이한 제2 포획자, 및 광분해성 올리고머가 나노입자에 고정된 복합체를 나타낸다.

본 발명의 나노입자로, 금, 은, 실리카 및 폴리스티렌을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나의 소재를 포함하는 미소구체(microsphere)를 사용할 수 있으며, 상기 나노 입자는 본 발명의 결합물질 고정화 수단으로 코팅된 것을 특징으로 한다. 상기 결합물질 고정화 수단으로 코팅된 나노 입자는 직경이 1 ㎛ 미만인 것이 바람직하지만, 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 올리고머는, DNA 또는 DNA 유사체이며, 상기 DNA 유사체는 PNA, TNA 및 GNA를 포함하는 군으로부터 선택됨이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예의 광분해성 올리고머는, 나노 입자에 표지되기 위한 올리고머로서, 5' 부위에 결합물질, 바람직하게는 비오틴을 포함하고, 그 서열 내에 광분해성 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 결합물질로서, 상기 결합물질 고정화수단인 스트렙트아비딘에 대해 공유결합하는 비오틴이 사용되었으나, 이에 한정되는 것은 아니며 결합물질 고정화수단에 따라 그에 결합하는 물질로 조정될 수 있다. 상기 광분해성 물질은 DNA에 편입될 수 있는 광분해성 물질이라면 가능하고, 바람직하게는 포스포라미다이트(phosphoramidite)화합물, 더욱 바람직하게는 하기의 화학식을 갖는 PC-o-니트로페닐-CE-포스포라미다이트(PC-o-nitrophenyl-CE-phosphoramidite; [o-Nitrophenyl- 1-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidyl)-3-O-(4,4'-dimethoxytriphenylmethyl)-1,3-propandiol])일 수 있다.

[화학식]

본 발명의 일 실시예에서 제조된 DcR3(NT)에 대한 광분해성 올리고머의 서열은 5'-비오틴-AAA-N-AGAGAGAGAA-3'로 기재되며, 상기에서 G는 구아닌(Guanine)을 나타내며, A는 아데닌을 나타내며, N은 광분해성 물질, 즉 PC-o-니트로페닐-CE-포스포라미다이트를 나타낸다.

상기 나노입자와 제2 포획자 및 표적생체분자 식별용 광분해성 올리고머 간의 결합을 위한 각 성분의 사용량은 나노입자의 결합능에 따라 최적화됨이 바람직하다.

본 발명에 있어서 용어 "생체분자에 대한 신호"란, 목적하는 표적생체분자에 결합된 나노입자에 표지된 복수의 광분해성 올리고머 내의 광분해성 물질을 광조사하여 분리한 올리고머의 검출 수치가 광학적, 전기화학적, 전자적 신호 등으로 변환된 것을 나타내며, 상기 신호의 검출 정도를 분석하여 표적생체분자의 정성적 및/또는 정량적 검출이 가능한 것이다.

상기 나노입자의 표면적 및 광분해성 올리고머와의 결합능에 따라 복수개의 광분해성 올리고머를 부착시킬 수 있으므로, 미량의 표적생체분자도 증폭된 신호로서 검출될 수 있는 것이다.

다음으로, 프로브-표적생체분자 복합체의 표적생체분자와, 상기 광분해성 올리고머 및 제2 포획자가 결합된 나노입자의 제2 포획자와 결합될 수 있는 조건 하에서, 상기 광분해성 올리고머 및 제2 포획자가 결합된 나노입자와 프로브-표적생체분자 복합체를 접촉시켜, 프로브-표적생체분자-제2 포획자-나노입자-표적생체분자 식별용 광분해성 올리고머 복합체를 생성한다. 이 때, pH 변화에 의해 포획자와 표적생체분자간의 결합이 분리되지 않도록 주의하여야 한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 프로브-표적생체분자-제2 포획자-나노입자를 제거하여 표적생체분자 식별용 올리고머만을 분리해내기 위해, 상기 광분해성 물질인 PC-o-니트로페닐-CE-포스포라미다이트가 분해되어 2개의 일인산 단편을 생성하는 파장인 200 내지 400nm의 파장의 광을 사용하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 사용되는 광분해성 물질을 분해하는데 충분한 파장의 광선이면 사용이 가능하다.

상기 표적생체분자 식별용 올리고머들을 수합하여, 크로마토그래피, 예를 들어 HPLC(High Performance Liquid Chromatography), HPLC-MS(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry), CE(Capillary Electrophoresis) 및 CE-MS(Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry)를 포함하는 군으로부터 선택된 방법에 적용한 후, 상기 각 올리고머의 길이의 상이성에 따른 시간차(delayed) 피크로써 신호를 검출하는 크로마토그래피 및 상기 각 올리고머를 이들 올리고머의 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고머가 부착된 기판에 적용한 후, 이들의 하이브리드(hybrid) 형성 여부 및 정도에 따라 신호의 강도 및 종류가 다르게 발생하는 DNA 어레이(array)를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 이용하여 복수의 표적생체분자에 대한 신호를 동시에 검출할 수 있다. 한편, 상기의 신호 검출 단계에서, 분해에 의해 수득된 각 표적생체분자에 대한 올리고머의 길이가 동일한 경우, 크로마토그래피로 분취한 후, 상기 올리고머에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고머가 고정된 DNA 어레이에 적용하여 정성 및 정량적인 신호 검출이 가능한 것이다.

상기와 같은 검출 방법을 통해, 초고속 대용량 처리가 가능한 하이 스루풋(high throughput)을 구현할 수 있는 장점이 있으며, 검출 시료로서 표적생체분자 자체가 아닌 이에 선택적으로 결합한 광분해성올리고머를 이용하므로 시료의 안정성이 뛰어나고 시료의 준비가 간편하며, 실제 분석하고자 적용한 표적생체분자의 몰수보다 더 많은 DNA를 확보할 수 있으므로 표적생체분자를 증폭된 신호로서 검출할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 검출 방법을 통해, 복수의 표적생체분자에 표적생체분자 식별용 광분해성 올리고머를 각각 선택적으로 표지하고, 광조사하여 분리한 올리고머에 대한 신호를 검출하여, 복수의 생체 분자의 신호를 동시에 검출할 수 있으며, 표적생체분자에 대한 신호를 비교적 간단한 방법으로 신속히 획득할 수 있다. 또한, 미 량의 표적생체분자일지라도 증폭된 신호로써 검출이 가능하며, 검출이 종료된 이후에도 분석 시료를 올리고머 형태로서 장기간 확보할 수 있는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.

참조예 1. 광분해성 올리고머 합성

PC-o-니트로페닐-CE-포스포라미다이트(PC-o-nitrophenyl-CE-phosphoramidite)(P/N 212393, Bruker daltonics)가 편입된, 표적생체분자 DcR3, 알파-페토-단백질(α-feto-protein) 및 ENO1(enolase 1) 각각의 신호 검출을 위한, 길이 및 서열이 상이한 하기의 올리고머(Ⅰ)~(Ⅲ)은 주식회사 바이오니아(대전, 한국)에 합성을 의뢰하여 준비하였다.

* DcR3에 대한 올리고머(Ⅰ)

: 5'-비오틴-AAA-N-AGAGAGAGAA-3'

* 알파-페토-단백질에 대한 올리고머(Ⅱ)

: 5'-비오틴-AAA-N-AGAGAGAGAGAGAGA-3'

* ENO1에 대한 올리고머(Ⅲ)

: 5'-비오틴-AAA-N-AGAGAGAGAGAGAGAGAGAAG-3'

상기 서열 중 A는 아데닌(adenine), G는 구아닌(guanine), 그리고 N은 광분해성 물질인 PC-o-nitrophenyl-CE-phosphoramidite을 의미한다.

참조예 2. 표적생체분자에 대한 포획자 준비

본 실시예의 제1 표적생체분자인 DcR3(DcR3 Standard protein, Bender Medsystem, Austria) 항원에 대한 제1 및 제2 포획자(항체)로서 항-DcR3(DcR3(3H5/DcR3), Cat No.sc-53685, Santa Cruz, USA)과 비오티닐화된 항-DcR3(3H5/DcR3, Cat No. 321804, BioLegend, USA); 본 실시예의 제2 표적생체분자인 알파-페토-단백질(AFP recombinant protein; H00000174-QO1, Abnova, Taiwan) 항원에 대한 제1 및 제2 포획자(항체)로서 항-알파-페토-단백질(AFP Monoclonal antibody, H00000174-MO1, Abnova, Taiwan); 및 본 실시예의 제3 표적생체분자인 ENO1(ENO1 Recombinant Protein, H00002023-PO1, Abnova, Taiwan) 항원에 대한 제1 및 제2 포획자(항체)로서 항-ENO1(ENO1 monoclonal antibody, H00002023-M01, Abnova, Taiwan) 과 항-ENO1(ENO1 polycolonal antibody, H00002023-A01, Abnova, Taiwan)는, 항원 및 항체 각각 5,000pg/㎖의 농도가 되도록 0.1M 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 녹여 각각 튜브에 넣어 준비하였다.

상기 항체들에 대해 키트(EZ-Link sulfo NHS biotinylation kit, P/N 21217, PIERCE, USA)를 사용하여, 제조사의 지시에 따라 하기와 같이 비오티닐화(biotinylation)를 수행하였다. 우선 Sulfo-NHS-비오틴을 초순수에 녹여 10mM로 제조한 후, 상기 각 항체의 농도에 따라 적절히 계산된 양의 Sulfo-NHS-비오틴 용액을 항체가 들어있는 각 튜브에 분주하고 실온에서 약 1시간 정도 반응시켰다. 반응시 부드러운 교반이 이루어지도록 롤러믹서(roller mixer)를 이용하였다. 반응이 완료되면 자석으로 분리하고 100㎕ 정도의 0.1M PBS 용액을 이용하여 3회 세척한 뒤, 각 50㎕의 0.1M PBS 용액에 녹였다.

실시예 .

1-1. 프로브 (자성입자- 포획자 1 복합체) 제조

표면에 스트렙트아비딘이 코팅된 자성입자인 Dynabeads^®M-280(Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway) 현탁액 100㎕씩을 3개의 튜브에 넣고 이를 각각 2X B&W 버퍼(10mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 2.0M NaCl) 100㎕로 3회 세척하였다. 상기 세척 후의 자성입자 100㎕을 0.1M PBS 100㎕로 다시 부유시켜, 자성입자 용액 100㎕ X 3을 제조하였다.

참조예 2에서 제조한, 비오틴화된 제1 포획자 용액 각 100㎕을, 상기 자성입자 용액이 들어있는 각 튜브에 분주하고 실온에서 약 30분 정도 반응시켰다. 반응시 부드러운 교반이 이루어지도록 롤러믹서(roller mixer)를 이용하였다. 반응 후, 기타 비반응 물질 및 잔류물을 제거하기 위하여 자석을 이용하여 분리하고, 여액(상등액)을 바이오라드 사의 단백질 분석 표준 용액(Bio-rad protein assay standard Ⅱ, CAT No: 500-0007, USA) 및 micro-BCA 방법을 이용해 자성입자와 포 획자 1 간의 결합을 체크하였다. 결합을 확인한 후, 프로브는 0.1M PBS 100㎕에 녹여두었다.

1-2. 표적생체분자 식별용 나노입자(제2 포획자 -나노입자- 광분해성 올리고머 복합체) 제조

본 발명의 나노입자인, 스트렙트아비딘이 코팅된 실리카 미소구체(Streptavidin-coated silica microsphere, #CS01N, Bang's Laboratories, Inc., USA)를 제조사의 권고에 따른 적합한 방법으로 미리 적절히 세척한 후, 초순수 (100 ㎕ X 3)에 녹였다 (0.5 ㎎/㎖).

여기에 참조예 2에서 0.1M PBS 버퍼에 녹여둔 제2 포획자 용액을 동량으로 각각 혼합하였다 (제2 포획자 용액의 농도는 나노입자의 결합능에 따라 최적화됨). 실온에서 30분간, up-down 방식으로 부드럽게 혼합한 후, 자석을 이용하여 제2 포획자-나노입자 복합체를 분리하였다. 분리한 복합체를 10X PBS 버퍼를 이용하여 3회 정도 세척하고, 0.1M PBS에 녹였다(0.5 ㎎/㎖).

상기와 같이 준비된 제2 포획자-나노입자 복합체 용액 각 10㎕에, 참조예 1에서 합성한 표적생체분자 식별용 광분해성 올리고머(100 ㎕)를 넣고 20분간 결합반응시킨 후, 표지되지 않은 올리고머를 제거하기 위해 원심분리하고, 최종적으로 100㎕의 초순수에 각각 녹였다.

1-3. 프로브 - 표적생체분자 복합체 제조

프로브-표적생체분자 복합체는 당업자에게 항체 공급 업체로 알려진 Santa-Cruz의 ELISA 기법(Santa-Cruz, Inc., USA)을 인용한 하기의 방법으로 제조하였다.

본 실시예의 표적생체분자인 참고예 2의 항원, 즉, DcR3(NT), 알파-페토-단백질 및 ENO1 항원을 각각 50㎕씩 혼합한 항원 용액 150㎕를 준비하였다. 음성대조군 용액으로서, 탈지분유가 1.5% 포함된 PBS 용액 150㎕를 준비하였다. 상기 항원 용액 150㎕을 상기 항원 용액과 음성대조군 용액 150㎕에 각각 적용한 후 실온에서 2-3시간 반응시켰다. 그 후, 기타 비반응 물질 및 잔류물을 제거하기 위하여 자석을 이용하여 분리하고 다시 각 150㎕의 PBS에 녹여두었다. 반응 후, 기타 비반응 물질 및 잔류물을 제거하기 위하여 자석을 이용하여 분리하고, 여액(상등액)을 바이오라드 사의 단백질 분석 표준 용액(Bio-rad protein assay standard Ⅱ, CAT No: 500-0007, USA) 및 micro-BCA 방법을 이용해 프로브와 표적생체분자의 결합을 체크하였다. 결합을 확인한 후, 프로브-표적생체분자 복합체는 150㎕의 0.1M PBS에 녹여두었다.

1-4. 프로브 - 표적생체분자 - 표적생체분자 식별용 나노입자 복합체 생성

상기 실시예 1-3에서 준비한 프로브-표적생체분자 복합체 150㎕에 상기 1-2에서 준비한 표적생체분자 식별용 나노입자 각 100㎕씩을 혼합하였다. 실온에서 20분간, up-down 방식으로 부드럽게 혼합한 후, 자석을 이용하여 프로브-표적생체분자-표적생체분자 식별용 나노입자 복합체를 분리하였다. 분리한 복합체를 0.1M PBS를 이용하여 3회 정도 세척하고, 이때, 항원과 항체가 분리되는 것을 방지하기 위해, pH가 변화되지 않도록 유의하여야 한다. 세척 후, 10㎕의 초순수에 녹였다.

1-5. 광조사하여 프로브 - 표적생체분자 -제2 포획자 -나노입자 복합체 제거

상기 실시예 1-4에서 준비해둔 포획용 자성입자-표적생체분자-나노입자 복합체 용액 10㎕을 석영제 반응용기에 넣고 자외선 조사기에서 365 nm 및 254 nm의 파장을 동시에 사용하여 5분간 광을 조사하였다. 조사를 하는 도중에 입자가 침전되지 않도록 가끔씩 흔들어 주었다. 그 후, 자석을 이용하여 자성입자-표적생체분자-제2 포획자-나노입자 복합체를 제거하고 상등액을 취하여 표적생체분자 식별용 올리고머를 수합하였다.

시험예 . 고성능액체크로마토그래피 ( High Performance Liquid Chromatography; HPLC )를 이용한 각 표적생체분자에 대한 신호 검출 확인

상기 실시예 1-5에서 분리한 상등액은 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography, HP-1100, Agilent, USA) 및 하기의 조건 하에서 분리 및 정제하고, 표준 올리고머의 데이터에 대비하여 정량 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 6 및 도 7에 도시하였다.

컬럼 : Zorbax Bio series oligo 80 mm X 6.2 mm ID

이동상 : A= 20% 아세토나이트릴(ACN), 80% 0.02M 인산나트륨(Sodium phosphate monobasic pH7.0), B= A + 1.0M NaCl

기울기 농도(Gradient): 15% B 내지 75% B (40분간)

유속 : 1.0 ㎖/min

온도 : 대기 온도

검출기: UV, 260 nm

로딩 샘플양 : 2.0㎕

도 6에 나타난 바와 같이, 상기 실시예에서 분리한 올리고머(Ⅰ)~(Ⅲ)이 함유된 시료를 HPLC에 적용하였을 때, 각 항원에 대한 신호가 각 올리고머에 대한 피크로서 검출됨을 알 수 있다.

또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 샘플에서 표적생체분자 중 항원 DcR3를 제외한 실시예를 반복한 결과, DcR3 항원에 대해 표지되는 올리고머(Ⅰ)의 피크는 검출되지 않음을 알 수 있어, 본 발명의 표적생체분자에 대한 신호 검출 방법을 이용하여, 복수의 표적생체분자에 대한 신호를 동시에 효과적으로 검출할 수 있으며, 결과에 대한 신뢰성 또한 높음을 알 수 있다.

도 1은 본 발명의 검출 방법의 일실시예를 나타내는 개요도이다.

도 2는, 다른 농도로 존재하는 각 표적생체분자(항원)를 이들 각각에 대한 자성입자-제1 포획자 복합체로 포획하고, 여기에 제2 포획자 및 광분해성 올리고머가 표지된 나노 입자가 결합된 것을 나타낸 모식도이다.

도 3은, 나노 입자에의 광분해성 올리고머 및 제2 포획자의 결합 상태를 나타내는 모식도이다.

도 4는 광조사에 의한, 나노입자와 결합한 광분해성 올리고머의 분리를 나타내는 모식도이다.

도 5는 분리된 광분해성 올리고머의 분석 결과의 일례를 나타내는 크로마토그램이다.

도 6은 3 종류의 생체분자에 대한 신호를 검출하여 나타낸 그래프이다.

도 7은 3 종류의 생체분자 중 1 종류의 생체분자를 제거했을 때의, 생체분자에 대한 신호를 검출하여 나타낸 그래프이다.

Claims

샘플 내, 복수의 표적생체분자를 이들 각각에 대한 프로브로 포획하는, 포획 단계;

a) 상기 표적생체분자 각각에 대해 길이 및 염기서열 중 하나 이상이 상이한 표적생체분자 식별용 광분해성 올리고머, 및

b) 상기 표적생체분자에 대한 포획자,

가 각각 결합된 나노입자를 이용하여,

상기 포획된 복수의 표적생체분자와 상기 나노입자의 포획자를 결합시키는, 결합 단계; 및

광조사에 의하여, 상기 나노입자와 결합한 광분해성 올리고머의 서열 내에 포함된 광분해성 물질을 분해하고, 상기 분해에 의하여 수득한 올리고머 각각에 대한 신호를 검출하는, 신호 검출 단계;

를 포함하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법으로서,

상기 표적생체분자는, 상기 포획자에 대해 항원-항체 반응으로 결합하는 생체분자이고,

상기 나노입자와 포획자 간의 결합 및 상기 나노입자와 광분해성 올리고머 간의 결합은, 상기 나노입자에 고정된 결합물질 고정화 수단 및 상기 포획자와 광분해성 올리고머 각각에 고정된 결합물질 간의 화학결합에 의해 이루어지며,

상기 결합물질 고정화 수단은, 비오틴, 스트렙트아비딘, 아비딘, 압타머(aptamer), 렉틴(lectin), DNA, RNA, 리간드, 조효소(coenzyme), 무기이온, 효소보조인자(cofactor), 당, 지질 및 기질을 포함하는 군으로부터 선택되고,

상기 결합물질은, 상기 결합물질 고정화 수단과 화학결합하는 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되며,

상기 신호 검출 단계는, 크로마토그래피, 및 DNA 어레이 중 선택되는 하나 이상을 이용하여 표적생체분자에 대한 신호를 검출하고,

상기 DNA 어레이는, 상기 각 올리고머를, 이들 올리고머의 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고머가 부착된 기판에 적용하여, 이들의 하이브리드(hybrid) 형성에 의한 신호를 검출하는 것임

을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법은, 상기 검출된 신호로부터 상기 표적생체분자 각각에 대한 농도를 판독하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 크로마토그래피는, 상기 각 올리고 머의 길이의 상이성에 따른 시간차(delayed) 피크로써 신호를 검출하는 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
삭제
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 올리고머는 DNA 또는 DNA 유사체인 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 광분해성 물질은 DNA에 편입할 수 있는 광분해성 물질인 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 광분해성 물질은 포스포라미다이트(phosphoramidite) 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자 에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 포스포라미다이트 화합물은 PC-o-니트로페닐-CE-포스포라미다이트(PC-o-nitrophenyl-CE-phosphoramidite)인 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 광조사는 상기 포스포라미다이트 화합물이 분해되는 파장인 200 내지 400nm의 광을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 프로브는

자성입자; 및

표적생체분자에 대한 포획자;

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 표적생체분자에 대한 포획자의 결합은 항원-항체 반응에 의한 결합인 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 자성입자와 포획자 간의 결합, 상기 나노입자와 포획자 간의 결합 및 상기 나노입자와 광분해성 올리고머 간의 결합은, 결합물질 고정화 수단 및 여기에 결합하는 결합물질 간의 화학결합에 의해 이루어지고,

상기 결합물질 고정화 수단은, 비오틴, 스트렙트아비딘, 아비딘, 압타머, 렉틴, DNA, RNA, 리간드, 조효소, 무기이온, 효소보조인자, 당, 지질 및 기질을 포함하는 군으로부터 선택되고,

상기 결합물질은, 상기 결합물질 고정화 수단과 화학결합하는 물질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
삭제
청구항 13에 있어서,

상기 자성입자와 포획자 간의 결합은, 상기 자성입자에 고정된 제1 결합물질 고정화 수단 및 상기 포획자에 고정된 제1 결합물질 간의 화학결합에 의해 이루어지고,

상기 나노입자와 포획자간의 결합 및 상기 나노입자와 광분해성 올리고머의 결합은, 상기 나노입자에 고정된 제2 결합물질 고정화 수단 및 상기 포획자와 광분해성 올리고머에 고정된 제2 결합물질 간의 화학결합에 의해 이루어지는 것을 특징 으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 15에 있어서, 상기 제1 및 제2 결합물질 고정화 수단은 스트렙트아비딘이고, 상기 제1 및 제2 결합물질은 비오틴인 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 결합물질 고정화 수단으로 코팅되고,

상기 결합물질 고정화 수단은, 비오틴, 스트렙트아비딘, 아비딘, 압타머, 렉틴, DNA, RNA, 리간드, 조효소, 무기이온, 효소보조인자, 당, 지질 및 기질을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 금, 은, 실리카 및 폴리스티렌을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나의 소재를 포함하는 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 샘플은 배양된 바이러스, 박테리아, 세포 또는 조직 유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 복수의 표적생체분자에 대한 신호의 동시 검출 방법.