KR20120115813A - 생체물질의 정량적 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 웰(well) 타입의 플라스틱 기판을 사용하는 면역반응에서 나노입자와 도금법을 이용하여 짧은 시간 동안 고 감도(high sensitivity)로 생체물질을 정량적으로 검출하는 방법을 제공한다.

Description

생체물질의 정량적 검출방법 {METHOD FOR QUANTITATIVELY DETECTING BIOMOLECULES}
본 발명은 웰(well) 타입의 플라스틱 기판을 사용하는 면역반응에서 나노입자와 도금법을 이용하여 짧은 시간 동안 고 감도(high sensitivity)로 생체물질을 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
현재 생체물질의 정량적 검출은 주로 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 사용하여 이루어지고 있으며, 시판중인 ELISA 장비는 웰 타입(well type)의 플라스틱 기판을 주로 사용하고 있다. 그런데, 이 ELISA 장비는 형광 분자를 이용하여 시그널을 분석하기 때문에 분석 시간이 대략 2시간 정도로 매우 길다. 또한, 1 ng/ml 이하의 저 농도 분석에서는 시그널이 급격히 약해지고 재현성 확보도 매우 어려워 고 감도의 분석이 어렵다는 문제점이 있다.
이에 저 비용으로 짧은 시간 동안 고 감도로 생체물질을 검출할 수 있는 새로운 분석방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 웰(well) 타입의 플라스틱 기판을 사용하는 면역반응에서 나노입자와 도금법을 이용하여 짧은 시간 동안 고 감도(high sensitivity)로 생체물질을 정량적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 웰(well) 타입의 플라스틱 기판상에 분석하고자 하는 생체물질에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 포획자를 고정화시키는 단계; 상기 플라스틱 기판상에 분석하고자 하는 생체물질을 포함한 시료를 적용하여 상기 제1 포획자와 상기 생체물질을 결합시킨 다음 제2 포획자와 결합된 나노입자로 상기 생체물질을 표지하는 단계; 상기 플라스틱 기판상에 금속 이온을 함유한 용액을 적용하여 상기 나노입자를 성장시키는 단계; 및 상기 플라스틱 기판에 빛을 조사하여 투과된 빛의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, 생체물질의 정량적 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한 웰(well) 타입의 플라스틱 기판상에 분석하고자 하는 생체물질에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 포획자를 고정화시키는 단계; 분석하고자 하는 생체물질과 동일한 생체물질을 제2 포획자와 결합된 나노입자로 표지하여 표준 생체물질을 준비하고 상기 표준 생체물질을 분석하고자 하는 생체물질이 포함된 시료와 혼합한 다음 상기 플라스틱 기판상에 적용하여 상기 표준 생체물질과 분석하고자 하는 생체물질을 상기 제1 포획자에 결합시키는 단계; 상기 플라스틱 기판상에 금속 이온을 함유한 용액을 적용하여 상기 나노입자를 성장시키는 단계; 및 상기 플라스틱 기판에 빛을 조사하여 투과된 빛의 양을 측정하는 단계;를 포함하는, 생체물질의 정량적 검출방법을 제공한다.
본 발명자들은 상기와 같은 생체물질의 정량적 검출방법의 경우 놀랍게도 종래의 ELISA 장비와 달리 짧은 시간 동안(대략 20분 이내) 저 비용, 고 감도(대략 10 pg/ml)로 생체물질 검출이 가능하다는 점을 발견하였다. 이에, 본 발명의 검출방법을 시판용 ELISA 장비에 적용하여 상용화 가능성을 높일 수 있다(coefficient of variation(CV) 10% 이내). 또한, 저 비용으로 짧은 분석 시간 동안 고 감도로 정량 분석을 할 수 있기 때문에 스크리닝용 신속진단 키트(rapid kit)를 정량 분석이 가능한 rapid kit로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 웰 타입 플라스틱 기판이 여러 개의 웰로 구성되거나 어레이(array) 형태로 제작될 경우 다종 혹은 다중의 타겟 생체물질을 동시에 효과적으로 검출할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따라 샌드위치 면역분석(sandwich immunoassay)에 의한 생체물질의 정량적 검출방법을 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 1b는 도 1a의 샌드위치 면역분석(sandwich immunoassay)에 따른 타겟 생체물질 예상 검출 결과를 보여준다.
도 2a는 본 발명의 다른 실시예에 따라 경쟁 면역분석(competitive immunoassay)에 의한 생체물질의 정량적 검출방법을 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 2b는 도 2a의 경쟁 면역분석(competitive immunoassay)에 따른 타겟 생체물질 예상 검출 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티-웰(multi-well) 타입의 플라스틱 기판을 개략적으로 보여준다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 어레이형 웰(array well) 타입의 플라스틱 기판을 개략적으로 보여준다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체물질 검출 장치를 보여준다.
도 6은 실시예 1에서 TROPONIN I-CARDIAC(cTnI) 항원 농도에 따른 은(Ag) 코팅후의 이미지를 보여준다.
도 7은 실시예 1에서 TROPONIN I-CARDIAC 항원 농도에 따른 흡광도 및 검출결과를 보여준다 (분석시간: 1시간).
도 8은 실시예 2에서 TROPONIN I-CARDIAC 항원 농도에 따른 흡광도 및 검출결과를 보여준다 (분석시간: 20분).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 생체물질의 정량적 검출방법을 상세히 설명하도록 한다.
본 발명은 웰(well) 타입의 플라스틱 기판을 사용하는 면역반응에서 나노입자와 도금법을 이용하여 짧은 시간 동안 고 감도(high sensitivity)로 생체물질을 정량적으로 검출하는 방법을 제공한다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 검출방법은 웰(well) 타입의 플라스틱 기판상에 분석하고자 하는 생체물질에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 포획자를 고정화시키는 단계; 상기 플라스틱 기판상에 분석하고자 하는 생체물질을 포함한 시료를 적용하여 상기 제1 포획자와 상기 생체물질을 결합시킨 다음 제2 포획자와 결합된 나노입자로 상기 생체물질을 표지하는 단계; 상기 플라스틱 기판상에 금속 이온을 함유한 용액을 적용하여 상기 나노입자를 성장시키는 단계; 및 상기 플라스틱 기판에 빛을 조사하여 투과된 빛의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 제1 포획자와 상기 생체물질을 결합시킨 다음 제2 포획자와 결합된 나노입자로 상기 생체물질을 표지하는 단계는 샌드위치 면역반응(sandwich immunoassay)에 의한 것으로, 이에 대한 구체적인 예가 도 1a에 도시되어 있다.
도 1a를 참조하면, 플라스틱 기판 표면에 제1 포획자(예: 수용체)를 고정화하고, 고정화된 상기 제1 포획자에 타겟 생체물질을 결합시킨 다음, 제2 포획자(예: 바이오분자)와 나노입자(예: 금 나노입자)가 결합된 제2 포획자-나노입자 컨쥬게이트(conjugate)를 상기 플라스틱 기판상에 고정화된 생체물질과 결합하는 방식으로 생체물질에 나노입자를 표지할 수 있다.
다른 실시예에 따르면, 본 발명의 검출방법은 웰(well) 타입의 플라스틱 기판상에 분석하고자 하는 생체물질에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 포획자를 고정화시키는 단계; 분석하고자 하는 생체물질과 동일한 생체물질을 제2 포획자와 결합된 나노입자로 표지하여 표준 생체물질을 준비하고 상기 표준 생체물질을 분석하고자 하는 생체물질이 포함된 시료와 혼합한 다음 상기 기판상에 적용하여 상기 표준 생체물질과 분석하고자 하는 생체물질을 상기 제1 포획자에 결합시키는 단계; 상기 플라스틱 기판상에 금속 이온을 함유한 용액을 적용하여 상기 나노입자를 성장시키는 단계; 및 상기 플라스틱 기판에 빛을 조사하여 투과된 빛의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 표준 생체물질을 분석하고자 하는 생체물질이 포함된 시료와 혼합한 다음 상기 기판상에 적용하여 상기 표준 생체물질과 분석하고자 하는 생체물질을 상기 제1 포획자에 결합시키는 단계는 경쟁 면역반응(competitive immunoassay)을 통해 진행되며, 이에 대한 구체적인 예가 도 2a에 도시되어 있다.
플라스틱 기판에 형성된 웰은 크기, 개수, 배열 등에 특별한 제한이 없다. 웰은 복수로 구성되거나(도 3 참조) 어레이(array) 형태로 구성될 수 있으며(도 4 참조), 이에 따라 복수 종 혹은 복수 개의 타겟 생분자를 동시에 검출할 수 있다.
또한, 플라스틱 기판은 생체물질에 대한 제1 포획자가 고정가능하도록, 바이오센서 제작에 사용되는 일반적인 화학물질을 이용하여 표면처리 가능한 것을 사용하는데, 상기의 표면처리는 측정하고자 하는 시료의 종류, 생체물질의 종류 및 제1 포획자의 종류 등에 따라 당업자가 공지된 방법을 적절히 이용하여 수행될 수 있다.
이와 같은 플라스틱 기판 표면에 고정화되는 제1 포획자 및 상기 제1 포획자에 의해 포획된 생체물질에 결합하는 제2 포획자는, 생체물질에 대하여 항원-항체반응, DNA 상보결합, 유기화학물질의 특이반응성 등으로 결합가능한 생체분자라면 모두 가능하다. 예를 들면, 상기 제1 포획자 및 제2 포획자로서, 각각 항원, 항체, DNA, RNA, PNA, 합텐(hapten), 앱타머(aptamer), 아비딘, 비오틴, 리간드, 아미노산, 식품 독소나 호르몬 같은 small molecules 등에서 선택되어 사용될 수 있으나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 제1 포획자 및 제2 포획자는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명에서 표적이 되는 생체물질은 제한이 없으나, 예를 들어 항원, 항체, 바이러스, DNA, RNA, 세포, 식품 독소나 호르몬 같은 small molecules 등일 수 있다.
상기 생체물질을 포함하는 시료(샘플)는 반드시 이에 한정되는 것은 아니나, 배양된 바이러스, 박테리아, 세포 또는 조직유래 추출물, 혈액, 혈장, 혈청, 곡물 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서는, 생체물질에 결합하는 제2 포획자에 대해 표지물질로서 나노입자를 결합시키는데, 이러한 나노입자는 기존의 표지물질인 효소, 형광물질 등에 비해 저렴하고 안정하며 보다 신뢰성 있는 분석을 가능케 하며, 후술하는 도금용액에 의해 성장하여 시그널을 크게 증폭할 수 있는 이점이 있다.
이러한 나노입자는 평균 입경이 0.1 내지 300 nm를 충족한다면 특별한 제한이 없으며, 금, 은, 구리, 백금, 팔라듐 등일 수 있다. 바람직하게는 금 나노입자 또는 은 나노입자가 사용될 수 있다.
본 발명에서 “제2 포획자-나노입자 컨쥬게이트”는 제2 포획자가 물리적 또는 화학적으로 결합되거나(linked) 제2 포획자가 작용화된(functionalized) 나노입자를 의미하는 것으로 해석한다.
제2 포획자-나노입자 컨쥬게이트는 실험실에서 쉽게 제조될 수 있으며, 플라스틱 기판의 웰에 존재하는 타겟 생체물질과 특이 결합하며, 타겟 생체물질의 개수와 비례하여 플라스틱 기판의 웰에 존재하게 된다.
상기 플라스틱 기판상에 생체물질을 고정화하고 생체물질을 나노입자로 표지하는 단계는 일반적으로 1 내지 40℃ 범위의 온도에서 안정적으로 수행될 수 있으며 반드시 이러한 온도범위에 한정되는 것은 아니다. 반응시간은 대략 50분 이내, 바람직하게는 10분 이내일 수 있다.
생체물질을 나노입자로 표지한 이후에는, 상기 생체물질을 표지한 나노입자에 금속 이온을 함유한 용액을 적용하여 상기 나노입자를 성장시킨다.
타겟 생체물질의 농도가 낮은 경우에는 시그널이 약해 변화 관측 구별이 쉽지 않다. 그러나, 금속이 포함된 용액을 생체물질을 표지한 나노입자에 적용하면 금속 이온이 금속으로 환원되면서 상기 나노입자 표면에 코팅되어 나노입자 성장이 일어나 빛을 효과적으로 차단할 수 있으므로 시그널이 증폭되어 효과적으로 시그널 변화를 관측할 수 있다. 환원된 금속의 코팅 정도는 금속을 포함한 용액의 적용 시간과 상기 용액에 포함된 금속 이온의 농도를 조절함으로써 쉽게 조절이 가능하다. 적용 시간이 길수록, 용액내 포함된 금속 이온 농도가 높을수록 환원된 금속의 코팅 정도는 증가하게 된다.
이러한 환원반응은 일반적으로 1 내지 40℃ 범위의 온도에서 30분 이내, 바람직하게는 0.1분 내지 15분 동안 수행될 수 있다.
환원될 금속 이온으로는 금, 은, 구리, 백금, 팔라듐 등일 수 있으며, 금 또는 은 이온이 바람직하다.
상기 금속 이온의 금속으로의 환원은 하이드로퀴논, 하이드록실아민 등과 같은 환원제의 존재하에 수행될 수도 있다.
다음으로, 상기 플라스틱 기판에 빛을 조사하여 투과된 빛의 양을 측정한다.
상기와 같이 환원된 금속이 코팅된 후, 플라스틱 기판에 빛을 조사하여 플라스틱 기판에 투과된 빛의 양을 측정하면 타겟 생체물질의 존재 및 농도를 확인할 수 있다. 이를 위해 일반적으로 400 내지 600 nm 범위의 파장에서 흡광도를 측정할 수 있다. 도 1b는 샌드위치 면역반응에 대한 결과로서, 분석하고자 하는 생체물질의 농도가 증가할수록 흡광도 값이 증가함을 보여주고, 도 2b는 경쟁 면역반응에 대한 결과로서, 분석하고자 하는 생체물질의 농도가 증가할수록 흡광도 값이 감소함을 보여준다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 생체물질 검출 장치를 예시하고 있으며, 측정하고자 하는 시료(샘플)에 광원으로부터 빛을 조사하면, 투과된 빛은 빛의 세기를 전기적 신호로 전환하는 변환기에 의해 전기적 신호값으로 전환된다. 광원으로는 photodiode, LED, LCD 등이 이용될 수 있다.
상술한 생체물질의 정량적 검출방법에 따르면, 짧은 시간 동안(대략 20분 이내) 저 비용, 고 감도(대략 10 pg/ml)로 생체물질의 검출이 가능하다. 또한, 고감도 및 분석 시간 단축이 쉽지 않은 기존의 ELISA 장비에서 웰 타입의 플라스틱 기판이 주로 사용되고 있는 점을 고려했을 때, 본 발명의 검출방법을 이러한 시판용 ELISA 장비에 적용한다면 상용화 가능성을 높일 수 있는 이점이 있다 (coefficient of variation(CV) 10% 이내). 또한, 저 비용으로 짧은 분석 시간 및 고 감도의 정량 분석이 가능하기 때문에 스크리닝용 신속진단 키트(rapid kit)를 정량 분석이 가능한 rapid kit로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 웰 타입 플라스틱 기판이 여러 개의 웰로 구성되거나 어레이(array) 형태로 제작될 경우 다종 혹은 다중의 타겟 생분자를 동시에 효과적으로 검출할 수 있으므로 매우 실용적이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
본 실시예에서는 웰 타입 플라스틱 기판에 TROPONIN I-CARDIAC (cTnI) 항체를 고정화시킨 후, 타겟 생체물질로서 TROPONIN I-CARDIAC 항원을 검출하는 방법 및 결과를 보여준다.
구체적으로, Nunc사에서 구입한 웰 타입의 플라스틱 기판상에 TROPONIN I-CARDIAC 항체(Merdian Life Science)를 고정화시킨 다음 TROPONIN I-CARDIAC 항원을 포함한 시료와 TROPONIN I-CARDIAC 항체-금 나노입자 컨쥬게이트를 섞은 후 50분간 반응시켰다. 여기서, 항원은 Merdian Life Science사에서 구입하였고, 금 나노입자는 Ted Pella사에서 구입하였으며, TROPONIN I-CARDIAC 항체-금 나노입자 컨쥬게이트는 실험실에서 직접 제조하여 사용하였다. 샘플의 TROPONIN I-CARDIAC 항원 농도는 0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 ng/ml로 조절하였으며, TROPONIN I-CARDIAC 항체-금 나노입자 컨쥬게이트는 4.5 nM의 농도로 사용하였다.
이후, 은(Ag) 이온이 포함된 용액(Sigma사, Silver Enhancer Kit (SE100))을 12분간 상기 기판 표면에 적용하여 금속 은(Ag)이 항체-금 나노입자 컨쥬게이트상에 코팅되도록 하였다. 도 6은 TROPONIN I-CARDIAC 항원 농도에 따른 은 코팅후의 이미지를 보여준다. 도 6을 살펴보면, TROPONIN I-CARDIAC 농도가 증가할수록 은 코팅이 많이 진행되었음을 알 수 있다.
이후, 흡광도(absorbance)(측정 파장: 450 nm)를 측정하고 그 결과를 도 7에 나타내고 있다. 본 실험에서는 항원에 대한 각각의 농도에 대해 6개의 플라스틱 기판이 사용되었으며 도 7에서는 이들 결과에 대한 에러바(error bar)를 표시하였다.
도 7을 살펴보면, 검출 한계가 대략 10 pg/ml로서 감도가 매우 좋음을 알 수 있다.
< 실시예 2>
본 실시예는 항원 시료와 항체-금 나노입자 컨쥬게이터를 섞은 후 10분간 반응시키는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 항원을 검출하였다. 그 결과가 도 8에 나타나 있다.
도 8을 살펴보면, 아주 짧은 시간임에도 검출이 가능함을 알 수 있고, 검출 한계 또한 대략 10 pg/ml로서 감도가 매우 좋음을 알 수 있다.

Claims (10)

  1. 웰(well) 타입의 플라스틱 기판상에 분석하고자 하는 생체물질에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 포획자를 고정화시키는 단계;
    상기 플라스틱 기판상에 분석하고자 하는 생체물질을 포함한 시료를 적용하여 상기 제1 포획자와 상기 생체물질을 결합시킨 다음 제2 포획자와 결합된 나노입자로 상기 생체물질을 표지하는 단계;
    상기 플라스틱 기판상에 금속 이온을 함유한 용액을 적용하여 상기 나노입자를 성장시키는 단계; 및
    상기 플라스틱 기판에 빛을 조사하여 투과된 빛의 양을 측정하는 단계
    를 포함하는, 생체물질의 정량적 검출방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 포획자 및 제2 포획자는 각각 독립적으로 항원, 항체, DNA, RNA, PNA, 합텐(hapten), 앱타머(aptamer), 아비딘, 비오틴, 리간드, 아미노산, 식품 독소 및 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 생체물질은 항원, 항체, 바이러스, DNA, RNA, 세포, 식품 독소 및 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 나노입자는 금, 은, 구리, 백금 및 팔라듐으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속 나노입자인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 금속 이온은 금, 은, 구리, 백금 및 팔라듐으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속 이온인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  6. 웰(well) 타입의 플라스틱 기판상에 분석하고자 하는 생체물질에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 포획자를 고정화시키는 단계;
    분석하고자 하는 생체물질과 동일한 생체물질을 제2 포획자와 결합된 나노입자로 표지하여 표준 생체물질을 준비하고 상기 표준 생체물질을 분석하고자 하는 생체물질이 포함된 시료와 혼합한 다음 상기 플라스틱 기판상에 적용하여 상기 표준 생체물질과 분석하고자 하는 생체물질을 상기 제1 포획자에 결합시키는 단계;
    상기 플라스틱 기판상에 금속 이온을 함유한 용액을 적용하여 상기 나노입자를 성장시키는 단계; 및
    상기 플라스틱 기판에 빛을 조사하여 투과된 빛의 양을 측정하는 단계
    를 포함하는, 생체물질의 정량적 검출방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 제1 포획자 및 제2 포획자는 각각 독립적으로 항원, 항체, DNA, RNA, PNA, 합텐(hapten), 앱타머(aptamer), 아비딘, 비오틴, 리간드, 아미노산, 식품 독소 및 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 생체물질은 항원, 항체, 바이러스, DNA, RNA, 세포, 식품 독소 및 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 나노입자는 금, 은, 구리, 백금 및 팔라듐으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속 나노입자인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  10. 제 6 항에 있어서,
    상기 금속 이온은 금, 은, 구리, 백금 및 팔라듐으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속 이온인 것을 특징으로 하는 검출방법.
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