JP2004500403A - オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド合成のための反応性単量体、修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびにそれらの製造方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド合成のための反応性単量体、修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびにそれらの製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は修飾されたオリゴヌクレオチドの製造および結合反応へのそれらの使用に関する。本発明はさらにアセタールとして保護されたアルデヒドを含むアルデヒドに修飾されたオリゴヌクレオチドを製造するための試薬および方法に関する。前記アセタールはいったんオリゴヌクレオチドに結合すれば、オリゴヌクレオチドはアルデヒドに変換し、結合に使用される。結合反応は遊離オリゴヌクレオチドまたは基質上に固定されているオリゴヌクレオチドにより行うことができる。
Description
【0001】
本発明は、少なくとも1つのアセタールまたはアルデヒド基により修飾されているオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびにそのような修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを製造するための方法、およびそれらに必要な新規単量体ビルディングブロックに関する。
【0002】
アルデヒドは、例えば、生体分子に例えば、蛍光団、レポーター基、蛋白質、核酸および他の生体分子、小分子(例えば、ビオチン)を結合させるためか、さもなければ表面に生体分子を固定するために使用される反応性基である(例として:Hermanson,G.T.;Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego 1996;Timofeev,E.N.;Kochetkova,S.V.;Mirzabekov,A.D.;Floentiev,V.L.,Nucleic Acid Res.24(1996)3142を参照されたい)。蛋白質も核酸もそれらの天然の形状ではアルデヒドを有することができないので、後者は生体分子の特殊な修飾にとりわけ適切である。糖質は本質的にアルデヒドであるが、たいていは(環状)アセタールまたはヘミアセタールとして存在し、そしてこの形状ではどちらも典型的なアルデヒド反応性を有しない。したがって、それらは同様にアルデヒドとの指向性結合に使用することができる。生体分子を結合するために使用することができるアルデヒドの反応の先行技術由来の例は、図1の反応AおよびBに記載されている。
【0003】
現在、オリゴヌクレオチドにアルデヒドを導入する種々の方法が利用可能であり、それらのすべてはアルデヒドまたはビス−アルデヒドを得るための過ヨウ素酸ナトリウムによるビシナルジオールの酸化に基づく。
【0004】
初めに、3′−末端リボヌクレオチドを使用したオリゴヌクレオチドの酸化について記載する(このことについては、Timofeev,E.N.Kochetkova,S.V.;Mirzabekov,A.D.;Florentiev,V.L.,Nucleic Acids Res.24(1996)3142;Lemaitre,M.;Bayard,B.;Lebleu,B.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(1987)648)を参照されたい)。このようにして、オリゴヌクレオチドの3′−末端を形成するリボヌクレオチドは過ヨウ素酸塩により酸化されてビス−アルデヒドが得られる。このアルデヒドは次にアミンまたはヒドラジドと共に環状付加物(モルホリン構造)を形成し、それを結合に使用することができる。
【0005】
この方法は、オリゴヌクレオチドの3′−末端のヌクレオチドがいつも結合のために犠牲にならなければならないという決定的な不利益を有する。さらに、この方法はオリゴヌクレオチドと結合パートナー間の距離を変化させる可能性を提供しない。
【0006】
第2の可能性は、保護されたビシナルジオールのホスホロアミダイトをオリゴヌクレオチドの5′−末端に結合させることである(Lemaitre,M.;Bayard,B.;Lebleu,B.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(1987)648)。ここで、保護されたビシナルジオール基を有する、特に製造されたビルディングブロックはオリゴヌクレオチドの5′−末端に結合する。オリゴヌクレオチドを合成、脱保護および後処理すると、過ヨウ素酸塩により同様に酸化されることでアルデヒドが得られる、ビシナルジオール基が現れる。
【0007】
さらに、アルデヒド基をオリゴヌクレオチドに導入するための側鎖上に保護されたビシナルジオールを有する、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の使用は最先端の技術である(Dechamps,M.;Sonveaux,E.,Nucreosides Nucleotides 14(1995)867;Dechamps,M.;Sonveaux,E.,Nucreosides Nucleotides 17(1998)697;Trevisiol,E.:Renard,A.;Defrancq,E.;Lhomme,J.,Tetrahedron Lett.38(1997)8687)。しかし、この方法はかなり複雑な合成を必要とする。
【0008】
3種すべての方法では共通して、過ヨウ素酸ナトリウムによりビシナルジオールを酸化することにより、アルデヒドが生成されなければならない。この試薬はその後、結合反応の前に除去されなければならない。さらに、この方法は他の過ヨウ素酸塩に酸化されることが可能な基を有する分子には適用できない。したがって、例えばRNA鎖の5′−末端を、オリゴヌクレオチドの3′−末端が酸化されることなく、特異的に修飾することも不可能である。
【0009】
このことは、過ヨウ素酸塩に酸化されることなしにアルデヒドに修飾されたオリゴヌクレオチドを得るには代わりとなる方法が必要であるということに帰着する。
【0010】
さらに、アルデヒドは反応種であるため、それらの貯蔵安定性は無制限ではないということを考慮にいれなければならない。とりわけ、空気中での自然酸化はそれらの分解を導く。したがって、アルデヒドは使用の直前に製造することが好都合である。この点に関して、できるだけ簡単で容易に実施可能で、あまり複雑でなく、貯蔵が安定な反応物質から出発する、それらの製造のための方法が好都合であろう。
【0011】
したがって、本発明の目的はオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド合成の条件に一致する反応性単量体を提供すること、および扱い易く、アルデヒド基を含む対応する誘導体に容易に変換することができる、修飾されたオリゴおよびポリヌクレオチドを製造し、提供することである。
【0012】
かかる目的は、貯蔵が非常に容易で、アルデヒドに修飾されたオリゴおよびポリヌクレオチドの容易な入手法である、新規単量体アセタールならびにアセタールに修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにより達成される。さらに、本発明の単量体アセタールならびにアセタールに修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、オリゴおよびポリヌクレオチド合成、および例えば、ホスホロアミダイト法またはPCRのようなオリゴおよびポリヌクレオチド複製のための標準法の条件、ならびに共通の保護基の導入および除去のための反応条件に安定である。
【0013】
したがって、本発明は式(I):
【0014】
【化12】
【0015】
の反応性単量体に関し、式中l、vはお互いに独立して0または1であり、およびaは1ないし5、好ましくは1ないし3の整数であり、
そして式中
Xは例えば、お互いに独立してアルキルであるR2およびR3を有するホスホロアミダイト(II)またはホスホネート(III):
【0016】
【化13】
【0017】
のような、オリゴヌクレオチド合成のための反応性リン含有基であり、
式中、アルキルは分枝しているか、もしくは分枝していないC1からC5ラジカル、好ましくはイソプロピルであり、そしてR1はメチル、アリル(−CH2−CH=CH2)、または好ましくはβ−シアノエチル(−CH2−CH2−CN)であり、
そして式中、
Vは少なくとも3種の結合パートナー、例えば、原子または原子基、好ましくは窒素原子、炭素原子またはフェニル環を有する分枝単位であり、
そして式中、Aは式(IV):
【0018】
【化14】
【0019】
のアセタールであり、
ここでYおよびZはお互いに独立して、同一であるかまたは異なって、分枝しているかもしくは分枝していない、飽和もしくは不飽和で、適切ならば環状の、C1からC18までの炭化水素、好ましくはメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、2−ブチル、tert−ブチル、とりわけ好ましくはエチルであるか、または式中YおよびZが一緒に構造(V)または(VI)のラジカルであり、ここでR4はお互いに独立して同一であるか、または異なり、そしてそれはH、メチル、フェニル、分枝しているかもしくは分枝していない、飽和もしくは不飽和で、適切ならば環状の、C1からC18までの炭化水素、または構造(VII)のラジカルであり、そしてR5は同一であるかまたは異なり、そしてH、メチル、アルキル、O−メチル、O−アルキル、またはアルキルであり、ここでアルキルは分枝しているかもしくは分枝していない、飽和もしくは不飽和で、適切ならば環状の、C1からC18までの炭化水素であり、
【0020】
【化15】
【0021】
そして式中、
Lは、例えば、分枝しているかまたは分枝していないか、飽和または不飽和で、適切ならば環状の、C1からC18までの炭化水素、例えばアルキル−(CnH2n)−(式中、nは0ないし18,好ましくは3ないし8の整数である)であるか、またはポリエーテル−(CH2)k−[O−(CH2)m]o−O−(CH2)p−(式中、k、m、pはお互いに独立して0ないし4、好ましくは2の整数であり、そしてoは0ないし8、好ましくは2ないし4の整数である)であるか、またはアミン−(CH2)w−NH−(CH2)u−(式中、wおよびuはお互いに独立して0ないし18、好ましくは3ないし6の整数である)であるか、またはアミド−(CH2)q−C(O)−N−(CH2)r−もしくは−(CH2)q−N−C(O)−(CH2)r−(式中、qおよびrはお互いに独立して0ないし18、好ましくは1ないし5の整数である)である、XとAまたはXとVおよびVとAの結合に適切なリンカーである。この点に関して、リンカーLは酸素原子により分枝単位Vに結合していてもよい。
【0022】
この種の反応性単量体の個々の好ましい例としては:
【0023】
【化16】
【0024】
【化17】
【0025】
【化18】
【0026】
が挙げられる。
本発明はさらに、少なくとも1つのアセタール基により修飾されている、いずれかの配列のモノ、オリゴおよびポリヌクレオチドにも関する。
【0027】
少なくとも1つの式(I)の本発明の反応性単量体を使用することにより得ることができるモノ、オリゴ、およびポリヌクレオチドがとりわけ好ましい。
得ることができる例としては、ランダム配列を有し、そして少なくとも1つのアセタール基により修飾されている式VIIIの物質が挙げられ、
【0028】
【化19】
【0029】
式中(M)sはsが1以上である、お互いに結合したs単量体単位であり、X′は式(IX)
【0030】
【化20】
【0031】
(式中UはOまたはSであり、WはOH、SHまたはHであり、そしてQはOまたはNHである)のリン含有基であり、そしてzは1以上であり、
そしてl、v、a、L、VおよびAは先に記載した意味を有する。
【0032】
本発明の反応性単量体を好ましくはX′のホスホジエステル、H−ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミデート基によりモノ、オリゴまたはポリヌクレオチドに結合すると
【0033】
【化21】
【0034】
を形成する。
この点に関して、式(I)の反応性単量体をとりわけ末端に結合することができる。したがって、zはヌクレオチド鎖の分枝の程度に依存し、好ましくは1ないし10,そしてとりわけ好ましくは1または2である。本発明の別の利点は反応性単量体を選択的にDNAもしくはRNAオリゴヌクレオチドまたはDNAもしくはRNAポリヌクレオチドの3′および/または5′末端に、またはp−DNAもしくはp−RNAオリゴヌクレオチド、またはp−DNAもしくはp−RNAポリヌクレオチドの2′および/または4′末端に結合するという可能性である。これとは対照的に、遊離ジオール基は過ヨウ素酸塩により反応中に完全に酸化される。
【0035】
有効なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはすべて天然に存在するか、さもなければ分子認識または対合ができる合成ポリマーであり、そして主にリン酸ジエステルブリッジを含む反復構造を有する。前記分子認識または対合は選択的、安定および可逆的であること、そして例えば温度、pHおよび濃度により影響を受けてもよいという事実により特徴付けられる。例えば、分子認識はそれのみではないが、Watson−Crickの規則に従って、プリンおよびピリミジン塩基対合により成し遂げられる。天然に存在するヌクレオチド鎖の例としてはDNA、cDNAおよびRNAがあり、それらにおいては2−デオキシ−D−リボースまたはD−リボースにN−グリコシル結合している複素環塩基を含むヌクレオシドが、リン酸ジエステルにより結合している。非天然オリゴおよびポリヌクレオチドの好ましい例としては、DNA、cDNAおよびRNAの化学的に修飾された誘導体、例えばホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、メチルホスホネート類、2′−O−メチル−RNA、2′−O−アリル−RNA、2′−フルオロ−RNA、それらのLNA、またはPNAのようなDNAおよびRNAと対合できる分子(Sanghivi,Y.S.,Cook,D.P.,Carbohydrate Modification in Antisense Research,American Chemical Society,Washington 1994)、さもなければp−RNA、ホモDNA、p−DNA、CNA(ドイツ特許第19741715号,ドイツ特許第19837387号およびWO97/43232)のような、例えば特定の対合性により分子認識ができる分子が挙げられる。
【0036】
請求項1に記載の単量体ビルディングブロックを含む鎖長範囲は、好ましくは2から10000までの単量体単位であり、そして5から30までの単量体単位の鎖長がとりわけ好ましい。
【0037】
オリゴまたはポリヌクレオチドを製造するために使用できる適切な単量体単位は、とりわけデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのような天然に存在するヌクレオチドである。しかし、天然に存在しない合成ヌクレオチドを使用することも可能である。
【0038】
合成単量体単位の好ましい例としては2′−デオキシリボフラノシルヌクレオチド類、リボフラノシルヌクレオシド類、2′−デオキシ−2′−フルオロリボフラノシルヌクレオシド類、2′−O−メチルリボフラノシルヌクレオシド類、ペントピラノシルヌクレオチド類、3′−デオキシペントピラノシルヌクレオチド類が挙げられる。これらのヌクレオチドに適切な複素環塩基はとりわけ:プリン、2,6−ピアミノプリン、6−プリンチオール、ピリジン、ピリミジン、アデノシン、グアノシン、イソグアノシン、6−チオグアノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、チミジン、シトシン、イソシトシン、インドール、トリプタミン、N−フタロイルトリプタミン、ウラシル、カフェイン、テオブロミン、テオフィリン、ベンゾトリアゾールまたはアクリジンおよび、さらに共有結合的に結合した官能基を有する前記複素環体の誘導体も挙げられる。
【0039】
天然および非天然のアミノ酸、PNA単量体およびCNA単量体のような他の単量体単位を使用することも同様に可能である。
本発明と一致したオリゴおよびポリヌクレオチドはまた、分子認識に必要な単位に加えて、さらに、例えば検出、他の分子単位との結合、表面上もしくは他のポリマー上への固定、スペーシングまたはヌクレオチド鎖の分枝のような他の目的に役立つ分子部分を含む、分子をも含む。それらはとりわけ、オリゴヌクレオチドと蛍光染料、化学ルミネセンス分子、ペプチド、蛋白質、抗体、アプタマー、有機および無機分子との共有結合的、または安定な非共有結合的結合体、および異なる対合様式を有する2以上の対合システムの結合体を意味し、それらの結合体の例としては、DNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したp−RNAと、RNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したp−RNA、DNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したp−DNA、RNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したp−DNA、DNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したCNA、RNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したCNAが挙げられる。しかし、例えばガラス、シリコン、プラスチック、金またはプラチナのような支持物質表面上への固定はとりわけ興味深い。表面はまた、1以上の被覆層、好ましくはポリリシン、アガロースまたはポリアクリルアミドのような高分子被覆物を含んでいてもよい。被覆物は複数のスタガード層か、さもなければ配列されていない層を含んでいてもよい。この点において、個々の層は単分子層の形状であってもよい。
【0040】
本発明に関して、結合は分子、オリゴもしくはポリヌクレオチド、超分子複合体、またはポリマーのような成分と、1以上の他の、異なるもしくは同一の成分との共有結合または非共有結合を意味し、その結果それらは、それらの使用に必要な条件下で、安定な単位、結合体を形成する。この点に関して、結合は必ずしも共有結合である必要はないが、van der Waals相互作用、双極相互作用、とりわけ水素結合、またはイオン相互作用のような超分子力によって行なわれてもよい。
【0041】
さらに生物学的活性を有する有機または無機分子との結合体はとりわけ興味深い。
この点に関して記載することができる分子としては、医薬品、作物保護剤、錯化剤、酸化還元系、フェロセン系誘導体、レポーターグループ、ラジオアイソトープ、ステロイド、ホスフェート、トリホスフェート、ヌクレオシドトリホスフェート、リーディング(leading)構造の誘導体、遷移状態の類似体、脂質、複素環体、とりわけ窒素複素環体、糖質、分枝しているか、もしくは分枝していないオリゴまたはポリサッカライド、糖蛋白質、糖ペプチド、受容体もしくはその機能的部分、例えば膜結合受容体の細胞外ドメイン、代謝産物、メッセンジャー、病的変化の場合にヒトおよび動物体内で産生される物質、抗体もしくはその機能的部分、例えばFvフラグメント、1本鎖FvフラグメントもしくはFabフラグメント、酵素、線維成分、ウイルス、カプシドのようなウイルス成分、ウイロイド、およびそれらの誘導体、例えばアセテート、構造的に異なる化合物の集団のような物質ライブラリー、好ましくはオリゴマーもしくはポリマーペプチド、ペプチドイド、糖質、核酸、エステル、アセタールまたは複素環体のような単量体、脂質、ステロイドもしくは医薬品が作用する構造、好ましくは医薬品受容体、イオンチャンネル、とりわけ電位依存的イオンチャンネル、トランスポーター、酵素または微生物の生合成単位が挙げられる。
【0042】
本発明は同様にアルデヒドに修飾されたp−RNAおよびp−DNAオリゴヌクレオチドおよびp−RNAおよびp−DNAポリヌクレオチドに関し、それらは特定のアセタールから、例えば水性酸の手段によるか、または光化学的に容易に製造できる。
【0043】
アセタールオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの製造は出発物質として式(I)のアセタール類を使用することにより達成される。例としては、1以上のアセタール基を有する慣用のホスホロアミダイトを使用することが可能である。これらは固相合成の標準法によりオリゴまたはポリヌクレオチドに統合されてもよい(図2はこれを図に表示する)。
【0044】
そのようなアセタール基含有反応性単量体ビルディングブロックは、例えばアミノアセタール(2a、2b、6)とカプロラクトンを反応させることにより合成される(図3)(例えばZhang,J.;Yergey,A.;Kowalak,J.:Kovac,P.;Tetrahedron 54(1998)11783に記載)。得られたヒドロキシアセタール3a、3bまたは7は次に、適切なリン試薬との反応により、オリゴヌクレオチド合成のための反応性単量体に変換される(この例としては、I.Beaucage,S.L.,Iyer,R.P.,Tetrahedron 49(1993)を参照されたい)。
【0045】
代わりとなるものとしては、適切なヒドロキシアセタールをFinkelstein反応によりそのハライドから、またはアセタール化によりヒドロキシアルデヒドおよびアルコール成分から製造することが可能である。その後、反応型への変換は再び対応するリン試薬との反応により行われる。
【0046】
O−ニトロフェニル基を有する環状アセタールもとりわけ興味深い、なぜなら、それらは酸だけでなく、光の照射によりアルデヒドに変換できるからである。
その後、アセタールはオリゴヌクレオチド固相合成の標準法に従ってオリゴヌクレオチドに結合される(Beaucage,S.L.;Iyer,R.P.,Tetahedron 49(1993)6123;Caruthers,M.H.,Barone,A.D.;Beaucage,S.L.,Dodds,D.R.,Fisher,E.F.,McBride,L.J.,Matteucci,M.;Stabinksy,Z.;Tang,J.Y.,Methods Enzymol.154(1987)287;Caruthers,M.H.;Beaton,G.;Wu,J.V.;Wiesler,W.,Methods Enzymol.211(1992)3)。
【0047】
アセタールは、例えばホスホロアミダイト法のような一般的なオリゴヌクレオチド合成法のすべての反応条件に不活性である。
したがって、例えばテトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、塩酸ピリジニウムなどによる活性化、無水酢酸およびN−メチルイミダゾールによるキャッピング、例えばヨウ素/水による酸化に対して不活性である。それらは同様に、ピバロイルクロリドによる活性化のような、H−ホスホネート法の反応条件に不活性である。
【0048】
さらに、アセタールはオリゴヌクレオチド脱保護のための塩基性反応条件に安定である。それらは慣例的に使用される濃縮水性アンモニア溶液(55℃、2〜10時間)に損なわれずに耐え、特定の場合に使用される代わりとなる試薬(エチレンジアミン、メチルアミン、ヒドラジン)のいずれにも攻撃されない(Hogrefe,R.I.;Vghefi,M.M.;Reynolds,M.A.;Young,K.M.;Arnold,L.J.Jr.,Nucreic Acids Res.21(1993)2031)。
【0049】
アルデヒド官能基は、アセタールオリゴヌクレオチドを水性酸(酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸など)と反応させることにより、または光の照射(このためには、図2の表示を参照されたい)によりアセタールから容易に遊離される(例としては、実施例8〜11)。両者の場合、アルデヒドオリゴヌクレオチドを過ヨウ素酸ナトリウムのような試薬から除去することは必要でない。いつも必要ではないが、酸で中和することで十分である。もし酸を中和した塩の量がアルデヒドの変換を妨害するなら、例えばゲル濾過、透析、逆相抽出のような一般的な方法により除去してもよい。
【0050】
このようにして得られたアルデヒドオリゴまたはポリヌクレオチドは参考文献に記載されたすべての結合反応に使用してもよい(例えば、Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press、San Diego 1996;Timofeev、E.N.,Kochetkova,S.V.,Mirzabekov,A.D.:Florentiev,V.L.,Nucreic Acids Res.24(1996)3142)。蛋白質およびペプチド、蛍光染料、他のオリゴヌクレオチドとオリゴおよびポリヌクレオチドの結合、ならびに表面および他のポリマー上にオリゴまたはポリヌクレオチドを固定することはとりわけ興味深い。
【0051】
さらに、アルデヒドに修飾されたオリゴまたはポリヌクレオチドは、それらのN末端にシステインを有するペプチド、蛋白質、または他の有機もしくは無機分子との結合のための図1のCに示された反応を使用することを可能にする。この場合、一定のアルデヒドの化学構造とともに、さらに改変が可能なチアゾリジン誘導体が形成される(Lemieux,G.A.;Bertozzi,C.R.,Trends in Biotechnology 16(1998)506;Liu,C.−F.;Rao,C.;Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.118(1996)307)。この反応は低い反応物質濃度およびpHで起こるという利点を有する。
【0052】
アルデヒドの保護基としてのアセタールの使用はさらにオリゴまたはポリヌクレオチドを結合するためのとりわけ簡単な方法:支持物質上への結合を可能にする。
【0053】
この目的のために、オリゴヌクレオチド固相合成の支持物質上に固定されたままの、完全にまたは部分的に保護されたままのアセタールオリゴヌクレオチドまたはアセタールポリヌクレオチドは、対応するアルデヒドオリゴヌクレオチドまたはアルデヒドポリヌクレオチドに変換される。水性酸または光の照射により可能になるこの反応が、支持物質からオリゴまたはポリヌクレオチドを除去しないということは重要である。次に支持物質に結合したアルデヒド−ヌクレオチド鎖を適切な反応パートナーと反応させる(その例として、図1を参照されたい)。その後、オリゴまたはポリヌクレオチド結合体は水性アンモニアまたは代わりの試薬(例えば、エチレンジアミン、メチルアミン、ヒドラジン)により支持物質から除去され、残りの保護基、DNAの場合は、例えば塩基の環外アミノ基上のベンゾイルおよびイソブチリル保護基が除去される。図1の例として記載された生成物の場合に、結合反応中に形成される結合が上記の脱保護条件に対して安定なことが前提条件である。支持物質に結合したオリゴまたはポリヌクレオチドの結合反応は、過剰の結合成分および例えば、還元剤のような他の試薬が単純な洗浄により除去できるという利点を有する。したがって、特有の不安定性のために直接オリゴヌクレオチド固相合成が利用できない分子とオリゴまたはポリヌクレオチドの結合体を得ることも可能である。
【0054】
代表的な態様:
一般的な予備的注意:
特記しない限り、Aldrichの試薬およびRiedel(p.a.)の溶媒を使用した。薄層クロマトグラフィー(TLC)はシリカゲル 60 F254(Merck)を含むプレート上で行った。カラム−クロマトグラフィーによる分離はシリカゲル 60(Merck、230〜400メッシュ)上で行った。1H−NMRスペクトルはBruker DRX 400スペクトロメーターを使用して400MHzで測定し、化学シフトはテトラメチルシラン(TMS)に対するδ値として表した。IRスペクトルはGraseby Specac 10500 ATR unitを備えたPerkin Elmer Paragon 1000FT−IRを使用して測定した。DNAオリゴヌクレオチドはPE Biosystems Expedite 8905を使用してホスホロアミダイト法に従って製造した。アセタールホスホロアミダイトおよびDNAアミダイトは乾燥アセトニトリル中で0.1M溶液として使用した。カップリングは活性化剤としてテトラゾールを使用して行った。p−RNAオリゴヌクレオチドには、以前に記載した合成条件を使用した(ドイツ特許第19741715号)。エレクトロスプレー質量分析(ESI―MS)はFinnigan LCQ instrumentを使用して陰性イオン化モードで測定した。
【0055】
個々の物質に示された番号付けは図3から5までに使用される数字を表す。
図3は例として、アセタールホスホロアミダイトの合成を記載し、図4は、DNAアセタールおよびDNAアルデヒドの例を示し、図5はp−RNAアセタールおよびp−RNAアルデヒドの例を示す。
【0056】
【実施例】
反応性単量体の合成
実施例1:N−(2,2−ジメトキシエチル)−6−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルアミドホスホロアミダイト]−ヘキサミド 5aの合成:
2.19g(10mmol、[219.28])のN−(2,2−ジメトキシエチル)−6−ヒドロキシヘキサミド 3aを5.17g(40mmol、4等量、[129.25])のN−エチル−ジイソプロピルアミン(Hunigs Base)と一緒に40mlの乾燥ジクロロメタンに溶解する。2.6g[11mmol、1.1等量,[236.68]]モノ(2−シアノエチル)N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト 4を15分かけて滴下して加える。1時間後、TLC(酢酸エチル/n−ヘプタン2:1)は完全な変換を示す。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を直接クロマトグラフィーカラムにかける。数滴のトリエチルアミンを含む酢酸エチル/n−ヘプタン(2:1)で溶出し、無色オイルとして化合物 5a(C19H38N3O5P;[419.51])2.48g(59%)を得る。
【0057】
【化22】
【0058】
【化23】
【0059】
実施例2:N−(2,2−ジエトキシエチル)−6−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルアミドホスホロアミダイト]−ヘキサミド 5b:
2.47g(10mmol、[247.34])のN−(2,2−ジエトキシエチル)−6−ヒドロキシヘキサミド 3bを5.17g(40mmol、4等量、[129.25])のN−エチル−ジイソプロピルアミン(Hunigs Base)と一緒に40mlの乾燥ジクロロメタンに溶解する。5ml ジクロロメタンに溶解した2.6g(11mmol、1.1等量,[236.68])のモノ(2−シアノエチル)N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト 4を30分かけて滴下して加える。さらに30分後、TLC(酢酸エチル/n−ヘプタン2:1)は完全な変換を示す。溶媒はロータリーエバポレーターで除去し、残渣は酢酸エチル/n−ヘプタン(2:3)に溶解する。沈殿した塩酸は吸引により濾過し、濾液は直接クロマトグラフィーカラムにかける。数滴のトリエチルアミンを含む酢酸エチル/n−ヘプタン(1:1)で溶出し、無色オイルとして化合物 5b(C21H42N3O5P;[419.51])2.96g(66%)を得る。
【0060】
【化24】
【0061】
実施例3:N−(2,2−ジエトキシブチル)−6−O−[(2−シアノエチ ル)−N,N−ジイソプロピルアミドホスホロアミダイト]−ヘキサミド 8:
1.75g(6.35mmol、[275.39])のN−(2,2−ジエトキシブチル)−6−ヒドロキシヘキサミド 7を1.64g(12.7mmol、4等量、[129.25])のN−エチルジイソプロピルアミン(Hunigs Base)と一緒に30mlの乾燥ジクロロメタンに溶解する。2ml ジクロロメタンに溶解した1.65g(6.99mmol、1.1等量,[236.68])のモノ(2−シアノエチル)N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト 4を40分かけて滴下して加える。さらに30分後、TLC(酢酸エチル/n−ヘプタン10:1)は反応物の完全な消費を示す。反応はメチノールで停止し、溶媒はロータリーエバポレーターで除去する。残渣は直接クロマトグラフィーカラムにかける。数滴のトリエチルアミンを含む酢酸エチル/n−ヘプタン(10:1)で溶出し、無色オイルとして化合物 8(C23H46N3O5P;[475.61])1.87g(62%)を得る。
【0062】
【化25】
【0063】
アセタールおよびアルデヒドに修飾されたオリゴヌクレオチドの合成:
アセタールによるアルデヒドの導入はDNAおよびp−RNAオリゴヌクレオチドの両方に対して示される。図4および5はオリゴヌクレオチドの例の配列を示す。
【0064】
実施例4:ジエチルアセタール 5b由来のDNAアセタール 9(K3194/3196 O4)
オリゴヌクレオチド合成は装置の製造業者に提供されたプロトコルに従って、1μmolのスケールで行う。ホスホロアミダイト 5bの0.1M溶液は標準条件下で最後の単量体として結合させる。支持物質に結合したオリゴヌクレオチドを除去し、25%水性アンモニア溶液、80℃、10時間の処理により脱保護する。支持物質を除去後、溶液を減圧下で濃縮し、残渣を水に溶解する。オリゴヌクレオチドはRP−HPLCカラムにより精製する。カラム:Merck LiChrospher RP 18,10μM、分析用:4x250mm、流速=1.0ml/分、セミ分取用:10x250,流速=3.0ml/分;バッファー:A:水中、0.1M トリエチルアンモニウム酢酸(TEAA)pH=7.0、B:アセトニトリル/水(95:5)中、0.1M TEAA pH=7.0;グラジエント:分析用および分取用分離のために100分で0% Bから100% B。保持時間 DNAアセタール 9:22.8分;MS:計算値[6193]、実測値[6195]
【0065】
実施例5:ジエチルアセタール 8由来のDNAアセタール 11(K3208/3214/3218 O16)
オリゴヌクレオチド合成および後処理は実施例4に記載のように行う。保持時間 DNAアセタール 11:23.4分;MS:計算値[6222]、実測値[6221]
【0066】
実施例6:ジエチルアセタール 5b由来のp−RNAアセタール 13(K3168 16)
オリゴヌクレオチド合成は実施例4に記載のように行う。このプロトコルから逸脱して、p−RNAにはより長い結合時間および活性化剤塩酸ピリジニウムが使用された。この場合、活性化剤として塩酸ピリジニウムを使用して、アセタールホスホロアミダイトも結合させる。初めに、ジクロロメタン中のジエチルアミン1.5%(w/v)溶液を支持物質に添加し、混合物を暗所で振とうしながら室温で一晩(15時間)インキュベートする。溶液を廃棄し、支持物質を以下の溶媒:CH2Cl2、アセトン、水それぞれについて3回ずつ洗浄する。次にp−RNAをCPG支持物質から除去し、水性24%ヒドラジン水和物を4℃で18時間処理することにより脱保護する。ヒドラジンはSep−Pak C18カートリッジ(0.5g Waters,No.20515;アセトニトリル 10mlによる活性化、5倍容積のトリエチルアンモニウムビカーボネートバッファー(TEAB) pH=7.0により希釈されたヒドラジン溶液の結合、TEABによる洗浄およびTEAB/アセトニトリル(1:2)によるオリゴヌクレオチドの溶出)を使用して固相抽出により除去する。オリゴヌクレオチド含有画分を合わせ、減圧下で濃縮して乾燥する。分析および分取用精製は実施例4に記載のようにRP−HPLCにより行う。保持時間 DNAアセタール 13:22.0分;MS:計算値[2719]、実測値[2718]
【0067】
実施例7:ジエチルアセタール 8由来のp−RNAアセタール 15(K3208/3214/3218 O16)
オリゴヌクレオチド合成および後処理は実施例6に記載のように行う。保持時間 p−RNAアセタール 15:24.0分;MS:計算値[2747]、実測値[2747]
アセタールオリゴヌクレオチドからアルデヒドオリゴヌクレオチドへの変換
一般的プロトコル:
アセタールオリゴヌクレオチドは水に溶解し、過剰の水性酸(例えばHCl)と混合する。このようにして得られた反応溶液中のオリゴヌクレオチド濃度は通常20および60μMであり、大過剰の酸(5x104mol等量)が使用される。溶液は室温でインキュベートし、反応の進行はHPLCでモニターする。アセタールオリゴヌクレオチドの完全な変換後、溶液を水性NaOHで中和する。このようにして得られたアルデヒド−オリゴヌクレオチド溶液は直接結合反応に使用するか、またはゲル濾過もしくは固相抽出のような常法により脱塩してもよい(実施例6参照)。
【0068】
実施例8:DNAアセタール 9由来のDNAアルデヒド 10
26nmolのアセタール 10は1mlの1M水性HClと混合し、室温で6.5時間インキュベートする。反応の進行は実施例4で示された条件下で、RP−HPLCにより追跡できる。酸は1N 水性NaOHを添加することにより中和する。このようにして得られたDNA−アルデヒド溶液は直接結合反応に使用するか、またはRP−HPLCにより精製してもよい。保持時間 DNAアルデヒド10:20.6分。
【0069】
実施例9:DNAアセタール 11由来のDNAアルデヒド 12
120nmolのアセタール 11は実施例8に記載のように2mlの1M 水性HClと反応させ、DNAアルデヒド 12を得る。保持時間 21.5分;MS:計算値:[6148]、実測値:[6147]。
【0070】
実施例10:DNAアセタール 13由来のp−RNAアルデヒド 14
16nmolのアセタール 13は実施例8に記載のように400μlの0.5M 水性HClと反応させ、DNAアルデヒド 14を得る。保持時間 19.2分;MS:計算値:[2645]、実測値:[2645]。
【0071】
実施例11:DNAアセタール 15由来のp−RNAアルデヒド 16
50nmolのアセタール 15は実施例8に記載のように1mlの1M 水性HClと反応させ、DNAアルデヒド 16を得る。保持時間 20.0分;MS:計算値:[2673]、実測値:[2672]。
【0072】
アルデヒドオリゴヌクレオチドの結合反応:
一般的プロトコルA(溶液中の結合):
(I)ヒドラジンまたはアミン(5〜20mM)の溶液10μLおよび100mM 水性NaCNBH4溶液10μLを酢酸バッファー(pH5)で500μLに希釈する。これに、数μLの水に溶解した1〜5nmolのアルデヒドオリゴヌクレオチドを添加する。室温で2時間放置後、溶液をゲル濾過により脱塩し、結合体をHPLCにより精製する。
(II)代わりとして、酸を中和することにより得られたアルデヒド−オリゴヌクレオチド溶液(cf.3.1.3)を100mole等量のヒドラジドまたはアミンおよび1000mole等量のNaCNBH4と混合してもよい。混合物は必要ならば、酢酸バッファーpH5で希釈する。室温で2時間放置後、溶液をゲル濾過により脱塩し、結合体はHPLCにより精製する。
【0073】
一般的プロトコルB(固相上の結合):
初めに、アセタールオリゴヌクレオチドは実施例4および実施例6に記載のように固相合成により製造する。支持物質に結合したオリゴヌクレオチドは次にジクロロメタン中のジエチルアミン1.5%(w/v)溶液と初めに混合し、暗所で振とうしながら室温で一晩(15時間)インキュベートする。溶液を廃棄し、支持物質を以下の溶媒:CH2Cl2、アセトン、水それぞれについて3回ずつ洗浄する。支持物質に結合したアセタールオリゴヌクレオチドは、支持物質を0.1から1Mの水性酸(例えばHCl)で2時間、室温で処理することにより、支持物質に結合したアルデヒドオリゴヌクレオチドに変換する。次に濾液が中性になるまで水で洗浄する。結合反応のために、数時間、室温で振とうしながら、酢酸バッファー中のヒドラジドまたはアミンおよびNaCNBH4とのインキュベーションを行う。次に結合体を支持物質から除去し、ヒドラジンまたはアンモニアによる処理により脱保護する(実施例4および6参照)。後処理および精製は実施例6に記載のように行う。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、アルデヒドオリゴヌクレオチドの反応を示した図である。AおよびBは、生体分子を結合するために使用することができるアルデヒドの反応の先行技術由来の反応例であり、Cは、アルデヒドに修飾されたオリゴまたはポリヌクレオチドのN末端にシステインを有するペプチド、蛋白質、または他の有機もしくは無機分子との結合反応の例である。
【図2】図2は、アセタールからのアルデヒドオリゴヌクレオチドの製造についての反応経路を示す図である。
【図3】図3は、アセタールホスホロアミダイトの合成についての反応経路を示す図である。
【図4】図4は、DNAアセタールおよびDNAアルデヒドの例を示す図である。
【図5】図5は、p−RNAアセタールおよびp−RNAアルデヒドの例を示す図である。
本発明は、少なくとも1つのアセタールまたはアルデヒド基により修飾されているオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびにそのような修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを製造するための方法、およびそれらに必要な新規単量体ビルディングブロックに関する。
【0002】
アルデヒドは、例えば、生体分子に例えば、蛍光団、レポーター基、蛋白質、核酸および他の生体分子、小分子(例えば、ビオチン)を結合させるためか、さもなければ表面に生体分子を固定するために使用される反応性基である(例として:Hermanson,G.T.;Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego 1996;Timofeev,E.N.;Kochetkova,S.V.;Mirzabekov,A.D.;Floentiev,V.L.,Nucleic Acid Res.24(1996)3142を参照されたい)。蛋白質も核酸もそれらの天然の形状ではアルデヒドを有することができないので、後者は生体分子の特殊な修飾にとりわけ適切である。糖質は本質的にアルデヒドであるが、たいていは(環状)アセタールまたはヘミアセタールとして存在し、そしてこの形状ではどちらも典型的なアルデヒド反応性を有しない。したがって、それらは同様にアルデヒドとの指向性結合に使用することができる。生体分子を結合するために使用することができるアルデヒドの反応の先行技術由来の例は、図1の反応AおよびBに記載されている。
【0003】
現在、オリゴヌクレオチドにアルデヒドを導入する種々の方法が利用可能であり、それらのすべてはアルデヒドまたはビス−アルデヒドを得るための過ヨウ素酸ナトリウムによるビシナルジオールの酸化に基づく。
【0004】
初めに、3′−末端リボヌクレオチドを使用したオリゴヌクレオチドの酸化について記載する(このことについては、Timofeev,E.N.Kochetkova,S.V.;Mirzabekov,A.D.;Florentiev,V.L.,Nucleic Acids Res.24(1996)3142;Lemaitre,M.;Bayard,B.;Lebleu,B.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(1987)648)を参照されたい)。このようにして、オリゴヌクレオチドの3′−末端を形成するリボヌクレオチドは過ヨウ素酸塩により酸化されてビス−アルデヒドが得られる。このアルデヒドは次にアミンまたはヒドラジドと共に環状付加物(モルホリン構造)を形成し、それを結合に使用することができる。
【0005】
この方法は、オリゴヌクレオチドの3′−末端のヌクレオチドがいつも結合のために犠牲にならなければならないという決定的な不利益を有する。さらに、この方法はオリゴヌクレオチドと結合パートナー間の距離を変化させる可能性を提供しない。
【0006】
第2の可能性は、保護されたビシナルジオールのホスホロアミダイトをオリゴヌクレオチドの5′−末端に結合させることである(Lemaitre,M.;Bayard,B.;Lebleu,B.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(1987)648)。ここで、保護されたビシナルジオール基を有する、特に製造されたビルディングブロックはオリゴヌクレオチドの5′−末端に結合する。オリゴヌクレオチドを合成、脱保護および後処理すると、過ヨウ素酸塩により同様に酸化されることでアルデヒドが得られる、ビシナルジオール基が現れる。
【0007】
さらに、アルデヒド基をオリゴヌクレオチドに導入するための側鎖上に保護されたビシナルジオールを有する、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の使用は最先端の技術である(Dechamps,M.;Sonveaux,E.,Nucreosides Nucleotides 14(1995)867;Dechamps,M.;Sonveaux,E.,Nucreosides Nucleotides 17(1998)697;Trevisiol,E.:Renard,A.;Defrancq,E.;Lhomme,J.,Tetrahedron Lett.38(1997)8687)。しかし、この方法はかなり複雑な合成を必要とする。
【0008】
3種すべての方法では共通して、過ヨウ素酸ナトリウムによりビシナルジオールを酸化することにより、アルデヒドが生成されなければならない。この試薬はその後、結合反応の前に除去されなければならない。さらに、この方法は他の過ヨウ素酸塩に酸化されることが可能な基を有する分子には適用できない。したがって、例えばRNA鎖の5′−末端を、オリゴヌクレオチドの3′−末端が酸化されることなく、特異的に修飾することも不可能である。
【0009】
このことは、過ヨウ素酸塩に酸化されることなしにアルデヒドに修飾されたオリゴヌクレオチドを得るには代わりとなる方法が必要であるということに帰着する。
【0010】
さらに、アルデヒドは反応種であるため、それらの貯蔵安定性は無制限ではないということを考慮にいれなければならない。とりわけ、空気中での自然酸化はそれらの分解を導く。したがって、アルデヒドは使用の直前に製造することが好都合である。この点に関して、できるだけ簡単で容易に実施可能で、あまり複雑でなく、貯蔵が安定な反応物質から出発する、それらの製造のための方法が好都合であろう。
【0011】
したがって、本発明の目的はオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド合成の条件に一致する反応性単量体を提供すること、および扱い易く、アルデヒド基を含む対応する誘導体に容易に変換することができる、修飾されたオリゴおよびポリヌクレオチドを製造し、提供することである。
【0012】
かかる目的は、貯蔵が非常に容易で、アルデヒドに修飾されたオリゴおよびポリヌクレオチドの容易な入手法である、新規単量体アセタールならびにアセタールに修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにより達成される。さらに、本発明の単量体アセタールならびにアセタールに修飾されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、オリゴおよびポリヌクレオチド合成、および例えば、ホスホロアミダイト法またはPCRのようなオリゴおよびポリヌクレオチド複製のための標準法の条件、ならびに共通の保護基の導入および除去のための反応条件に安定である。
【0013】
したがって、本発明は式(I):
【0014】
【化12】
【0015】
の反応性単量体に関し、式中l、vはお互いに独立して0または1であり、およびaは1ないし5、好ましくは1ないし3の整数であり、
そして式中
Xは例えば、お互いに独立してアルキルであるR2およびR3を有するホスホロアミダイト(II)またはホスホネート(III):
【0016】
【化13】
【0017】
のような、オリゴヌクレオチド合成のための反応性リン含有基であり、
式中、アルキルは分枝しているか、もしくは分枝していないC1からC5ラジカル、好ましくはイソプロピルであり、そしてR1はメチル、アリル(−CH2−CH=CH2)、または好ましくはβ−シアノエチル(−CH2−CH2−CN)であり、
そして式中、
Vは少なくとも3種の結合パートナー、例えば、原子または原子基、好ましくは窒素原子、炭素原子またはフェニル環を有する分枝単位であり、
そして式中、Aは式(IV):
【0018】
【化14】
【0019】
のアセタールであり、
ここでYおよびZはお互いに独立して、同一であるかまたは異なって、分枝しているかもしくは分枝していない、飽和もしくは不飽和で、適切ならば環状の、C1からC18までの炭化水素、好ましくはメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、2−ブチル、tert−ブチル、とりわけ好ましくはエチルであるか、または式中YおよびZが一緒に構造(V)または(VI)のラジカルであり、ここでR4はお互いに独立して同一であるか、または異なり、そしてそれはH、メチル、フェニル、分枝しているかもしくは分枝していない、飽和もしくは不飽和で、適切ならば環状の、C1からC18までの炭化水素、または構造(VII)のラジカルであり、そしてR5は同一であるかまたは異なり、そしてH、メチル、アルキル、O−メチル、O−アルキル、またはアルキルであり、ここでアルキルは分枝しているかもしくは分枝していない、飽和もしくは不飽和で、適切ならば環状の、C1からC18までの炭化水素であり、
【0020】
【化15】
【0021】
そして式中、
Lは、例えば、分枝しているかまたは分枝していないか、飽和または不飽和で、適切ならば環状の、C1からC18までの炭化水素、例えばアルキル−(CnH2n)−(式中、nは0ないし18,好ましくは3ないし8の整数である)であるか、またはポリエーテル−(CH2)k−[O−(CH2)m]o−O−(CH2)p−(式中、k、m、pはお互いに独立して0ないし4、好ましくは2の整数であり、そしてoは0ないし8、好ましくは2ないし4の整数である)であるか、またはアミン−(CH2)w−NH−(CH2)u−(式中、wおよびuはお互いに独立して0ないし18、好ましくは3ないし6の整数である)であるか、またはアミド−(CH2)q−C(O)−N−(CH2)r−もしくは−(CH2)q−N−C(O)−(CH2)r−(式中、qおよびrはお互いに独立して0ないし18、好ましくは1ないし5の整数である)である、XとAまたはXとVおよびVとAの結合に適切なリンカーである。この点に関して、リンカーLは酸素原子により分枝単位Vに結合していてもよい。
【0022】
この種の反応性単量体の個々の好ましい例としては:
【0023】
【化16】
【0024】
【化17】
【0025】
【化18】
【0026】
が挙げられる。
本発明はさらに、少なくとも1つのアセタール基により修飾されている、いずれかの配列のモノ、オリゴおよびポリヌクレオチドにも関する。
【0027】
少なくとも1つの式(I)の本発明の反応性単量体を使用することにより得ることができるモノ、オリゴ、およびポリヌクレオチドがとりわけ好ましい。
得ることができる例としては、ランダム配列を有し、そして少なくとも1つのアセタール基により修飾されている式VIIIの物質が挙げられ、
【0028】
【化19】
【0029】
式中(M)sはsが1以上である、お互いに結合したs単量体単位であり、X′は式(IX)
【0030】
【化20】
【0031】
(式中UはOまたはSであり、WはOH、SHまたはHであり、そしてQはOまたはNHである)のリン含有基であり、そしてzは1以上であり、
そしてl、v、a、L、VおよびAは先に記載した意味を有する。
【0032】
本発明の反応性単量体を好ましくはX′のホスホジエステル、H−ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミデート基によりモノ、オリゴまたはポリヌクレオチドに結合すると
【0033】
【化21】
【0034】
を形成する。
この点に関して、式(I)の反応性単量体をとりわけ末端に結合することができる。したがって、zはヌクレオチド鎖の分枝の程度に依存し、好ましくは1ないし10,そしてとりわけ好ましくは1または2である。本発明の別の利点は反応性単量体を選択的にDNAもしくはRNAオリゴヌクレオチドまたはDNAもしくはRNAポリヌクレオチドの3′および/または5′末端に、またはp−DNAもしくはp−RNAオリゴヌクレオチド、またはp−DNAもしくはp−RNAポリヌクレオチドの2′および/または4′末端に結合するという可能性である。これとは対照的に、遊離ジオール基は過ヨウ素酸塩により反応中に完全に酸化される。
【0035】
有効なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはすべて天然に存在するか、さもなければ分子認識または対合ができる合成ポリマーであり、そして主にリン酸ジエステルブリッジを含む反復構造を有する。前記分子認識または対合は選択的、安定および可逆的であること、そして例えば温度、pHおよび濃度により影響を受けてもよいという事実により特徴付けられる。例えば、分子認識はそれのみではないが、Watson−Crickの規則に従って、プリンおよびピリミジン塩基対合により成し遂げられる。天然に存在するヌクレオチド鎖の例としてはDNA、cDNAおよびRNAがあり、それらにおいては2−デオキシ−D−リボースまたはD−リボースにN−グリコシル結合している複素環塩基を含むヌクレオシドが、リン酸ジエステルにより結合している。非天然オリゴおよびポリヌクレオチドの好ましい例としては、DNA、cDNAおよびRNAの化学的に修飾された誘導体、例えばホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、メチルホスホネート類、2′−O−メチル−RNA、2′−O−アリル−RNA、2′−フルオロ−RNA、それらのLNA、またはPNAのようなDNAおよびRNAと対合できる分子(Sanghivi,Y.S.,Cook,D.P.,Carbohydrate Modification in Antisense Research,American Chemical Society,Washington 1994)、さもなければp−RNA、ホモDNA、p−DNA、CNA(ドイツ特許第19741715号,ドイツ特許第19837387号およびWO97/43232)のような、例えば特定の対合性により分子認識ができる分子が挙げられる。
【0036】
請求項1に記載の単量体ビルディングブロックを含む鎖長範囲は、好ましくは2から10000までの単量体単位であり、そして5から30までの単量体単位の鎖長がとりわけ好ましい。
【0037】
オリゴまたはポリヌクレオチドを製造するために使用できる適切な単量体単位は、とりわけデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのような天然に存在するヌクレオチドである。しかし、天然に存在しない合成ヌクレオチドを使用することも可能である。
【0038】
合成単量体単位の好ましい例としては2′−デオキシリボフラノシルヌクレオチド類、リボフラノシルヌクレオシド類、2′−デオキシ−2′−フルオロリボフラノシルヌクレオシド類、2′−O−メチルリボフラノシルヌクレオシド類、ペントピラノシルヌクレオチド類、3′−デオキシペントピラノシルヌクレオチド類が挙げられる。これらのヌクレオチドに適切な複素環塩基はとりわけ:プリン、2,6−ピアミノプリン、6−プリンチオール、ピリジン、ピリミジン、アデノシン、グアノシン、イソグアノシン、6−チオグアノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、チミジン、シトシン、イソシトシン、インドール、トリプタミン、N−フタロイルトリプタミン、ウラシル、カフェイン、テオブロミン、テオフィリン、ベンゾトリアゾールまたはアクリジンおよび、さらに共有結合的に結合した官能基を有する前記複素環体の誘導体も挙げられる。
【0039】
天然および非天然のアミノ酸、PNA単量体およびCNA単量体のような他の単量体単位を使用することも同様に可能である。
本発明と一致したオリゴおよびポリヌクレオチドはまた、分子認識に必要な単位に加えて、さらに、例えば検出、他の分子単位との結合、表面上もしくは他のポリマー上への固定、スペーシングまたはヌクレオチド鎖の分枝のような他の目的に役立つ分子部分を含む、分子をも含む。それらはとりわけ、オリゴヌクレオチドと蛍光染料、化学ルミネセンス分子、ペプチド、蛋白質、抗体、アプタマー、有機および無機分子との共有結合的、または安定な非共有結合的結合体、および異なる対合様式を有する2以上の対合システムの結合体を意味し、それらの結合体の例としては、DNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したp−RNAと、RNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したp−RNA、DNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したp−DNA、RNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したp−DNA、DNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したCNA、RNAまたは化学的に修飾されたその誘導体と結合したCNAが挙げられる。しかし、例えばガラス、シリコン、プラスチック、金またはプラチナのような支持物質表面上への固定はとりわけ興味深い。表面はまた、1以上の被覆層、好ましくはポリリシン、アガロースまたはポリアクリルアミドのような高分子被覆物を含んでいてもよい。被覆物は複数のスタガード層か、さもなければ配列されていない層を含んでいてもよい。この点において、個々の層は単分子層の形状であってもよい。
【0040】
本発明に関して、結合は分子、オリゴもしくはポリヌクレオチド、超分子複合体、またはポリマーのような成分と、1以上の他の、異なるもしくは同一の成分との共有結合または非共有結合を意味し、その結果それらは、それらの使用に必要な条件下で、安定な単位、結合体を形成する。この点に関して、結合は必ずしも共有結合である必要はないが、van der Waals相互作用、双極相互作用、とりわけ水素結合、またはイオン相互作用のような超分子力によって行なわれてもよい。
【0041】
さらに生物学的活性を有する有機または無機分子との結合体はとりわけ興味深い。
この点に関して記載することができる分子としては、医薬品、作物保護剤、錯化剤、酸化還元系、フェロセン系誘導体、レポーターグループ、ラジオアイソトープ、ステロイド、ホスフェート、トリホスフェート、ヌクレオシドトリホスフェート、リーディング(leading)構造の誘導体、遷移状態の類似体、脂質、複素環体、とりわけ窒素複素環体、糖質、分枝しているか、もしくは分枝していないオリゴまたはポリサッカライド、糖蛋白質、糖ペプチド、受容体もしくはその機能的部分、例えば膜結合受容体の細胞外ドメイン、代謝産物、メッセンジャー、病的変化の場合にヒトおよび動物体内で産生される物質、抗体もしくはその機能的部分、例えばFvフラグメント、1本鎖FvフラグメントもしくはFabフラグメント、酵素、線維成分、ウイルス、カプシドのようなウイルス成分、ウイロイド、およびそれらの誘導体、例えばアセテート、構造的に異なる化合物の集団のような物質ライブラリー、好ましくはオリゴマーもしくはポリマーペプチド、ペプチドイド、糖質、核酸、エステル、アセタールまたは複素環体のような単量体、脂質、ステロイドもしくは医薬品が作用する構造、好ましくは医薬品受容体、イオンチャンネル、とりわけ電位依存的イオンチャンネル、トランスポーター、酵素または微生物の生合成単位が挙げられる。
【0042】
本発明は同様にアルデヒドに修飾されたp−RNAおよびp−DNAオリゴヌクレオチドおよびp−RNAおよびp−DNAポリヌクレオチドに関し、それらは特定のアセタールから、例えば水性酸の手段によるか、または光化学的に容易に製造できる。
【0043】
アセタールオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの製造は出発物質として式(I)のアセタール類を使用することにより達成される。例としては、1以上のアセタール基を有する慣用のホスホロアミダイトを使用することが可能である。これらは固相合成の標準法によりオリゴまたはポリヌクレオチドに統合されてもよい(図2はこれを図に表示する)。
【0044】
そのようなアセタール基含有反応性単量体ビルディングブロックは、例えばアミノアセタール(2a、2b、6)とカプロラクトンを反応させることにより合成される(図3)(例えばZhang,J.;Yergey,A.;Kowalak,J.:Kovac,P.;Tetrahedron 54(1998)11783に記載)。得られたヒドロキシアセタール3a、3bまたは7は次に、適切なリン試薬との反応により、オリゴヌクレオチド合成のための反応性単量体に変換される(この例としては、I.Beaucage,S.L.,Iyer,R.P.,Tetrahedron 49(1993)を参照されたい)。
【0045】
代わりとなるものとしては、適切なヒドロキシアセタールをFinkelstein反応によりそのハライドから、またはアセタール化によりヒドロキシアルデヒドおよびアルコール成分から製造することが可能である。その後、反応型への変換は再び対応するリン試薬との反応により行われる。
【0046】
O−ニトロフェニル基を有する環状アセタールもとりわけ興味深い、なぜなら、それらは酸だけでなく、光の照射によりアルデヒドに変換できるからである。
その後、アセタールはオリゴヌクレオチド固相合成の標準法に従ってオリゴヌクレオチドに結合される(Beaucage,S.L.;Iyer,R.P.,Tetahedron 49(1993)6123;Caruthers,M.H.,Barone,A.D.;Beaucage,S.L.,Dodds,D.R.,Fisher,E.F.,McBride,L.J.,Matteucci,M.;Stabinksy,Z.;Tang,J.Y.,Methods Enzymol.154(1987)287;Caruthers,M.H.;Beaton,G.;Wu,J.V.;Wiesler,W.,Methods Enzymol.211(1992)3)。
【0047】
アセタールは、例えばホスホロアミダイト法のような一般的なオリゴヌクレオチド合成法のすべての反応条件に不活性である。
したがって、例えばテトラゾール、ベンジルチオテトラゾール、塩酸ピリジニウムなどによる活性化、無水酢酸およびN−メチルイミダゾールによるキャッピング、例えばヨウ素/水による酸化に対して不活性である。それらは同様に、ピバロイルクロリドによる活性化のような、H−ホスホネート法の反応条件に不活性である。
【0048】
さらに、アセタールはオリゴヌクレオチド脱保護のための塩基性反応条件に安定である。それらは慣例的に使用される濃縮水性アンモニア溶液(55℃、2〜10時間)に損なわれずに耐え、特定の場合に使用される代わりとなる試薬(エチレンジアミン、メチルアミン、ヒドラジン)のいずれにも攻撃されない(Hogrefe,R.I.;Vghefi,M.M.;Reynolds,M.A.;Young,K.M.;Arnold,L.J.Jr.,Nucreic Acids Res.21(1993)2031)。
【0049】
アルデヒド官能基は、アセタールオリゴヌクレオチドを水性酸(酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸など)と反応させることにより、または光の照射(このためには、図2の表示を参照されたい)によりアセタールから容易に遊離される(例としては、実施例8〜11)。両者の場合、アルデヒドオリゴヌクレオチドを過ヨウ素酸ナトリウムのような試薬から除去することは必要でない。いつも必要ではないが、酸で中和することで十分である。もし酸を中和した塩の量がアルデヒドの変換を妨害するなら、例えばゲル濾過、透析、逆相抽出のような一般的な方法により除去してもよい。
【0050】
このようにして得られたアルデヒドオリゴまたはポリヌクレオチドは参考文献に記載されたすべての結合反応に使用してもよい(例えば、Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press、San Diego 1996;Timofeev、E.N.,Kochetkova,S.V.,Mirzabekov,A.D.:Florentiev,V.L.,Nucreic Acids Res.24(1996)3142)。蛋白質およびペプチド、蛍光染料、他のオリゴヌクレオチドとオリゴおよびポリヌクレオチドの結合、ならびに表面および他のポリマー上にオリゴまたはポリヌクレオチドを固定することはとりわけ興味深い。
【0051】
さらに、アルデヒドに修飾されたオリゴまたはポリヌクレオチドは、それらのN末端にシステインを有するペプチド、蛋白質、または他の有機もしくは無機分子との結合のための図1のCに示された反応を使用することを可能にする。この場合、一定のアルデヒドの化学構造とともに、さらに改変が可能なチアゾリジン誘導体が形成される(Lemieux,G.A.;Bertozzi,C.R.,Trends in Biotechnology 16(1998)506;Liu,C.−F.;Rao,C.;Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.118(1996)307)。この反応は低い反応物質濃度およびpHで起こるという利点を有する。
【0052】
アルデヒドの保護基としてのアセタールの使用はさらにオリゴまたはポリヌクレオチドを結合するためのとりわけ簡単な方法:支持物質上への結合を可能にする。
【0053】
この目的のために、オリゴヌクレオチド固相合成の支持物質上に固定されたままの、完全にまたは部分的に保護されたままのアセタールオリゴヌクレオチドまたはアセタールポリヌクレオチドは、対応するアルデヒドオリゴヌクレオチドまたはアルデヒドポリヌクレオチドに変換される。水性酸または光の照射により可能になるこの反応が、支持物質からオリゴまたはポリヌクレオチドを除去しないということは重要である。次に支持物質に結合したアルデヒド−ヌクレオチド鎖を適切な反応パートナーと反応させる(その例として、図1を参照されたい)。その後、オリゴまたはポリヌクレオチド結合体は水性アンモニアまたは代わりの試薬(例えば、エチレンジアミン、メチルアミン、ヒドラジン)により支持物質から除去され、残りの保護基、DNAの場合は、例えば塩基の環外アミノ基上のベンゾイルおよびイソブチリル保護基が除去される。図1の例として記載された生成物の場合に、結合反応中に形成される結合が上記の脱保護条件に対して安定なことが前提条件である。支持物質に結合したオリゴまたはポリヌクレオチドの結合反応は、過剰の結合成分および例えば、還元剤のような他の試薬が単純な洗浄により除去できるという利点を有する。したがって、特有の不安定性のために直接オリゴヌクレオチド固相合成が利用できない分子とオリゴまたはポリヌクレオチドの結合体を得ることも可能である。
【0054】
代表的な態様:
一般的な予備的注意:
特記しない限り、Aldrichの試薬およびRiedel(p.a.)の溶媒を使用した。薄層クロマトグラフィー(TLC)はシリカゲル 60 F254(Merck)を含むプレート上で行った。カラム−クロマトグラフィーによる分離はシリカゲル 60(Merck、230〜400メッシュ)上で行った。1H−NMRスペクトルはBruker DRX 400スペクトロメーターを使用して400MHzで測定し、化学シフトはテトラメチルシラン(TMS)に対するδ値として表した。IRスペクトルはGraseby Specac 10500 ATR unitを備えたPerkin Elmer Paragon 1000FT−IRを使用して測定した。DNAオリゴヌクレオチドはPE Biosystems Expedite 8905を使用してホスホロアミダイト法に従って製造した。アセタールホスホロアミダイトおよびDNAアミダイトは乾燥アセトニトリル中で0.1M溶液として使用した。カップリングは活性化剤としてテトラゾールを使用して行った。p−RNAオリゴヌクレオチドには、以前に記載した合成条件を使用した(ドイツ特許第19741715号)。エレクトロスプレー質量分析(ESI―MS)はFinnigan LCQ instrumentを使用して陰性イオン化モードで測定した。
【0055】
個々の物質に示された番号付けは図3から5までに使用される数字を表す。
図3は例として、アセタールホスホロアミダイトの合成を記載し、図4は、DNAアセタールおよびDNAアルデヒドの例を示し、図5はp−RNAアセタールおよびp−RNAアルデヒドの例を示す。
【0056】
【実施例】
反応性単量体の合成
実施例1:N−(2,2−ジメトキシエチル)−6−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルアミドホスホロアミダイト]−ヘキサミド 5aの合成:
2.19g(10mmol、[219.28])のN−(2,2−ジメトキシエチル)−6−ヒドロキシヘキサミド 3aを5.17g(40mmol、4等量、[129.25])のN−エチル−ジイソプロピルアミン(Hunigs Base)と一緒に40mlの乾燥ジクロロメタンに溶解する。2.6g[11mmol、1.1等量,[236.68]]モノ(2−シアノエチル)N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト 4を15分かけて滴下して加える。1時間後、TLC(酢酸エチル/n−ヘプタン2:1)は完全な変換を示す。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣を直接クロマトグラフィーカラムにかける。数滴のトリエチルアミンを含む酢酸エチル/n−ヘプタン(2:1)で溶出し、無色オイルとして化合物 5a(C19H38N3O5P;[419.51])2.48g(59%)を得る。
【0057】
【化22】
【0058】
【化23】
【0059】
実施例2:N−(2,2−ジエトキシエチル)−6−O−[(2−シアノエチル)−N,N−ジイソプロピルアミドホスホロアミダイト]−ヘキサミド 5b:
2.47g(10mmol、[247.34])のN−(2,2−ジエトキシエチル)−6−ヒドロキシヘキサミド 3bを5.17g(40mmol、4等量、[129.25])のN−エチル−ジイソプロピルアミン(Hunigs Base)と一緒に40mlの乾燥ジクロロメタンに溶解する。5ml ジクロロメタンに溶解した2.6g(11mmol、1.1等量,[236.68])のモノ(2−シアノエチル)N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト 4を30分かけて滴下して加える。さらに30分後、TLC(酢酸エチル/n−ヘプタン2:1)は完全な変換を示す。溶媒はロータリーエバポレーターで除去し、残渣は酢酸エチル/n−ヘプタン(2:3)に溶解する。沈殿した塩酸は吸引により濾過し、濾液は直接クロマトグラフィーカラムにかける。数滴のトリエチルアミンを含む酢酸エチル/n−ヘプタン(1:1)で溶出し、無色オイルとして化合物 5b(C21H42N3O5P;[419.51])2.96g(66%)を得る。
【0060】
【化24】
【0061】
実施例3:N−(2,2−ジエトキシブチル)−6−O−[(2−シアノエチ ル)−N,N−ジイソプロピルアミドホスホロアミダイト]−ヘキサミド 8:
1.75g(6.35mmol、[275.39])のN−(2,2−ジエトキシブチル)−6−ヒドロキシヘキサミド 7を1.64g(12.7mmol、4等量、[129.25])のN−エチルジイソプロピルアミン(Hunigs Base)と一緒に30mlの乾燥ジクロロメタンに溶解する。2ml ジクロロメタンに溶解した1.65g(6.99mmol、1.1等量,[236.68])のモノ(2−シアノエチル)N,N−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト 4を40分かけて滴下して加える。さらに30分後、TLC(酢酸エチル/n−ヘプタン10:1)は反応物の完全な消費を示す。反応はメチノールで停止し、溶媒はロータリーエバポレーターで除去する。残渣は直接クロマトグラフィーカラムにかける。数滴のトリエチルアミンを含む酢酸エチル/n−ヘプタン(10:1)で溶出し、無色オイルとして化合物 8(C23H46N3O5P;[475.61])1.87g(62%)を得る。
【0062】
【化25】
【0063】
アセタールおよびアルデヒドに修飾されたオリゴヌクレオチドの合成:
アセタールによるアルデヒドの導入はDNAおよびp−RNAオリゴヌクレオチドの両方に対して示される。図4および5はオリゴヌクレオチドの例の配列を示す。
【0064】
実施例4:ジエチルアセタール 5b由来のDNAアセタール 9(K3194/3196 O4)
オリゴヌクレオチド合成は装置の製造業者に提供されたプロトコルに従って、1μmolのスケールで行う。ホスホロアミダイト 5bの0.1M溶液は標準条件下で最後の単量体として結合させる。支持物質に結合したオリゴヌクレオチドを除去し、25%水性アンモニア溶液、80℃、10時間の処理により脱保護する。支持物質を除去後、溶液を減圧下で濃縮し、残渣を水に溶解する。オリゴヌクレオチドはRP−HPLCカラムにより精製する。カラム:Merck LiChrospher RP 18,10μM、分析用:4x250mm、流速=1.0ml/分、セミ分取用:10x250,流速=3.0ml/分;バッファー:A:水中、0.1M トリエチルアンモニウム酢酸(TEAA)pH=7.0、B:アセトニトリル/水(95:5)中、0.1M TEAA pH=7.0;グラジエント:分析用および分取用分離のために100分で0% Bから100% B。保持時間 DNAアセタール 9:22.8分;MS:計算値[6193]、実測値[6195]
【0065】
実施例5:ジエチルアセタール 8由来のDNAアセタール 11(K3208/3214/3218 O16)
オリゴヌクレオチド合成および後処理は実施例4に記載のように行う。保持時間 DNAアセタール 11:23.4分;MS:計算値[6222]、実測値[6221]
【0066】
実施例6:ジエチルアセタール 5b由来のp−RNAアセタール 13(K3168 16)
オリゴヌクレオチド合成は実施例4に記載のように行う。このプロトコルから逸脱して、p−RNAにはより長い結合時間および活性化剤塩酸ピリジニウムが使用された。この場合、活性化剤として塩酸ピリジニウムを使用して、アセタールホスホロアミダイトも結合させる。初めに、ジクロロメタン中のジエチルアミン1.5%(w/v)溶液を支持物質に添加し、混合物を暗所で振とうしながら室温で一晩(15時間)インキュベートする。溶液を廃棄し、支持物質を以下の溶媒:CH2Cl2、アセトン、水それぞれについて3回ずつ洗浄する。次にp−RNAをCPG支持物質から除去し、水性24%ヒドラジン水和物を4℃で18時間処理することにより脱保護する。ヒドラジンはSep−Pak C18カートリッジ(0.5g Waters,No.20515;アセトニトリル 10mlによる活性化、5倍容積のトリエチルアンモニウムビカーボネートバッファー(TEAB) pH=7.0により希釈されたヒドラジン溶液の結合、TEABによる洗浄およびTEAB/アセトニトリル(1:2)によるオリゴヌクレオチドの溶出)を使用して固相抽出により除去する。オリゴヌクレオチド含有画分を合わせ、減圧下で濃縮して乾燥する。分析および分取用精製は実施例4に記載のようにRP−HPLCにより行う。保持時間 DNAアセタール 13:22.0分;MS:計算値[2719]、実測値[2718]
【0067】
実施例7:ジエチルアセタール 8由来のp−RNAアセタール 15(K3208/3214/3218 O16)
オリゴヌクレオチド合成および後処理は実施例6に記載のように行う。保持時間 p−RNAアセタール 15:24.0分;MS:計算値[2747]、実測値[2747]
アセタールオリゴヌクレオチドからアルデヒドオリゴヌクレオチドへの変換
一般的プロトコル:
アセタールオリゴヌクレオチドは水に溶解し、過剰の水性酸(例えばHCl)と混合する。このようにして得られた反応溶液中のオリゴヌクレオチド濃度は通常20および60μMであり、大過剰の酸(5x104mol等量)が使用される。溶液は室温でインキュベートし、反応の進行はHPLCでモニターする。アセタールオリゴヌクレオチドの完全な変換後、溶液を水性NaOHで中和する。このようにして得られたアルデヒド−オリゴヌクレオチド溶液は直接結合反応に使用するか、またはゲル濾過もしくは固相抽出のような常法により脱塩してもよい(実施例6参照)。
【0068】
実施例8:DNAアセタール 9由来のDNAアルデヒド 10
26nmolのアセタール 10は1mlの1M水性HClと混合し、室温で6.5時間インキュベートする。反応の進行は実施例4で示された条件下で、RP−HPLCにより追跡できる。酸は1N 水性NaOHを添加することにより中和する。このようにして得られたDNA−アルデヒド溶液は直接結合反応に使用するか、またはRP−HPLCにより精製してもよい。保持時間 DNAアルデヒド10:20.6分。
【0069】
実施例9:DNAアセタール 11由来のDNAアルデヒド 12
120nmolのアセタール 11は実施例8に記載のように2mlの1M 水性HClと反応させ、DNAアルデヒド 12を得る。保持時間 21.5分;MS:計算値:[6148]、実測値:[6147]。
【0070】
実施例10:DNAアセタール 13由来のp−RNAアルデヒド 14
16nmolのアセタール 13は実施例8に記載のように400μlの0.5M 水性HClと反応させ、DNAアルデヒド 14を得る。保持時間 19.2分;MS:計算値:[2645]、実測値:[2645]。
【0071】
実施例11:DNAアセタール 15由来のp−RNAアルデヒド 16
50nmolのアセタール 15は実施例8に記載のように1mlの1M 水性HClと反応させ、DNAアルデヒド 16を得る。保持時間 20.0分;MS:計算値:[2673]、実測値:[2672]。
【0072】
アルデヒドオリゴヌクレオチドの結合反応:
一般的プロトコルA(溶液中の結合):
(I)ヒドラジンまたはアミン(5〜20mM)の溶液10μLおよび100mM 水性NaCNBH4溶液10μLを酢酸バッファー(pH5)で500μLに希釈する。これに、数μLの水に溶解した1〜5nmolのアルデヒドオリゴヌクレオチドを添加する。室温で2時間放置後、溶液をゲル濾過により脱塩し、結合体をHPLCにより精製する。
(II)代わりとして、酸を中和することにより得られたアルデヒド−オリゴヌクレオチド溶液(cf.3.1.3)を100mole等量のヒドラジドまたはアミンおよび1000mole等量のNaCNBH4と混合してもよい。混合物は必要ならば、酢酸バッファーpH5で希釈する。室温で2時間放置後、溶液をゲル濾過により脱塩し、結合体はHPLCにより精製する。
【0073】
一般的プロトコルB(固相上の結合):
初めに、アセタールオリゴヌクレオチドは実施例4および実施例6に記載のように固相合成により製造する。支持物質に結合したオリゴヌクレオチドは次にジクロロメタン中のジエチルアミン1.5%(w/v)溶液と初めに混合し、暗所で振とうしながら室温で一晩(15時間)インキュベートする。溶液を廃棄し、支持物質を以下の溶媒:CH2Cl2、アセトン、水それぞれについて3回ずつ洗浄する。支持物質に結合したアセタールオリゴヌクレオチドは、支持物質を0.1から1Mの水性酸(例えばHCl)で2時間、室温で処理することにより、支持物質に結合したアルデヒドオリゴヌクレオチドに変換する。次に濾液が中性になるまで水で洗浄する。結合反応のために、数時間、室温で振とうしながら、酢酸バッファー中のヒドラジドまたはアミンおよびNaCNBH4とのインキュベーションを行う。次に結合体を支持物質から除去し、ヒドラジンまたはアンモニアによる処理により脱保護する(実施例4および6参照)。後処理および精製は実施例6に記載のように行う。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、アルデヒドオリゴヌクレオチドの反応を示した図である。AおよびBは、生体分子を結合するために使用することができるアルデヒドの反応の先行技術由来の反応例であり、Cは、アルデヒドに修飾されたオリゴまたはポリヌクレオチドのN末端にシステインを有するペプチド、蛋白質、または他の有機もしくは無機分子との結合反応の例である。
【図2】図2は、アセタールからのアルデヒドオリゴヌクレオチドの製造についての反応経路を示す図である。
【図3】図3は、アセタールホスホロアミダイトの合成についての反応経路を示す図である。
【図4】図4は、DNAアセタールおよびDNAアルデヒドの例を示す図である。
【図5】図5は、p−RNAアセタールおよびp−RNAアルデヒドの例を示す図である。
Claims (19)
- l、vはお互いに独立して0または1であり、そしてaは1ないし5の整数である、式(I)の反応性単量体:
Xはオリゴヌクレオチド合成に適切な反応性リン含有基であり、
Vは少なくとも3つの結合パートナーを有する、原子または分子からなる分枝単位であり、
Aは式(IV)のアセタールであり:
そして式中、
LはXをAにまたはXをVに、そしてVをAに結合するために適切なリンカーである。 - 分枝単位Vが窒素原子、炭素原子またはフェニル環である、請求項1または2に記載の反応性単量体。
- ラジカルYおよびZがお互いに独立してメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、2−ブチル、tert−ブチル、とりわけ好ましくはエチルである、請求項1から3のいずれか一項に記載の反応性単量体。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載の反応性単量体であって、
式中、リンカーLは分枝しているか、分枝していないか、もしくは環状で、飽和されているか、もしくは不飽和のC1からC18までの炭化水素、好ましくは(CnH2n)アルキルラジカル(式中、nは0ないし18,好ましくは3ないし8の整数である)であるか、またはポリエーテル−(CH2)k−[O−(CH2)m]o−O−(CH2)p−(式中、k、m、pはお互いに独立して0ないし4、好ましくは2の整数であり、そしてoは0ないし8まで、好ましくは2ないし4の整数である)であるか、またはアミン−(CH2)w−NH−(CH2)U−(式中、wおよびuはお互いに独立して0ないし18、好ましくは3ないし6の整数である)であるか、またはアミド−(CH2)q−C(O)−N−(CH2)r−もしくは−(CH2)q−N−C(O)−(CH2)r−(式中、qおよびrはお互いに独立して0ないし18、好ましくは1ないし5の整数である)であり、リンカーLは酸素ブリッジによりVに結合することも可能である。 - 少なくとも1アセタール基により修飾されている、モノ、オリゴまたはポリヌクレオチド。
- 少なくとも1つの式(I)の反応性単量体をモノ、オリゴまたはポリヌクレオチドの末端にを結合することにより得られる、請求項8に記載のモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド。
- ランダム配列中の天然に存在するヌクレオチド、好ましくはDNA、cDNAまたはRNA、および/またはランダム配列中の非天然ヌクレオチド、例えば化学的に修飾されたDNA、cDNAまたはRNA、好ましくはホスホロジチオエート、メチルホスホネート、2′−O−メチルRNA、2′−O−アリルRNA、2′−フルオロRNA、LNA、PNAp−RNA、ホモDNA、p−DNA、CNAを含む、請求項8から10のいずれか一項に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載の単量体ビルディングブロックを含む鎖が2から10,000単量体単位、好ましくは5から30単量体単位を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド。
- 共有結合により、または安定して非共有結合的により結合した分子部分、好ましくは蛍光染料、ペプチド、蛋白質、抗体、ポリマー、アプタマー、有機分子、無機分子、他のオリゴもしくはポリヌクレオチド、および/または被覆されているか、もしくは被覆されていない固体の支持物質の共有結合的に、または安定して非共有結合的に結合した表面を含む、請求項8から12のいずれか一項に記載のモノ、オリゴまたはポリヌクレオチド。
- 少なくとも1アルデヒド基により修飾されていて、ヌクレオチド鎖がp−RNA、ホモ−DNA、p−DNAまたはCNAを含む、モノ、オリゴ、およびポリヌクレオチド。
- a)請求項1から7のいずれか一項に記載の反応性単量体をオリゴヌクレオチドにカップリングすること、および
b)アルデヒドを生成するために酸または光で処理することを含む、アルデヒドにより修飾されたオリゴまたはポリヌクレオチドを製造するための方法。 - アルデヒド基をさらなる結合反応、好ましくはアミン、ヒドラジンと、または末端にシステインを有するペプチド、蛋白質、有機分子と結合反応させる、請求項15に記載の方法。
- オリゴまたはポリヌクレオチドの製造が完全に、または部分的に固相オリゴヌクレオチド合成の条件下で行われる、請求項15または16に記載の方法。
- オリゴもしくはポリヌクレオチド合成、またはオリゴもしくはポリヌクレオチド複製のための、とりわけホスホロアミダイト法またはPCRにおける、請求項1から7のいずれか一項に記載の反応性単量体、または請求項8から13のいずれか一項に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチドの使用。
- 請求項16に記載の結合反応のための請求項14に記載のモノ、オリゴもしくはポリヌクレオチドの使用。
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