JP2015536906A - 一過性のバイオコンジュゲート合成のための、ジアリールスルフィド骨格を有する光開裂性リンカー分子 - Google Patents

一過性のバイオコンジュゲート合成のための、ジアリールスルフィド骨格を有する光開裂性リンカー分子 Download PDF

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Abstract

本明細書は、オリゴヌクレオチド及びペプチドなどの二つの生体分子を結合するために、光開裂性リンカーとして使用することができる光開裂性化合物に関する。本明細書は、前記光開裂性化合物を合成するための方法に更に関する。【選択図】図１

Description

本明細書は、例えばオリゴヌクレオチドやペプチドなど、二つの生体分子を結合するために光開裂性リンカーとして使用され得る光開裂性化合物に関する。本明細書は、前記光開裂性化合物を合成するための方法に更に関する。
光開裂性化合物は、生体分子、例えば核酸及びそれらの誘導体、タンパク質、ペプチド並びに炭水化物の合成のために用いられるヌクレオシド、ヌクレオチド、糖類及びアミノ酸中に存在する官能基のブロッキングにおいて、保護基として重要な役割を果たす。そのような化合物は、保護された官能基の脱保護が光曝露によって簡単に実施され得るという利点を有する。そのため、光開裂性化合物は、マイクロアレイなど固体支持体上のオリゴヌクレオチド又はペプチドのフォトリソグラフィーに基づく空間的に分解された合成のための基礎を提供する。マイクロアレイの合成のための光解離性化合物の使用はよく知られている(Pease, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 5022-5026), Hasan, et al. Tetrahedron 53 (1997) 4247-4264)。
光開裂性化合物はまた、様々な要素、例えば二つの生体分子、生体分子と固体相、生体分子とストレプトアビジンを結合するために光開裂性リンカー分子として使用することもできる。光の照射により二つの個々のオリゴヌクレオチドを放出し、次にそれらが二本鎖ＤＮＡを形成して生物学的機能を示すことができる一本鎖分子を生化学的又は生物学的アッセイに送達するために、例えば二つの異なるオリゴヌクレオチドが光開裂性化合物によって結合され得る。他の考えられる用途としては、例えばストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズなどのアフィニティー精製によってアッセイからオリゴヌクレオチドが得られるように、二つには光照射によってアフィニティー樹脂からオリゴヌクレオチドが遊離されるように、オリゴヌクレオチドを光開裂性化合物によってビオチン分子に結合することである。
更に他の考えられる用途としては、前述のオリゴヌクレオチド−光開裂性化合物−ビオチン構造が、オリゴヌクレオチドがタンパク質に結合するアプタマーである場合にプルダウン精製又はプルダウンアッセイにおいて有用であり得ることである。
上記化合物によって光開裂可能に結合している要素は、光曝露によって簡単に、相互に分離することができる。そのような構成要素は良く知られている(Olejnik, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7590-7594; Olejnik, et al. Nucleic Acids Res. 26 (1998) 3572-3576; Olejnik, et al. Nucleic Acids Res. 27 (1999) 4626-4631)。
当技術分野で言われている光開裂性化合物の主な欠点は、光開裂性化合物を開裂するために、近紫外線域（３６５ｎｍ以下）の光が共有結合の開裂のために使用されなければならないことである。そのような波長を生成するのに適した光源は、例えば水銀アークランプ、エキシマレーザー、ＵＶ−ＬＥＤ及び周波数増倍固体レーザーである。そのような光源は高い購入コストを特徴とし、限られた光出力しか提供せず、寿命も短く、全体の高い運転コストにつながる。上記で言及した光源のいくつかは危険な物質、例えば水銀を含有するため、労働安全を確保するための適切な行動及び適正な廃棄が必要であり、それが更にコストを増大させる。
上記で言及した光源のいくつかは広いスペクトルの波長を生成し、例えば水銀アークランプは紫外から赤外までの範囲の光を放射し、その両方とも、生体分子との関連において使用された場合に不都合な作用を有する。例えば紫外光は、合成されたＤＮＡにより吸収されてリン酸骨格のラジカル開裂による鎖内でのランダムな切断、グアニン塩基の酸化及びそれに続く鎖の切断、又は特にチミン塩基の光二量体化をもたらし得る。更に、紫外光は特定のアミノ酸の破壊、例えばラジカル酸化によるトリプトファンの破壊、又は硫黄酸化によるシステイン及びメチオニンの破壊ももたらし得る。このため、生体分子関連の実験は、光開裂性化合物の開裂のためのそのような紫外光の使用に影響される。一方、赤外光は、これも実験の結果に影響を与える実験装置の昇温をもたらす。
したがって、上記の欠点を示さない光開裂性化合物の提供が本明細書の目的である。
本明細書は、例えばオリゴヌクレオチドやペプチドなど、二つの生体分子を結合するために光開裂性リンカーとして使用され得る光開裂性化合物に関する。可視光を照射すると、リンカーは開裂され、それにより生体分子を二つ放出する。より正確には、本明細書は、以下の式
[式Ｉ］


［上式中、Ａは-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ（ＣＨ３）-、-ＣＨ（ＣＨ３）-ＣＨ２-であり、Ｒ３はＨ、メチル基又はエチル基であり、Ｒ２はホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネート、リン酸ジエステル又はリン酸トリエステルであり、ここで、Ｒ２が式-Ｏ-Ｐ（Ｏ）-（ＯＲ４）-（ＯＨ）のリン酸ジエステルの場合、Ｒ４はアルキルもしくは置換アルキル、又はヌクレオシドもしくはヌクレオチドであり、且つここで、Ｒ２が式-Ｏ−Ｐ（Ｏ）−（ＯＲ４）−（ＯＲ５）のリン酸トリエステルの場合、Ｒ４及びＲ５は、各々アルキルもしくは置換アルキル、又はヌクレオシドもしくはヌクレオチドであるか、あるいはオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間部分を共に形成し、且つＲ１はフェニルカルボン酸アミドであり、ここで官能基はアミノ基によってフェニルカルボン酸アミドに結合している］
の光開裂性化合物に関する。
本明細書は、ａ）出発物質としてのｐ−ジエチルベンゼンの提供、ｂ）フェニル環の臭素化、ｃ）臭素に対してパラ位の硝酸及び硫酸における得られた化合物のニトロ化、ｄ）精製及び結晶化、ｅ）ベンジル位での該化合物のヒドロキシメチル化、ｆ）置換チオフェノールを用いた芳香族臭素基のアリールスルフィドへの変換、ｇ）精製、ｈ）アルコールのクロロ炭酸塩への変換、ｉ）クロロ炭酸塩のヌクレオシドとの反応及びヌクレオシドのホスファイト化剤との反応、又はクロロ炭酸塩のアミノ酸誘導体との反応、の工程を含む上記光開裂性化合物の調製のための方法に更に関する。
オリゴヌクレオチド合成のためのビルディングブロックとしての光開裂性スペーサーアミダイトを示す。 オリゴヌクレオチド合成のためのビルディングブロックとしての光開裂性アミノ修飾剤アミダイトを示す。 オリゴヌクレオチド合成のためのビルディングブロックとしての光開裂性ビオチン修飾剤アミダイトを示す。 光開裂性リンカーにより結合された二つの例示的オリゴヌクレオチド、及び光の照射による開裂部位を示す。
以下の定義は本明細書で使用される種々の用語の意味及び範囲を例示及び定義するために記載される。
基−Ａ−Ｏ−中の文字Ａは、１から２個までの線状に共有結合的に結合した原子を含む「断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）リンカー」、例えばメチレン−又はエチレン−を表す。用語「断片化リンカー」は本明細書において当業者に周知の意味で用いられており、光化学において一次光過程を化学開裂反応に変換することによりその光開裂性化合物の光に誘導される分裂を達成する部分として用いられる部分に関する。
用語「アルキル」は、炭素原子１から１２個を有する一価の直鎖状又は分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味する。特定の実施態様において、アルキルは１から７個の炭素原子を有し、また、より特定の実施態様においては１から４個の炭素原子を有する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、又はｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
用語「アミノ」は、式−ＮＲ’Ｒ’’（式中、Ｒ’及びＲ’’は独立して、水素、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリールである）の基を意味する。あるいは、Ｒ’及びＲ’’は、それらが結合している窒素と共に、ヘテロシクロアルキルを形成し得る。用語「第一級アミノ」は、Ｒ’とＲ’’の両方が水素である基を意味する。用語「第二級アミノ」は、Ｒ’が水素であり、Ｒ”が水素ではない基を意味する。用語「第三級アミノ」は、Ｒ’とＲ’’の両方が水素ではない基を意味する。特定の第二級アミン及び第三級アミンは、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、フェニルアミン、ベンジルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン及びジイソプロピルアミンである。
用語「アリール」は、６から１０個の炭素環原子を含む一価の芳香族炭素環式単環式又は二環式環系を意味する。アリール部分の例としては、フェニル及びナフチルが挙げられる。
用語「生体分子」は、本明細書において当業者に周知の意味で用いられ、生存生物により産生される任意の有機分子、あるいは人工的に生成されるかかる化合物の任意の誘導体を指し、このようなものとして大きなポリマー分子、例えばタンパク質、多糖類、炭水化物、脂質、核酸及びオリゴヌクレオチド、並びに小分子、例えば一次代謝産物、二次代謝産物及び天然産物が挙げられる。
用語「官能基」は、本明細書において当業者に周知の意味で用いられ、化学分子の一部を形成し、自らが特徴的な反応を経て、そして多くの場合においてその分子の残りの部分の反応性に影響を及ぼす、数多くの原子の組み合わせのいずれかを指す。典型的な官能基は、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、カルボニル、アミノ、アジド、アルキニル、チオール及びニトリルである。
用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、３又は４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である、５から１２個の環原子の一価の芳香族複素環単環式又は二環式環系を意味する。ヘテロアリール部分の例には、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル又はキノキサリニルが含まれる。
用語「ヌクレオチド間部分」は、本明細書において当業者に周知の意味で用いられ、二つのヌクレオシド間の架橋を形成する任意の共有結合した原子又は分子を指す。ＤＮＡの典型的なヌクレオチド間部分は、ホスホジエステル部分である。
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、リボース核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマーに対応させ得るポリマー又はその類似体を指す。これは、ＲＮＡやＤＮＡといったヌクレオチドのポリマーとその合成型、修飾（例えば化学的又は生化学的に修飾された）型、及び混合ポリマー（例えばＲＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットの両方を含むもの）を含む。例示的な修飾には、メチル化、一又は複数の天然ヌクレオチドの類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合（メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメート等）、ペンダント部分（ポリペプチド等）、インターカレーター（アクリジン、ソラレン等）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（アルファアノマー核酸等）、が含まれる。また、水素結合及び他の化学的相互作用によって指定された配列に結合するポリヌクレオチドの能力を模倣する合成分子も含まれる。核酸の合成型は他の結合（例えば、Nielsen, et al., Science 254 (1991) 1497-1500に記載されているようなペプチド核酸）を含むことができるが、典型的には、ヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合により結合する。核酸は、例えば、染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば、発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の生成物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーであり得るか、又はそれらを含んでもよい。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖又は三本鎖であることができ、特定の長さに限定されない。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示した任意の配列に加え、相補配列を含むか、又はコード化する。
用語「ヌクレオシド」は、本明細書において当業者に周知の意味で用いられ、プリン又はピリミジンなどの塩基部分を含有する窒素を持つ分子を指し、ここで塩基部分は、デオキシリボース、リボース、アラビノース、キシロース又はリキソースなどのペントースに結合しているか、あるいはヘキソース糖部分に結合している。ヌクレオシドを形成する典型的なプリン塩基又はピリミジン塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、５−メチルシトシン及びウラシルを含む。
用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的に一本鎖ＤＮＡであって、長さが７５ヌクレオチド未満であるように設計された核酸配列を通常指す。
用語「ペプチド」は、本明細書において当業者に周知の意味で用いられ、線状鎖に配列され、且つ隣接アミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基の間のペプチド結合によって一緒に結合したアミノ酸からなる有機化合物を指す。
用語「ホスホラミダイト」は、本明細書において当業者に周知の意味で用いられ、それ自体が酸素によって例えばベータ−シアノエトキシ−等の保護基及びジアルキル化された窒素に結合している（ＩＩＩ）価の蛍リン光体に、糖ヒドロキシル部分により結合しているヌクレオシドを指す。
用語「光開裂性」は、本明細書において当業者に周知の意味で用いられ、特定の波長での照射によって開裂され得る特定の結合を有する基を指す。用語「光開裂化合物」は、特定の光の照射中に、照射により二つ以上の独立した分子に解離する部分を含有する化合物を指す。
用語「保護基」は、合成化学においてこの語に慣用的に用いられている意味で、化学反応が別の非保護反応部位で選択的に行われることができるように、多官能化合物における反応部位を選択的にブロックする基を意味する。保護基は、適当な時点で除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基又はヒドロキシ保護基である。
本明細書に記載の新規の光開裂性保護基には、限定されないが、２−ニトロベンジルオキシカルボニル−（ＮＢＯＣ）、２−ニトロフェニル−エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）、２−（３，４−メチレンジオキシ−２−ニトロフェニル）−プロピルオキシ−カルボニル（ＭｅＮＰＰＯＣ）、２−（３，４−メチレンジオキシ−２−ニトロフェニル）−オキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）、２−（２−ニトロフェニル）−プロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）、ジメトキシ−ベンゾ−イニリル（ｉｎｙｌｙｌ）−オキシカルボニル（ＤＭＢＯＣ）、２−（２−ニトロフェニル−エチルスルホニル（ＮＰＥＳ）、（２−ニトロフェニル）−プロピルスルホニル（ＮＰＰＳ）等が含まれる。
結合基という用語定義の文脈での用語「飽和（した）」は、本明細書において当業者に周知の意味で用いられ、その基のすべての員がそれぞれの隣接する原子（単数又は複数）に単結合により結合している結合基に関する。したがって、飽和炭化水素鎖は式-（ＣＨ２）ｎ−により表され、ｎは１から２までの範囲の整数である。
用語「固体支持体」は、本明細書において当業者に周知の意味で用いられ、大きな表面積を有し、その表面に有機分子が、結合形成により結合することができるか、又は電子的もしくは静的相互作用、例えば官能基による結合形成により吸着され得る、任意の不溶性且つ剛性もしくは半剛性の無機性又は有機性物質を指す。
用語「置換（されている）」は、特定の基が一又は複数の置換基を有することを意味する。任意の基が複数の置換基を有することができ、様々な可能な置換基が提供される場合、置換基は独立して選択され、同じ置換基である必要はない。用語「非置換である」は、特定の基が置換基を有しないことを意味する。用語「置換されていてもよい」は、特定の基が非置換であるか、あるいは可能な置換基の群から独立して選択される一又は複数の置換基により置換されていることを意味する。置換基の数を示す場合、用語「一又は複数の」は、一置換基から最も多い可能な置換数まで、つまり、一個の水素から最大すべての水素を置換基で置き換えることを意味する。
本明細書は、以下の式
［式Ｉ］


［式中、Ａは-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ（ＣＨ３）-、-ＣＨ（ＣＨ３）-ＣＨ２-であり、Ｒ３はＨ、メチル基又はエチル基であり、Ｒ２はホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネート、又はリン酸ジエステルもしくはリン酸トリエステルであって、ここで、Ｒ２が式-Ｏ−Ｐ（Ｏ）−（ＯＲ４）−（ＯＨ）のリン酸ジエステルの場合、Ｒ４はアルキルもしくは置換アルキル、又はヌクレオシドもしくはヌクレオチドであり、また、Ｒ２が式-Ｏ−Ｐ（Ｏ）−（ＯＲ４）−（ＯＲ５）のリン酸トリエステルの場合、Ｒ４及びＲ５は、各々アルキルもしくは置換アルキル、又はヌクレオシドもしくはヌクレオチドであるか、あるいはオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間部分を共に形成し、且つ、Ｒ１はフェニルカルボン酸アミドであって、ここで、官能基はアミノ基によってフェニルカルボン酸アミドに結合している］
の開裂性化合物に関する。
一実施態様において、官能基は４，４’−ジメトキシトリチル−オキシ−アルキル−、トリフルオロアセチル−アミノ−アルキル−、アルキルアミド−ビオチン及びハプテンからなる群より選択される。
一実施態様において、Ａは-ＣＨ（ＣＨ３）-ＣＨ２-である。一実施態様において、Ｒ３はエチル基である。一実施態様において、Ｒ２はホスホラミダイトである。
別の実施態様において、第一の分子は官能基に結合し、第二の分子はホスホラミダイトに結合する。第一の分子は、アミノ−アルキル基又はオキシ−アルキル基によって官能基に結合し得る。第二の分子は、標準的なオリゴヌクレオチド合成によってホスホラミダイトに結合し得る。
更に別の実施態様において、第一の分子及び第二の分子は任意の生体分子であってもよい。一実施態様において、第一の分子及び第二の分子は、タンパク質、ペプチド、多糖類、炭水化物、脂肪、核酸、オリゴヌクレオチド、一次代謝産物、二次代謝産物及び天然産物からなる群より独立して選択される。特定の実施態様において、第一の分子及び第二の分子は、ペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群より独立して選択される。別の実施態様において、第一の分子はＤＮＡであり、且つ第二の分子もＤＮＡである。別の実施態様において、第一の分子はペプチドであり、且つ第二の分子はＤＮＡであるか、あるいはその逆である。
本明細書に記載の光開裂性化合物は、３７５ｎｍから４２０ｎｍの範囲の可視光を使用することによって開裂され得る。特定の実施態様において、可視光は３９０から４０５ｎｍの範囲で使用される。更に特定の実施態様において、可視光は３９０ｎｍで、又は４０５ｎｍで使用される。いずれの波長も、約３６５ ｎｍの近紫外域での脱保護を行うのに必要な光源と比べかなり安価な光源を使用して発生させることができる。一実施態様において、３７５ｎｍから４２０ｎｍの範囲内、特に３９０ｎｍと４０５ｎｍの固体レーザーが、本明細書に記載の開裂反応を行うための光源として使用される。更に特定の実施態様において、３７５ｎｍから４２０ｎｍの範囲内、特に３９０ｎｍと４０５ｎｍの高出力ＬＥＤ（発光ダイオード）が、本明細書に記載の開裂反応を行うための光源として使用される。特にＬＥＤは、例えばブルーレイプレーヤー用などに大量生産されるので低コストである。
本明細書に記載の光開裂性化合物の開裂反応において、当業者に既知の安定化剤が存在し得、それは開裂反応の効率を高め、光により生成されるラジカルの副反応を抑制する。安定化剤として、基剤と還元剤の組み合わせ、例えばイミダゾール、ヒドロキシルアミン、ベンザルアセトン及び類似のものを使用してもよい。
特定の実施態様において、官能基は、４，４’−ジメトキシトリチル−オキシ−アルキル−、トリフルオロアセチル−アミノ−アルキル−及びアルキルアミド−ビオチンからなる群より選択され、Ａは-ＣＨ（ＣＨ３）-ＣＨ２-であり、Ｒ３はエチル基であり、Ｒ２はホスホラミダイトであり、第一の分子は官能基に結合し、且つ第二の分子はホスホラミダイトに結合し、ここで、第一及び第二の分子は、ペプチド並びにオリゴヌクレオチドからなる群より独立して選択され、且つ開裂反応は３７５ｎｍから４２０ｎｍの波長で行われ得る。
一実施態様において、図１に描かれている光開裂性スペーサーアミダイトは、化学オリゴヌクレオチド合成中に、オリゴヌクレオチドを、その５´末端で伸長させるために使用され得る。その後、オリゴヌクレオチド合成における標準的な方法でＤＭＴ基を除去し、第二のオリゴヌクレオチドを遊離ＯＨ基上に合成することができ、合成の終わりに、光開裂性化合物が存在し、それが矢印で示されている位置で開裂されている、図４のようなオリゴヌクレオチドを提供する。
一実施態様において、図２のような化合物は、「イムノＰＣＲ」として知られるアッセイを行うためにペプチド又は抗体に結合し得る５´−遊離アミノ基を有するオリゴヌクレオチドを放出し、後に、例えばアレイベースの多重化解析用に、光溶解的にオリゴヌクレオチドと抗体に開裂され得る。その上、抗体又はタンパク質のＤＮＡへの固定化は、光可逆的に達成され得る。
一実施態様において、図３の化合物は、捕捉されたアプタマー−タンパク質複合体がアフニティーマトリックスから光により開裂される場合、光開裂性リンカーによりビオチン分子を持つオリゴヌクレオチドのようなアプタマーが、試料濃縮法として複合生体試料から適切な標的タンパク質を精製するために使用される方法のために用いられ得る。
本明細書は、ａ）出発物質としてのｐ−ジエチルベンゼンの提供、ｂ）フェニル環の臭素化、ｃ）臭素に対してパラ位の硝酸及び硫酸における得られた化合物のニトロ化、ｄ）精製及び結晶化、ｅ）ベンジル位での該化合物のヒドロキシメチル化、ｆ）置換チオフェノールを用いた芳香族臭素基のアリールスルフィドへの変換、ｇ）精製、ｈ）アルコールのクロロ炭酸塩への変換、ｉ）クロロ炭酸塩のヌクレオシドとの反応及びヌクレオシドのホスファイト化剤との反応、又はクロロ炭酸塩のアミノ酸誘導体との反応、の工程を含む上記光開裂性化合物の調製のための方法に更に関する。
一実施態様において、Ａは-ＣＨ（ＣＨ３）-ＣＨ２-である。一実施態様において、Ｒ３はエチル基である。一実施態様において、Ｒ２はホスホラミダイトである。
一実施態様において、官能基は４，４’−ジメトキシトリチル−オキシ−アルキル−、トリフルオロアセチル−アミノ−アルキル−、アルキルアミド−ビオチン及びハプテンからなる群より選択される。
以下の実施例は本明細書の理解を助けるために提供されており、本明細書の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。記載されている手順の改変は、本明細書の精神から離れることなく行われ得る。
実施例１：
オリゴヌクレオチド合成のためのビルディングブロックとしての光開裂性スペーサーアミダイトの合成
２３１ｇの２，５−ジエチル−４−ニトロベンゼン（０．８９５ｍｏｌ）、１０６．２ｇのチオサリチル酸（０．６８８ｍｏｌ）及び２８５ｇの炭酸カリウム（２．０６４ｍｏｌ）を加熱し、１．２Ｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で１時間還流する。次いでＤＭＦを減圧中で蒸留し、残留物を全量が３．５Ｌになるまで水で希釈し、ヘキサン／酢酸エチル（１：１）０．５Ｌで６回抽出する。残留水溶液を希ＨＣｌでｐＨ６．０になるまで調整し、０．５Ｌ酢酸エチルで２回抽出し、混ぜ合わせて水１Ｌで洗浄する。酢酸エチルはＲｏｔａｖａｐにより除去し、残留物をジクロロメタンに溶解し、カラムクロマトグラフィーによりシリカ／ジクロロメタン上で精製する。
収量：１７３．１ｇ（７６％） 濃縮後、非晶質の赤味がかった泡状物（Ｐ３酸）
１７３ｇのＰ３酸（０．５２２ｍｏｌ）、５９ｇのパラホルムアルデヒド（０．６５２ｍｏｌ）及び４３７ｇのトリトンＢ（ＭｅＯＨ中４０％＝１．０４４ｍｏｌ）を１．４ＬのＤＭＳＯ中で９０℃になるまで２時間加熱する。冷却後、酢酸０．２Ｌと水６Ｌを添加する。それを１Ｌジクロロメタンで抽出し、水０．２Ｌで２回洗浄し、減圧中で濃縮する。固体残留物を放置して結晶化させ、少量のジクロロメタン中で粉砕し、吸引濾過する。
1H-NMR (300MHz, DMSO)：
13.32 ppm (s, 1H, COOH); 7.95 ppm (dd, 1H, Ar-H チオサリチル); 7.83 ppm (s, 1H, Ar-H 芳香族ニトロ); 7.56 ppm (s, 1H, Ar-H 芳香族ニトロ; 7.46-7.38 ppm (m, 1H, Ar-H チオサリチル); 7.32-7.25 ppm (m, 1H, Ar-H チオサリチル); 6.73 ppm (d, 1H, Ar-H チオサリチル); 4.75 ppm (s, 1H, OH); 3.44 ppm (d, 2H, Ar-C(CH3)H-CH 2 -OH); 3.26-3.11 ppm (m, 1H, Ar-C(CH3)H-CH2-OH); 2.68 ppm (q, 2H, Ar-EtのCH2); 1.19-1.08 ppm (m, 6H, 2xCH3)
収量：８２ｇ（４３％） 黄味がかった結晶（Ｐ３酸アルコール）
１６．０ｇのＰ３酸アルコール（４４．３ｍｍｏｌ）、１６．０ｇのｔ−ＢｄＭＳ−Ｃｌ（１０６ｍｍｏｌ）及び１４．５ｇのＮ−メチルイミダゾール（１７７ｍｏｌ）を０．１Ｌジクロロメタン中、室温（ＲＴ）で一晩撹拌する。混合物を各回０．４Ｌの水で３回抽出し、濃縮する。固体残留物を０．２Ｌメタノールに溶解させ、１６ｇの炭酸カリウムを添加し、４０℃で９０分間撹拌する。メタノールの約７０％を減圧中で除去し、水０．２Ｌを添加し、クエン酸でおよそｐＨ２．０に酸性化し、酢酸エチルで抽出する。抽出物を水で洗浄し、茶色がかった透明な油（２２．７ｇ；１０８、Ｐ３酸−（ｔＢｄＭＳ−エーテル）になるまで濃縮し、それを更なる精製及びキャラクタリゼーションをせずに次工程で用いる。
４．９ｇのＰ３酸−（ｔＢｄＭＳ−エーテル）を３０ｍＬジクロロメタンに溶解し、２．２ｇのＮ−エチル−Ｎ’−ジエチルアミノプロピル−カルボジイミド＊ＨＣｌを入れ、室温で４５分間撹拌する。４．９ｇのＯ−ジメトキシトリチル−１−アミノ−６−ヘキサノールを含む１５ｍＬジクロロメタン溶液を添加し、一晩撹拌を続ける。混合物を水で洗浄し、残留有機物を飽和ＮａＣｌ／水で二回抽出し、減圧中で濃縮する。
残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン−メタノール勾配）で精製し、濃縮し、黄色の泡状物を得る。
４．４ｇ（５０％）のｔＢｄＭＳで保護された光開裂性スペーサー
1H-NMR (300MHz, DMSO):
8.39 ppm (t, 1H, アミド-H); 7.72 ppm (s, 1H, Ar-H 芳香族ニトロ); 7.55-7.47 ppm (m, 1H, Ar-H); 7.40-7.32 ppm (m, 4H, Ar-H); 7.30-7.16 (m, 9H, Ar-H); 7.08-7.02 ppm (m, 1H, Ar-H); 6.90-6.82 ppm (m, 4H, Ar-H); 3.72 ppm (s, 6H, ＤＭＴの２ｘメトキシ ); 3.59-3.46 ppm (m, 2H, Ar-C(CH3)H-CH 2 -OTBDMS); 3.33-3.24 ppm (m,1H, Ar-C(CH3)H-CH2-OTBDMS); 3.25-3.14 ppm (m, 2H, R-CH 2 -O-DMT); 2.97-2.91 ppm (m, 2H, R-CH 2 -NH-CO-R´); 2.67 ppm (q, 2H, Ar-EtのCH2); 1.56-1.20 ppm (m, 8H, 4xCH2 「ヘキシル中間体」(“Mittelteil Hexyl“)); 1.12-1.04 ppm (m, 6H, Ar-EtのCH3 + Ar-C(CH 3 )H-CH2-OTBDMS); 0.71 ppm (s, 9H, TBDMSのt-Bu); 0.14 ppm (d, 6H, TBDMSのSi(CH3)2).
ｔＢｄＭＳ基の除去は、３０ｍＬＴＨＦ中、３ｇＴＢＡＦ＊３＊Ｈ２Ｏ混合物を入れて室温で１時間撹拌することによって達成される。
混合物を重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、減圧中で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン−メタノール勾配２％）で精製し、濃縮し、黄色の泡状物を得た。
収量：２．９ｇ（７６％） 光開裂性スペーサーアルコール
1H-NMR (300MHz, DMSO):
8.33 ppm (t, 1H, アミド-H); 7.71 ppm (s, 1H, Ar-H 芳香族ニトロ); 7.53-7.46 ppm (m, 1H, Ar-H); 7.44-7.33 ppm (m, 4H, Ar-H); 7.33-7.11 (m, 10H, Ar-H); 6.92-6.84 ppm (m, 4H, Ar-H); 4.74 ppm (t, 1H, R-OH); 3.73 ppm (s, 6H, DMTの2xメトキシ); 3.35-3.31 ppm (m, 2H, Ar-C(CH3)H-CH 2 -OH); 3.25-3.11 ppm (m, 3H, R-CH 2 -O-DMT + Ar-C(CH3)H-CH2-OH); 2.98-2.90 ppm (m, 2H, R-CH 2 -NH-CO-R´); 2.67 ppm (q, 2H, Ar-EtのCH2); 1.56-1.18 ppm (m, 8H, 4xCH2 中心体ヘキシル（ｃｅｎｔｅｒｂｏｄｙ ｈｅｘｙｌ）; 1.13 ppm (t, 3H, Ar-EtのCH3); 1.03 ppm (d, 3H, Ar-C(CH 3 )H-CH2-OH)
２．９ｇの光開裂性スペーサーアルコールを３０ｍＬ乾燥ジクロロメタンに溶解させ、０．６８ｇシアノエチル−テトライソプロピル−ホスホロジアミダイト及び０．２２ｇジシアノイミダゾールを入れ、アルゴン下で一晩撹拌する。
反応混合物を、わずかに濁りが残るまでへキサンで希釈し、カラムクロマトグラフィー（シリカ、ヘキサン−酢酸エチル 勾配 ４：１−１：１）で精製し、濃縮し、黄色の泡状物を得た。
収量：０．９５ｇ（２５％） 図１の光開裂性スペーサーアミダイト
ＨＰＬＣ：純度９２．４％
1H-NMR (300MHz, DMSO):
8.38 ppm (m, 1H, アミド-H); 7.74 ppm (s, 1H, Ar-H 芳香族ニトロ); 7.54-7.46 ppm (m, 1H, Ar-H); 7.40-7.16 ppm (m, 12H, Ar-H); 7.12-7.00 ppm (m, 1H, Ar-H); 6.92-6.82 ppm (m, 4H, Ar-H); 3.72 ppm (s, 6H, DMTの2x メトキシ); 3.68-3.34 ppm (m, 7H, Ar-C(CH3)H-CH 2 -OPA + Ar-C(CH3)H-CH2-OH + シアノエチルの2x CH2); 3.24-3.14 ppm (m, 2H, R-CH 2 -O-DMT); 2.97-2.90 ppm (m, 2H, R-CH 2 -NH-CO-R´); 2.73-2.61 ppm (m, 4H, Ar-EtのCH2 + イソ−プロピルの2x CH); 1.57-1.39 ppm (m, 4H, 2xCH2 中心体ヘキシル); 1.39-1.21 ppm (m, 4H, 2x CH2 中心体ヘキシル); 1.21-0.90 ppm (m, 18H, 6x CH3).
31P-NMR (121,53MHz, DMSO):
143,76 ppm; 143,24 ppm.
実施例２：
図２の化合物の合成：光開裂性アミノ修飾剤アミダイト（Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ−ａｍｉｄｉｔｅ）
光開裂性アミノ修飾剤をＰ３酸−（ｔＢｄＭＳ−エーテル）及びＮ−トリフルオロアセチル−１，６−ジアミノヘキサンから同様の方法で調製し、標題化合物を全収率１２ ％（４工程）で得た。
実施例３：
図３の化合物の合成：光開裂性ビオチン修飾剤アミダイト
光開裂性ビオチン修飾剤をＰ３酸−（ｔＢｄＭＳ−エーテル）及びＮ−ジメトキシトリチル−ビオチン−６−アミノカプロイルアミドから同様の方法で調製し、標題化合物を全収率９％（４工程）で得た。

Claims (9)

  1. 以下の式
    ［式Ｉ］



    ［式中、Ａは-ＣＨ２-、-ＣＨ２-ＣＨ２-、-ＣＨ（ＣＨ３）-又は-ＣＨ（ＣＨ３）-ＣＨ２-であり、 Ｒ３はＨ、メチル基又はエチル基であり、 Ｒ２はホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネート、リン酸ジエステル、又はリン酸トリエステルであって、
    ここで、Ｒ２が式-Ｏ−Ｐ（Ｏ）−（ＯＲ４）−（ＯＨ）のリン酸ジエステルである場合、Ｒ４はアルキルもしくは置換アルキル、又はヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドであって、また、
    Ｒ２が式-Ｏ−Ｐ（Ｏ）−（ＯＲ４）−（ＯＲ５）のリン酸トリエステルである場合、Ｒ４及びＲ５は、各々アルキルもしくは置換アルキル、又はヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドであるか、あるいはオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間部分を共に形成し、
    Ｒ１はフェニルカルボン酸アミドであって、
    ここで、官能基はアミノ基によってフェニルカルボン酸アミドに結合している］
    の光開裂性化合物。
  2. 官能基が４，４’−ジメトキシトリチル−オキシ−アルキル−、トリフルオロアセチル−アミノ−アルキル−、アルキルアミド−ビオチン及びハプテンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
  3. Ａが-ＣＨ（ＣＨ３）-ＣＨ２-であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の化合物。
  4. Ｒ３がエチル基であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
  5. Ｒ２がホスホラミダイトであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
  6. 第一の分子が官能基に結合し、第二の分子がホスホラミダイトに結合することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
  7. 第一の分子及び第二の分子がオリゴヌクレオチド及びペプチドからなる群より独立して選択されることを特徴とする、請求項６に記載の化合物。
  8. ３７５ｎｍから４２０ｎｍの波長で光開裂性化合物の開裂が行われ得る点において特徴づけられる、請求項１から７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の光開裂性化合物の調製のための方法であって、
    ａ）出発物質としてのｐ−ジエチルベンゼンの提供
    ｂ）フェニル環の臭素化
    ｃ）臭素に対してパラ位の硝酸及び硫酸における得られた化合物のニトロ化
    ｄ）精製及び結晶化
    ｅ）ベンジル位での該化合物のヒドロキシメチル化
    ｆ）置換チオフェノールを用いた芳香族臭素基のアリールスルフィドへの変換
    ｇ）精製
    ｈ）アルコールのクロロ炭酸塩への変換
    ｉ）クロロ炭酸塩のヌクレオシドとの反応及びヌクレオシドのホスファイト化剤との反応、又はクロロ炭酸塩のアミノ酸誘導体との反応
    の工程を含む、方法。
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