JP2007028993A - オリゴヌクレオチドプローブ - Google Patents

Abstract

【課題】 アミノ基の反応性が向上した、アミノ化オリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【解決手段】 一般式１：

（式中、Ｒ_１は水素原子またはアミノ基の保護基であり、Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、二価の有機基であり、Ａはオリゴヌクレオチドである）で表されるオリゴヌクレオチドプローブであり、さらにＲ_２およびＲ_３が、それぞれ独立して複素原子を含んでいてもよい置換または無置換の二価の炭化水素であるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【選択図】 図５

Description

本発明は、アミノ化オリゴヌクレオチドプローブ、該オリゴヌクレオチドプローブが固定化された担体および該オリゴヌクレオチドプローブを合成するための化合物に関する。

ＤＮＡチップまたはビーズ等を用いた遺伝子解析においては、合成オリゴヌクレオチドまたはＰＣＲ産物などをプローブとして担体上に固定化する必要がある。当該担体上に固定化されたプローブと、蛍光などで標識された標的核酸とが相補的に結合することによって、標的核酸が担体上に保持され、標識に由来する蛍光強度を測定することによって、標的核酸量を検出することができる。ＤＮＡチップは、平板状の担体上に数千〜数十万種類のプローブが、あらかじめ決まった場所に固定化されているため、他種類の遺伝子の発現量を一度に定量することができ、遺伝子間の複雑なネットワークの解明に極めて有用である。そのため、遺伝子診断のための有力な手法の一つとして期待されている。

合成オリゴヌクレオチドプローブを担体上に固定化するには、担体上でオリゴヌクレオチドを直接合成する方法（非特許文献１および非特許文献２）、および合成したオリゴヌクレオチドを精製後、担体上に固定化する方法とがある。後者の方法としては、オリゴヌクレオチドプローブの合成中に、アミノ基などの官能基を導入し、スポット後にこれらの官能基と担体上にコーティングされた官能基とを共有結合させることによって、不可逆的にプローブを固定化する方法が知られている。また、プラス電荷を有するポリＬリジンなどをコーティングした担体上にオリゴヌクレオチドプローブを静電的に結合させる方法なども報告されている。静電的な結合は、オリゴヌクレオチドのマイナス電荷に依存するため、オリゴヌクレオチドプローブの鎖長が短くなるほど、固定化効率が低下してしまう。そのため、共有結合を介して担体上にオリゴヌクレオチドを固定化する方法が広く用いられている。

アミノ基をオリゴヌクレオチドの末端に導入する場合、直鎖アルキル基に結合したアミノ化試薬を用いる手法が一般的である（特許文献１および２）。この種のアミノ化試薬の合成法は幾つか報告されているが、現在主に用いられているアミノ化試薬は、炭素数６の直鎖アルキル鎖を有するアミノ化試薬である（非特許文献３および４）。しかしながらこの場合、オリゴヌクレオチドとアミノ化試薬の縮合率が十分ではないため、アミノ基が導入されなかった短いオリゴヌクレオチドが副産物として混入する。また、ＤＮＡ自動合成機中で行われる各塩基の縮合反応においても、若干の未反応体が含まれているため、目的のアミノ化オリゴヌクレオチドを、そのような不純物より分離・精製する必要がある。しかし、目的のアミノ化オリゴヌクレオチドを高純度に精製しようとする場合、時間を要するだけでなく十分な収率が得られない、という問題があった。また、短時間で精製を実施した場合には、十分な純度で得ることができなかった。これは、アミノ基の保護基の性質によるものと考えられた。

市販されているアミノ化試薬におけるアミノ基の保護基としては、酸性条件下で脱保護可能なモノメトキシトリチル基と、アルカリ性条件下で脱保護できるトリフルオロアセチル基が用いられている。モノメトキシトリチル基は酸性条件下で脱保護させることが可能であるが、厳しい条件（８０％酢酸中１時間以上など）を必要とし、さらにこのような条件下でも完全に保護基を取り去ることができないため、回収されるアミノ化オリゴヌクレオチドの収量が低い、といった問題点がある。このような条件は、酸性条件で損傷を受けやすいＤＮＡには好ましくないだけではなく、精製に時間を要するため、アミノ化オリゴヌクレオチドのハイスループット精製が困難である。一方、トリフルオロアセチル基はアルカリ性条件下で速やかに脱保護されるが、オリゴヌクレオチドの塩基部の脱保護をアルカリ性条件下で行うため、その間にアミノ基が脱保護され、モノメトキシトリチル基のように保護基の疎水性を利用して精製することができない。アミノ化されていない不良のオリゴヌクレオチドと、アミノ化されたオリゴヌクレオチドとでは、疎水的性質がほとんど同じであるため、トリフルオロアセチル基でアミノ基を保護したオリゴヌクレオチドは、アミノ化されていない不良のオリゴヌクレオチドから分離精製することは困難であった。そのため、高純度かつ迅速に合成し、精製することができるアミノ化オリゴヌクレオチドの開発が望まれていた。

特開昭５９−２７９００号広報 特開昭６０−１６６６９４号広報 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，１６７５−１６７８（１９９２） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１２，１９−２６（１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１６８，７５３−７６１（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１４，６２２７−６２４５（１９８６）

本発明の課題は、アミノ基の反応性が向上した、アミノ化オリゴヌクレオチドプローブを提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、カルバモイル基を有するリンカーを介してオリゴヌクレオチドにアミノ基を導入することにより、アミノ化オリゴヌクレオチドプローブにおけるアミノ基の反応性が向上すること、酸性条件下で脱保護されるアミノ基保護基を用いた場合に、より穏和な条件で脱保護できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）一般式１：

（式中、
Ｒ_１は水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、二価の有機基であり、
Ａはオリゴヌクレオチドである）
で表されるオリゴヌクレオチドプローブ。

（２）Ｒ_２およびＲ_３が、それぞれ独立して、複素原子を含んでいてもよい置換または無置換の二価の炭化水素基である、（１）記載のオリゴヌクレオチドプローブ。

（３）Ｒ_２が、一般式２：

（式中、
Ｒ_４は、直接結合、または置換もしくは無置換の鎖員１〜９のアルキレン基であり；
Ｒ_５は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、または複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基であり；
Ｒ_６は、直接結合、または置換もしくは無置換の鎖員１〜５のアルキレン基である）
で表される、（１）または（２）記載のオリゴヌクレオチドプローブ。

（４）Ｒ_５が、水素原子、鎖員１〜２０の脂肪族炭化水素基、置換もしくは無置換の鎖員１〜１０のアルコキシ基、置換もしくは無置換の鎖員５〜２０のアリール基、置換もしくは無置換の鎖員３〜２０の脂環式基、または置換もしくは無置換の鎖員６〜２０のアリールアルキル基であり、これらの基において一部の炭素原子が複素原子と置き換えられていてもよい、（３）記載のオリゴヌクレオチドプローブ。

（５）Ｒ_２が、一般式３：

（式中、
Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９およびＲ_１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、または複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基であるか、または、Ｒ_７もしくはＲ_８とＲ_９もしくはＲ_１０とが、それらが結合している炭素原子と一緒になって複素原子を含んでいてもよい環を形成している）
で表される、（１）または（２）記載のオリゴヌクレオチドプローブ。

（６）Ｒ_１がトリチル基またはモノ置換もしくはジ置換トリチル基である、（１）〜（５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。

（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブが固定化された担体。

（８）一般式４：

（式中、
Ｒ_１は、水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、二価の有機基であり、
Ｒ_１１およびＲ_１２は、それぞれ独立して、有機基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよく、
Ｒ_１３は、リン酸保護基である）
で表される化合物。

（９）Ｒ_２およびＲ_３が、それぞれ独立して、複素原子を含んでいてもよい置換または無置換の二価の炭化水素基である、（８）記載の化合物。

（１０）Ｒ_２が、一般式２：

（式中、
Ｒ_４は、直接結合、または置換もしくは無置換の鎖員１〜９のアルキレン基であり；
Ｒ_５は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、または複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基であり；
Ｒ_６は、直接結合、または置換もしくは無置換の鎖員１〜５のアルキレン基である）
で表される、（８）または（９）記載の化合物。

（１１）Ｒ_５が、水素原子、鎖員１〜２０の脂肪族炭化水素基、置換もしくは無置換の鎖員１〜１０のアルコキシ基、置換もしくは無置換の鎖員５〜２０のアリール基、置換もしくは無置換の鎖員３〜２０の脂環式基、または置換もしくは無置換の鎖員６〜２０のアリールアルキル基であり、これらの基において一部の炭素原子が複素原子と置き換えられていてもよい、（１０）記載の化合物。

（１２）Ｒ_２が、一般式３：

（式中、
Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９およびＲ_１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、または複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基であるか、または、Ｒ_７もしくはＲ_８とＲ_９もしくはＲ_１０とが、それらが結合している炭素原子と一緒になって複素原子を含んでいてもよい環を形成している）
で表される、（８）または（９）記載の化合物。

（１３）Ｒ_１がトリチル基またはモノ置換もしくはジ置換トリチル基である、（８）〜（１２）のいずれかに記載の化合物。

（１４）（８）〜（１３）のいずれかに記載の化合物を用いて、オリゴヌクレオチドにアミノ基を導入する方法。

本発明により、アミノ基の反応性が向上したアミノ化オリゴヌクレオチドプローブが提供される。また、目的のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブを、簡便かつ高収率で分離精製することができる。

本発明は、アミノ基がカルバモイル構造を含むリンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入されたアミノ化オリゴヌクレオチドプローブに関する。すなわち、以下の一般式１で表される。

式中、Ｒ_１は水素原子またはアミノ基の保護基であり、Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、二価の有機基であり、Ａはオリゴヌクレオチドである。一般式１において、Ｒ_３がオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端の、水酸基またはリン酸基の酸素と結合する。

本発明においてオリゴヌクレオチドは、天然のものでも合成のものでもよく、ポリヌクレオチドをも包含する。また、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸、二本鎖オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体を包含する。ＰＣＲ産物も包含される。オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミダイト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体 、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体 、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−メチルシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ，４’−Ｃ-メチレン架橋リボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ，４’−Ｃ-エチレン架橋リボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる。

本発明においてオリゴヌクレオチドの塩基数は、通常１〜５００、より好ましくは５〜２００、より好ましくは１０〜１００である。

Ｒ_１におけるアミノ基の保護基としては、特に制限されないが、アシル基、カルバメート基、トリアルキルシリル基、フタリル基、カルボキシアルキルカルボニル基、トシル基、トリフルオロアセチル基、トリチル基、およびモノまたはジ置換トリチル基が挙げられる。酸性条件下で脱保護される疎水性の保護基が好ましい。酸性条件下で脱保護される保護基は、アルカリ条件下で行うオリゴヌクレオチドの塩基部の脱保護工程において脱保護されないため、保護基の疎水性を利用して、目的のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブを分離精製できる点で有利である。酸性条件下で脱保護される保護基としては、トリチル基およびモノ置換またはジ置換トリチル基が挙げられる。トリチル基の置換基として、炭素数１〜４のアルコキシ基が挙げられる。モノ置換またはジ置換トリチル基の具体例としては、モノメトキシトリチル基、モノエトキシトリチル基、モノプロポキシトリチル基、モノイソプロポキシトリチル基、モノブトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、ジエトキシトリチル基、ジプロポキシトリチル基、ジイソプロポキシトリチル基およびジブトキシトリチル基が挙げられる。トリチル基およびモノまたはジ置換トリチル基は疎水性が強いため、合成したオリゴヌクレオチドプローブを逆相カラムによって容易に精製できるという点で有利である。通常、アミノ基をトリチル基またはモノ置換トリチル基で保護した場合、脱保護するためには強い酸性条件下で長時間反応させる必要がある。このような条件は、核酸に損傷を与えることも考えられ、また時間を要するという点でも好ましくない。しかし、本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブにおいて、アミノ基をトリチル基またはモノもしくはジ置換トリチル基で保護した場合は、緩和な酸性条件下、短時間で脱保護可能なため、核酸を傷つけることもなく、また、脱保護時間を短縮することもできる。本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブにおいては、例えば、ｐＨ２〜６、または５〜８０体積％の酢酸存在下、５〜２０分処理することによりトリチル基またはモノもしくはジ置換トリチル基を除去することができる。

一般式１において、Ｒ_２は二価の有機基である。Ｒ_２は、オリゴヌクレオチドプローブの担体との結合性および標的オリゴヌクレオチドとの相補的結合を阻害するものでなければ特に制限されないが、好ましくは複素原子を含んでいてもよい置換または無置換の二価の炭化水素基であり、好ましくはＲ_２においてオキシ酸素原子とアミノ基の窒素原子とをつなぐ最短の鎖（以下、主鎖と称する）が、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは２個の炭素原子またはヘテロ原子を含む二価の基が好ましい。Ｒ_２における主鎖の長さを上記範囲とすること、すなわちカルバモイル構造とアミノ基との距離を一定の範囲とすることにより、アミノ基が活性化されるとともに、より穏和な条件でアミノ基の脱保護を実施できる。

具体的には、上記主鎖の鎖員が１〜１０、好ましくは１〜５、より好ましくは２の、二価の脂肪族炭化水素基、例えば、置換または無置換の、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基；ならびに上記主鎖の鎖員が１〜１０、好ましくは１〜５の、置換または無置換の鎖員３〜２０の二価の脂環式基、置換または無置換の鎖員５〜２０のアリーレン基等が挙げられる。ここで、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基等の脂肪族炭化水素基は、直鎖でも分岐鎖でもよい。また、脂環式基およびアリーレン基は、単環でも縮合環でもよい。上記炭化水素基において、一部の炭素原子、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の炭素原子が複素原子で置換されているものも包含される。本発明において、炭素原子が複素原子で置換されていてもよいアリーレン基には、フェニレン基、ピリジレン基、ピリダジニル基、ピリミジニレン基、ピラジニレン基、フリレン基、チエニレン基、ピロリレン基、イミダゾリレン基、チアゾリレン基、オキサゾリレン基、ナフチレン基、アントリレン基、ピレニレン基、インダニレン基、テトラヒドロナフチレン基、キノリレン基、イソキノリレン基、シンノリニレン基、キナゾリニレン基、キノキサリニレン基、ナフチリジニレン基、フタラジニレン基、インドリレン基、イソインドリレン基、ベンゾフリレン基、ベンゾチエニレン基、インダゾリレン基、ベンゾイミダゾリレン基およびベンゾチアゾリレン基等が含まれる。

本明細書において複素原子は、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、ケイ素原子およびリン原子から選択され、好ましくは、酸素原子、窒素原子および硫黄原子から選択される。また、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される。

置換基としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル基、置換または無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、ならびに複素原子を含んでいてもよい１価の炭化水素基、例えば、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルキル基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルケニル基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルキニル基、置換または無置換の鎖員１〜１０の脂環式基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルコキシ基、置換または無置換のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、および置換または無置換のアリール基等を挙げることができる。上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、脂環式基およびアリール基において、一部の炭素原子、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の炭素原子が複素原子で置き換えられているものも包含される。

本発明において、炭素原子が複素原子で置き換えられていてもよいアリール基には、フェニル基、ピリジル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、フリル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ナフチル基、フェナントリル基、フルオレニル基、アントリル基、ピレニル基、インダニル基、テトラヒドロナフチル基、キノリル基、イソキノリル基、シンノリニル基、キナゾリニル基、キノキサリニル基、ナフチリジニル基、フタラジニル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基およびベンゾチアゾリル基等が含まれる。

一実施形態において、Ｒ_２は、以下の一般式２で表される。

一般式２において、Ｒ_４はアミノ基の窒素原子に結合し、Ｒ_６はオキシ酸素原子に結合する。Ｒ_４とＲ_６に含まれる炭素原子の合計は、１〜９個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１個である。

Ｒ_４は、直接結合、または置換もしくは無置換の鎖員１〜９、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜２のアルキレン基である。アルキレン基は直鎖でも分岐鎖でもよいが、好ましくは直鎖である。具体的には、メチレン基、エチレン基、プロピレン基が挙げられ、好ましくはメチレン基である。

Ｒ_５は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、または複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基である。好ましくは、水素原子；鎖員１〜２０、好ましくは１〜１０の脂肪族炭化水素基、例えば、置換もしくは無置換の鎖員１〜１０のアルキル基、置換もしくは無置換の鎖員１〜１０のアルケニル基、置換もしくは無置換の鎖員１〜１０アルキニル基；置換もしくは無置換の鎖員１〜１０のアルコキシ基；置換もしくは無置換の鎖員５〜２０のアリール基；置換もしくは無置換の鎖員３〜２０の脂環式基；または置換もしくは無置換の鎖員６〜２０のアリールアルキル基であり、これらの基において一部の炭素原子、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の炭素原子が、複素原子と置き換えられているものも包含される。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ＣＨ_３−Ｏ−ＣＨ_２−、フェニル基、フェニルメチル基、トリル基、ナフチル基、ナフチル−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−、キシリル基等が挙げられる。

Ｒ_６は、直接結合、または置換もしくは無置換の鎖員１〜５、好ましくは１〜３のアルキレン基である。アルキレン基は直鎖でも分岐鎖でもよいが、好ましくは直鎖である。具体的には、メチレン基、エチレン基、プロピレン基が挙げられる。Ｒ_６は、好ましくは直接結合である。

一般式２において、置換基としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル基、置換または無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、ならびに複素原子を含んでいてもよい１価の炭化水素基、例えば、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルキル基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルケニル基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルキニル基、置換または無置換の鎖員１〜１０の脂環式基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルコキシ基、置換または無置換のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基および置換または無置換のアリール基等を挙げることができる。上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、脂環式基およびアリール基において、一部の炭素原子、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の炭素原子が複素原子で置き換えられているものも包含される。

別の実施形態においてＲ_２は、以下の一般式３で表される。

Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９およびＲ_１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、または複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基であるか、または、Ｒ_７もしくはＲ_８とＲ_９もしくはＲ_１０とが、それらが結合している炭素原子と一緒になって複素原子を含んでいてもよい環を形成している。一般式３においては、Ｒ_７およびＲ_８が結合した炭素原子がアミノ基の窒素原子に結合し、Ｒ_９およびＲ_１０が結合した炭素原子がオキシ酸素原子に結合する。

複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基としては、鎖員１〜１０の置換もしくは無置換アルキル基、鎖員１〜１０の置換もしくは無置換アルコキシ基、鎖員１〜１０の置換もしくは無置換アルケニル基、鎖員１〜１０の置換もしくは無置換アルキニル基、置換もしくは無置換アリール基、または置換もしくは無置換アリールアルキル基であり、これらの基において一部の炭素原子、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の炭素原子が、複素原子と置き換えられていてもよい。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、フェニル基、フェニルメチル基、トリル基、ナフチル基、キシリル基等が挙げられる。

Ｒ_７もしくはＲ_８とＲ_９もしくはＲ_１０とが、それらが結合している炭素原子と一緒になって形成する複素原子を含んでいてもよい環は、好ましくは置換または無置換の３〜１０員、好ましくは３〜６員の脂環式基またはアリール基であり、好ましくは複素原子を含まないか１つの複素原子を含む。

一般式３において、置換基としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル基、置換または無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、ならびに複素原子を含んでいてもよい１価の炭化水素基、例えば、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルキル基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルケニル基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルキニル基、置換または無置換の鎖員１〜１０の脂環式基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルコキシ基、置換または無置換のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基および置換または無置換のアリール基等を挙げることができる。上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、脂環式基およびアリール基において、一部の炭素原子、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の炭素原子が複素原子で置き換えられているものも包含される。

一般式１において、Ｒ_３は、二価の有機基であり、オリゴヌクレオチドプローブの担体との結合性および標的オリゴヌクレオチドとの相補的結合を阻害するものでなければ特に制限されない。Ｒ_３は、アミノ基の反応性や脱保護のしやすさに影響を及ぼさないと考えられるが、好ましくは複素原子を含んでいてもよい置換または無置換の二価の炭化水素基であり、好ましくはＲ_３においてカルバモイル窒素原子とオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端の水酸基またはリン酸基の酸素原子とをつなぐ最短の鎖（以下、主鎖と称する）が、１〜２０個、好ましくは２〜１５個、より好ましくは２〜６個の炭素原子またはヘテロ原子を含む二価の基が好ましい。

具体的には、上記主鎖の鎖員が１〜２０、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜６の二価の脂肪族炭化水素基、例えば、置換または無置換の、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基；ならびに上記主鎖の鎖員が１〜２０、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜６の、置換または無置換の、鎖員３〜３０の脂環式基および鎖員５〜３０のアリーレン基等が挙げられる。ここで、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基等の脂肪族炭化水素基は、直鎖でも分岐鎖でもよい。脂環式基およびアリーレン基は、単環でも縮合環でもよい。上記炭化水素基において、一部の炭素原子、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個の炭素原子が複素原子で置換されているものも包含される。Ｒ_３は、好ましくは−（ＣＨ_２）ｎ−（ｎは１〜２０、好ましくは２〜６）で表される。

Ｒ_３における置換基としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル基、置換または無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、ならびに複素原子を含んでいてもよい１価の炭化水素基、例えば、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルキル基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルケニル基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルキニル基、置換または無置換の鎖員１〜１０の脂環式基、置換または無置換の鎖員１〜１０のアルコキシ基、置換または無置換のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基および置換または無置換のアリール基等を挙げることができる。上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、脂環式基およびアリール基において、一部の炭素原子、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の炭素原子が複素原子で置き換えられているものも包含される。

アミノ基とオリゴヌクレオチドの間のリンカー部分に、アリール基およびアリーレン基等の芳香族基を含むオリゴヌクレオチドプローブは、担体への反応効率が高いため、固定化に要するオリゴヌクレオチド量を低減することができる。さらに、当該オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸との結合効率も高いために、従来と同じ鎖長のものでも高い感度で検出することが可能である。

本発明者らは、驚くべきことに、一般式１の構造を有するアミノ化オリゴヌクレオチドプローブにおいて、アミノ基の反応性が向上し、活性エステル基などのアミノ基と共有結合を形成する官能基や、フルオレセインイソチオシアナートなどの蛍光化合物と効率的に反応することを見出した。また、トリチル基または置換トリチル基などの強酸性条件下でのみ脱保護されるアミノ基保護基を用いた場合でも、本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブにおいては、より穏和な条件下で保護基が除去されることを見出した。従って、本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブは、クロマトグラフィー等を用いて、アミノ化されていないオリゴヌクレオチドなどから簡便かつ高収率で分離精製することができる。

本発明はまた、上記アミノ化オリゴヌクレオチドプローブを合成するための中間体化合物に関する。一実施形態において本発明の中間体化合物は、上記オリゴヌクレオチドプローブにおいて、オリゴヌクレオチド部分がホスホロアミダイトになった構造を有する化合物である。従って、一実施形態において本発明の中間体化合物は、以下の一般式４で表される。

Ｒ_１は、水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、二価の有機基であり、
Ｒ_１１およびＲ_１２は、それぞれ独立して、有機基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよく、
Ｒ_１３は、リン酸保護基である。

Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３については、アミノ化オリゴヌクレオチドプローブについてすでに記載したのと同様である。

Ｒ_１１およびＲ_１２は、特に制限されないが、好ましくは一価の炭化水素基であり、より好ましくは炭素数１〜５のアルキル基である。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基およびイソペンチル基等が挙げられ、好ましくはイソプロピル基である。

あるいは、Ｒ_１１およびＲ_１２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって環基を形成していてもよい。該環はＲ_１１およびＲ_１２が結合している窒素原子の他にさらに複素原子を含んでいてもよい。そのような環基は、好ましくは環員５〜８、好ましくは６の環であり、例えば、モルホリン環、ピペリジン環、ピペラジン環およびチオモルホリン環等が挙げられ、好ましくはモルホリン環である。

リン酸保護基は、ホスホロアミダイト法に使用されるものであればどのようなものでもよいが、メチル基、２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基および４−オキシペンチル基などを好ましい基として挙げることができる。

本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブは、上記中間体化合物をオリゴヌクレオチドと連結させることにより合成することができる。オリゴヌクレオチドへの中間体化合物の導入は、ＤＮＡ自動合成機上でオリゴヌクレオチド合成と同時に実施することができる。

本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドプローブが固定化された担体に関する。オリゴヌクレオチドプローブを固定化するための担体は、オリゴヌクレオチドプローブが有するアミノ基と共有結合しうる官能基をその表面に有するものであれば特に制限されない。

担体の基材としては、特に制限されないが、例えば、石英ガラス、ホウ珪酸ガラスおよびソーダライムガラスなどのガラス、シリコン、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂)、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）が挙げられる。本発明においては、ガラス、シリコン、セラミックス、プラスチックを使用するのが好ましい。上記基材の表面に官能基を導入したものを担体として用い、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを固定化する。オリゴヌクレオチドプローブのアミノ基が保護されているときは、保護基を除去してから固定化することが好ましい。

オリゴヌクレオチドプローブが有するアミノ基と共有結合しうる官能基としては、例えば、活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イソチオシアネート基、イソシアネート基が挙げられる。

担体の形状は、特に制限されず、基盤状、糸状、球状、ビーズ状、多角形状、粉末状、多孔質状などが挙げられ、本発明においては基盤状が好ましい。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ビオチンおよび蛍光色素などの標識に結合させることができる。蛍光色素としては、例えば、Ｃｙ３およびＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、ＧＦＰなどが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドプローブにおけるアミノ基は、蛍光色素、特にフルオレセインイソチオシアナートとの反応性が高い。本発明のオリゴヌクレオチドプローブはまた、医薬に結合させることもできる。

本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、オリゴヌクレオチドを担体上に効率よく固定化することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、その合成と精製が容易である。

本発明のオリゴヌクレオチドプローブを合成するための中間体化合物（以下、アミダイト化合物と称する）を合成し、それをオリゴヌクレオチドに導入し、得られたオリゴヌクレオチドプローブの能力を評価した。

オリゴヌクレオチドへアミノ基を導入するための中間体化合物（アミダイト化合物：ｓｓＮ−ａｍ、ｓｓＭｅ−ａｍ、ｓｓＭｅＯ−ａｍ、ｓｓＨ−ａｍ）を、それぞれ図１、２、３、４に示す方法により合成した。

薄層クロマトグラフィーは、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４ プレート（Ｍｅｒｃｋ）上で行った。カラムクロマトグラフィーにはＩＣＮ Ｓｉｌｉｃａ ６０Å（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いた。^１Ｈ−ＮＭＲはテトラメチルシランを内部標準とし、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＸ２７０を用いて測定した。^３１Ｐ−ＮＭＲは無機リン酸を外部標準とし、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＸ２７０を用いて測定した。

（実施例１） 中間体化合物ｓｓＮ−ａｍ（化合物７）の合成（図１）
（Ｒ）−１−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物３）
アルゴン雰囲気下、１−（クロロメチル）ナフタレン（化合物１）４．６４ｍｌ（３１．０ｍｍｏｌ）および（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（化合物２）３．７１ｍｌ（３０．０ｍｍｏｌ）をトルエンとジオキサンの混合溶液（２：１）１５０ｍｌに溶解し、粉末状に砕いた水酸化カリウム９．０ｇを加えて１２０℃で２時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル３５０ｍｌを加えて、水１００ｍｌで４回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、得られた黄色オイル状物質に８０％酢酸水溶液１５０ｍｌを加えて溶解し、室温で６時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮した後トルエンとの共沸により酢酸を除き、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により精製して標記化合物（化合物３）６．８２ｇ（収率９８％）を白色固体状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 8.12-8.09 (m, 1 H), 7.95-7.86 (m, 2 H), 7.59-7.44 (m, 4 H), 4.93 (s, 2 H), 4.67 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.48 (t, 1 H, J = 5.5 Hz), 3.66 (ddddd, 1 H, J = 3.5, 4.8, 5.2, 5.3, 5.9 Hz), 3.56 (dd, 1 H, J = 4.8, 9.7 Hz), 3.45 (dd, 1 H, J = 3.5, 9.7 Hz), 3.39 (ddd, 1 H, J = 5.2, 5.5, 10.9 Hz), 3.34 (ddd, 1 H, J = 5.5, 5.9, 10.9 Hz).

（Ｓ）−１−アジド−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物４）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−１−Ｏ−（１−ナフチルメチル）グリセロール（化合物３）６．８２ｇ（２９．４ｍｍｏｌ）をピリジン２００ｍｌに溶解し、塩化トシル８．４０ｇ（１．５当量）を加えて室温で５時間撹拌した。反応液に水１５ｍｌを加えて過剰の試薬を分解した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を酢酸エチル３８０ｍｌに溶解し、水１２０ｍｌで２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１２０ｍｌで１回、水１２０ｍｌで１回、飽和食塩水１２０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られたオイル状物質をアルゴン雰囲気下、ジメチルホルムアミド１２０ｍｌに溶解し、アジ化ナトリウム５．７３ｇ（３．０当量）および塩化アンモニウム６．２９ｇ（４．０当量）を加えて８０℃で２時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル３５０ｍｌを加えて、水１００ｍｌで４回、飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物４）５．０５ｇ（収率６７％）を無色オイル状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 8.11-8.06 (m, 1 H), 7.96-7.87 (m, 2 H), 7.59-7.44 (m, 4 H), 5.29 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.94 (s, 2 H), 3.83 (dddt, 1 H, J = 3.6, 5.3, 6.3, 6.4 Hz), 3.51 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.9 Hz), 3.46 (dd, 1 H, J = 6.3, 9.9 Hz), 3.29 (dd, 1 H, J = 3.6, 12.6 Hz), 3.21 (ddd, 1 H, J = 6.4, 12.6 Hz).

（Ｓ）−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物５）
（Ｓ）−１−アジド−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物４）５．０５ｇ（１９．６ｍｍｏｌ）をエタノール２００ｍｌに溶解し、パラジウム炭素（１０％）１．１８ｇを加えて、常圧の水素雰囲気化、室温で１４時間撹拌した。パラジウム触媒をセライトろ過により除去した後、溶液を減圧下濃縮し、さらに減圧下乾燥した。得られたオイル状物質をアルゴン雰囲気下、ピリジン１２０ｍｌに溶解し、トリエチルアミン８．２０ｍｌ（３．０当量）および塩化モノメトキシトリチル７．２６ｇ（１．２当量）を加え、室温で１．５時間撹拌した。エタノール２０ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル３８０ｍｌに溶解し、水１２０ｍｌで２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１２０ｍｌで１回、水１２０ｍｌで１回、飽和食塩水１２０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物５）７．４９ｇ（収率７６％）を淡黄色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 8.03-8.00 (m, 1 H), 7.94-7.85 (m, 2 H), 7.54-7.34 (m, 8 H), 7.28-7.12 (m, 8 H), 6.82-6.77 (m, 2 H), 4.94 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 4.88 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 4.80 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 3.82 (m, 1 H), 3.70 (s, 3 H), 3.51 (m, 2 H), 2.39 (br dd, 1 H, J = 7.0, 8.6 Hz), 2.17 (ddd, 1 H, J = 4.6, 8.6, 11.5 Hz), 1.97 (ddd, 1 H, J = 6.6, 7.0, 11.5 Hz).

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン（化合物６）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン−２−オール（化合物５）７．４９ｇ（１４．８７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ３７０ｍｇ（０．２当量）をジメチルホルムアミド１５０ｍｌに溶解し、１，１’−カルボニルジイミダゾール１．９３ｇ（０．８当量）を加えて室温で撹拌した。２時間後、１，１’−カルボニルジイミダゾール１．９３ｇ（０．８当量）を追加してさらに４時間撹拌した。この反応液に６−アミノ−１−ヘキサノール５．２３ｇ（３．０当量）を加えて室温で１５時間撹拌した。反応液に酢酸エチル３５０ｍｌを加えて、水１２０ｍｌで４回、飽和食塩水１２０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物６）８．８２ｇ（収率９２％）を白色固体状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 8.00-7.85 (m, 3 H), 7.53-7.33 (m, 8 H), 7.28-7.12 (m, 9 H), 6.81-6.77 (m, 2 H), 4.95 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.95 (m, 1 H), 4.88 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.30 (t, 1 H, J = 5.1 Hz), 3.72-3.68 (m, 5 H), 3.36 (m, 2 H), 2.96 (m, 2 H), 2.38 (t, 1 H, J = 8.1 Hz), 2.18 (m, 2 H), 1.41-1.33 (m, 4 H), 1.26-1.22 (m, 4 H).

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン ６’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物７）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−３−（１−ナフチルメトキシ）プロパン（化合物６）３２３ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．５２ｍｌ（６．０当量）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解して氷冷し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト０．１３ｍｌ（１．２当量）を加え、室温に戻して３０分撹拌した。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍｌで１回、水２０ｍｌで１回、飽和食塩水２０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物７）３１０ｍｇ（収率７３％）を無色シロップ状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 8.00-7.85 (m, 3 H), 7.53-7.33 (m, 8 H), 7.26-7.12 (m, 9 H), 6.81-6.77 (m, 2 H), 4.95 (d, 1 H, J = 11.9 Hz), 4.94 (m, 1 H), 4.88 (d, 1 H, J = 11.9 Hz), 3.72-3.64 (m, 7 H), 3.61-3.48 (m, 4 H), 2.96 (m, 2 H), 2.73 (t, 2 H, J = 5.8 Hz), 2.39 (m, 1 H), 2.17 (m, 2 H), 1.52-1.46 (m, 2 H), 1.41-1.36 (m, 2 H), 1.28-1.23 (m, 4 H), 1.14-1.09 (m, 12 H).
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆)δ: 147.27.

（実施例２）中間体化合物ｓｓＭｅＯ−ａｍ（化合物１１）の合成（図２）
（Ｓ）−３−メトキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノプロパン−２−オール（化合物９）
アルゴン雰囲気下、（Ｒ）−（−）−グリシジルメチルエーテル（化合物８）０．９０ｍｌ（１０．０ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド４０ｍｌに溶解し、アジ化ナトリウム１．９５ｇ（３．０当量）および塩化アンモニウム２．１４ｇ（４．０当量）を加えて８０℃で３時間加熱撹拌した。反応液を室温まで冷ました後、酢酸エチル２３０ｍｌを加えて、水６０ｍｌで４回、飽和食塩水６０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、得られたオイル状物質をエタノール１００ｍｌに溶解し、パラジウム炭素（１０％）６００ｍｇを加えて、常圧の水素雰囲気化、室温で１３時間撹拌した。パラジウム触媒をセライトろ過により除去した後、溶液を減圧下濃縮し、さらにピリジン１５ｍｌで２回共沸した。得られたオイル状物質をアルゴン雰囲気下、ピリジン１００ｍｌに溶解し、トリエチルアミン４．１８ｍｌ（３．０当量）および塩化モノメトキシトリチル３．７０ｇ（１．２当量）を加え、室温で４５分撹拌した。エタノール１０ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル２４０ｍｌに溶解し、水８０ｍｌで１回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液８０ｍｌで１回、水８０ｍｌで１回、飽和食塩水８０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物９）１．９７ｇ（収率５２％）を淡黄色シロップ状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6)δ: 7.41-7.38 (m, 4 H), 7.30-7.25 (m, 6 H), 7.19-7.14 (m, 2 H), 6.87-6.83 (m, 2 H), 4.78 (d, 1 H, J = 5.0 Hz), 3.75 (ddddd, 1 H, J = 4.6, 5.0, 5.3, 5.8, 6.6 Hz), 3.71 (s, 3 H), 3.33 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.6 Hz), 3.28 (dd, 1 H, J = 5.8, 9.6 Hz), 3.23 (s, 3 H), 2.42 (dd, 1 H, J = 6.7, 8.9 Hz), 2.14 (ddd, 1 H, J = 4.6, 8.9, 11.5 Hz), 1.96 (ddd, 1 H, J = 6.7, 6.9, 11.5 Hz).

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−メトキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノプロパン（化合物１０）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−３−メトキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノプロパン−２−オール（化合物９）１．７４ｇ（４．６１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ１１０ｍｇ（０．２当量）をジメチルホルムアミド５０ｍｌに溶解し、１，１’−カルボニルジイミダゾール６００ｍｇ（０．８当量）を加えて室温で撹拌した。２時間後、１，１’−カルボニルジイミダゾール６００ｍｇ（０．８当量）を追加してさらに４時間撹拌した。この反応液に６−アミノ−１−ヘキサノール１．６４ｇ（３．０当量）を加えて室温で１６時間撹拌した。反応液に酢酸エチル２５０ｍｌを加えて、水７０ｍｌで４回、飽和食塩水７０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物１０）２．０５ｇ（収率８５％）を無色シロップ状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.40-7.37 (m, 4 H), 7.30-7.24 (m, 6 H), 7.19-7.12 (m, 3 H), 6.86-6.83 (m, 2 H), 4.87 (m, 1 H), 4.31 (t, 1 H, J = 5.1 Hz), 3.72 (s, 3 H), 3.50 (dd, 1 H, J = 5.4, 10.5 Hz), 3.45 (dd, 1 H, J = 4.3, 10.5 Hz), 3.35 (q, 2 H, J = 5.1, 6.5 Hz), 3.23 (s, 3 H), 2.96 (m, 2 H), 2.43 (t, 1 H, J = 8.1 Hz), 2.15 (m, 2 H), 1.43-1.33 (m, 4 H), 1.27-1.22 (m, 4 H).

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−メトキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノプロパン ６’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物１１）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−３−メトキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノプロパン（化合物１０）２６０ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．５２ｍｌ（６．０当量）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解して氷冷し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト０．１３ｍｌ（１．２当量）を加え、室温に戻して３０分撹拌した。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍｌで１回、水２０ｍｌで１回、飽和食塩水２０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物１１）３１０ｍｇ（収率８６％）を無色シロップ状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.39-7.36 (m, 4 H), 7.30-7.24 (m, 6 H), 7.19-7.14 (m, 3 H), 6.86-6.83 (m, 2 H), 4.86 (m, 1 H), 3.72 (s, 3 H), 3.75-3.65 (m, 2 H), 3.59-3.50 (m, 4 H), 3.48-3.46 (m, 2 H), 3.26 (s, 3 H), 2.96 (m, 2 H), 2.74 (t, 2 H, J = 5.9 Hz), 2.43 (br t, 1 H, J = 8.0 Hz), 2.16-2.13 (m, 2 H), 1.52-1.47 (m, 2 H), 1.41-1.36 (m, 2 H), 1.28-1.25 (m, 4 H), 1.14-1.10 (m, 12 H).
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆)δ: 147.20.

（実施例３）中間体化合物ｓｓＭｅ−ａｍ（化合物１５）の合成（図３）
（Ｓ）−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−２−プロパノール（化合物１３）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−（＋）−１−アミノ−２−プロパノール（化合物１２）０．７９ｍｌ（１０．０ｍｍｏｌ）をピリジン１００ｍｌに溶解し、トリエチルアミン２．８０ｍｌ（２．０当量）および塩化モノメトキシトリチル３．７０ｇ（１．２当量）を加え、室温で２時間撹拌した。エタノール１０ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル１５０ｍｌに溶解し、水６０ｍｌで１回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液６０ｍｌで１回、水６０ｍｌで１回、飽和食塩水６０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物１３）３．３０ｇ（収率９５％）を淡黄色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.43-7.38 (m, 4 H), 7.32-7.25 (m, 6 H), 7.19-7.13 (m, 2 H), 6.88-6.82 (m, 2 H), 4.55 (d, 1 H, J = 4.6 Hz), 3.74 (m, 1 H), 3.72 (s, 3 H), 2.40 (dd, 1 H, J = 6.9, 8.9 Hz), 1.99 (ddd, 1 H, J = 4.6, 8.9, 11.5 Hz), 1.91 (td, 1 H, J = 6.9, 11.5 Hz), 1.04 (d, 3 H, J = 6.3 Hz).

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノプロパン（化合物１４）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−１−（モノメトキシトリチル）アミノ−２−プロパノール（化合物１３）１．３９ｇ（４．０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ９８ｍｇ（０．２当量）をジメチルホルムアミド４０ｍｌに溶解し、１，１’−カルボニルジイミダゾール５２０ｍｇ（０．８当量）を加えて室温で撹拌した。２時間後、１，１’−カルボニルジイミダゾール５２０ｍｇ（０．８当量）を追加してさらに５時間撹拌した。この反応液に６−アミノ−１−ヘキサノール１．４０ｇ（３．０当量）を加えて室温で１６時間撹拌した。反応液に酢酸エチル２５０ｍｌを加えて、水８０ｍｌで４回、飽和食塩水８０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物１４）１．８１ｇ（収率９２％）を白色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.41-7.38 (m, 4 H), 7.31-7.25 (m, 6 H), 7.19-7.14 (m, 2 H), 7.03 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 6.87-6.84 (m, 2 H), 4.80 (m, 1 H), 4.32 (t, 1 H, J = 5.1 Hz), 3.72 (s, 3 H), 3.36 (dt, 2 H, J = 5.1, 6.4 Hz), 2.96 (m, 2 H), 2,41 (br t, 1 H, J = 8.1 Hz), 2.08 (m, 2 H), 1.43-1.34 (m, 4 H), 1.27-1.23 (m, 4 H), 1.15 (d, 3 H, J = 5.6 Hz).

（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノプロパン ６’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物１５）
アルゴン雰囲気下、（Ｓ）−２−［Ｎ−（６’−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］オキシ−１−（モノメトキシトリチル）アミノプロパン（化合物１４）２４５ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．５２ｍｌ（６．０当量）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解して氷冷し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト０．１３ｍｌ（１．２当量）を加え、室温に戻して３０分撹拌した。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍｌで１回、水２０ｍｌで１回、飽和食塩水２０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物１５）２１３ｍｇ（収率６２％）を無色シロップ状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.40-7.38 (m, 4 H), 7.30-7.25 (m, 6 H), 7.19-7.14 (m, 2 H), 7.02 (br t, 1 H, J = 5.5 Hz), 6.87-6.83 (m, 2 H), 4.80 (m, 1 H), 3.72 (s, 3 H), 3.76-3.65 (m, 2 H), 3.62-3.48 (m, 4 H), 2.96 (m, 2 H), 2.74 (t, 2 H, J = 5.9 Hz), 2.41 (br t, 1 H, J = 7.9 Hz), 2.07 (m, 2 H), 1.55-1.46 (m, 2 H), 1.41-1.33 (m, 2 H), 1.30-1.25 (m, 4 H), 1.16-1.10 (m, 15 H).
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆)δ: 147.22.

（実施例４）中間体化合物ｓｓＨ−ａｍ（化合物１９）の合成（図４）
２−（モノメトキシトリチル）アミノエタノール（化合物１７）
アルゴン雰囲気下、２−アミノエタノール（化合物１６）０．３０ｍｌ（５．０ｍｍｏｌ）をピリジン５０ｍｌに溶解し、トリエチルアミン１．４０ｍｌ（２．０当量）および塩化モノメトキシトリチル１．７０ｇ（１．１当量）を加え、室温で１時間撹拌した。エタノール１０ｍｌを加えて反応を止めた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル１５０ｍｌに溶解し、水６０ｍｌで１回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液６０ｍｌで１回、水６０ｍｌで１回、飽和食塩水６０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物１７）１．６３ｇ（収率９８％）を淡黄色泡状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.41-7.38 (m, 4 H), 7.30-7.25 (m, 6 H), 7.19-7.13 (m, 2 H), 6.88-6.82 (m, 2 H), 4.49 (t, 1 H, J = 5.5 Hz), 3.71 (s, 3 H), 3.50 (dt, 2 H, J = 5.5, 6.0 Hz), 2.54 (br t, 1 H, J = 7.7 Hz), 2.07 (dt, 2 H, J = 6.0, 7.7 Hz).

１−Ｎ−［２−（モノメトキシトリチル）アミノエトキシカルボニル］アミノ−６−ヘキサノール（化合物１８）
アルゴン雰囲気下、２−（モノメトキシトリチル）アミノエタノール（化合物１７）１．５０ｇ（４．５０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ１１０ｍｇ（０．２当量）をジメチルホルムアミド４５ｍｌに溶解し、１，１’−カルボニルジイミダゾール４４０ｍｇ（０．６当量）を加えて室温で撹拌した。１．５時間後、１，１’−カルボニルジイミダゾール４４０ｍｇ（０．６当量）を追加してさらに２．５時間撹拌した。この反応液に６−アミノ−１−ヘキサノール１．６０ｇ（３．０当量）を加えて室温で１６時間撹拌した。反応液に酢酸エチル２５０ｍｌを加えて、水８０ｍｌで４回、飽和食塩水８０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物（化合物１８）２．０２ｇ（収率９４％）を無色シロップ状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.40-7.38 (m, 4 H), 7.30-7.25 (m, 6 H), 7.19-7.14 (m, 2 H), 7.11 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 6.87-6.83 (m, 2 H), 4.33 (t, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.02 (t, 2 H, J = 5.8 Hz), 3.72 (s, 3 H), 3.36 (dt, 2 H, J = 5.3, 6.5 Hz), 2.94 (dt, 2 H, J = 5.6, 6.9 Hz), 2.69 (br t, 1 H, J = 7.9 Hz), 2.14 (dt, 2 H, J = 5.7, 7.9 Hz), 1.43-1.33 (m, 4 H), 1.28-1.21 (m, 4 H).

１−Ｎ−［２−（モノメトキシトリチル）アミノエトキシカルボニル］アミノ−６−ヘキサノール ６−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物１９）
アルゴン雰囲気下、１−Ｎ−［２−（モノメトキシトリチル）アミノエトキシカルボニル］アミノ−６−ヘキサノール（化合物１８）２４０ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．５２ｍｌ（６．０当量）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解して氷冷し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト０．１３ｍｌ（１．２当量）を加え、室温に戻して３０分撹拌した。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍｌで１回、水２０ｍｌで１回、飽和食塩水２０ｍｌで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン−１％トリエチルアミン）により精製して標記化合物（化合物１９）２７３ｍｇ（収率８０％）を無色シロップ状物質として得た。
¹H NMR (270 MHz, DMSO-d₆)δ: 7.40-7.37 (m, 4 H), 7.30-7.25 (m, 6 H), 7.19-7.14 (m, 2 H), 7.10 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 6.86-6.83 (m, 2 H),4.02 (t, 2 H, J = 5.9 Hz), 3.76-3.65 (m, 2 H), 3.72 (s, 3 H), 3.61-3.50 (m, 4 H), 2.94 (m, 2 H), 2.74 (t, 2 H, J = 5.9 Hz), 2.69 (br t, 1 H, J = 7.9 Hz), 2.14 (m, 2 H), 1.56-1.46 (m, 2 H), 1.41-1.33 (m, 2 H), 1.30-1.24 (m, 4 H), 1.14-1.10 (m, 12 H).
³¹P NMR (109 MHz, DMSO-d₆)δ:147.15.

（実施例５）オリゴヌクレオチドプローブの合成と精製
オリゴヌクレオチドの合成はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー上で行った。

ＨＰＬＣにはＧｉｌｓｏｎの装置を用い、分析はＷａｔｅｒｓ９９６フォトダイオードアレイ検出器を用いて行った。逆相分析用カラムとしてＷａｔｅｒｓ μ−Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８、３００Å（内径３．９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）、逆相分取用カラムとしてＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ Ｃ１８（内径８．０ｍｍ×長さ３００ｍｍ）を使用した。移動相として、逆相の場合には０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＡ、ｐＨ７．０）中アセトニトリルの濃度勾配を用いた。

配列番号１で表される２５塩基のオリゴヌクレオチドを含む各アミノ化オリゴヌクレオチドプローブを、デオキシヌクレオシド３’−ホスホロアミダイト（日本テクノサービス社より購入）を原料として、ＤＮＡ自動合成機（モデル３９４Ａ；（株）パーキンエルマージャパン・アプライドバイオシステムズ事業部製）で、０．２または１μｍｏｌスケールで合成した。
Ｘ−２５（Ｘ＝Ｃｏｎ、ｓｓＮ，ｓｓＭｅ、ｓｓＭｅＯ、ｓｓＨ）：
５’−Ｘ−ＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号１）
ｓｓＮ−２５、ｓｓＭｅ−２５、ｓｓＭｅＯ−２５、ｓｓＨ−２５の合成におけるアミノ基の導入は、それぞれ実施例１〜４で合成したｓｓＮ−ａｍ、ｓｓＭｅ−ａｍ、ｓｓＭｅＯ−ａｍ、ｓｓＨ−ａｍのホスホロアミダイト化合物を用いて行った（図５）。比較用オリゴヌクレオチドプローブとして、市販のアミノ基結合ホスホロアミダイト化合物（Ｃｏｎ−ａｍ）を用い、Ｃｏｎ−２５を合成した。すなわち、Ｃｏｎ−２５におけるアミノ基の導入には、Ｎ−モノメトキシトリチル−６−アミノヘキシルホスホロアミダイト（グレンリサーチ社）を用いた。合成したオリゴヌクレオチドプローブＣｏｎ−２５、ｓｓＮ−２５、ｓｓＭｅ−２５、ｓｓＭｅＯ−２５、ｓｓＨ−２５の構造を図６に示す。

（実施例６）アミノ基保護基の除去効率の比較
アンモニア処理後のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブ（１０μＬ）をエッペンドルフチューブにとり、減圧下乾固した。その後、１％、１０％、または８０％酢酸水溶液（２５μＬ）を加え、室温で放置した。適当な時間に反応液（５μＬ）をサンプリングしアンモニア水で中和後、逆相カラムを用いたＨＰＬＣで分析した。

モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）基の脱保護後および脱保護前のオリゴヌクレオチドプローブのＨＰＬＣの保持時間を表１に、酸処理前（脱保護前）および酸処理後（脱保護後）のＨＰＬＣチャートを図７に示す。カラムは、μ−Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８， Φ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）を使用した。

また、アミノ化オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｏｎ−２５、ｓｓＮ−２５、ｓｓＭｅＯ−２５、ｓｓＭｅ−２５、ｓｓＨ−２５）を各酸性条件において２０分間処理したときの、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）基の脱保護体の生成率を表２に示した。

溶液１
Ａ溶液 ５％ アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
Ｂ溶液 ５０％ アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
カラム温度：５０度
ＨＰＬＣ条件
条件１ Ｂ溶液の％ ０→１００％／２０分
条件２ Ｂ溶液の％ １０→８０％／２０分

図７および表２の結果から、本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブにおいては、置換トリチル基で保護したアミノ基を穏和な酸性条件下で脱保護できることが示された。従って、本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドを損傷することなく、迅速かつ簡便に分離精製することができることが示された。

（実施例７）オリゴヌクレオチドプローブと活性エステルとの反応
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｏｎ−２５、ｓｓＮ−２５、ｓｓＭｅＯ−２５、ｓｓＭｅ−２５、ｓｓＨ−２５）（１ｎｍｏｌ）とビオチン−スクシンイミジルエステル（ＤＯＪＩＮＤＯ）（３０ｎｍｏｌ）を１０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド、０．２５Ｍ リン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）に溶解し（全量１００μＬ）、遮光し４０℃で反応を行った。反応開始後３０分〜２時間までの任意の時間に１５μＬはかりとり、ＮＡＰ５（ファルマシア社）で脱塩し、溶出液を逆相ＨＰＬＣで分析した。ビオチン−スクシンイミジルエステルと未反応のまたは反応したアミノ化オリゴヌクレオチドプローブのＨＰＬＣにおける保持時間を表３に示す。また、反応３０分後の反応生成物の割合を図８（ａ）に示す。カラムは、μ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラムΦ３．９ｘ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製）を使用した。

溶液
Ａ溶液 ５％アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
Ｂ溶液 ５０％アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
カラム温度：５０度
ＨＰＬＣ条件
条件１ Ｂ溶液の％ ０→１００％／２０分
図８ａの結果から、本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドにおいては、アミノ基の反応性が高く、活性エステルと効率的に反応することが示された。

（実施例８）フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）との反応
オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｏｎ−２５、ｓｓＮ−２５、ｓｓＭｅＯ−２５、ｓｓＭｅ−２５、ｓｓＨ−２５）（１ｎｍｏｌ）とＦＩＴＣ（５００ｎｍｏｌ）を１０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド、０．２５Ｍ リン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）に溶解し（全量１００μＬ）、遮光し４０℃で反応を開始した。反応開始後３０分〜２時間までの任意な時間に１５μＬはかりとり、ＮＡＰ５（ファルマシア社）で脱塩した。その後逆相ＨＰＬＣで分析した。ＦＩＴＣと未反応のまたは反応したオリゴヌクレオチドプローブの保持時間を表４に示す。また、反応３０分後の反応生成物の割合を図８（ｂ）に示す。

溶液
Ａ溶液 ５％ アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）；
Ｂ溶液 ５０％ アセトニトリル／０．１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）
カラム温度：５０度
ＨＰＬＣ条件
条件３ Ｂ溶液の％ ０→７０％／２０分
条件４ Ｂ溶液の％ ２０→５０％／２０分
条件５ Ｂ溶液の％ ０→５０％／２０分
図８ｂの結果から、本発明のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブにおいては、アミノ基の反応性が高く、蛍光化合物と効率的に反応することが示された。

本発明により、オリゴヌクレオチドへのアミノ基の導入および精製が容易となり、迅速かつ高純度にアミノ化オリゴヌクレオチドを供給することが可能となる。これにより、ＤＮＡチップまたはビーズアレイに搭載されるオリゴヌクレオチオドプローブの品質が向上し、それらの低価格化にもつながる。

中間体化合物ｓｓＮ−ａｍの合成スキームを示す。 中間体化合物ｓｓＭｅＯ−ａｍの合成スキームを示す。 中間体化合物ｓｓＭｅ−ａｍの合成スキームを示す。 中間体化合物ｓｓＨ−ａｍの合成スキームを示す。 各中間体化合物の構造を示す。 アミノ化オリゴヌクレオチドプローブにおけるオリゴヌクレオチド配列、および５’末端に導入されたアミノ基の構造を示す。 モノメトキシトリチル基で保護したアミノ化オリゴヌクレオチドの、酸性条件下（１０％酢酸、２０分）におけるモノメトキシトリチル基の脱保護反応の結果を示す。ピーク１はモノメトキシトリチル基で保護されたアミノ化オリゴヌクレオチド由来のピークであり、ピーク２はモノメトキシトリチル基が除去されたアミノ化オリゴヌクレオチド由来のピークを表す。 アミノ化オリゴヌクレオチドの溶液中における化学反応性を示す。（ａ）は、ビオチン−スクシンイミジルエステルとの反応性を示し、（ｂ）はフルオレセインイソチオシアネートとの反応性を示す。それぞれ反応３０分後の反応生成物の割合を示す。

Claims (15)

1. 一般式１：
   

   

   （式中、
   Ｒ_１は水素原子またはアミノ基の保護基であり、
   Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、二価の有機基であり、
   Ａはオリゴヌクレオチドである）
   で表されるオリゴヌクレオチドプローブ。
2. Ｒ_２およびＲ_３が、それぞれ独立して、複素原子を含んでいてもよい置換または無置換の二価の炭化水素基である、請求項１記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
3. Ｒ_２が、一般式２：
   

   

   （式中、
   Ｒ_４は、直接結合、または置換もしくは無置換の鎖員１〜９のアルキレン基であり；
   Ｒ_５は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、または複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基であり；
   Ｒ_６は、直接結合、または置換もしくは無置換の鎖員１〜５のアルキレン基である）
   で表される、請求項１または２記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
4. Ｒ_５が、水素原子、鎖員１〜２０の脂肪族炭化水素基、置換もしくは無置換の鎖員１〜１０のアルコキシ基、置換もしくは無置換の鎖員５〜２０のアリール基、置換もしくは無置換の鎖員３〜２０の脂環式基、または置換もしくは無置換の鎖員６〜２０のアリールアルキル基であり、これらの基において一部の炭素原子が複素原子と置き換えられていてもよい、請求項３記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
5. Ｒ_２が、一般式３：
   

   

   （式中、
   Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９およびＲ_１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、または複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基であるか、または、Ｒ_７もしくはＲ_８とＲ_９もしくはＲ_１０とが、それらが結合している炭素原子と一緒になって複素原子を含んでいてもよい環を形成している）
   で表される、請求項１または２記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
6. Ｒ_１がトリチル基またはモノ置換もしくはジ置換トリチル基である、請求項１〜５のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
7. 請求項１〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドプローブが固定化された担体。
8. 一般式４：
   

   

   （式中、
   Ｒ_１は、水素原子またはアミノ基の保護基であり、
   Ｒ_２およびＲ_３は、それぞれ独立して、二価の有機基であり、
   Ｒ_１１およびＲ_１２は、それぞれ独立して、有機基であるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよく、
   Ｒ_１３は、リン酸保護基である）
   で表される化合物。
9. Ｒ_２およびＲ_３が、それぞれ独立して、複素原子を含んでいてもよい置換または無置換の二価の炭化水素基である、請求項８記載の化合物。
10. Ｒ_２が、一般式２：
    

    

    （式中、
    Ｒ_４は、直接結合、または置換もしくは無置換の鎖員１〜９のアルキレン基であり；
    Ｒ_５は、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、または複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基であり；
    Ｒ_６は、直接結合、または置換もしくは無置換の鎖員１〜５のアルキレン基である）
    で表される、請求項８または９記載の化合物。
11. Ｒ_５が、水素原子、鎖員１〜２０の脂肪族炭化水素基、置換もしくは無置換の鎖員１〜１０のアルコキシ基、置換もしくは無置換の鎖員５〜２０のアリール基、置換もしくは無置換の鎖員３〜２０の脂環式基、または置換もしくは無置換の鎖員６〜２０のアリールアルキル基であり、これらの基において一部の炭素原子が複素原子と置き換えられていてもよい、請求項１０記載の化合物。
12. Ｒ_２が、一般式３：
    

    

    （式中、
    Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９およびＲ_１０は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、または複素原子を含んでいてもよい置換もしくは無置換の一価の炭化水素基であるか、または、Ｒ_７もしくはＲ_８とＲ_９もしくはＲ_１０とが、それらが結合している炭素原子と一緒になって複素原子を含んでいてもよい環を形成している）
    で表される、請求項８または９記載の化合物。
13. Ｒ_１がトリチル基またはモノ置換もしくはジ置換トリチル基である、請求項８〜１２のいずれか１項記載の化合物。
14. 請求項８〜１３のいずれか１項記載の化合物を用いて、オリゴヌクレオチドにアミノ基を導入する方法。
15. 以下の式：
    

    

    （式中、ＭＭＴはモノメトキシトリチル基であり、
    Ｒ_３は、置換または無置換の鎖員１〜２０のアルキレン基である）
    で表される化合物。

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