JP2016519055A - アミノ酸側鎖を含有する合成重合体 - Google Patents
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Abstract
多数のサブユニットを含有する合成高分子であって、前記サブユニットのうちの1つ以上が、リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有し、ホスホジエステル結合または修飾ホスホジエステル結合により隣接サブユニットに結合される合成高分子。本発明は、類似体ポリペプチドの分野に、ならびにこのような類似体を製造するのに有用である合成化学化合物に関する。【選択図】図1
Description
本発明は、ポリペプチドの類似体の分野に、ならびにこのような類似体を製造するのに有用である合成化学化合物に関する。
式Aで示されるように、アミノ酸は、アミノ基(NH2)、カルボキシル基(COOH)および側鎖(R)を含有し、その各々は中心アルファ炭素に結合される。それらのそれぞれの側鎖(R)とともに以下の表1に列挙された遺伝暗号によりコードされる20のアミノ酸(イミノ酸プロリンを含む)が存在する。
天然アミノ酸のほかに、遺伝暗号によりコードされない2つの他のアミノ酸が、タンパク質中に見出されている。セレノシステインはいくつかの酵素中に存在し、例えばそのいくつかはヒトに存在する。ピロリシンは、いくつかのメタン生成性古細菌において、それらがメタンを生成するために用いる酵素中に存在する。DNAコード化されない付加的アミノ酸としては、カルニチンおよびGABA(ガンマ−アミノ酪酸)、セレノメチオニン、ならびにヒドロキシプロリンが挙げられる。
アミノ酸は、あるアミノ酸からのカルボキシ部分からのヒドロキシル基、および第二のアミノ酸のヒドロキシ部分からのアミノ基からの水素のうちの1つが水として放出され、図Bに示されるようにペプチド結合(CO−NH)が形成される脱水または縮合反応により、第二のアミノ酸と連結されて、アミドである分子の生成を引き起こす。
ペプチド結合による2つのアミノ酸の連結は、ジペプチドとして言及される。2つ以上のアミノ酸の鎖は、ポリペプチドとして言及される。ポリペプチドの場合、各アミノ酸は、2つの末端アミノ酸を除いて、ポリペプチド結合により2つの隣接アミノ酸と連結される。本特許出願において、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも2つのアミノ酸を有する鎖を指す。ポリペプチドが完全生物学的形態であり、安定立体配座である場合、ポリペプチドは「タンパク質」として本明細書中で言及され得る。「タンパク質」という用語は、本明細書中で用いる場合、安定三次元構造を有することも有さないこともあり、生物学的または化学的活性を有することも有さないこともある2〜50のアミノ酸の短いアミノ酸オリゴマーを指す。
タンパク質は、動物または植物の身体内部で、および環境中で、種々の機能を有する。生体系において、タンパク質、例えばコラーゲン、ケラチンおよび植物タンパク質は剛性を提供し、構造を形成する。その他のタンパク質は、細胞シグナル伝達およびシグナル変換の過程に関与する。他のタンパク質は、生体系および環境の両方において、酵素として機能して、化学反応を触媒する。
細胞シグナル伝達およびシグナル変換タンパク質、例えば受容体、受容体リガンド、抗体および酵素は、ポリペプチド鎖の精確なフォールディングを基礎にした特定の立体配座を有する。ポリペプチドのアミノ酸は、互いに相互作用して、天然状態として既知の、折りたたまれたタンパク質である明確な三次元構造を生成する。それは、その結果生じる三次元構造を決定するポリペプチド中のアミノ酸の配列である。
ポリペプチドの場合、多数の三次元立体配座が考えられる。しかしながら、熱力学的に最も安定である立体配座が、優位に採用される。ペプチド結合は、堅くかつ平坦である。ペプチド結合と隣接する2つのアミノ酸の中心炭素、ならびにペプチド結合それ自体のCOおよびNHは、単一平面にある。しかしながら、アミノ酸側鎖(R)は、それらの中心炭素周囲を自由に回転する。その結果は、一連の剛性平面で作られるポリペプチド主鎖であり、隣接平面は、隣接平面間で共有される中心四面体炭素での回転の共通点を共有する。ポリペプチド鎖の中心炭素でのねじれ自由度は、原子間の立体障害により妨げられない限り、ポリペプチド鎖の種々のアミノ酸側鎖に互いと自由に相互作用させ、最も熱力学的に安定な立体配座を採用させる。
相対的に長さが短い、50アミノ酸未満、特に30アミノ酸未満のポリペプチド鎖では、ポリペプチドは、典型的には、二次構造をほとんど有さず、フォールディングをほとんど伴わない。しかしながら、50アミノ酸より長いポリペプチド鎖では、主にアミノ酸の配列によって、特にそれらの側鎖によって決まるたたまれた立体配座をポリペプチドが採用するので、二次構造はより大きい意義を有する。
例えば医学的または環境的適用のために、それらの細胞シグナル伝達、シグナル変換または酵素的特性に関して、ならびにそれらの構造的特性に関してはより低い程度に、ポリペプチドを用いるという発想は、長い間、望ましいと考えられてきた。しかしながら、ポリペプチドのこのような使用を相容れない追求目標にする多数の問題が存在する。
ポリペプチドの化学合成は、成長中のペプチド結合連結アミノ酸鎖に化学的に保護されたアミノ酸を1つずつ段階的に付加することを包含する。近年まで、各付加的アミノ酸添加ステップでの収率が低すぎるため、このような化学合成は実用的でなかった。段階的添加工程の合成における誤りは、各付加的アミノ酸に関して90%の収率を提供する剛性方法に関しては、10個だけのアミノ酸のポリペプチドに関する最終収率は34%に過ぎず、20個のアミノ酸のポリペプチドに関する最終収率は12%に過ぎない。しかしながら、近年、合成工程は、99%より高い各新規添加アミノ酸に関する収率を提供して、従来得られていたよりも有意に高い収率を提供することが報告されている。
治療目的のためのポリペプチドの使用に伴うさらに扱いにくい問題は、その活性部位へのポリペプチドの送達、ならびに生物学的環境におけるポリペプチドの不安定性に関する。ポリペプチドは唾液および胃液酵素により迅速に分解されるため、ポリペプチドの経口投与は実用的でない。しかしながら、このような投与経路が、例えば静脈内投与により、迂回される場合でさえ、血流中に、または身体全体に見出されるペプチダーゼ酵素により、ポリペプチドは不活性断片に迅速に分解される。したがって、ポリペプチドが治療的に用いられた場合、非常に短期間であっても、何らかの活性ポリペプチドの利用可能性を保証するために、ポリペプチドの迅速な分解および排除は、超薬理学的用量の投与を要する。さらに重要なことは、このような超薬理学的用量のポリペプチドの投与が、その後の臨床的毒性と関連すると思われる点である。それは主に、治療薬としてのポリペプチドの使用が広範に利用されていないというこれらの理由のためである。
分解および送達についての同様の問題は、環境的目的のためのポリペプチドの使用に伴って生じる。環境ペプチダーゼ、例えば細菌および真菌のような顕微鏡的生物体におけるものは、迅速にポリペプチドを分解し、それらの意図した目的のためにポリペプチドを役に立たなくさせる。
環境的な、および臨床的に投与されるポリペプチドの不安定性の問題を克服するために、多くの試みがなされてきた。上記のように、一方法は、超薬理学的用量でポリペプチドを投与するかまたは適用することである。しかしながら、このような超薬理学的用量投与は、極端に高い経費と、ならびに考え得る毒性と関連する。したがって、ほとんどの状況において、この選択肢は実行可能でない。
身体的および環境的ペプチダーゼに対して耐性である機能的タンパク質様分子を獲得するための試みにおいて、ポリペプチドの種々の類似体が生成されている。Hechter et al,PNAS,72(2):563−566(1975)は、ペプチド結合のCOおよびNが入れ替えられるペプチド類似体であるレトロ−D類似体を試験した。Hectherに開示されるように、このようなペプチド類似体は、経口投与される場合、活性を保持すると予測される。しかしながら、Hectherにさらに開示されるように、レトロ−D類似体は機能的活性を欠く。
Gopi et al,FEBS Letters,535:175−178(2003)は、ペプチド鎖中のベータ−アミノ酸の組み入れがタンパク質分解性分解に対するペプチドの耐性を提供する、と開示している。天然アミノ酸は、アミノ基およびカルボキシル基が同一中心炭素原子に結合されるアルファ−アミノ酸である。グリシン以外の天然アミノ酸の各々は、ベータ−アミノ酸として作られ得る。グリシンは、単一炭素だけを有し、したがってアミノおよびカルボキシル基はグリシン側鎖の異なる炭素と結合され得ないため、ベータ−アミノ酸に作られ得ない。Gopiは、単一ベータ−アミノ酸のペプチドへの添加がプロテアーゼによる分解からペプチドを保護する、と開示した。しかしながら、Gopiは、ベータ−アミノ酸の存在が、さらにまた、ペプチドの機能性をかなり低減する、とさらに開示した。
Hirschmann(米国特許第5,770,732号)は、活性ポリペプチドの1つ以上のアミノ酸サブユニット、アミノ酸のピロリノンサブユニット類似体による取り替えを開示する。要するに、ポリペプチドのアミド主鎖は、5員ピロリノン環系で中心アミド基を取り替えるために再整列される。Hirschmann特許の発明人等は、会社Provid Pharmaceuticals Inc.(Piscataway,NJ)を設立して、これらのピロリノン模擬足場を含有するペプチド類似体を開発し、商業化した。
本出願人の知るところでは、従来技術のペプチド類似体のうち、ペプチドの代用物として広範囲の用途を見出したものはない。したがって、プロテアーゼ分解に耐性であり、類似体が基礎とする天然ペプチドの機能性を保持するペプチド類似体を開発するための目標は依然としてわかりにくい。
核酸は、ポリペプチドとは異なる生体高分子の一クラスである。ポリペプチドとは違って、核酸の単量体単位は、ペプチド結合というよりむしろホスホジエステル結合の主鎖により、一緒に結び付けられる。さらにまた、ポリペプチドとは違って、天然核酸は、リボ核酸(RNA)の場合にはリボース、デオキシリボ核酸(DNA)の場合にはデオキシリボースの糖の反復単位を含有する。
核酸とポリペプチドの間の別の差異は、側鎖にある。ポリペプチドが中心炭素と連結されるアミノ酸側鎖を含有する一方、天然核酸は4つの側鎖を含有する。RNAの場合、側鎖は、プリン アデニンおよびグアニン、ならびにピリミジン シトシンおよびウラシルである。DNAの場合、側鎖は、プリン アデニンおよびグアニン、ならびにピリミジン シトシンおよびチミンである。
これらの差異は別にして、核酸およびポリペプチドは、共同のいくつかの特徴を共有する。ポリペプチドと同様に、一本鎖核酸は、側鎖の高自由度の動きを有する平坦な主鎖、この場合はプリンまたはピリミジンを本質的に有する。ポリペプチドと同様に、核酸は、身体内の、ならびに環境中の酵素による分解に付される。
ペプチド核酸(PNA)は、ペプチド結合により連結されるN−(2−アミノセチル)−グリシン単位を反復する主鎖を有するキメラ高分子化合物である。種々のプリンおよびピリミジン塩基は、メチレンカルボニル結合により主鎖と連結される。PNAはプロテアーゼまたはヌクレオシダーゼにより分解されず、DNAの作用を抑制するためにDNAと結合することは有用である。
PNA分子は、合成核酸類似体である。今日まで、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖を基礎にした合成ポリペプチド分子を、本発明人は承知していない。以下でさらに詳細に記載されるように、このような分子は、ヒトおよび動物医療における治療的および診断的指標のために有用であり、ポリペプチドが有用である状況での環境的適用において有用である。
発明の詳細な説明
一実施形態において、本発明は、ポリペプチドおよび核酸の両方の要素を含有する合成高分子分子である。高分子分子は、核酸または主鎖修飾核酸中に存在するような、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖により鎖中で連結される一連の単量体サブユニットを含有する。合成高分子は、天然ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドと比較して、酸、ヌクレアーゼおよび/またはプロテアーゼ増大を示す。分子の単量体は、さらにまた、核酸中に存在する塩基の代わりにアミノ酸側鎖を含有する。
一実施形態において、本発明は、ポリペプチドおよび核酸の両方の要素を含有する合成高分子分子である。高分子分子は、核酸または主鎖修飾核酸中に存在するような、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖により鎖中で連結される一連の単量体サブユニットを含有する。合成高分子は、天然ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドと比較して、酸、ヌクレアーゼおよび/またはプロテアーゼ増大を示す。分子の単量体は、さらにまた、核酸中に存在する塩基の代わりにアミノ酸側鎖を含有する。
本出願の単量体は、高収率で長い重合体の合成を可能にするが、それは、このような重合体の合成が標準オリゴヌクレオチド合成方法により成し遂げられ得るためである。したがって、本発明の適用の利点は、自動ポリペプチド合成方法と比較して、改良された単位長当たり収率である。
本明細書中では、「単量体サブユニット」という用語は、高分子中のサブユニットの鎖内に存在する単量体を指し、「反応性単量体」という用語は、高分子の一部ではない、そして1つ以上の他の反応性単量体と組み合わされて、高分子を形成し得る分子を指し、ならびに「単量体」という用語は、本明細書中で用いる場合、単量体サブユニットおよび/または反応性単量体のいずれかまたは両方を指す。
好ましい一実施形態では、合成高分子は、さらに、糖部分、例えば五炭糖、例えばリボースまたはデオキシリボースを含有する。糖部分は、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖のアミノ酸側鎖およびホスフェートまたは修飾ホスフェートと連結され、独立してつながる。
好ましい一実施形態では、糖はデオキシリボースであり、主鎖はホスホジエステルである。したがって、この実施形態における高分子は、DNAのヌクレオシドの窒素塩基がアミノ酸側鎖により取って代わられるデオキシリボ核酸(DNA)類似体であると考えられ得る。この実施形態の高分子は、ポリペプチド主鎖がホスホジエステル主鎖により取って代わられたポリペプチド類似体であるとも考えられ得る。少なくとも3つの類似体単量体サブユニットの鎖を有するこの実施形態のDNA/ポリペプチド類似体は、式Cで示される。
式Cで示されるように、デオキシリボース糖部分の5つの炭素は、1〜5の番号を付けられる。式CのR1、R2およびR3は、独立して、アミノ酸側鎖であり、これらは、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸または遺伝暗号によりコードされないアミノ酸を有し得る。隣接糖部分は、天然DNAと同様に、ホスホジエステル結合により連結される。式CのAおよびBは、本発明のこの実施形態に対する物質ではなく、例えば、本発明の単量体であり得るし、そうでないこともある隣接単量体サブユニットであり得る。適切なAおよびB基の他の例としては、H、OH、アルキル基、例えばメチル、エチル、ブチル、プロピルまたはイソプロピル基、アルコキシ基、例えばメトキシ、エトキシ、ブトキシ、プロポキシまたはイソプロポキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆連結、アミノ酸、ポリペプチドまたは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、例えば一般的支持体、および固体支持体との連結、例えば長鎖スクシニミジルエステル結合が挙げられる。
好ましくは、式Cのアミノ酸側鎖Rは、位置1で糖と連結される。あまり好ましくはないが、Rは、位置1以外の糖の環上の一、例えば五炭糖の位置2で、あるいはヘキソースまたはヘプトース糖の位置2または3で連結される。
式Cの高分子の反応性基は、保護または非保護状態であり得る。例えば、ホスホジエステル結合のホスフェートの潜在的反応性O基およびOH基、ならびにアミノ酸側鎖上の任意の反応性基は、保護され得る。例えばアラニン、グリシン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの側鎖はアルキル基からなり、一般的に、化学合成中の副反応を防止するために基を保護する必要がない。同様に、フェニルアラニンの側鎖は、反応性官能基を含有せず、一般的に基を保護する必要がない。しかしながら、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファンおよびチロシンの側鎖は反応性官能基を含有し、化学合成中のこれらの官能基の反応を防止するために基を保護することは必要でない。
利用され得る保護基の例としては、アルコール保護基、例えばアセチル、ベンゾイル、ベンジル、ベータ−メトキシエトキシメチルエーテル、ジメトキシトリチル(DMT)、メトキシメチルエーテル(MOM)、メトキシトリチル(MMT)、p−メトキシベンジルエーテル(PMB)、メチルチメチルエーテル、ピバロイル、テトラヒドロピラニル(THP)、トリチル(Tr)、シリルエーテル、例えばTMS、TBDMS、TOMおよびTIPS、メチルエーテルおよびエトキシエチルエーテル、アミン保護基、例えばカルボベンジルオキシ(Cbz)、p−メトキシベンジルカルボニル(MozまたはMeOZ)、tert−ブチルオキシカルボニル(BOC)、9−フルオロエニルメチルオキシカルボニル(FOMC)、アセチル(Ac)、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、p−メトキシベンジル、3,4−ジメトキシベンジル、p−メトキシフェニル、トシルおよびスルホンアミド基、例えばノシルおよびNps基、カルボニル保護基、例えばアセタルおよびケタール、アシラールおよびジチアン、カルボン酸保護基、例えばメチルエステル、ベンジルエステル、tert−ブチルエステル、2,6−二置換フェノールのエステル、シリルエステル、オルトエステルおよびオキサゾリン、末端アルキン保護基、例えばプロパルギルアルコールおよびシリル基、ならびにホスフェート保護基、例えば2−シアノエチルおよびメチルが挙げられる。
別の好ましい実施形態では、式Cの単量体サブユニットのうちの1つ以上のデオキシリボース糖部分は、式Dで示されるように、リボース糖部分に取って代わられる。所望により、リボース部分の遊離ヒドロキシル基は保護され得る。
別の実施形態では、合成高分子の単量体サブユニットの糖部分は、デオキシリボースまたはリボース以外である。例えば糖部分は、2’O−メチルリボース、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖または七炭糖部分であり得るし、アルドースまたはケトース糖であり得る。適切な糖の例としては、四炭糖、例えばエリトロース、トレオースおよびエリスルロース;五炭糖、例えばアラビノース、リキソース、キシロース、リブロースおよびキシルロース;六炭糖、例えばアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトース;ならびに七炭糖、例えばセドヘプツロース、マンノヘプツロースおよびマンノケトヘプトースが挙げられる。糖は、1つ以上の位置で脱酸素化され、したがってデオキシ糖部分であり得る。
合成高分子の糖部分は、所望により修飾され得る。例えば糖の任意の位置、例えば2位置は、例えばフッ素または塩素を用いてハロゲン化され得る。その他の修飾としては、例えば2位置での、糖中のO−メトキシまたはエトキシメトキシが挙げられる。別の修飾は、例えば式Cに示されたような位置2での、デオキシであり得る。
別の実施形態では、合成高分子の糖部分は、糖以外の環化構造により取って代わられる。例えば、合成高分子は、非糖、例えばシクロアルキル環部分、例えばシクロペンタンまたはシクロヘキサンを含有し得る。これらの環化構造としては、モルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノ、または機器ベースのオリゴヌクレオチド合成において既知であるようなその他の環構造が挙げられ得る。環化構造部分は、糖に関して上記したように修飾されるかまたは置換され得る。
別の実施形態では、合成高分子の単量体サブユニットのうちの1つ以上は、アミノ酸側鎖とホスホジエステル基または修飾ホスホジエステル基との間に糖部分を含まない。代わりに、層部分は、式Eで以下に示されるようにリンカーにより取って代わられる。
式Fにおいて、A、BおよびR基は、式C、DおよびEにおけると同様である。しかしながら、式Fでは、糖部分は存在しない。代わりに、合成高分子は、R基を高分子のホスホジエステル主鎖と連結するリンカー(L)、ならびに高分子のホスホジエステル主鎖の隣接ホスフェート基を共有的に結合するスペーサー(Y)を含有する。
リンカーLは、Rと共有結合する。リンカーLは、1〜10原子長であり、生物学的系で生じる任意の原子で構成され得るし、多重共有結合を形成し得る。したがって、Lの原子の例としては、C、N、OまたはSが挙げられる。あまり好ましくないが、リンカーは、Ca、Mn、Mg、FeおよびSeのような原子を含有することがある。Lから生じる側鎖は重要でなく、Lの長さを決定する場合、考慮されない、ということに留意されたい。側鎖がL上に存在する場合、側鎖のサイズは、分子のアミノ酸側鎖Rが他の化合物との相互作用のために、例えば結合のために利用可能であるようなものである。
好ましい一実施形態では、Lは、架橋剤を用いて活性化アミノ酸側鎖RをYスペーサーと繋ぐ化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合である。このような架橋試薬の例としては、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋試薬、例えばNHSエステル、マレイミド、カルボジイミド、イソチオネート、イミドエステル、ピリジルジチオール、ハロセチル、アリール、アジドおよびヒドラジドが挙げられる。その他の適切な架橋剤は、Thermo Scientific Pierce Protein Biologics Products,Product Catalogに開示されており、これは、www.piercenet.comでアクセスし得る。
上記のようなLは、アミノ酸側鎖がY基と連結される実施例において以下に開示される単量体の合成方法の結果として生じ得る。しかしながら、本出願の単量体が作られる多数の方法が存在し、そのいくつかは、RおよびYを連結するための架橋剤の使用を包含しない。このような方法に起因する単量体はLを有さないことがあり、あるいはLは、化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合以外であり得る。
例えば、式CおよびDに上記で示された高分子合成分子において、R基は、糖により主鎖と連結される。環中のOおよび位置1および2での炭素を含む糖の部分はLに対応するために考え出され、位置3、4および5での炭素はYに対応するために考え出され得る。この状況では、Lは、化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合ではない。したがって、LはRと単量体の主鎖基との間の繋がりであるので、Lの実際の同一性は本出願の単量体に欠かせないというわけではない。所望により、リンカーLは省かれ得るし、アミノ酸側鎖Rは直接Yと連結され得る。
スペーサーYは、一般的に1〜15、好ましくは3〜12原子長である。Yの原子は逐次的に共有結合され、好ましくはC、N、OまたはSである。Yの原子と結合される他の原子は、分子を利用する場合に立体障害を引き起こさない限り、一般的に必須というわけではない。Lに関する場合と同様に、側鎖が存在する場合、またはYが環構造、例えば式C、DおよびEの環構造の一部である場合、Yの長さは、ホスホジエステル主鎖の隣接ホスフェート基間に続いて起こる原子の数であるとみなされる。
好ましい一実施形態では、合成高分子は、一部がリンカーLであり、一部がスペーサーYである環構造を含む。このような環構造を有する本出願の合成高分子は、式C、DおよびEで示され、式中、環構造は糖である。代替的には、環構造は糖部分以外であり得る。合成高分子中に含まれ得る、そしてリンカーLおよびスペーサーYの両方を構成する糖意外である適切な環構造部分の例は、モルホリノ、シクロアルキル、例えばシクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシル、アリール、例えばフェニルまたはナフチル、およびヘテロアリール、例えばイオウ含有環、例えばチオフェン、窒素含有環、例えばピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピロリン、ピロリジン、ピリジン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリンまたはカルバゾール、もしくは酸素含有環、例えばフラン、あるいはオキサゾールまたはチアゾールのような組合せである。環構造へ、糖部分であっても非糖部分であっても、置換され得る。したがって、環構造は、基、例えばあるいる基、アミノ基、メルカプト器またはハロゲン基、例えば塩素またはフッ素を含み得る。
本明細書中のこの時点まで、高分子の上記実施形態の全てが、ホスホジエステル主鎖に関して開示されている。核酸適用において、種々の理由のために、例えば合成を促進するために、または分解に対して主鎖をより耐性にさせるために、ホスホジエステル主鎖における種々の変化が導入されている。ホスホジエステル主鎖におけるこのような変化は、本出願の高分子に利用され得る。
核酸主鎖化学の分野で既知であるホスホジエステル主鎖の任意の修飾が、本発明の適用の単量体のために利用され得る。例えば、ホスホジエステル結合の代わりに、主鎖は、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合を含有し得るが、この場合、非架橋酸素(O)のいずれかまたは両方がイオウ(S)に取って代わられる。主鎖は、ホスホロチオレートまたはジホスホロチオエート結合を含有し得るが、この場合、架橋O基のいずれかまたは両方がSに取って代わられる。主鎖は、アルキルホスホネート、例えばメチルホスホネートまたはエチルホスホネートを含み得るが、この場合、非架橋O基のいずれかまたは両方が、アルキル基、例えばメチルまたはエチルに取って代わられる。主鎖は、アルコキシホスホネート結合、例えばメトキシホスホネートまたはエトキシホスホネートを含有し得るが、この場合、非架橋O基のいずれかまたは両方が、アルコキシ基、例えばメトキシまたはエトキシに取って代わられる。主鎖は、ホスホルアミダイト結合を含有し得るが、この場合、架橋および/または非架橋O基のうちの1つ以上がアミノ基に取って代わられる。上記は、利用され得るホスホジエステル主鎖の修飾の単なる例である。
式Gにおいて、変数A、B、R、LおよびYは、式C〜Fの場合と同じである。Fは、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖基であり、n=少なくとも2である。式Gにおける破線は、式Gの高分子が少なくとも2つのサブユニットを含有すること、さらにサブユニットが任意であることを示す。
好ましい一実施形態では、本出願の高分子は、式Hで示されているようなサブユニットを含有し、合成高分子の各サブユニットは、Hで示されているものと同じである。しかしながら、以下でさらに詳細に考察されるように、本出願の高分子は、式Hで示されるもの以外のサブユニットを含有し得る。
例えば、高分子は、式Hで示されるような1つ以上のサブユニット、ならびに例えばDNAまたはRNAのヌクレオチドである1つ以上のサブユニットを含有し得る。ヌクレオチドの主鎖基は、ホスホジエステル主鎖基または修飾ホスホジエステル主鎖基であり得る。したがって、一実施形態では、高分子は、ホスホジエステルまたは修飾ホスホジエステル主鎖基と連結されるヌクレオシドである1つ以上のサブユニットを含有する。
式Hで示される単量体サブユニットに関する場合と同様に、式Hのもの以外であるサブユニットは、保護基の存在により保護され得る。このような保護基は、当該技術分野で既知である。
好ましい一実施形態では、本出願の単量体は、アミノ酸側鎖R、リンカーL、スペーサーYおよびホスホジエステル基または修飾ホスホジエステル基を含有する。好ましい一実施形態では、本出願の単量体は、式Iで示されるものと同じである。
式Iにおいて、スペーサーY、ならびにリンカーLの一部分はデオキシリボース内にあり、Rはアミノ酸側鎖であり、AおよびBは独立して隣接単量体サブユニットであり得るが、これは本発明の単量体であり得るし、そうでないこともある。適切なAおよびB基の他の例としては、H、OH、アルキル基、例えばメチル、エチル、ブチル、プロピルまたはイソプロピル基、アルコキシ基、例えばメトキシ、エトキシ、ブトキシ、プロポキシまたはイソプロポキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆結合、アミノ酸、ポリペプチドまたは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、例えば一般的支持体、および固体支持体との連結、例えば長鎖スクシニミジルエステル結合が挙げられる。
別の好ましい実施形態では、単量体は、式Iで示されるデオキシリボース部分の代わりに、式Jで示されるようなリボース部分を含有する。
別の好ましい実施形態では、式IまたはJのリボースまたはデオキシリボース部分は、式Kで示されるように、デオキシリボースまたはリボース以外の糖部分に取って代わられる。例えば糖部分は、2’O−メチルリボース、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖または七炭糖部分であり得るし、アルドースまたはケトース糖であり得る。適切な糖の例としては、四炭糖、例えばエリトロース、トレオースおよびエリスルロース;五炭糖、例えばアラビノース、リキソース、キシロース、リブロースおよびキシルロース;六炭糖、例えばアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グルコース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトース;ならびに七炭糖、例えばセドヘプツロース、マンノヘプツロースおよびマンノケトヘプトースが挙げられる。糖は、1つ以上の位置で脱酸素化され、したがってデオキシ糖部分であり得る。
単量体の糖部分は、単量体サブユニットとしてであっても、反応性単量体としてであっても、所望により修飾され得る。例えば糖の任意の位置、例えば2位置は、例えばフッ素または塩素を用いてハロゲン化され得る。その他の修飾としては、例えば2位置での、糖中のO−メトキシまたはエトキシメトキシが挙げられる。別の修飾は、例えば式Iに示されたような位置2での、デオキシであり得る。
別の実施形態では、単量体の糖部分は、式Lで示されるような糖以外の環化構造により取って代わられる。例えば、単量体は、非糖、例えばシクロアルキル環部分、例えばシクロペンタンまたはシクロヘキサンを含有し得る。環化構造部分は、糖に関して上記したように修飾されるかまたは置換され得る。
別の実施形態では、糖部分または環化構造は単量体中に存在せず、その代わりに、単量体はリンカーLおよびスペーサーYを含有するが、この場合、Lはアミノ酸側鎖をスペーサーと繋ぎ合わせ、スペーサーは、AおよびFを繋ぎ合わせて、Lと結合する一連の原資である。この実施形態は、式Lで示される。
式Lにおいて、リンカーLは、Rと共有結合する。リンカーLは、1〜10原子長であり、生物学的系で生じる任意の原子で構成され得るし、多重共有結合を形成し得る。したがって、Lの原子の例としては、C、N、OまたはSが挙げられる。あまり好ましくないが、リンカーは、Ca、Mn、Mg、FeおよびSeのような原子を含有することがある。Lから生じる側鎖は重要でなく、Lの長さを決定する場合、考慮されない、ということに留意されたい。側鎖がL上に存在する場合、側鎖のサイズは、分子のアミノ酸側鎖Rが他の化合物との相互作用のために、例えば結合のために利用可能であるようなものである。
好ましい一実施形態では、Lは、架橋剤を用いて活性化アミノ酸側鎖RをYスペーサーと繋ぐ化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合である。式Lにおいて、Yスペーサーは非糖スペーサーである。Lに示されているように、Yは三炭素スペーサーである。したがって、Yという文字は式Lにおいて上記で明白に示されていない。このような架橋試薬の例としては、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋試薬、例えばNHSエステル、マレイミド、カルボジイミド、イソチオネート、イミドエステル、ピリジルジチオール、ハロセチル、アリール、アジドおよびヒドラジドが挙げられる。その他の適切な架橋剤は、Thermo Scientific Pierce Protein Biologics Products,Product Catalogに開示されており、これは、www.piercenet.comでアクセスし得る。
上記のようなLは、一般的に、アミノ酸側鎖がY基と連結される実施例において以下に開示される単量体の合成方法の結果として生じ得る。しかしながら、本出願の単量体が作られる多数の方法が存在し、そのいくつかは、RおよびYを連結するための架橋剤の使用を包含しない。このような方法に起因する単量体はLを有さないことがあり、あるいはLは、化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合以外であり得る。
例えば、式CおよびDに上記で示された高分子合成分子において、R基は、糖により主鎖と連結される。環中のOおよび位置1および2での炭素を含む糖の部分はLに対応するために考え出され、位置3、4および5での炭素はYに対応するために考え出され得る。この状況では、Lは、化学的架橋反応に起因する共有的化学的結合ではない。したがって、LはRと単量体の主鎖基との間の繋がりであるので、Lの実際の同一性は本出願の単量体に欠かせないというわけではない。所望により、リンカーLは省かれ得るし、アミノ酸側鎖RおよびYは互いに直接連結され得る。
単量体についての上記の実施形態において、単量体は、ホスホジエステル基を含有する。核酸適用において、種々の理由のために、例えば合成を促進するために、または分解に対して主鎖をより耐性にさせるために、ホスホジエステル主鎖における種々の変化が導入されている。ホスホジエステル主鎖におけるこのような変化は、本出願の高分子に利用され得る。
核酸主鎖化学の分野で既知であるホスホジエステル主鎖の任意の修飾が、本発明の適用の単量体のために利用され得る。例えば、反応性単量体に関しては、式H〜LのいずれかにおけるFは、ホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、例えばp−エトキシ、またはホスホネート基であり得る。例えば、単量体サブユニットに関しては、Fはホスホジエステル基、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基、アルキルホスホネート、例えばメチルホスホネートまたはエチルホスホネート基、アルコキシホスホネート、例えばメトキシホスホネートまたはエトキシホスホネート基、アルコキシ、例えばメトキシまたはエトキシ基、ホスホルアミデート基、または核酸化学で用いられるようなホスホジエステル基のその他の修飾であり得る。
単量体の上記の実施形態において、任意のアミノ酸側鎖が含まれ得る。しかしながら、アミノ酸グリシンの側鎖は単に水素(H)であるため、Rとしてグリシン側鎖を含有する反応性単量体は、本出願の範囲から除外される。しかしながら、グリシン側鎖を含有する単量体サブユニットは、本出願の範囲から除外されない。
単量体の反応性基は、反応性単量体としてであっても、単量体サブユニットとしてであっても、保護化または非保護化状態であり得る。このような反応性基としては、例えばイミン基、アミン基、ヒドロキシル基、チオールおよびカルボキシル基が挙げられ得る。アラニン、グリシン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの側鎖はアルキル基で構成され、一般的に、化学合成中の副反応を防止するために保護基を必要としない。同様に、フェニルアラニンの側鎖は反応性官能基を含有せず、一般的に、保護基を必要としない。しかしながら、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファンおよびチロシンの側鎖は反応性官能基を含有し、化学合成中のこれらの官能基の、例えば分枝のような反応を防止するために、保護基が必要とされる。
本出願の単量体に利用され得る保護基の例としては、アルコール保護基、例えばアセチル、ベンゾイル、ベンジル、ベータ−メトキシエトキシメチルエーテル、ジメトキシトリチル(DMT)、メトキシメチルエーテル(MOM)、メトキシトリチル(MMT)、p−メトキシベンジルエーテル(PMB)、メチルチメチルエーテル、ピバロイル、テトラヒドロピラニル(THP)、トリチル(Tr)、シリルエーテル、例えばTMS、TBDMS、TOMおよびTIPS、メチルエーテルおよびエトキシエチルエーテル、アミン保護基、例えばカルボベンジルオキシ(Cbz)、p−メトキシベンジルカルボニル(MozまたはMeOZ)、tert−ブチルオキシカルボニル(BOC)、9−フルオロエニルメチルオキシカルボニル(FOMC)、アセチル(Ac)、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、p−メトキシベンジル、3,4−ジメトキシベンジル、p−メトキシフェニル、トシル、およびスルホンアミド基、例えばノシルおよびNps基、カルボニル保護基、例えばアセタルおよびケタール、アシラールおよびジチアン、カルボン酸保護基、例えばメチルエステル、ベンジルエステル、tert−ブチルエステル、2,6−二置換フェノールのエステル、シリルエステル、オルトエステルおよびオキサゾリン、末端アルキン保護基、例えばプロパルギルアルコールおよびシリル基、ならびにホスフェート保護基、例えば2−シアノエチルおよびメチルが挙げられる。
本出願の合成高分子は、好ましくは、DNAおよびRNAのような核酸を合成するために用いられる固体状態ホスホルアミダイト合成方法により製造される。このような方法において、最初の単量体は、固体状態支持体、例えば制御細孔ガラスビーズ(CPG)に固定される。ホスホルアミダイト合成スキームにおけるように、単量体は、好ましくは、単量体の各反応性基を被覆する保護基を有する。
伸長の第一ステップでは、存在する末端単量体が非ブロック化され、これがDMTのようなブロッキング基を鎖伸長の部位から除去し、その位置に反応性基を残す。活性剤溶液が新規の単量体に添加される。次に、鎖に添加されるべき新規の単量体は、結合非ブロック化単量体または鎖と組み合わされ、それにより鎖を伸長する。1つの単量体により鎖を伸長するための反応を可能にした後、次のステップは、非反応化試薬が不活性にされるキャッピングステップであり、それにより内部欠失を有する鎖の伸長を防止する。次に、酸化ステップが起こり、これによってOまたはSがホスフェート基に添加されて、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはその他の修飾リン結合を生じる。所望の高分子が構築されるまで、付加的単量体単位に関して当該サイクルが反復される。すべての単量体添加の完了後、分子は支持体から切り離され、脱保護化される。
単量体の製造のための一般スキームは、実施例1における米国特許第4,415,732号(Caruthers)に記載された方法と類似するが、但し、Caruthers実施例におけるBは本発明の適用とは異なる。
本発明の単量体は、以下のように製造され得る。アミノ酸の側鎖に対応する保護化化学基を得る。側鎖がアミノ、ヒドロキシ、カルボキシまたはチオール反応性基を含有する場合、反応性基は、好ましくはDNAホスホルアミダイト化学的性質と適合性である化学的保護基で保護される。このような化学的性質により重合体中に単量体を組み入れさせるため、DNAホスホルアミダイト化学的性質との適合性が選択される。しかしながら、単量体が、重合体中に組み入れられることなく、単独で用いられるべきものである場合、あるいは単量体がDNAホスホルアミダイト化学的性質以外により重合体中に組み入れられるべきものである場合、DNAホスホルアミダイト化学的性質と適合性でない化学的保護基が用いられ得る。ホスフェートまたは修飾ホスフェート基と組み合わされて、単量体を提供する中間体を得るために、保護化アミノ酸側鎖を上記のような糖またはその他のL基と反応させる。ブロッキング基、例えばDMTは、糖またはその他のL基における望ましくない副反応を防止するために用いられる。ブロック化中間体は、ヘテロ−またはホモ−二官能性架橋剤、例えばEDC、NHSエステル、またはその他の作用物質、例えばThermo Scientific Pierce Protein Biologics Products,Product Catalogで言及されたものと反応させられる。次に、ブロック化中間体は、リン酸化剤、例えばクロロ−N N−ジメチルアミノメトキシホスフィン[CH3O−P(Cl)−N(CH3)2]と組み合わされて、単量体を生成する。
本出願の合成高分子を用いて、ポリペプチドの作用を模倣するかまたは調整し得る。本明細書中で用いる場合、「模倣する」という用語は、活性の大きさまたは時間経過に関係なく、そうでなければポリペプチドを用いることにより得られる応答を得るために、合成高分子を利用することを意味する。多くの場合、合成高分子は、ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するアミノ酸側鎖を伴う単量体の配列を有する。本明細書中で用いる場合、「調整する」という用語は、ポリペプチドの活性を抑制することまたは刺激すること、あるいはそうでなければ修飾することを意味する。例えば、合成高分子は、直接的触媒作用により、あるいは酵素重合の崩壊、フォールディング、補因子との結合、または基質との結合により、ポリペプチドの作用を増大するかまたは減少し得る。
本出願の合成高分子化合物により模倣され得るポリペプチドの一例は、十二指腸の壁を通して栄養物を輸送するのを手助けするポリペプチドであるコレシストキニンである。コレシストキニンのアミノ酸配列にじゅんじ的に対応するアミノ酸側鎖を含有する一連の単量体を有する合成高分子は、経口投与され得る。合成高分子は消化管中のタンパク質分解酵素による分解に耐性であるため、それは胃を通過した後、十二指腸に到達し、腸壁に結合して、十二指腸における栄養物の取り込みを増大する。
模倣され得るポリペプチドの別の例は、ACTH(副腎皮質刺激ホルモン)である。ACTHのアミノ酸配列に対応するアミノ酸側鎖を伴う本発明の適用の単量体の配列を含有する合成高分子の注射、あるいは合成高分子への培養中の副腎細胞の曝露は、副腎細胞によるコルチゾールの分泌を増大させる。
本出願に従って模倣され得るポリペプチドの第三の例は、昆虫捕食に対して防衛するために植物により分泌されるホルモンであるシステミンである。システミンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸側鎖を伴う単量体配列を有する合成高分子を植物に適用することは、昆虫の侵襲に対する植物の耐性を増大する。
本出願に従って模倣され得るポリペプチドの第四の例は、フィトスルホカイン(PSK)である。PSKは、アスパラガスおよびニンジンにおける細胞分化を促進する5−merポリペプチドである。
調製され得るポリペプチドの一例は、ヒスタミンである。ヒスタミンのアミノ酸配列に対応するアミノ酸側鎖を有する単量体の配列を含有する合成高分子の投与は、ヒスタミン受容体の競合的結合のため、減少を生じる。
合成高分子は、当該技術分野で既知の任意の手段、例えば限定されないが、錠剤、カプセル、カプレット、懸濁液、粉末、凍結乾燥形態およびエアゾールにより処方され得るし、緩衝剤、結合剤、安定化剤、酸化防止剤、および当該技術分野で既知のその他の作用物質と混合され、処方され得る。合成高分子を含有する製剤は、当該技術分野で既知の任意の手段により、例えば、限定されないが、静脈内注射、皮下注射、粘膜を通した投与、経口投与、皮膚投与、皮膚パッチおよびエアゾールにより、個体に投与され得る。合成高分子を含有する製剤は、当該技術分野で既知の任意の手段により、例えば噴霧、塗布、ダビング、および顆粒の形態で適用することにより、環境に、例えば植物に適用され得る。
一実施形態では、本発明は、合成高分子および製薬上許容可能な担体を含む薬学的組成物である。合成高分子は、本出願の少なくとも1つの合成高分子を、所望により、1つ以上の製薬上許容可能な担体、例えば賦形剤、例えば希釈剤、担体等、ならびに添加物、例えば安定化剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤等を一緒に含む薬学的組成物に処方されるかまたは調合され得る。製剤賦形剤としては、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムが挙げられ得る。注射またはその他の液体投与用製剤に関しては、少なくとも1つ以上の緩衝構成成分を含有する水が適切であり、安定化剤、防腐剤および可溶化剤も用いられ得る。固形投与製剤に関しては、種々の増粘剤、充填剤、嵩高剤および担体添加物のうちのいずれか、例えばデンプン、糖、脂肪酸等が用いられ得る。局所投与製剤に関しては、種々のクリーム、軟膏、ゲル、ローション等のうちのいずれかが用いられ得る。ほとんどの薬学的製剤に関して、非活性成分は、調製物の、重量または容量での、より大きい部分を構成する。薬学的製剤に関しては、種々の計量放出性、徐放性または時効性製剤および添加物のうちのいずれかが用いられるということも意図され、したがって、一定時間に亘る本出願のペプチド模倣性化合物の有効な送達のために投与量が処方され得る。
本出願の合成高分子および薬学的組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内である注射により、あるいは当該技術分野で既知の任意の他の手段により、投与され得る。概して、合成高分子が身体内に導入され得る任意の投与経路としては、粘膜を通した投与、頬投与、経口投与、皮膚投与、吸入投与、経鼻投与等が挙げられ得る。処置のための投薬量は、前記の手段のいずれか、または当該技術分野で既知の任意の他の手段による、所望の治療効果をもたらすのに十分な量の投与である。
本出願の単量体は、いくつかの用途を有する。主に、単量体は、ペプチドまたはタンパク質模倣物または調整物質として有用である本発明の重合体を製造するための基本要素として有用である。付加的には、単量体は、核酸分子上のタグまたは情報提供基として有用である。
本出願の単量体は、タグまたは情報提供基として用いられる場合、いくつかの有益な特徴を提供する。それらは、核酸を合成するために用いられるような標準ホスホルアミダイト化学により合成核酸中に挿入され得るため、それらは核酸の任意の位置に挿入され得る。さらに、単量体の多重コピー、または種々のアミノ酸側鎖を有する異なる単量体が利用されて、独自の標識を提供し得る。さらに、単量体は、他のオリゴヌクレオチド標識、例えば蛍光または金属ラベリングと組み合わせて用いられ得る。
以下の非限定的実施例で、本発明をさらに例証する。
簡単なアミノ酸側鎖は、反応性基、例えば−OH、−NH2、−COOH、−SHを欠き、例としてはアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、セリン、トレオニン、バリンおよびグリシンの側鎖が挙げられる。複雑なアミノ酸側鎖としては、反応性基を各フェニルアラニンの側鎖、ならびにアスパラギン、システイン、グルタミン、リシン、メチオニン、チロシンおよびヒスチジンのアミノ酸側鎖が挙げられる。非常に複雑なアミノ酸側鎖は、多重反応性基を含有し、例としてはアルギニン、プロリンおよびトリプトファンのものが挙げられる。
実施例1a − 簡単なアミノ酸側鎖を用いるデオキシリボホスホルアミダイト単量体の調製
実施例1a.1 − アラニン
主鎖スペーサーと共有結合されるアミノ酸アラニンの側鎖を用いて、ホスホルアミダイト単量体を調製する。この実施例では、図1に示すように、化合物1(I)は主鎖スペーサー、5’ジメトキシトリチル、1’アミン修飾環状デオキシリボース(I)である。化合物2(II)は、メトキシアミン(CAS#74−89−5、化合物ID 6329)である。化合物IおよびIIは、メーカーが示唆するように、二官能性架橋剤(III)、例えばDMA(ジメチルアジピミデート、CAS #14620−72−5)(Thermo Scientific part#20660)を用いて架橋される。架橋中間体(IV)、1mmoleを、乾燥窒素で予め洗い流しておいた10ml反応容器中の3mlの乾燥無酸CHCl3およびジイソプロピルエチルアミン、4mmole中に溶解する。ホスフィチル化試薬(n−ジメチルアミノメトキシ−ホスフィン、2mmole)を、乾燥窒素下に保持しながら、反応容器に滴下する。Carruthers(米国特許第4,415,732号)により記載されたようなこのホスフィチル化プロトコールは、乾燥窒素下での少なくとも15分間の反応時間後、溶液を35mlの酢酸エチルとともに125mlの分離漏斗に移す、ということを必要とする。次に、溶液を80mlの飽和NaClで4回抽出する。次いで、有機相を無水Na2SO4上で乾燥し、減圧下で蒸発させて発泡体とする。次に、発泡体を、10mlのトルエンまたは10mlの酢酸エチルで溶解する。次いで、溶液を激しく撹拌しながら50mlの冷却(−78℃)ヘキサンに滴下して、粉末を生成する。懸濁液を濾過し、粉末をさらなる75mlの冷却ヘキサンで洗浄する。次に、その結果生じた粉末を減圧および乾燥窒素下で乾燥し、乾燥生成物を乾燥窒素下で保存する。
実施例1a.1 − アラニン
主鎖スペーサーと共有結合されるアミノ酸アラニンの側鎖を用いて、ホスホルアミダイト単量体を調製する。この実施例では、図1に示すように、化合物1(I)は主鎖スペーサー、5’ジメトキシトリチル、1’アミン修飾環状デオキシリボース(I)である。化合物2(II)は、メトキシアミン(CAS#74−89−5、化合物ID 6329)である。化合物IおよびIIは、メーカーが示唆するように、二官能性架橋剤(III)、例えばDMA(ジメチルアジピミデート、CAS #14620−72−5)(Thermo Scientific part#20660)を用いて架橋される。架橋中間体(IV)、1mmoleを、乾燥窒素で予め洗い流しておいた10ml反応容器中の3mlの乾燥無酸CHCl3およびジイソプロピルエチルアミン、4mmole中に溶解する。ホスフィチル化試薬(n−ジメチルアミノメトキシ−ホスフィン、2mmole)を、乾燥窒素下に保持しながら、反応容器に滴下する。Carruthers(米国特許第4,415,732号)により記載されたようなこのホスフィチル化プロトコールは、乾燥窒素下での少なくとも15分間の反応時間後、溶液を35mlの酢酸エチルとともに125mlの分離漏斗に移す、ということを必要とする。次に、溶液を80mlの飽和NaClで4回抽出する。次いで、有機相を無水Na2SO4上で乾燥し、減圧下で蒸発させて発泡体とする。次に、発泡体を、10mlのトルエンまたは10mlの酢酸エチルで溶解する。次いで、溶液を激しく撹拌しながら50mlの冷却(−78℃)ヘキサンに滴下して、粉末を生成する。懸濁液を濾過し、粉末をさらなる75mlの冷却ヘキサンで洗浄する。次に、その結果生じた粉末を減圧および乾燥窒素下で乾燥し、乾燥生成物を乾燥窒素下で保存する。
実施例1a.2 − アスパラギン酸
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはアスパラギン酸の側鎖、3−アミノプロパン酸CID#239である。
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはアスパラギン酸の側鎖、3−アミノプロパン酸CID#239である。
実施例1a.3 − グルタミン酸
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはグルタミン酸の側鎖、アミノブタン酸CID#119である。
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはグルタミン酸の側鎖、アミノブタン酸CID#119である。
実施例1a.4 − イソロイシン
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはイソロイシンの側鎖、2−アミノブタンCID#2724537である。
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはイソロイシンの側鎖、2−アミノブタンCID#2724537である。
実施例1a.5 − ロイシン
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはロイシンの側鎖、イソ−ブチルアミンCID#6558である。
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはロイシンの側鎖、イソ−ブチルアミンCID#6558である。
実施例1a.6 − セリン
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質Iはセリンの側鎖、エタノールアミンCID#700である。
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質Iはセリンの側鎖、エタノールアミンCID#700である。
実施例1a.7 − トレオニン
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはトレオニンの側鎖、3−アミノ−2−プロパノール、CID#4631415である。
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはトレオニンの側鎖、3−アミノ−2−プロパノール、CID#4631415である。
実施例1a.8 − バリン
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはバリンの側鎖、2−プロピルアミンCID#6363である。
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIはバリンの側鎖、2−プロピルアミンCID#6363である。
実施例1a.9 − グリシン
グリシンベースの単量体に関しては、自動オリゴヌクレオチド合成のために利用される既存の単量体、例えばD−スペーサー(Glen Research catalog #10−1914、Sterling VA)が利用され得る。
グリシンベースの単量体に関しては、自動オリゴヌクレオチド合成のために利用される既存の単量体、例えばD−スペーサー(Glen Research catalog #10−1914、Sterling VA)が利用され得る。
実施例1b − 複雑なアミノ酸側鎖を用いるデオキシリボホスホルアミダイト単量体の調製
実施例1b.1 − フェニルアラニン
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIは、図2に示すように、フェニルアラニンの側鎖、ベンジルアミンCID#7504である。
実施例1b.1 − フェニルアラニン
単量体を実施例1a.1に従って調製するが、但し、出発物質IIは、図2に示すように、フェニルアラニンの側鎖、ベンジルアミンCID#7504である。
実施例1b.2 − アスパラギン
単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質IIは、L−アスパラギン、CID#6267である。アスパラギンアミノ酸は、L−アルギニンに関して記載したように(実施例1c.1)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質IIは、L−アスパラギン、CID#6267である。アスパラギンアミノ酸は、L−アルギニンに関して記載したように(実施例1c.1)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
実施例1b.3 − システイン
図3に示すように、単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質は、システインの側鎖、2−アミノエタンチオールCID#6058である(1−メルカプトヘキサンCID#8106が、システインのチオールのための保護基として用いられる)。
図3に示すように、単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質は、システインの側鎖、2−アミノエタンチオールCID#6058である(1−メルカプトヘキサンCID#8106が、システインのチオールのための保護基として用いられる)。
実施例1b.4 − グルタミン
単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質IIは、L−グルタミンCID#5961である。L−グルタミンアミノ酸は、L−アルギニンに関して記載したように(実施例1c.1)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質IIは、L−グルタミンCID#5961である。L−グルタミンアミノ酸は、L−アルギニンに関して記載したように(実施例1c.1)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
実施例1b.5 − リシン
図4に示すように、単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質IIは、リシンの側鎖、4−アミノブタン酸CID#119を有する。4−アミノブタン酸のアミノ基は、L−アルギニンに関して記載したように(実施例1c.1)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
図4に示すように、単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質IIは、リシンの側鎖、4−アミノブタン酸CID#119を有する。4−アミノブタン酸のアミノ基は、L−アルギニンに関して記載したように(実施例1c.1)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
実施例1b.6 − メチオニン
単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質IIは、メチオニンの側鎖、3−メチルチオプロピルアミンCID#77743を有する。
単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質IIは、メチオニンの側鎖、3−メチルチオプロピルアミンCID#77743を有する。
実施例1b.7 − チロシン
単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質IIは、図5に示すように、チロシンの側鎖、4−ヒドロキシベンジルアミンCID#97472を有する。
単量体を実施例1b.2に従って調製するが、但し、出発物質IIは、図5に示すように、チロシンの側鎖、4−ヒドロキシベンジルアミンCID#97472を有する。
実施例1c − 非常に複雑なアミノ酸側鎖を用いるデオキシリボホスホルアミダイト単量体の調製
実施例1c.1 − アルギニン
L−アルギニンCID#6322(メタノール中10mg/mml)を、試料中の第一級アミンに対して4倍モル過剰量の無水酢酸で無水アセチルと反応させる。連続的に混合しながら、フュームフード中で室温で24時間、反応を継続する。
実施例1c.1 − アルギニン
L−アルギニンCID#6322(メタノール中10mg/mml)を、試料中の第一級アミンに対して4倍モル過剰量の無水酢酸で無水アセチルと反応させる。連続的に混合しながら、フュームフード中で室温で24時間、反応を継続する。
実施例1c.2 − ヒスチジン
単量体を実施例1c.1に従って調製するが、但し、出発物質IIは、L−ヒスチジンCID#6274である。L−ヒスチジンアミノ酸は、L−アルギニンに関して記載したように(実施例1c.1)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
単量体を実施例1c.1に従って調製するが、但し、出発物質IIは、L−ヒスチジンCID#6274である。L−ヒスチジンアミノ酸は、L−アルギニンに関して記載したように(実施例1c.1)、第一級アミン上のアセチル基で保護される。
実施例1c.3 − プロリン
主鎖スペーサーと共有結合されるアミノ酸プロリンの側鎖を用いて、ホスホルアミダイト単量体を調製した。この実施例では、化合物1は主鎖スペーサー、5’ジメトキシトリチル、1’アミン修飾環状デオキシリボース(I)である。化合物2(II)は、プロリン(CAS#7005−20−1、化合物ID 145742)である。化合物IおよびIIは、メーカーが示唆するような条件を用いて、二官能性架橋剤(III)、例えばEDCまたはDCC(Thermo Scientific part番号それぞれ22980および20320)を用いて架橋される。
主鎖スペーサーと共有結合されるアミノ酸プロリンの側鎖を用いて、ホスホルアミダイト単量体を調製した。この実施例では、化合物1は主鎖スペーサー、5’ジメトキシトリチル、1’アミン修飾環状デオキシリボース(I)である。化合物2(II)は、プロリン(CAS#7005−20−1、化合物ID 145742)である。化合物IおよびIIは、メーカーが示唆するような条件を用いて、二官能性架橋剤(III)、例えばEDCまたはDCC(Thermo Scientific part番号それぞれ22980および20320)を用いて架橋される。
実施例1c.4 − トリプトファン
単量体を実施例1c.1に従って調製するが、但し、出発物質IIは、アセチル−L−トリプトファン、CID#700653である。
単量体を実施例1c.1に従って調製するが、但し、出発物質IIは、アセチル−L−トリプトファン、CID#700653である。
実施例2 − リボホスホルアミダイト単量体の調製
実施例1a.1〜1c.4に記述した各アミノ酸側鎖に関して、実施例1の方法を反復するが、但し、デオキシリボース糖部分の代わりにリボース糖部分を用いる。
実施例1a.1〜1c.4に記述した各アミノ酸側鎖に関して、実施例1の方法を反復するが、但し、デオキシリボース糖部分の代わりにリボース糖部分を用いる。
実施例3 − 2’−O−メチルリボホスホルアミダイトの調製
実施例1a.1〜1c.4に記述した各アミノ酸側鎖に関して、実施例1の方法を反復するが、但し、2’−デオキシリボースベースの糖の代わりに2’−O−メチルリボース糖ベースの部分を用いる。両方の場合に、5’ヒドロキシル基はDMT基(ジメトキシトリチル)でブロックされる。
実施例1a.1〜1c.4に記述した各アミノ酸側鎖に関して、実施例1の方法を反復するが、但し、2’−デオキシリボースベースの糖の代わりに2’−O−メチルリボース糖ベースの部分を用いる。両方の場合に、5’ヒドロキシル基はDMT基(ジメトキシトリチル)でブロックされる。
実施例4 − 糖部分を欠くホスホルアミデート単量体の調製
実施例1a.1〜1c.4に記述した各アミノ酸側鎖に関して、実施例1の方法を反復するが、但し、アミノ酸側鎖をL基を介してYスペーサーと連結し(化合物I、実施例4a)、スペーサーが糖意外である場合はベータシアノエチルホスホルアミダイト器およびDMT保護化酸素を分離する。
実施例1a.1〜1c.4に記述した各アミノ酸側鎖に関して、実施例1の方法を反復するが、但し、アミノ酸側鎖をL基を介してYスペーサーと連結し(化合物I、実施例4a)、スペーサーが糖意外である場合はベータシアノエチルホスホルアミダイト器およびDMT保護化酸素を分離する。
実施例4a. − アラニン、図6に示す
実施例4b. − フェニルアラニン、図7に示す
実施例4c. − リシン、図8に示す
実施例4d. − チロシン、図9に示す
実施例5 − 最終単量体がL基を各単量体の製造のための代替方法
出発物質は、メチルプロパンジオールCID#7503である。メチルプロパンジオール(10mmol)を、トリエチルアミン(25mmol)の存在下で塩化ジメトキシトリチル(12mmol)と反応させ、Zekri et al.(Zekri,Alamdari,and Khalafi−Nezhad.2010.Bull.Chem.Soc.Ethiop.24(2):299−304)に従って反応させる。冷却反応混合物を100mlのクロロホルム中に溶解し、60mlの5%NaHCO3で洗浄する。有機層を分離し、水(2×50ml)で抽出する。その結果生じた有機層を、次に乾燥し、逆相クロマトグラフィーによりDMT−O−メチルプロパン−3−オールを単離する。実施例1.a1に記載したように、化合物Iをホスホルアミダイトに転化する。
出発物質は、メチルプロパンジオールCID#7503である。メチルプロパンジオール(10mmol)を、トリエチルアミン(25mmol)の存在下で塩化ジメトキシトリチル(12mmol)と反応させ、Zekri et al.(Zekri,Alamdari,and Khalafi−Nezhad.2010.Bull.Chem.Soc.Ethiop.24(2):299−304)に従って反応させる。冷却反応混合物を100mlのクロロホルム中に溶解し、60mlの5%NaHCO3で洗浄する。有機層を分離し、水(2×50ml)で抽出する。その結果生じた有機層を、次に乾燥し、逆相クロマトグラフィーによりDMT−O−メチルプロパン−3−オールを単離する。実施例1.a1に記載したように、化合物Iをホスホルアミダイトに転化する。
実施例6 − 主鎖における変更
実施例1〜5の各々の方法を反復するが、但し、実施例7ステップ4の酸化剤を、イオン酸化剤、例えばビューケージ試薬(Glen Research Catalog No.40−4036−XX)(Sterling,VA)に置換し、その結果、ホスホロチオエート結合を生じる。
実施例1〜5の各々の方法を反復するが、但し、実施例7ステップ4の酸化剤を、イオン酸化剤、例えばビューケージ試薬(Glen Research Catalog No.40−4036−XX)(Sterling,VA)に置換し、その結果、ホスホロチオエート結合を生じる。
実施例7 − 本発明の単量体を組み入れる重合体の合成
本出願の単量体を、自動オリゴヌクレオチド合成のために一般に用いられる化学工程を介して、重合体中に組み入れる。この合成方法は、初期脱ブロック化ステップ前に初期合成単量体と共有的に結合されることもされないこともある固体支持体を利用する。合成サイクルは、4つのステップからなる:脱ブロック化(脱トリチル化)、カップリング、キャッピング(AおよびB相)および酸化である。重合体に関する合成条件は、ABI Expedite DNA合成機(Life Technologies)に適合する条件で実施される。サイクルおよびプログラム時間はすべて、メーカーにより示唆されたとおりである。DNA合成機は、キメラ重合体の合成に必要とされる本発明の単量体およびその他の修飾因子の全てに関する十分な試薬スロットを一般的に有さないため、部分的配列を異なる合成機に挿入し得るが、最終脱ブロック化ステップは無能力化される。重合体の各セクションを完了したら、カラム(依然として固体支持体に結合された伸長重合体を含有する)を、合成の次のセクションに関してプログラムされた合成機に移す。
本出願の単量体を、自動オリゴヌクレオチド合成のために一般に用いられる化学工程を介して、重合体中に組み入れる。この合成方法は、初期脱ブロック化ステップ前に初期合成単量体と共有的に結合されることもされないこともある固体支持体を利用する。合成サイクルは、4つのステップからなる:脱ブロック化(脱トリチル化)、カップリング、キャッピング(AおよびB相)および酸化である。重合体に関する合成条件は、ABI Expedite DNA合成機(Life Technologies)に適合する条件で実施される。サイクルおよびプログラム時間はすべて、メーカーにより示唆されたとおりである。DNA合成機は、キメラ重合体の合成に必要とされる本発明の単量体およびその他の修飾因子の全てに関する十分な試薬スロットを一般的に有さないため、部分的配列を異なる合成機に挿入し得るが、最終脱ブロック化ステップは無能力化される。重合体の各セクションを完了したら、カラム(依然として固体支持体に結合された伸長重合体を含有する)を、合成の次のセクションに関してプログラムされた合成機に移す。
以下で列挙する各ステップ後、成長中の支持体結合重合体を無水アセトニトリルで洗浄して、非反応化学物質および化学副産物を除去する。
ステップ1:脱ブロック化
脱ブロック化は、酸性条件下で重合体の伸長中の末端からDMT基を除去する。不活性溶媒DCM(ジクロロメタン)中の3%ジクロロ酢酸(DCA)溶液を、脱ブロック化のために用いる。橙色反応産物の生成により、脱ブロック効率をモニタリングする。脱ブロック化の結果は、重合体延長の先端での遊離ヒドロキシル基である。
脱ブロック化は、酸性条件下で重合体の伸長中の末端からDMT基を除去する。不活性溶媒DCM(ジクロロメタン)中の3%ジクロロ酢酸(DCA)溶液を、脱ブロック化のために用いる。橙色反応産物の生成により、脱ブロック効率をモニタリングする。脱ブロック化の結果は、重合体延長の先端での遊離ヒドロキシル基である。
ステップ2:カップリング
乾燥窒素フラッシュ化単量体を、0.02〜0.2Mの濃度で無水アセトニトリル中に懸濁する。懸濁化単量体を合成機に付着させて、合成前に、乾燥窒素またはアルゴンでフラッシュし、再び手短にフラッシュする(1〜2分)。0.2〜0.7Mの1H−テトラゾールまたは2−エチルチオテトラゾール(または類似の相溶性化合物)により、単量体を活性化する。固体支持体を含有する反応カラムに構成成分を送達しながら、単量体および活性化剤を手短に混合して、オリゴヌクレオチド合成機の流体ラインを生じさせる。活性化ホスホルアミダイトを、支持体結合物質より1.5〜20倍過剰量で供給し、5’−ヒドロキシ基と反応させて、ホスファイトトリエステル結合を形成する。本発明の単量体のプログラムされた反応時間を、カップリング反応のために5〜15分とする。各カップリングステップの完了時に、反応カラムを洗浄して、未反応物質を除去する。
乾燥窒素フラッシュ化単量体を、0.02〜0.2Mの濃度で無水アセトニトリル中に懸濁する。懸濁化単量体を合成機に付着させて、合成前に、乾燥窒素またはアルゴンでフラッシュし、再び手短にフラッシュする(1〜2分)。0.2〜0.7Mの1H−テトラゾールまたは2−エチルチオテトラゾール(または類似の相溶性化合物)により、単量体を活性化する。固体支持体を含有する反応カラムに構成成分を送達しながら、単量体および活性化剤を手短に混合して、オリゴヌクレオチド合成機の流体ラインを生じさせる。活性化ホスホルアミダイトを、支持体結合物質より1.5〜20倍過剰量で供給し、5’−ヒドロキシ基と反応させて、ホスファイトトリエステル結合を形成する。本発明の単量体のプログラムされた反応時間を、カップリング反応のために5〜15分とする。各カップリングステップの完了時に、反応カラムを洗浄して、未反応物質を除去する。
ステップ3:キャッピング
カップリングステップ中に単量体が添加されなかった場合の重合体の延長を防止するために、合成サイクルの第三ステップがキャッピングである。キャッピング試薬としては、無水酢酸および1メチルアミジゾール(amidizole)、またはいくつかの場合には、DMAPが挙げられる。これらの試薬はヒドロキシル基と反応して、さらなる伸長を防止する。その他の反応部位が重合体上に存在する場合、キャッピングは分枝を防止し得る。
カップリングステップ中に単量体が添加されなかった場合の重合体の延長を防止するために、合成サイクルの第三ステップがキャッピングである。キャッピング試薬としては、無水酢酸および1メチルアミジゾール(amidizole)、またはいくつかの場合には、DMAPが挙げられる。これらの試薬はヒドロキシル基と反応して、さらなる伸長を防止する。その他の反応部位が重合体上に存在する場合、キャッピングは分枝を防止し得る。
ステップ4:酸化
カップリングステップ中のホスホルアミダイト単量体の添加は、ホスファイトトリエステル結合の形成を生じる。成長中の重合体を弱塩基、例えばピリジンまたはウリジン中のヨウ素で処理すると、(酸化剤)結合は四配位化リン酸トリエステルになり、これは重合体の最終脱保護時にホスホジエステル結合になる。
カップリングステップ中のホスホルアミダイト単量体の添加は、ホスファイトトリエステル結合の形成を生じる。成長中の重合体を弱塩基、例えばピリジンまたはウリジン中のヨウ素で処理すると、(酸化剤)結合は四配位化リン酸トリエステルになり、これは重合体の最終脱保護時にホスホジエステル結合になる。
最終単量体間結合がホスホロチオエートである場合、ステップ3としてのキャッピングステップ前に硫酸化ステップがより効率的に実施され、その場合、キャッピングステップがステップ4となる。
最終脱ブロック、固体支持体からの切断、および脱保護化
合成の終わりに、重合体を最終回の脱ブロックをして、末端DMT基を除去する。次に、重合体を塩基性条件、最も一般的にはアンモニア下で固体支持体から切り離す。アンモニア処理は、重合体側鎖上の保護基も除去する(アミノ酸側鎖またはヌクレオチド塩基)。
合成の終わりに、重合体を最終回の脱ブロックをして、末端DMT基を除去する。次に、重合体を塩基性条件、最も一般的にはアンモニア下で固体支持体から切り離す。アンモニア処理は、重合体側鎖上の保護基も除去する(アミノ酸側鎖またはヌクレオチド塩基)。
実施例7.1 − DNA分子中への単量体サブユニットの組み入れ
実施例7の方法に従って、実施例1〜6の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列AGTTGCACGTを有するDNA分子中に組み入れて、式AGTTGCACGTM(式中、Mは単量体サブユニットを表す)を有する合成高分子を得る。
実施例7の方法に従って、実施例1〜6の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列AGTTGCACGTを有するDNA分子中に組み入れて、式AGTTGCACGTM(式中、Mは単量体サブユニットを表す)を有する合成高分子を得る。
実施例7.2 − DNA分子中への単量体サブユニットの組み入れ
実施例7の方法に従って、実施例1〜6の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列AGTTGCACGTを有するDNA分子中に組み入れて、式AGTTGCACGTM(式中、Mは単量体サブユニットを表す)を有する合成高分子を得て、次に、付加的ヌクレオチドを順次添加して、式AGTTGCACGTMCGATを有する合成分子を得る。
実施例7の方法に従って、実施例1〜6の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列AGTTGCACGTを有するDNA分子中に組み入れて、式AGTTGCACGTM(式中、Mは単量体サブユニットを表す)を有する合成高分子を得て、次に、付加的ヌクレオチドを順次添加して、式AGTTGCACGTMCGATを有する合成分子を得る。
実施例7.3 − RNA分子中への単量体サブユニットの組み入れ
実施例7の方法に従って、実施例1〜6の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列AGUUGCACGUを有するRNA分子中に組み入れて、式AGUUGCACGUM(式中、Mは単量体サブユニットを表す)を有する合成高分子を得る。
実施例7の方法に従って、実施例1〜6の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列AGUUGCACGUを有するRNA分子中に組み入れて、式AGUUGCACGUM(式中、Mは単量体サブユニットを表す)を有する合成高分子を得る。
実施例7.4 − RNA分子中への単量体サブユニットの組み入れ
実施例7の方法に従って、実施例1〜6の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列AGUUGCACGUを有するRNA分子中に組み入れて、式AGUUGCACGUM(式中、Mは単量体サブユニットを表す)を有する合成高分子を得て、次に、付加的ヌクレオチドを順次添加して、式AGUUGCACGUMCGAUを有する合成分子を得る。
実施例7の方法に従って、実施例1〜6の各々に従って調製された単量体サブユニットを、以下の配列AGUUGCACGUを有するRNA分子中に組み入れて、式AGUUGCACGUM(式中、Mは単量体サブユニットを表す)を有する合成高分子を得て、次に、付加的ヌクレオチドを順次添加して、式AGUUGCACGUMCGAUを有する合成分子を得る。
実施例7.5 − ホモ重合体
実施例7の方法に従って、各々、ヒスチジンの側鎖を有する実施例1〜5の10連続単量体を含有する合成高分子を調製する。
実施例7の方法に従って、各々、ヒスチジンの側鎖を有する実施例1〜5の10連続単量体を含有する合成高分子を調製する。
実施例7.6 − ヘテロ重合体
実施例7の方法に従って、単量体のアミノ酸側鎖が変更される実施例1〜5の30個の単量体を含有する合成高分子を調製する。
実施例7の方法に従って、単量体のアミノ酸側鎖が変更される実施例1〜5の30個の単量体を含有する合成高分子を調製する。
実施例7.7 − 非均一主鎖を有するヘテロ重合体
実施例7の方法に従って、単量体のアミノ酸側鎖が変更される、ならびに主鎖基が変更される実施例1〜5の30個の単量体を含有する合成高分子を調製する。
実施例7の方法に従って、単量体のアミノ酸側鎖が変更される、ならびに主鎖基が変更される実施例1〜5の30個の単量体を含有する合成高分子を調製する。
実施例7.8 − 非均一主鎖および非均一リンカー基を有するヘテロ重合体
実施例7の方法に従って、単量体のアミノ酸側鎖、主鎖基およびリンカー(L)が変更される実施例1〜5の20個の単量体を含有する合成高分子を調製する。
実施例7の方法に従って、単量体のアミノ酸側鎖、主鎖基およびリンカー(L)が変更される実施例1〜5の20個の単量体を含有する合成高分子を調製する。
実施例8 − 単量体の使用
H−タグを生成するために単量体を用いる実施例。 最終配列が5’HHH HHH TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT3’であるように、実施例1 c2に記載したような6個のHis側鎖単量体(H)を、オリゴヌクレオチド合成中に20merポリdTの5’位置に添加する。Hを、合成のためにアセトニトリル中に0.1Mの濃度で用いる。ABI Expedite合成機に関するメーカーの推奨に従って、キメラ重合体を合成する。脱保護後、H−タグ化ポリdTを、ヒスチジン特異的抗体(ポリクローナルIgG ab6442、ABCAMから)とともにインキュベートした。20−merポリdTの対照試料も、ヒスチジン特異的抗体とともにインキュベートした。天然12%ポリアクリルアミド(20:1 アクリルアミド:ビス)を、4つの試料:20−merポリdT、20−merポリdT+ヒスチジン特異的抗体、His−タグ化20−merポリdT、His−タグ化20−merポリdT+ヒスチジン特異的抗体(FICOLL(登録商標)(GE Healthcare)、ゲル上に負荷する前にすべての試料に添加)とともに負荷した。ヒスチジン特異的抗体の添加は、対照と比較した場合、His−タグ化20−merポリdTオリゴヌクレオチドに関してゲルシフトを生じた。
H−タグを生成するために単量体を用いる実施例。 最終配列が5’HHH HHH TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT3’であるように、実施例1 c2に記載したような6個のHis側鎖単量体(H)を、オリゴヌクレオチド合成中に20merポリdTの5’位置に添加する。Hを、合成のためにアセトニトリル中に0.1Mの濃度で用いる。ABI Expedite合成機に関するメーカーの推奨に従って、キメラ重合体を合成する。脱保護後、H−タグ化ポリdTを、ヒスチジン特異的抗体(ポリクローナルIgG ab6442、ABCAMから)とともにインキュベートした。20−merポリdTの対照試料も、ヒスチジン特異的抗体とともにインキュベートした。天然12%ポリアクリルアミド(20:1 アクリルアミド:ビス)を、4つの試料:20−merポリdT、20−merポリdT+ヒスチジン特異的抗体、His−タグ化20−merポリdT、His−タグ化20−merポリdT+ヒスチジン特異的抗体(FICOLL(登録商標)(GE Healthcare)、ゲル上に負荷する前にすべての試料に添加)とともに負荷した。ヒスチジン特異的抗体の添加は、対照と比較した場合、His−タグ化20−merポリdTオリゴヌクレオチドに関してゲルシフトを生じた。
実施例9 − 単量体の使用
単量体が一旦オリゴヌクレオチド中に組み入れられ、脱保護化されると、システイン側鎖は、2つの個々のオリゴヌクレオチド一本鎖を共有的に連結し得るジスルフィド結合を形成し得る。配列5’TTT TTT TTT−C−TTT TTT TTT3’(ここで、Cは、システイン側鎖を伴う本発明の単量体を表す)を、合成のために0.1Mの濃度で用いる。ABI Expedite合成機に関するメーカーの推奨に従って、キメラ分子を合成する。
単量体が一旦オリゴヌクレオチド中に組み入れられ、脱保護化されると、システイン側鎖は、2つの個々のオリゴヌクレオチド一本鎖を共有的に連結し得るジスルフィド結合を形成し得る。配列5’TTT TTT TTT−C−TTT TTT TTT3’(ここで、Cは、システイン側鎖を伴う本発明の単量体を表す)を、合成のために0.1Mの濃度で用いる。ABI Expedite合成機に関するメーカーの推奨に従って、キメラ分子を合成する。
本実施例のキメラ重合体の50nM規模合成を、20マイクロリットルの滅菌水中に懸濁する。1マイクロリットルの10mM DTTを10マイクロリットルの懸濁重合体に添加し、次いで、室温で10分間保持する。セファデックスG−10カラム中での短時間遠心分離により、またはプッシュカラムの使用により、DTTを除去する。その結果生じた溶液を、窒素下で蒸発、乾燥させる。乾燥試料を10マイクロリットルの水に再懸濁する。天然12%ポリアクリルアミド(20:1 アクリルアミド:ビス)を、以下のレーンで負荷した:非処理キメラ重合体、DTT処理重合体、および20−merポリdTオリゴヌクレオチド(ゲル上に載せる前にすべての試料にフィコールを添加)。その結果生じた帯域は、二量体化されるキメラ試料に関してゲル中でのより高い見掛けの分子量へのシフトを示す。
実施例10 − 合成高分子の使用
アルギニンバソプレッシンの作用の模倣
本出願によるアルギニンバソプレッシン合成重合体を、CYS−TYR−PHE−GLN−ASN−CYS−PRO−ARG−GLYのアミノ酸側鎖の配列を用いて製造する。本出願の単量体、ならびにABI Expedite DNA合成機のための標準DNA合成条件を用いて、配列を複製する。
アルギニンバソプレッシンの作用の模倣
本出願によるアルギニンバソプレッシン合成重合体を、CYS−TYR−PHE−GLN−ASN−CYS−PRO−ARG−GLYのアミノ酸側鎖の配列を用いて製造する。本出願の単量体、ならびにABI Expedite DNA合成機のための標準DNA合成条件を用いて、配列を複製する。
成体アカゲザルの左前下行回旋動脈および右冠動脈からの単一VMCを単離し、新規分散培養として、および初代培養としてともに試験する。短期初代培養化細胞(継代されていない)は、供給源組織の特質、例えば収縮、弛緩、受容体および膜電気的特性を2〜3週間保持する。Na+、Ca2+またはCl−による負荷を防止し、高比率の生育可能な収縮細胞を生じるグルタミン酸カリウム溶液(KG)中のコラゲナーゼおよびプロテアーゼ酵素で、VMCを解離する(Miyagawa et al,Am J Physiol 272:H2645−2654,1997;Hermsmeyer et,Art Thromb Vasc Biol,24:955−961,2004)。培養のために調製された細胞を、カバーガラス上の哺乳動物第五世代のための心臓血管培養溶液(CV5M)中で、低密度で播種して、個々の細胞の選択を助長する。カバーガラスへの付着の7〜14日後に、VMCを実験のために用いる。
カバーガラス上の新規分散または初代培養VMCを、Axiovert倒立蛍光顕微鏡上の層流設計の小室中に入れて、ツァイスPlan Neofluar 25X/0.80水浸対物レンズで観察する。蛍光強度を高感度較正ビデオセンサーで測定し、コンピューター取得および管理プログラムによりデジタルで記録する。哺乳動物用イオン溶液バージョン2(ISM2)を、小室を通して継続的にポンプ輸送して(1ml/分で)、連続的平衡および試薬の洗い落としを提供する。15分の平衡期間後、VMCに、室温で15分間、3μMのfluo3(Molecular Probes,Inc.)をCa2+探知のために負荷する。個々の細胞全体に亘って、本出願のアルギニンバソプレッシンまたはアルギニンバソプレッシン類似体を添加することにより、個々のVMCを刺激する。無流動条件下で15秒後、ISM2の連続流動を復活させて、約300μlの小室容積を保持する。光強度がカルシウムシグナル(蛍光)および細胞収縮性と一致してから1分、ならびにその後の時点で、蛍光画像を得る。本発明の重合体は、天然アルギニンバソプレッシンの場合と同様にVMCにおけるカルシウムシグナルおよび細胞収縮性に影響を及ぼす、ということが判明した。
上記の本発明の種々の修正は、当業者には明らかである。このような修正は以下の特許請求の範囲内に含まれるよう意図される。
Claims (21)
- 多数の単量体サブユニットを含む合成高分子であって、前記単量体サブユイットのうちの少なくとも1つがリン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有し、前記単量体サブユニットのリン酸基または修飾リン酸基がホスホジエステル結合または修飾ホスホジエステル結合により隣接単量体サブユニットと連結される合成高分子。
- リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有する前記単量体サブユニットが、アミノ酸側鎖とリン酸基または修飾リン酸基との間に糖部分を含有する、請求項1に記載の合成高分子。
- 前記糖部分が五炭糖部分である、請求項2に記載の合成高分子。
- 前記五炭糖部分がデオキシリボースまたはリボース糖部分である、請求項2に記載の合成高分子。
- リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有する前記単量体サブユニットが、ホスホジエステル結合により隣接単量体と連結される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の合成高分子。
- リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有する前記単量体が、修飾ホスホジエステル結合により隣接単量体と連結される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の合成高分子。
- 前記修飾ホスホジエステル結合が、ホスホロチオレート、ジホスホロチオレート、アルキルホスホネート、アルコキシホスホネートおよびホスホルアミデート結合からなる群から選択される、請求項6に記載の合成高分子。
- リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有する前記単量体サブユニットが、次式:
式中、A=H、OH、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆結合、アミノ酸、ポリペプチドもしくは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、固体支持体との連結、または隣接単量体サブユニット、
B=H、OH、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆結合、アミノ酸、ポリペプチドもしくは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、固体支持体との連結、または隣接単量体サブユニット、
L=Rと共有結合されるリンカー、
Y=LおよびF間のスペーサー、
F=ホスホジエステル基または修飾ホスホジエステル基、ならびに
R=アミノ酸側鎖
である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の合成高分子。 - 前記分子の前記単量体サブユニットの各々がリン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有し、前記単量体サブユニットの前記リン酸基または修飾リン酸基がホスホジエステル結合または修飾ホスホジエステル結合により隣接単量体サブユニットと連結される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の合成高分子。
- 前記分子の単量体サブユニットのうちの1つ以上が、リン酸基または修飾リン酸基と連結されるアミノ酸側鎖を含有するサブユニット以外であり、前記単量体サブユニットの前記リン酸基または修飾リン酸基がホスホジエステル結合または修飾ホスホジエステル結合により隣接単量体サブユニットと連結される、請求項1〜8のいずれかに記載の合成高分子。
- 前記単量体サブユニットのうちの1つ以上が、1つ以上の保護基の存在により保護される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の合成高分子。
- リン酸基または修飾リン酸基と連結されるグリシンの側鎖以外のアミノ酸側鎖を含む単量体分子。
- アミノ酸側鎖とリン酸基または修飾リン酸基との間に糖部分を含む、請求項12に記載の単量体分子。
- 前記糖部分が五炭糖部分である、請求項13に記載の単量体分子。
- 前記五炭糖部分がデオキシリボースまたはリボース糖部分である、請求項14に記載の単量体分子。
- 前記アミノ酸側鎖がリン酸基と連結される、請求項12〜15のいずれか1項に記載の単量体分子。
- 前記アミノ酸側鎖が修飾リン酸基と連結される、請求項12〜15のいずれか1項に記載の単量体分子。
- 前記修飾リン酸基が、ホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオレート、ジホスホロチオレート、アルキルホスホネート、アルコキシホスホネートおよびアルコキシ基からなる群から選択される、請求項17に記載の単量体分子。
- 1つ以上の保護基の存在により保護される、請求項12〜18のいずれか1項に記載の単量体分子。
- 次式:
式中、A=H、OH、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆結合、アミノ酸、ポリペプチドもしくは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、または固体支持体との連結、
B=H、OH、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシ基、ビオチン、染料、逆結合、アミノ酸、ポリペプチドもしくは類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、固体支持体、または固体支持体との連結、
L=Rと共有結合されるリンカー、
Y=LおよびF間のスペーサー、
F=ホスホジエステル基または修飾ホスホジエステル基、ならびに
R=アミノ酸側鎖
である、請求項12〜19のいずれか1項に記載の単量体分子。 - 合成高分子を伸長するための方法であって、請求項12〜19のいずれか1項に記載の単量体分子を獲得すること、ならびにホスホジエステル結合または修飾ホスホジエステル結合により前記単量体分子を前記合成高分子の単量体サブユニットに連結することを包含する合成高分子の伸長方法。
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