KR20150131045A - 아미노산 곁사슬을 포함하는 합성 중합체 - Google Patents

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Abstract

아단위들 중 하나 이상이 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기에 연결된 아미노산 곁사슬을 포함하고 포스포다이에스터 또는 변형된 포스포다이에스터 결합에 의해 인접한 아단위에 부착되는 다수의 아단위를 포함하는 합성 중합체 분자. 본 발명은 유사체 폴리펩타이드의 분야 및 이러한 유사체를 제조하는데 유용한 합성 화학적 화합물에 관한 것이다.

Description

아미노산 곁사슬을 포함하는 합성 중합체{SYNTHETIC POLYMERS CONTAINING AMINO ACID SIDE CHAINS}
본 발명은 폴리펩타이드의 유사체의 분야, 그리고 이러한 유사체를 제조하는데 유용한 합성 화학적 화합물에 관한 것이다.
폴리펩타이드는 α-아미노산의 중합체이다. 아미노산의 일반 구조는 이하에 하기 화학식 A로 표시된다.
Figure pct00001
화학식 A에 나타낸 바와 같이, 아미노산은 아미노기(NH2), 카복실기(COOH) 및 곁사슬(R)을 포함하며, 이들의 각각은 중심 알파 탄소에 부착된다. 각각의 곁사슬(R)을 가진 이하의 표 1에 나열된, 유전자 코드에 의해 암호화되는 20개의 아미노산(이미노산 프롤린을 포함)이 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
천연형 아미노산 이외에도, 유전자 코드에 의해 암호화되지 않는 2개의 다른 아미노산이 단백질에서 발견되었다. 셀레노시스테인은, 일부가 인간에 존재하는 수개의 효소에 존재한다. 파이로라이신은 메탄을 생산하는데 이용되는 효소 중 몇몇 메탄 생성 고세균류에 존재한다. DNA 암호화되지 않은 추가의 아미노산은 카니틴과 GABA(감마-아미노뷰티르산), 셀레노메티오닌, 및 하이드록시프롤린을 포함한다.
아미노산은 하나의 아미노산의 카복시 부분으로부터의 하이드록실기와 제2의 아미노산의 하이드록시 부분으로부터의 아미노기로부터의 수소들 중 하나가 물로서 방출되고, 하기 화학식 B에 나타낸 바와 같이 펩타이드 결합(CO-NH)이 형성되고, 그 결과 아마이드인 분자의 형성을 초래하는, 탈수 또는 축합 반응에 의해 제2의 아미노산에 연결될 수 있다.
Figure pct00004
펩타이드 결합에 의한 두 아미노산의 연쇄는 다이펩타이드라 지칭된다. 2개 이상의 아미노산의 사슬은 폴리펩타이드라 지칭된다. 폴리펩타이드에서, 각각의 아미노산은, 2개의 말단 아미노산을 제외하고, 폴리펩타이드 결합에 의해서 2개의 인접한 아미노산에 연결된다. 본 특허 출원에서, "폴리펩타이드"란 용어는 적어도 2개의 아미노산의 사슬을 지칭한다. 폴리펩타이드가 완전한 생물학적 형태이고 안정적인 입체구조로 있다면, 그 폴리펩타이드는 본 명세서에서 "단백질"이라 지칭될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "펩타이드"란 용어는 안정적인 3차원 구조를 지닐 수 있거나 지닐 수 없고 그리고 생물학적 혹은 화학적 활성을 지닐 수 있거나 지닐 수 없는 2 내지 50개의 아미노산의 짧은 아미노산 올리고머를 지칭한다.
단백질은 동물 혹은 식물의 체내에서 그리고 환경에서 각종 기능을 지닌다. 생물학적 시스템에서, 콜라겐, 케라틴 및 식물 단백질 등과 같은 단백질은 강성도를 제공하고 구조를 형성한다. 기타 단백질은 세포 신호발생 및 신호 전달의 과정에 연루된다. 기타 단백질은, 생물학적 시스템 및 환경 둘 다에서, 화학적 반응을 촉매하는 효소로서 기능한다.
세포 신호발생 및 신호 전달 단백질, 예컨대, 수용체(receptor), 수용체 리간드, 항체 및 효소는, 폴리펩타이드 사슬의 정확한 접힘에 기초하여 특정 입체구조를 지닌다. 폴리펩타이드의 아미노산들은 서로 상호작용하여, 천연 상태로서 알려진 접힘 단백질의 명확한 3차원 구조를 생성한다. 얻어지는 3차원 구조를 결정하는 것은 폴리펩타이드 내 아미노산의 서열이다.
폴리펩타이드에서, 많은 3차원 입체구조가 가능하다. 그러나, 열역학적으로 가장 안정한 입체구조가 우선적으로 채택된다. 펩타이드 결합은 강고하고 평면적이다. 펩타이드 결합 자체의 CO 및 NH뿐만 아니라, 펩타이드 결합에 인접한 두 아미노산의 중심 탄소는 단일 평면에 존재한다. 그러나, 아미노산 곁사슬(R)들은 그들의 중심 탄소 둘레를 자유롭게 회전한다. 그 결과, 일련의 강고한 평면으로 이루어지고 인접한 평면들이 해당 인접한 평면들 사이에 공유된 중심의 4면체 탄소에서 공통 회전점을 공유하는 상태의 폴리펩타이드 골격이 얻어진다. 폴리펩타이드 사슬의 중심 탄소에서 비틀림 자유도는 폴리펩타이드 사슬의 각종 아미노산 곁사슬이 서로 자유롭게 상호작용하여 원자들 간에 입체 장애에 의해 금지되지 않는 한 가장 열역학적으로 안정적인 구조를 취할 수 있게 한다.
비교적 짧은 길이, 50개 미만의 아미노산의 폴리펩타이드 사슬, 특히 30개 미만의 아미노산의 폴리펩타이드 사슬에서, 폴리펩타이드는 전형적으로 약간의 접힘을 지니는 약간의 2차 구조를 가진다. 그러나, 50개보다 많은 아미노산을 지니는 폴리펩타이드 사슬에서, 2차 구조는 폴리펩타이드가 아미노산의 서열, 특히 그들의 곁사슬에 주로 의존하는 접힌 입체구조를 취하므로 보다 큰 유의성을 지닌다.
의료 또는 환경 용도를 위하여, 그들의 세포 신호발생, 신호 전달 또는 효소 특성을 위하여, 그리고 그들의 구조적 특성을 위하여 보다 적은 정도로 폴리펩타이드를 이용한다는 사상은, 오랫동안 바람직한 것으로 간주되어 왔다. 그러나, 폴리펩타이드의 이러한 이용을 달성하기 힘든 것으로 만드는 많은 문제가 존재한다.
폴리펩타이드의 화학적 합성은 화학적으로 보호된 아미노산을 성장하는 펩타이드-결합-연결된 아미노산 사슬로 하나씩 단계적으로 추가하는 것을 포함한다. 최근까지, 이러한 화학적 합성은 각 부가적인 아미노산 첨가 단계에서의 수율이 너무 낮았기 때문에 실용적이지 않았다. 단계적 첨가 과정의 합성에서의 오류가 누적되기 때문에, 각 부가적인 아미노산에 대해서 90%의 수율을 제공하는 합성 방법에 대해서, 단지 10개의 아미노산의 폴리펩타이드를 위한 최종 수율은 고작 34%였고, 20개의 아미노산의 폴리펩타이드를 위한 최종 수율은 고작 12%였다. 그러나 최근에, 99%를 넘는 각각 새롭게 첨가된 아미노산에 대한 수율을 제공하는 합성 공정이 보고되었는 바, 이는 기존에 얻어질 수 있는 것보다 상당히 높은 수율을 제공한다.
치료 목적을 위한 폴리펩타이드의 이용에 따른 더욱 다루기 힘든 문제는 그의 활성 부위로의 폴리펩타이드의 전달과, 생물학적 세팅에서 폴리펩타이드의 불안정성에 관한 것이다. 폴리펩타이드가 타액 및 위장 효소에 의해 신속하게 분해되기 때문에, 폴리펩타이드의 경구 투여는 실행 불가능하다. 그러나, 이러한 투여 경로가 예컨대 정맥내 투여에 의하는 등과 같이 우회적인 경우에도, 폴리펩타이드는 혈류에 그리고 신체 전체를 통해서 위치된 펩타다제 효소에 의해 비활성 단편으로 신속하게 분해된다. 따라서, 폴리펩타이드가 치료적으로 이용된 경우에, 폴리펩타이드의 신속한 분해 및 제거는, 매우 짧은 시간 기간 동안일지라도, 일부 활성 폴리펩타이드의 이용 가능성을 확실하게 하기 위하여 극도의 약리학적 용량(super-pharmacological dose)의 투여를 필요로 한다. 추가의 문제는 폴리펩타이드의 이러한 극도의 약리학적 용량의 투여, 그리고 그의 결과적인 분해 산물이 후속의 임상적 독성과 연관될 가능성이 있다는 점이다. 이들 이유가 치료제로서의 폴리펩타이드의 사용이 광범위하게 활용되지 않았던 주된 점이다.
분해 및 전달의 유사한 쟁점은 환경적 목적을 위한 폴리펩타이드의 사용으로 일어난다. 환경적 펩티다제들, 예컨대, 세균 및 진균 등과 같은 미생물 유기체에서의 환경적 펩티다제들은, 폴리펩타이드들을 신속하게 분해시켜 그들의 의도된 목적을 위하여 비효율적이 되게 한다.
환경적 그리고 임상적으로 투여된 폴리펩타이드의 불안정성의 문제를 극복하기 위하여 많은 시도가 행해져 왔다. 위에서 언급된 바와 같이, 하나의 방법은 극도의 약리학적 용량으로 폴리펩타이드를 투여 혹은 적용하는 것이다. 그러나 이러한 극도의 약리학적 용량은, 극히 높은 비용과 그리고 가능한 독성과 연관된다. 따라서, 대부분의 환경에서, 이 옵션은 실행 가능하지 않다.
폴리펩타이드의 각종 유사체는 신체적 그리고 환경적 펩티다제에 내성이 있는 기능적 단백질-유사 분자를 얻기 위한 시도에서 생성되었다. Hechter 등[PNAS, 72(2):563-566 (1975)]은, 펩타이드 결합의 CO와 N이 역전되는 레트로-D 유사체인 펩타이드 유사체를 시험하였다. Hecther에 개시된 바와 같이, 이러한 펩타이드 유사체는 경구 투여되는 경우 활성을 유지할 것으로 예상된다. 그러나, Hechter에 추가로 개시된 바와 같이, 레트로-D 유사체는 기능적 활성을 결여한다.
Gopi 등[FEBS Letters, 535:175-178 (2003)]은, 펩타이드 사슬 내 베타-아미노산의 혼입이 단백질분해 절단에 대한 펩타이드의 내성을 제공하는 것을 개시하고 있다. 천연 아미노산은 아미노기와 카복실기가 동일한 중심 탄소 원자에 부착된 알파-아미노산이다. 베타-아미노산에서, 아미노기와 카복실기는 상이한 인접한 탄소에 부착된다. 글라이신을 제외한 천연형 아미노산들의 각각은 베타-아미노산으로서 만들어질 수 있다. 글라이신은 단일 탄소만을 지니므로 아미노기와 카복실기가 글라이신 곁사슬의 상이한 탄소에 결합될 수 없기 때문에 베타-아미노산으로 만들어질 수 없다. Gopi는 펩타이드 내로의 단일 베타-아미노산의 부가가 프로테아제에 의한 분해로부터 펩타이드를 보호하는 것을 개시하고 있다. 그러나, Gopi는 베타-아미노산의 존재가 또한 펩타이드의 기능성을 상당히 저감시키는 것을 추가로 개시하고 있다.
Hirschmann의 미국 특허 제5,770,732호는, 활성 폴리펩타이드의 1개 이상의 아미노산 아단위(subunit)를 아미노산의 피롤리논 아단위 유사체로 교체한 것을 개시하고 있다. 본질적으로, 폴리펩타이드의 아마이드 골격은 중심의 아마이드기를 5-원 피롤리논 고리계로 교체하도록 재배열된다. Hirschmann 특허의 발명자들은, 이들 피롤리논 모사체 골격을 포함하는 펩타이드 유사체를 개발하여 상용화하기 위하여 프로비드 파마슈티컬즈사(Provid Pharmaceuticals, Inc.)(뉴저지주의 피스카타웨이시에 소재)란 회사를 세웠다.
본 출원인의 지식에 의하면, 선행 기술의 펩타이드 유사체의 어느 것도 펩타이드의 대체품으로서 광범위한 응용을 발견하지 못하였다. 따라서, 펩타이드 유사체가 기반으로 하는 천연 펩타이드의 기능을 유지하고 프로테아제 분해에 대해 내성이 있는 펩타이드 유사체를 개발하기 위한 달성하기 힘든 목표가 여전히 남아 있다.
핵산은 폴리펩타이드와는 다른 생물학적 중합체의 한 부류이다. 폴리펩타이드와 달리, 핵산의 단량체 단위는 펩타이드 결합보다 오히려 포스포다이에스터 결합의 골격에 의해 함께 접합된다. 또한, 폴리펩타이드와 달리, 천연형 핵산은 리보핵산(RNA)의 경우에 리보스 또는 데옥시리보핵산(DNA)의 경우에 데옥시리보스인 당의 반복단위를 포함한다.
핵산과 폴리펩타이드 간의 다른 차이는 곁사슬에 있다. 폴리펩타이드가 중심 탄소에 연결된 아미노산 곁사슬을 포함하는 반면, 천연형 핵산은 4개의 곁사슬을 포함한다. RNA의 경우에, 곁사슬은 퓨린류인 아데닌과 구아닌, 그리고 피리미딘류인 사이토신과 유라실이다. DNA의 경우에, 곁사슬은 퓨린류인 아데닌과 구아닌, 그리고 피리미딘류인 사이토신과 티민이다.
이들 차이를 제외하고, 핵산과 폴리펩타이드는 수개의 공통적인 특성을 공유한다. 폴리펩타이드와 마찬가지로, 단일 가닥 핵산은 본질적으로 퓨린류 또는 피미리딘류의 경우에 곁사슬의 고도의 이동 자유도를 가진 평면 골격을 가진다. 폴리펩타이드와 마찬가지로, 핵산은 체내에서 그리고 환경에서 효소에 의해 분해된다.
펩타이드 핵산(PNA)은 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복적인 N-(2-아미노에틸)-글라이신 단위의 골격을 가진 키메라 중합체 화합물이다. 각종 퓨린 및 피리미딘 염기는 메틸렌 카보닐 결합에 의해 골격에 연결된다. PNA는 프로테아제 또는 뉴클레오시다제에 의해 분해되지 않고, 그리고 DNA의 작용을 저해하기 위하여 DNA에 결합하는데 유용하다.
PNA 분자는 합성 핵산 유사체이다. 오늘날까지, 본 발명자는 포스포다이에스터 또는 변형된 포스포다이에스터 골격에 기반한 합성 폴리펩타이드 분자를 알고 있지 못하였다. 이하에 더욱 상세히 기술하는 바와 같이, 이러한 분자는 인간 및 동물 약제에서 치료 및 진단 조치를 위하여 유용할 것이고, 그리고 폴리펩타이드가 유용한 상황에서 환경적 응용에 유용할 것이다.
도 1은 당 모이어티를 함유하는 알라닌 포스포라미다이트 단량체의 합성을 도시한 도면;
도 2는 당 모이어티를 함유하는 페닐알라닌 포스포라미다이트 단량체의 합성을 도시한 도면;
도 3은 당 모이어티를 함유하는 시스테인 포스포라미다이트 단량체의 합성을 도시한 도면;
도 4는 당 모이어티를 함유하는 라이신 포스포라미다이트 단량체의 합성을 도시한 도면;
도 5는 당 모이어티를 함유하는 티로신 포스포라미다이트 단량체의 합성을 도시한 도면;
도 6은 당 모이어티를 결여하는 알라닌 포스포라미다이트 단량체의 합성을 도시한 도면;
도 7은 당 모이어티를 결여하는 페닐알라닌 포스포라미다이트 단량체의 합성을 도시한 도면;
도 8은 당 모이어티를 결여하는 라이신 포스포라미다이트 단량체의 합성을 도시한 도면;
도 9는 당 모이어티를 결여하는 티로신 포스포라미다이트 단량체의 합성을 도시한 도면.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 폴리펩타이드와 핵산 둘 다의 성분을 함유하는 합성 중합체 분자이다. 중합체 분자는 포스포다이에스터 또는 변형된 포스포다이에스터에 의해 사슬에 연결되는 일련의 단량체 아단위를 함유하며, 그 골격은 핵산 또는 골격-변형된 핵산에 존재한다. 합성 중합체 분자는 천연 폴리펩타이드 또는 올리고뉴클레오타이드와 비교해서 증가된 산, 뉴클레아제 및/또는 프로테아제 안정성을 지닌다. 분자의 단량체는 또한 핵산 중에 존재하는 염기 대신에 아미노산 곁사슬을 함유한다.
본 출원의 단량체는 고수율로 긴 중합체의 합성을 허용하는데, 그 이유는 이러한 중합체의 합성이 표준 DNA 올리고뉴클레오타이드 합성 방법에 의해 달성될 수 있다. 이와 같이 해서, 본 출원의 이점은 자동화 폴리펩타이드 합성법과 비교해서 단위 길이당 수율이 개선된다는 점이다.
본 명세서에서, "단량체 아단위"란 용어는 중합체 분자에서 아단위의 사슬 내에 존재하는 단량체를 지칭하고, "반응성 단량체"란 용어는 중합체 분자의 일부가 아니고 중합체 분자를 형성하기 위하여 하나 이상의 다른 반응성 단량체와 조합될 수 있는 분자를 지칭하며, 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "단량체"란 용어는 단량체 아단위 및/또는 반응성 단량체 중 한쪽 또는 둘 다를 지칭한다.
바람직한 실시형태에 있어서, 합성 중합체 분자는 리보스 또는 데옥시리보스와 같은 오탄당 등과 같은 당 모이어티를 더 포함한다. 당 모이어티는, 아미노산 곁사슬과 포스포다이에스터 또는 변형된 포스포다이에스터 골격의 포스페이트 또는 변형된 포스페이트에 접속되고, 그리고 이들을 간접적으로 연결한다.
하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 당은 데옥시리보스이고, 골격은 포스포다이에스터이다. 따라서, 이 실시형태에서의 중합체 분자는, 데옥시리보핵산(DNA)의 뉴클레오사이드의 질소성 염기가 아미노산 곁사슬에 의해 교체된 DNA 유사체인 것으로 상정될 수 있다. 이 실시형태의 중합체 분자는 또한 폴리펩타이드 골격이 포스포다이에스터 골격으로 교체된 폴리펩타이드 유사체인 것으로 상정될 수 있다. 적어도 3개의 유사체 단량체 아단위를 가진 이 실시형태의 DNA/폴리펩타이드 유사체는 하기 화학식 C에 표시되어 있다.
Figure pct00005
화학식 C에 나타낸 바와 같이, 데옥시리보스 당 모이어티의 5개의 탄소는 1 내지 5로 번호 매겨진다. 화학식 C의 R1, R2 및 R3은 독립적으로 아미노산 곁사슬이며, 이는 유전자 코드에 의해 암호화된 아미노산 또는 유전자 코드에 의해 암호화되지 않은 아미노산일 수 있다. 인접한 당 모이어티는 천연형 DNA에서와 같이 포스포다이에스터 결합에 의해 연결된다. 화학식 C의 A와 B는 본 발명의 이 실시형태에 대해서 중요하지 않고, 예를 들어, 인접한 단량체 아단위일 수 있으며, 이는 본 발명의 단량체일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 적절한 A 및 B기의 기타 예는 H, OH, 메틸, 에틸, 뷰틸, 프로필 또는 아이소프로필기 등과 같은 알킬기, 메톡시, 에톡시, 뷰톡시, 프로폭시 또는 아이소프로폭시기 등과 같은 알콕시기, 아미노기, 카복시기, 바이오틴, 염료, 역전 연쇄(reversed linkage), 아미노산, 폴리펩타이드 또는 유사체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 범용 지지체 등과 같은 고체 지지체, 그리고 장쇄 숙신이미딜 에스터 연쇄 등과 같은 고체 지지체에 대한 연쇄를 포함한다.
바람직하게는, 화학식 C의 아미노산 곁사슬 R은 1번 위치에서 당에 연결된다. 덜 바람직하게는, R은 1번 위치 이외의 당의 고리 상의 위치, 예컨대, 오탄당의 2번 위치, 또는 육탄당 혹은 칠탄당의 2번 혹은 3번 위치에서 연결된다.
화학식 C의 중합체 분자의 반응성 기는 보호된 혹은 보호되지 않은 상태로 있을 수 있다. 예를 들어, 포스포다이에스터 결합의 포스페이트의 잠재적 반응성 O기와 OH기, 그리고 아미노산 곁사슬 상의 임의의 반응성 기는 보호되어 있을 수 있다. 예를 들어, 알라닌, 글라이신, 발린, 류신 및 아이소류신의 곁사슬은 알킬기로 구성되고, 일반적으로 화학적 합성 동안 부반응을 보호하기 위하여 보호기를 필요로 하지 않는다. 마찬가지로, 페닐알라닌의 곁사슬은 반응성 작용기를 함유하지 않고, 일반적으로 보호기를 필요로 하지 않는다. 그러나, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 티로신의 곁사슬은 반응성 작용기를 함유하고, 보호기는 화학적 합성 동안 이들 작용기의 반응을 방지하기 위하여 요구된다.
이용될 수 있는 보호기의 예는, 알코올 보호기, 예컨대, 아세틸, 벤조일, 벤질, 베타-메톡시에톡시메틸 에터, 다이메톡시트리틸(DMT), 메톡시메틸 에터(MOM), 메톡시트리틸(MMT), p-메톡시벤질 에터(PMB), 메틸티메틸 에터, 피발로일, 테트라하이드로피란일(THP), 트리틸(Tr), 실릴 에터, 예컨대, TMS, TBDMS, TOM 및 TIPS, 메틸 에터, 및 에톡시에틸 에터, 아민 보호기, 예컨대, 카보벤질옥시(Cbz), p-메톡시벤질 카보닐(Moz 또는 MeOZ), tert-뷰틸옥시카보닐(BOC), 9-플루오렌일메틸옥시카보닐(FOMC), 아세틸(Ac), 벤조일, 벤질, 카바메이트, p-메톡시벤질, 3,4-다이메톡시벤질, p-메톡시페닐, 토실, 노실(Nosyl) 및 Nps기 등과 같은 설폰아마이드기, 카보닐 보호기, 예컨대, 아세탈 및 케탈, 아실알, 및 다이티안, 카복실산 보호기, 예컨대, 메틸 에스터, 벤질 에스터, tert-뷰틸 에스터, 2,6-이치환된 페놀의 에스터, 실릴 에스터, 오쏘에스터, 및 옥사졸린, 말단 알킨 보호기, 예컨대, 프로파길 알코올 및 실릴기, 그리고 포스페이트 보호기, 예컨대, 2-사이아노에틸 및 메틸을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, 화학식 C의 하나 이상의 단량체 아단위의 데옥시리보스 당 모이어티는, 하기 화학식 D에 나타낸 바와 같이, 리보스 당 모이어티에 의해 교체된다. 필요한 경우, 리보스 모이어티의 유리 하이드록실기는 보호될 수 있다.
Figure pct00006
다른 실시형태에 있어서, 합성 중합체 분자의 단량체 아단위의 당 모이어티는 데옥시리보스 또는 리보스 이외의 것이다. 예를 들어, 당 모이어티는 2'O-메틸 리보스, 트라이오스, 테트로스, 펜토스, 헥소스 또는 헵토스 모이어티일 수 있고, 알도스 또는 케토스 당일 수 있다. 적절한 당의 예는 에리트로스, 트레오스 및 에리트룰로스 등과 같은 테트로스; 아라비노스, 릭소스, 자일로스, 리불로스 및 자일룰로스 등의 펜토스; 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스, 프시코스(psicose), 프럭토스, 소르보스 및 타가토스 등의 헥소스; 및 세도헵툴로스, 만노헵툴로스 및 만노케토헵토스 등과 같은 헵토스를 포함한다. 당은 하나 이상의 위치에서 탈산소화될 수 있고, 따라서 데옥시당 모이어티일 수 있다.
합성 중합체 분자의 당 모이어티는 필요한 경우 변형될 수 있다. 예를 들어, 당의 2번 위치 등과 같은 임의의 위치가, 플루오린 또는 염소 등에 의해 할로겐화될 수 있다. 기타 변형은 2번 위치에서 등과 같이 당 내에 O-메톡시 또는 에톡시메톡시를 포함한다. 다른 변형은 화학식 C에 나타낸 바와 같이 2번 위치 등에서 데옥시일 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 합성 중합체 분자의 당 모이어티는 당 이외의 고리화 구조로 대체된다. 예를 들어, 합성 중합체 분자는 사이클로펜탄 또는 사이클로헥산 등과 같은 사이클로알킬 고리 모이어티 등과 같은 비당(non-sugar)을 함유할 수 있다. 이들 고리화 구조는 몰폴리노, 피페리디노, 피롤리디노 또는 기구 기반 올리고뉴클레오타이드 합성에서 알려진 것들과 같은 기타 고리 구조를 포함할 수 있다. 고리화 구조 모이어티는 당에 대해서 위에서 기재된 바와 같이 변형 또는 치환될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 합성 중합체 분자의 단량체 아단위들 중 하나 이상이 아미노산 곁사슬과 포스포다이에스터기 또는 변형된 포스포다이에스터기 사이에 당 모이어티를 포함하지 않는다. 대신에 당 모이어티는 하기 화학식 E로 이하에 나타낸 바와 같이 링커에 의해 교체된다.
Figure pct00007
화학식 F에서, A, B 및 R기는 화학식 C, D 및 E에서와 같다. 그러나, 화학식 F에서, 당 모이어티는 존재하지 않는다. 대신에, 합성 중합체 분자는 중합체 분자의 포스포다이에스터 골격에 R기를 연결하는 링커(L)와, 중합체 분자의 포스포다이에스터 골격의 인접한 포스페이트기를 공유 결합하는 스페이서(Y)를 포함한다.
링커(L)는 R에 공유 결합된다. 링커(L)는 길이가 1 내지 10개의 원자이고 생물학적 시스템에서 발견되는 임의의 원자로 구성될 수 있으며 다수의 공유 결합을 형성할 수 있다. 따라서, L의 원자의 예는 C, N, O 또는 S를 포함한다. 덜 바람직하게는, 링커는 Ca, Mn, Mg, Fe 및 Se 등과 같은 원자를 포함할 수 있다. L로부터 유래된 곁사슬이 중요하지 않고 L의 길이를 결정할 때 고려되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 곁사슬이 L 상에 존재한다면, 곁사슬의 크기는 분자의 아미노산 곁사슬(R)이 다른 화합물과의 상호작용, 예컨대, 결합을 위하여 이용할 수 있도록 된다.
바람직한 실시형태에 있어서, L은 활성화된 아미노산 곁사슬(R)을 Y 스페이서와 가교결합제를 이용해서 연결하는 화학적 가교반응에 기인하는 공유 화학적 연쇄이다. 이러한 가교시약의 예는 호모2작용성 및 헤테로2작용성 가교시약, 예컨대, NHS 에스터, 말레이미드, 카보다이이미드, 아이소티오네이트, 이미도에스터, 피리딜다이티올, 할로세틸, 아릴 아자이드 및 하이드라자이드를 포함한다. 다른 적절한 가교결합제는 써모 사이언티픽 피어스 프로테인 바이올로직스 프로덕츠사(Thermo Scientific Pierce Protein Biologics Products)의 제품 카탈로그에 개시되어 있으며, "www.piercenet.com."에서 접속할 수 있다.
위에서 기재된 바와 같은 L은 아미노산 곁사슬이 Y기에 가교결합된 예에서 이하에 개시되는 단량체의 합성 방법의 결과로서 생길 수 있다. 그러나, 본 출원의 단량체가 제조될 수 있는 많은 방법이 있는데, 그 중 일부는 R과 Y를 연결하기 위하여 가교결합제의 사용을 포함하지 않는다. 이러한 방법으로부터 유래되는 단량체는 L을 가지지 않을 수 있거나, 또는 L은 화학적 가교반응으로부터 유래되는 공유 화학적 연쇄 이외의 것일 수 있다.
예를 들어, 화학식 C 및 D에서 위에서 나타낸 중합체 합성 분자에서, R기는 당에 의해 골격에 접속된다. 고리에 O를 그리고 1번 및 2번 위치에 탄소를 포함하는 당의 부분은 L에 대응하는 것으로 간주될 수 있고, 3번, 4번 및 5번 위치에서의 탄소가 Y에 대응하는 것으로 간주될 수 있다. 이 상황에서, L은 화학적 가교반응으로부터 유래되는 공유 화학적 연쇄가 아니다. 따라서, L의 실제 동일성은, L이 단량체의 골격기와 R 사이에 연결되므로 본 출원의 단량체에 대해 중요하지 않다. 필요한 경우, 링커(L)는 생략될 수 있고, 아미노산 곁사슬(R)은 Y에 직접 연결될 수 있다.
스페이서(Y)는 그 길이가 일반적으로 1 내지 15개, 바람직하게는 3 내지 12개 원자이다. Y의 원자들은 순차로 공유 결합되고, 바람직하게는 C, N, O 또는 S이다. Y의 원자에 결합된 기타 원자들은 이들이 분자를 이용할 때 입체 장애를 일으키지 않는 한 일반적으로 중요하지 않다. L에서와 마찬가지로, 곁사슬이 존재한다면, 또는 Y가 고리 구조, 예컨대, 화학식 C, D 및 E의 고리 구조의 일부이면, Y의 길이는 포스포다이에스터 골격의 인접한 포스페이트기들 사이에 순차로 다수의 원자인 것으로 여겨진다.
하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 합성 중합체 분자는, 그 일부가 링커(L)이고 일부가 스페이서(Y)인 고리 구조를 포함한다. 이러한 고리 구조를 가진 본 출원의 합성 중합체 분자는 화학식 C, D 및 E에 나타나 있고, 그 고리 구조는 당이다. 대안적으로, 고리 구조는 당 모이어티 이외의 것일 수 있다. 합성 중합체 분자에 포함될 수 있고 링커(L)와 스페이서(Y)를 둘 다 형성하는 당 이외의 적절한 고리 구조 모이어티의 예는 몰폴리노, 사이클로알킬, 예컨대, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실, 아릴, 예컨대, 페닐 또는 나프틸, 및 헤테로아릴, 예컨대, 티오펜과 같은 황-함유 고리, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 피롤린, 피롤리딘, 피리딘, 피리미딘, 퓨린, 퀴놀린, 아이소퀴놀린 또는 카바졸과 같은 질소-함유 고리, 또는 퓨란과 같은 산소-함유 고리, 또는 옥사졸 또는 티아졸 등과 같은 조합물이다. 구조는, 당 모이어티든지 또는 비-당 모이어티든지 간에, 치환되어 있을 수 있다. 따라서, 고리 구조는 알킬기, 아미노기, 머캅토기 등의 기, 또는 염소 또는 플루오린 등과 같은 할로겐기를 포함할 수 있다.
본 명세서에서의 이 점에 대해서, 중합체 분자의 상기 실시형태들 모두는 포스포다이에스터 골격을 이용해서 개시되어 있다. 핵산 응용에 있어서, 포스포다이에스터 골격의 각종 변화는 각종 이유를 위하여, 예컨대, 합성을 용이하게 하거나 골격이 분해에 대해 더욱 내성이 되도록 부여하기 위하여 도입되었다. 포스포다이에스터 골격의 이러한 변화는 본 출원의 중합체 분자에서 이용될 수 있다.
핵산 골격 화학 분야에서 공지된 포스포다이에스터 골격의 임의의 변형은 본 출원의 단량체에 대해서 이용될 수 있다. 예를 들어, 포스포다이에스터 연쇄 대신에, 골격은 비-브리지(non-bridging) 산소(O)들 중 하나 또는 둘 다가 황(S)으로 교체되어 있는 포스포로티오에이트 또는 포스포로다이티오에이트 연쇄를 포함할 수 있다. 골격은 브리지 O기들 중 하나 또는 둘 다가 S로 교체되어 있는 포스포로티올레이트 또는 다이포스포로티올레이트 연쇄를 포함할 수 있다. 골격은, 비-브리지 O기들 중 하나 또는 둘 다가 알킬기, 예컨대, 메틸기 혹은 에틸기로 교체되어 있는, 메틸포스포네이트 또는 에틸포스포네이트 등과 같은 알킬포스포네이트를 포함할 수 있다. 골격은, 비-브리지 O기들 중 하나 또는 둘 다가 알콕기, 예컨대, 메톡기 혹은 에톡기로 교체되어 있는, 메톡포스포네이트 또는 에톡시포스포네이트 등과 같은 알콕시포스포네이트를 포함할 수 있다. 골격은, 브리지 및/또는 비브리지 O기들 중 하나 이상이 아미노기로 교체되어 있는 포스포라미데이트 연쇄를 포함할 수 있다. 이상의 내용은 이용될 수 있는 포스포다이에스터 골격의 변형들의 예에 불과하다.
따라서, 위에서 기재된 바와 같이, 합성 중합체 분자는 하기 화학식 G로서 이하에 표시된 일반식을 지닐 수 있다.
Figure pct00008
화학식 G에서, 변수 A, B, R, L 및 Y는 화학식 C 내지 F에서와 마찬가지이다. F는 포스포다이에스터 또는 변형된 포스포다이에스터 골격기이고, n은 적어도 2이다. 화학식 G에서의 파선은 화학식 G의 중합체 분자가 적어도 2개의 아단위를 함유하고 추가의 아단위들은 임의선택적인 것을 나타낸다.
합성 중합체 분자는 다수의 아단위를 포함하며, 그 중 적어도 하나는 하기 화학식 H로 표시되며, 식 중, A, B, Y, L, F 및 R은 위에서 화학식 C 내지 G에서와 마찬가지이다.
Figure pct00009
바람직한 실시형태에 있어서, 본 출원의 중합체 분자는 화학식 H에 나타낸 바와 같은 아단위들을 포함하며, 합성 중합체 분자의 각 아단위는 화학식 H에 표시된 바와 같다. 그러나, 이하에 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 본 출원의 중합체 분자는 화학식 H에 나타낸 것들 이외의 아단위들을 포함할 수 있다.
예를 들어, 중합체 분자는 화학식 H에 나타낸 바와 같은 1개 이상의 아단위와, 뉴클레오타이드, 예컨대, DNA 또는 RNA인 1개 이상의 아단위를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 골격기는 포스포다이에스터 골격기 또는 변형된 포스포다이에스터 골격기일 수 있다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, 중합체 분자는 포스포다이에스터 또는 변형된 포스포다이에스터 골격기에 연결된 뉴클레오사이드인 1개 이상의 아단위를 포함한다.
화학식 H에 나타낸 단량체 아단위와 마찬가지로, 화학식 H의 아단위 이외인 아단위들은 보호기의 존재에 의해 보호될 수 있다. 이러한 보호기는 당업계에 공지되어 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 출원의 단량체는 아미노산 곁사슬(R), 링커(L), 스페이서(Y) 및 포스포다이에스터기 또는 변형된 포스포다이에스터기를 포함한다. 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 출원의 단량체는 하기 화학식 I에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00010
화학식 I에서, 스페이서(Y) 및 링커(L)의 일부는 데옥시리보스 당 내에 있고, R은 아미노산 곁사슬이며, A 및 B는 독립적으로 인접한 단량체 아단위일 수 있으며, 이는 본 발명의 단량체일 수 있거나 아닐 수도 있다. 적절한 A 및 B기의 기타 예는 H, OH, 알킬기, 예컨대, 메틸, 에틸, 뷰틸, 프로필 또는 아이소프로필기, 알콕시기, 예컨대, 메톡시, 에톡시, 뷰톡시, 프로폭시 또는 아이소프로폭시기, 아미노기, 카복시기, 바이오틴, 염료, 역전 연쇄, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 유사체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 고체 지지체, 예컨대, 범용 지지체, 및 장쇄 숙신이미딜 에스터 연쇄 등과 같은 고체 지지체에 대한 연쇄를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, 단량체는 화학식 I에 나타낸 데옥시리보스 모이어티 대신에 화학식 J에 나타낸 바와 같은 리보스 모이어티를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, 화학식 I 또는 J의 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티는, 하기 화학식 K에 나타낸 바와 같이, 데옥시리보스 또는 리보스 이외의 당 모이어티로 교체된다. 예를 들어, 당 모이어티는 2'O-메틸 리보스, 트라이오스, 테트로스, 펜토스, 헥소스, 또는 헵토스 모이어티일 수 있고, 알도스 또는 케토스 당일 수 있다. 적절한 당의 예는 테트로스, 예컨대, 에리트로스, 트레오스 및 에리트룰로스; 펜토스, 예컨대, 아라비노스, 릭소스, 자일로스, 리불로스 및 자일룰로스; 헥소스, 예컨대, 알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스, 프시코스, 프럭토스, 소르보스 및 타가토스; 및 헵토스, 예컨대, 세도헵툴로스, 만노헵툴로스 및 만노케토헵토스를 포함한다. 당은 하나 이상의 위치에서 탈산소화될 수 있고, 따라서 데옥시당 모이어티일 수 있다.
Figure pct00011
단량체의 당 모이어티는, 단량체 아단위로서든지 또는 반응성 단량체로서든지 간에, 필요한 경우 변형될 수 있다. 예를 들어, 당의 2번 위치 등과 같은 임의의 위치가, 플루오린 또는 염소 등에 의해 할로겐화될 수 있다. 기타 변형은 2번 위치에서 등과 같이 당 내에 O-메톡시 또는 에톡시메톡시를 포함한다. 다른 변형은 화학식 I에 나타낸 바와 같이 2번 위치 등에서 데옥시일 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 단량체의 당 모이어티는 화학식 L에 나타낸 바와 같이 당 이외의 고리화 구조로 교체된다. 예를 들어, 단량체는 비당, 예컨대, 사이클로펜탄 또는 사이클로헥산 등과 같은 사이클로알킬 고리 모이어티를 포함할 수 있다. 고리화 구조 모이어티는 당에 대해서 위에서 기재된 바와 같이 변형되거나 치환될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 당 모이어티 또는 고리화 구조는 단량체에 존재하지 않고, 그 대신에, 단량체는 링커(L)와 스페이서(Y)를 포함하며, 이때 L은 아미노산 곁사슬(R)을 스페이서에 연결하고, 스페이서는 A와 F를 연결하고 L에 부착되는 일련의 원자이다. 이 실시형태는 하기 화학식 L에 표시되어 있다.
Figure pct00012
화학식 L에서, 링커(L)는 R에 공유 결합된다. 링커(L)는 길이가 1 내지 10개의 원자이고, 생물학적 시스템에서 발견되는 임의의 원자로 구성될 수 있으며 다수의 공유 결합을 형성할 수 있다. 따라서, L의 원자의 예는 C, N, O 또는 S를 포함한다. 덜 바람직하게는, 링커는 원자, 예컨대, Ca, Mn, Mg, Fe 및 Se를 포함할 수 있다. 단, L로부터 유래되는 곁사슬은 중요하지 않으며, L의 길이를 결정할 때 고려되지 않는 것에 유의해야 한다. 곁사슬이 L 상에 존재한다면, 사슬의 크기는 분자의 아미노산 곁사슬(R)이 다른 화합물과 상호작용을 위하여, 예컨대, 결합을 위하여 이용가능하도록 된다.
바람직한 실시형태에 있어서, L은 가교결합제를 이용해서 활성화된 아미노산 곁사슬(R)을 Y 스페이서와 연결하는 화학적 가교반응으로부터 기인하는 공유 화학적 연쇄이다. 화학식 L에서, Y 스페이서는 비당 스페이서이다. L에 나타낸 바와 같이, Y는 3개의 탄소 스페이서이다. 따라서, Y 문자는 위에서 화학식 L에서 명확하게 표시되어 있지 않다. 이러한 가교 시약의 예는 호모2작용성 및 헤테로2작용성 가교시약, 예컨대, NHS 에스터, 말레이미드, 카보다이이미드, 아이소티오네이트, 이미도에스터, 피리딜다이티올, 할로세틸, 아릴 아자이드 및 하이드라자이드를 포함한다. 기타 적절한 가교결합제는 써모 사이언티픽 피어스 프로테인 바이올로직스 프로덕츠사의 제품 카탈로그에 개시되어 있으며, "www.piercenet.com."에서 접속할 수 있다.
위에서 기재된 바와 같이 L은 일반적으로 아미노산 곁사슬이 Y기에 가교결합된 예에서 이하에 개시되는 단량체의 합성 방법의 결과로서 생긴다. 그러나, 본 출원의 단량체가 제조될 수 있는 많은 방법이 있는데, 그 중 일부는 R과 Y를 연결하기 위하여 가교결합제의 사용을 포함하지 않는다. 이러한 방법으로부터 유래되는 단량체는 L을 가지지 않을 수 있거나, 또는 L은 화학적 가교반응으로부터 유래되는 공유 화학적 연쇄 이외의 것일 수 있다.
예를 들어, 화학식 C 및 D에서 위에서 나타낸 중합체 합성 분자에서, R기는 당에 의해 골격에 접속된다. 고리에 O를 그리고 1번 및 2번 위치에 탄소를 포함하는 당의 부분은 L에 대응하는 것으로 간주될 수 있고, 3번, 4번 및 5번 위치에서의 탄소가 Y에 대응하는 것으로 간주될 수 있다. 이 상황에서, L은 화학적 가교반응으로부터 유래되는 공유 화학적 연쇄가 아니다. 따라서, L의 실제 동일성은, L이 단량체의 골격기와 R 사이의 링크이므로 본 출원의 단량체에 대해 중요하지 않다. 필요한 경우, 링커(L)는 생략될 수 있고, 아미노산 곁사슬(R)과 Y는 서로 직접 연결될 수 있다.
단량체의 상기 실시형태에 있어서, 단량체는 포스포다이에스터기를 함유한다. 핵산 응용에서, 포스포다이에스터 골격의 각종 변화는, 각종 이유를 위하여, 예컨대, 합성을 용이하게 하거나 골격이 분해에 대해 더욱 내성이 되도록 부여하기 위하여 도입되었다. 포스포다이에스터 골격의 이러한 변화는 본 출원의 중합체 분자에서 이용될 수 있고, 변형된 포스포다이에스터기는 단량체에서 이용될 수 있다.
핵산 골격 화학 분야에서 공지된 포스포다이에스터 골격의 임의의 변형은 본 출원의 단량체에 대해서 이용될 수 있다. 예를 들어, 반응성 단량체에 대해서, 화학식 H 내지 L의 어느 하나에 있어서의 F는 포스포라미데이트, 포스포라미다이트, 예컨대, p-에톡시 또는 포스포네이트기일 수 있다. 예를 들어, 단량체 아단위에 대해서, F는 포스포다이에스터기, 포스포로티오에이트 또는 포스포로다이티오에이트기, 포스포로티올레이트 또는 다이포스포로티올레이트기, 알킬포스포네이트, 예컨대, 메틸포스포네이트 또는 에틸포스포네이트기, 알콕시포스포네이트, 예컨대, 메톡시포스포네이트 또는 에톡시포스포네이트기, 알콕시, 예컨대, 메톡시 또는 에톡시기, 포스포라미데이트기, 또는 핵산 화학에서 이용되는 바와 같은 포스포다이에스터기의 다른 변형일 수 있다.
단량체의 상기 실시형태에 있어서, 임의의 아미노산 곁사슬이 포함될 수 있다. 그러나, 아미노산 글라이신의 곁사슬이 단순히 수소(H)이므로, 글라이신 곁사슬을 R로서 함유하는 반응성 단량체는 본 출원의 범위로부터 배제된다. 그러나, 글라이신 곁사슬을 함유하는 단량체 아단위는 본 출원의 범위로부터 배제되지 않는다.
단량체의 반응성 기는, 반응성 단량체로서든지 혹은 단량체 아단위로서든지 간에, 보호된 또는 비보호된 상태로 있을 수 있다. 이러한 반응성 기는, 예를 들어, 이민기, 아민기, 하이드록실기, 티올, 및 카복실기를 포함할 수 있다. 알라닌, 글라이신, 발린, 류신 및 아이소류신의 곁사슬은 알킬기로 구성되고, 일반적으로 화학적 합성 동안 부반응을 방지하기 위하여 보호기를 필요로 하지 않는다. 마찬가지로, 페닐알라닌의 곁사슬은 반응성 작용기를 함유하지 않고, 일반적으로 보호기를 필요로 하지 않는다. 그러나, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 티로신의 곁사슬은 반응성 작용기를 함유하고, 보호기는 화학적 합성 동안 이들 작용기의 분지화 등과 같은 반응을 방지하기 위하여 요구된다.
본 출원의 단량체에서 이용될 수 있는 보호기의 예는 알코올 보호기, 예컨대, 아세틸, 벤조일, 벤질, 베타-메톡시에톡시메틸 에터, 다이메톡시트리틸(DMT), 메톡시메틸 에터(MOM), 메톡시트리틸(MMT), p-메톡시벤질 에터(PMB), 메틸티메틸 에터, 피발로일, 테트라하이드로피란일(THP), 트리틸(Tr), 실릴 에터, 예컨대, TMS, TBDMS, TOM 및 TIPS, 메틸 에터, 및 에톡시에틸 에터, 아민 보호기, 예컨대, 카보벤질옥시(Cbz), p-메톡시벤질 카보닐(Moz 또는 MeOZ), tert-뷰틸옥시카보닐(BOC), 9-플루오렌일메틸옥시카보닐(FOMC), 아세틸(Ac), 벤조일, 벤질, 카바메이트, p-메톡시벤질, 3,4-다이메톡시벤질, p-메톡시페닐, 토실, 및 설폰아마이드기, 예컨대, 노실(Nosyl) 및 Nps기, 카보닐 보호기, 예컨대, 아세탈 및 케탈, 아실알, 및 다이티안, 카복실산 보호기, 예컨대, 메틸 에스터, 벤질 에스터, tert-뷰틸 에스터, 2,6-이치환된 페놀의 에스터, 실릴 에스터, 오쏘에스터, 및 옥사졸린, 말단 알킨 보호기, 예컨대, 프로파길 알코올 및 실릴기, 그리고 포스페이트 보호기, 예컨대, 2-사이아노에틸 및 메틸을 포함한다.
본 출원의 합성 중합체 분자는 바람직하게는 DNA 및 RNA 등과 같은 핵산을 합성하는데 이용되는 고체 상태 포스포라미다이트 합성 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법에 있어서, 제1 단량체는 제어된 기공 유리 비드(controlled pore glass bead: CPG) 등과 같은 고체 상태 지지체에 고정된다. 포스포라미다이트 합성 반응식에서와 같이, 단량체는 바람직하게는 단량체의 각 반응성 기를 커버하는 보호기를 가진다.
제1 연장 단계에서, 기존의 말단 단량체는 탈블록화되어 사슬 연장 부위로부터 DMT 등과 같은 차단기를 제거하고, 그 위치에서 반응성 기를 남긴다. 활성제 용액이 새로운 단량체에 첨가된다. 이어서 사슬에 첨가될 새로운 단량체는 결합된 탈블록화된 단량체 혹은 사슬과 조합됨으로써, 사슬을 연장시킨다. 반응이 하나의 단량체에 의해 사슬을 연장시키도록 허용된 후에, 다음 단계는 캐핑 단계이며, 이로써 미반응 시약이 비활성으로 됨으로써 내부 결실을 가진 사슬의 연장을 방지한다, 다음에, 산화 단계가 일어나서, 포스페이트기에 O 또는 S가 첨가되어 포스포다이에스터, 포스포로티오에이트, 또는 기타 변형된 인 연쇄를 수득한다. 이 사이클은 목적으로 하는 중합체 분자가 구축될 때까지 추가의 단량체 단위에 대해서 반복된다. 모든 단량체 부가의 완료 후, 분자는 지지체로부터 절단되고 탈보호된다.
단량체를 제조하는 일반적인 반응식은, Caruthers의 실시예에서의 B가 본 출원과 다른 것을 제외하고, Caruthers의 미국 특허 제4,415,732호의 실시예 I에 기재된 절차와 유사하다.
본 발명의 단량체는 다음과 같이 제조될 수 있다. 아미노산의 곁사슬에 대응하는 보호된 화학적 기가 얻어진다. 곁사슬이 아미노, 하이드록시, 카복시, 또는 티올 반응성 기를 함유할 경우, 반응성 기는 바람직하게는 DNA 포스포라미다이트 화학과 양립 가능한 화학적 보호기로 보호된다. DNA 포스포라미다이트 화학과의 양립성은 이것은 이러한 화학에 의해서 중합체에 혼입되는 것이 허용될 것이기 때문에 바람직하다. 그러나, 단량체가 중합체 내에 혼입되는 일 없이 그 자체로 사용된다면, 또는 단량체가 DNA 포스포라미다이트 화학 이외의 것에 의해 중합체 내에 혼입된다면, DNA 포스포라미다이트 화학과 양립 가능하지 않은 화학적 보호기가 사용될 수 있다. 보호된 아미노산 곁사슬은 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기와 조합될 중간체를 얻기 위하여 위에서 논의된 바와 같은 당 또는 기타 L기와 반응하여 단량체를 제공한다. 차단기, 예컨대, DMT는, 당 또는 기타 L기 상에 원치 않는 부반응을 방지하기 위하여 이용된다. 차단된 중간체는 헤테로- 또는 호모-2작용성 가교제, 예컨대, EDC, NHS 에스터, 또는 써모 사이언티픽 피어스 프로테인 바이올로직스 프로덕츠사의 제품 카탈로그에 언급된 것들과 같은 기타 제제와 반응한다. 차단된 중간체는 이어서 포스파이틸화제, 예컨대, 클로로-N N-다이메틸아미노메톡시포스핀[CH3O-P(Cl)-N(CH3)2]과 배합되어, 단량체를 생성한다.
본 출원의 합성 중합체 분자는 폴리펩타이드의 작용을 모방하거나 조절하기 위하여 이용될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "모방하다"란, 활성의 크기 또는 시간 코스에 관계 없이 반응을 얻기 위하여, 다르게는 폴리펩타이드를 이용해서 얻어지는 합성 중합체 분자를 이용하는 것을 의미한다. 많은 경우에, 합성 중합체 분자는 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 곁사슬을 가진 단량체의 서열을 가질 것이다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "조절하다"란 용어는 폴리펩타이드의 활성을 저해하거나 자극하거나 그렇지 않으면 변형시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 합성 중합체 분자는 직접 촉매를 통해서 또는 효소 중합, 접힘, 보조인자에의 결합 또는 기질에 대한 결합을 통해서 폴리펩타이드의 효과를 증가 혹은 감소시킬 수 있다.
본 출원의 합성 중합체 화합물에 의해 모방될 수 있는 폴리펩타이드의 예는 콜레키스토키닌이며, 이 폴리펩타이드는 십이지장의 벽을 통해서 영양분을 이송하는 것을 돕는다. 콜레키스토키닌의 아미노산 서열에 순차적으로 대응하는 아미노산 곁사슬을 함유하는 일련의 단량체를 가진 합성 중합체 분자는 경구로 투여될 수 있다. 합성 중합체 분자가 위장관에서 단백질 분해효소에 의한 분해에 내성이 있으므로, 위장을 통과한 후 십이지장에 도달할 것이며, 십이지장 내에서의 양양분의 흡수를 증가시키기 위하여 소화관 벽에 결합될 것이다.
모방될 수 있는 폴리펩타이드의 다른 예는 ACTH(부신피질자극 호르몬)이다. ACTH의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 곁사슬을 가진 본 출원의 단량체의 서열을 함유하는 합성 중합체 분자의 주입 또는 이 합성 중합체 분자에 대한 배양액 중 부신 세포의 노출은 부신 세포에 의한 코르티졸의 분비의 증가를 유발할 것이다.
본 출원에 따라 모방될 수 있는 폴리펩타이드의 세번째 예는, 곤충 포식에 대항하여 방어하도록 식물에서 분비되는 호르몬인 시스테민이다. 식물에 적용되면, 시스테민의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 곁사슬을 가진 단량체 서열을 지닌 합성 중합체 분자는 곤충 침입에 대한 식물의 내성을 증가시킨다.
본 출원에 따라 모방될 수 있는 폴리펩타이드의 네번째 예는 피토설포카인(PSK)이다. PSK는 아스파라거스 및 당근에서의 세포내 분화를 촉진시키는 5량체 폴리펩타이드이다.
조절될 수 있는 폴리펩타이드의 일례는 히스타민이다. 히스타민의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 곁사슬을 가진 단량체의 서열을 함유하는 합성 중합체 분자의 투여는 히스타민 수용체의 경쟁적 결합으로 인해 감소를 초래한다.
합성 중합체 분자는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 제형화될 수 있되, 예를 들어, 정제, 캡슐, 당의정, 현탁제, 분말, 동결건조된 형태 및 에어로졸을 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 완충제, 결합제, 안정제, 항산화제 및 기타 제제와 혼합되어 제형화될 수 있다. 합성 중합체 분자를 함유하는 제형은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 개체에게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 정맥내 주사, 피하 주사, 점막을 통한 투여, 경구 투여, 피부 투여, 피부 패취, 및 에어로졸을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 합성 중합체 분자를 함유하는 제형은, 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해, 예컨대, 분무, 도장, 가볍게 바르기 및 과립 형태의 도포 등에 의해 환경에, 예컨대, 식물에 적용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 합성 중합체 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 합성 중합체 분자는, 요망될 수 있는, 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어, 부형제, 예컨대, 희석제, 담체 등, 그리고 첨가제, 예컨대, 안정제, 보존제, 가용화제, 완충제 등과 함께 본 출원의 적어도 하나의 합성 중합체 분자를 포함하는 약제학적 조성물에 조제 또는 배합될 수 있다. 제형 부형제는 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 하이드록시 셀룰로스, 아카시아, 폴리에틸렌 글라이콜, 만니톨, 염화나트륨 또는 시트르산나트륨을 포함할 수 있다. 주사 또는 기타 액체 투여 제형을 위하여, 적어도 하나 이상의 완충 성분을 함유하는 물이 적합하고, 안정제, 보존제 및 가용화제가 또한 이용될 수 있다. 고체 투여 제형을 위하여, 각종 증점제, 충전제, 벌크화제 및 담체 첨가제, 예컨대, 전분, 당, 지방산 등의 어느 하나가 이용될 수 있다. 국소 투여 제형을 위하여, 각종, 크림, 연고, 젤, 로션 등 중의 어느 하나가 이용될 수 있다. 대부분의 약제학적 제형을 위하여, 비활성 성분은 제제의 보다 큰 부분(중량 또는 부피로)을 구성할 것이다. 약제학적 제형을 위하여, 각종 계량된 방출, 서방출 또는 시간 방출 제형 및 첨가제의 어느 하나가 이용될 수 있으므로, 용량은 시간 기간에 걸쳐서 본 출원의 펩티도미메틱(peptidomimetic) 화합물의 전달을 수행하도록 제형화될 수 있는 것이 또한 상정된다.
본 출원의 합성 중합체 분자 및 약제학적 조성물은 주사에 의해 투여될 수 있고, 이러한 주사는 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 수단에 의한 것일 수 있다. 일반적으로, 합성 중합체 분자가 도입될 수 있는 임의의 투여 경로가 이용될 수 있다. 투여 수단은 점막, 협측 투여, 경구 투여, 피부 투여, 흡입 투여, 비강 투여 등을 포함할 수 있다. 치료용의 용량은, 목적으로 하는 치료 효과를 가져오기에 충분한 양의, 상기 수단 중 어느 하나 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 수단에 의한 투여이다.
본 출원의 단량체는 수개의 용도를 가진다. 주로, 단량체는 펩타이드 또는 단백질 모방체 또는 조절제로서 유용한 본 발명의 중합체를 제조하기 위한 구성 블록으로서 유용하다. 부가적으로, 단량체는 핵산 분자 상의 태그 혹은 레포트 기로서 유용하다.
본 출원의 단량체들은 태그 또는 레포트기로서 이용된 경우 몇가지 유리한 특징을 제공한다. 이들은 핵산을 합성하는데 이용되는 등과 같이 표준 포스포라미다이트 화학에 의해 합성 핵산 내로 삽입될 수 있기 때문에, 이들은 핵산의 임의의 위치 내로 삽입될 수 있다. 또한, 단량체의 다수의 카피, 또는 다양한 아미노산 곁사슬을 가진 상이한 단량체가 이용되어 특유의 표지를 제공할 수 있다. 부가적으로, 단량체들은 형광 또는 금속 표지 등과 같은 기타 올리고뉴클레오타이드 표지와 조합하여 이용될 수 있다.
본 발명은 이하의 비제한적인 실시예에서 더욱 예시된다.
실시예 1 - 단량체의 제조
아미노산은 표 2에 나타낸 바와 같이 아미노산 곁사슬의 복합성에 따라서 그룹화된다.
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단순 아미노산 곁사슬은 -OH, -NH2, -COOH, -SH 등과 같은 반응성 기를 결여하고, 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 아이소류신, 류신, 세린, 트레오닌, 발린 및 글라이신의 곁사슬을 포함한다. 복합 아미노산 곁사슬은 페닐알라닌의 곁사슬을 포함하고, 반응성 기, 및 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 라이신, 메티오닌, 티로신 및 히스티딘의 아미노산 곁사슬을 결여한다. 고도 복합(very complex) 아미노산 곁사슬은 다수의 반응성 기를 함유하고, 아르기닌, 프롤린 및 트립토판의 아미노산 곁사슬을 포함한다.
실시예 1a - 단순 아미노산 곁사슬을 가진 데옥시리보포스포라미다이트 단량체의 제조
실시예 1a.1 - 알라닌
포스포라미다이트 단량체는 골격 스페이서에 공유 결합된 아미노산 알라닌의 곁사슬을 가지고 제조된다. 이 실시예에서, 도 1에 나타낸 바와 같이, 화합물 1(I)은 골격 스페이서, 5' 다이메톡시트리틸, 1' 아민 변형된 환식 데옥시리보스(I)이다. 화합물 2(II)는 메톡시아민(CAS# 74-89-5, 화합물 ID 6329)이다. 화합물 I 및 II를, 제조사가 제시한 바와 같이 DMA(다이메틸 아디피미데이트, CAS #14620-72-5)(Thermo Scientific part#20660) 등과 같은 2작용성 가교제(III)를 이용해서 가교시킨다. 가교 중간체(IV)(1 밀리몰)를 건조 질소로 사전 플러싱된 10㎖ 반응 용기에서 3㎖의 건조, 산 유리 CHCl3 및 다이아이소프로필에틸아민(4 밀리몰)에 용해시킨다. 건조 질소 하에 유지하면서 이 반응 용기에 포스파이틸화 시약(n-다이메틸아미노메톡시-포스핀, 2 밀리몰)을 적가 첨가한다. 이 포스파이틸화 프로토콜은, Carruthers(미국 특허 제4,415,732)가 기술한 바와 같이, 건조 질소 하에 적어도 15분의 반응 시간 후에, 용액을 125㎖ 분액 깔때기 내로 아세트산에틸 35㎖와 함께 옮긴다. 이 용액을 이어서 포화 NaCl 80㎖로 4회 추출한다. 이어서 유기 상을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 발포물로 증발시킨다. 이 발포물을 이어서 톨루엔 10㎖ 또는 아세트산에틸 10㎖에 용해시킨다. 얻어진 용액을 이어서 냉(-78℃) 헥산 50㎖에 적가 첨가하고 격렬하게 교반하여 분말을 생성한다. 현탁액을 여과하고, 분말을 추가로 냉 헥산 75㎖로 세척한다. 얻어진 분말을 이어서 건조 질소 및 감압 하에 건조시키고 건조된 생성물을 건조 질소 하에 보관한다.
실시예 1a.2 - 아스파르트산
단량체는 출발 물질 II가 아스파르트산의 곁사슬, 3-아미노프로판산 CID# 239인 것을 제외하고 실시예 1a.1에 따라서 제조한다.
실시예 1a.3 - 글루탐산
단량체는 출발 물질 II가 글루탐산의 곁사슬, 아미노부탄산 CID#119인 것을 제외하고 실시예 1a.1에 따라서 제조한다.
실시예 1a.4 - 아이소류신
단량체는 출발 물질 II가 아이소류신의 곁사슬, 2-아미노 부탄 CID# 2724537인 것을 제외하고 실시예 1a.1에 따라서 제조한다.
실시예 1a.5 - 류신
단량체는 출발 물질 II가 류신의 곁사슬, 아이소-뷰틸아민 CID# 6558인 것을 제외하고 실시예 1a.1에 따라서 제조한다.
실시예 1a.6 - 세린
단량체는 출발 물질 I이 세린의 곁사슬, 에탄올아민 CID # 700인 것을 제외하고 실시예 1a.1에 따라서 제조한다.
실시예 1a.7 - 트레오닌
단량체는 출발 물질 II가 트레오닌의 곁사슬, 3-아미노-2-프로판올, CID# 4631415인 것을 제외하고 실시예 1a.1에 따라서 제조한다.
실시예 1a.8 - 발린
단량체는 출발 물질 II가 발린의 곁사슬, 2-프로필아민 CID# 6363인 것을 제외하고 실시예 1a.1에 따라서 제조한다.
실시예 1a.9 - 글라이신
글라이신계 단량체를 위하여, 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성을 위하여 이용되는 기존의 단량체인 이러한 D-스페이서(글렌 리서치 카탈로그(Glen Research catalog) #10-1914, 버지니아주의 스털링시에 소재)가 이용될 수 있다.
실시예 1b - 복합 아미노산 곁사슬을 가진 데옥시리보포스포라미다이트 단량체의 제조
실시예 1b.1 - 페닐알라닌
단량체는 출발 물질 II가 도 2에 나타낸 바와 같이 페닐알라닌의 곁사슬, 벤질아민 CID # 7504인 것을 제외하고 실시예 1a.1에 따라서 제조한다.
실시예 1b.2 - 아스파라긴
단량체는 출발 물질 II가 L-아스파라긴, CID# 6267인 것을 제외하고 실시예 1b.2에 따라서 제조한다. 아스파라긴 아미노산은 L-아르기닌에 대해서 기재된(실시예 1c.1) 바와 같이 1차 아민 상의 아세틸기로 보호된다.
실시예 1b.3 - 시스테인
도 3에 나타낸 바와 같이, 단량체는 출발 물질이 시스테인의 곁사슬, 2-아미노에탄티올 CID# 6058인 것을 제외하고 실시예 1b.2에 따라서 제조한다. (1-머캅토헥산 CID # 8106은 시스테인의 티올을 위한 보호기로서 사용된다.)
실시예 1b.4 - 글루타민
단량체는 출발 물질 II가 L-글루타민 CID# 5961인 것을 제외하고 실시예 1b.2에 따라서 제조된다. L-글루타민 아미노산은 L-아르기닌에 대해서 기재된(실시예 1c.1) 것과 같이 1차 아민 상의 아세틸기로 보호된다.
실시예 1b.5 - 라이신
도 4에 나타낸 바와 같이, 단량체는, 출발 물질 II가 라이신의 곁사슬, 4-아미노부탄산 CID # 119인 것을 제외하고 실시예 1b.2에 따라서 제조된다. 4-아미노부탄산의 아미노기는 L-아르기닌에 대해서 기재된(실시예 1c.1) 것과 같이 1차 아민 상의 아세틸기로 보호된다.
실시예 1b.6 - 메티오닌
단량체는 출발 물질 II가 메티오닌의 곁사슬, 3-메틸티오프로필아민 CID# 77743을 가지는 것을 제외하고 실시예 1b.2에 따라서 제조된다.
실시예 1b.7 - 티로신
단량체는, 도 5에 나타낸 바와 같이, 출발 물질 II가 티로신의 곁사슬, 4-하이드록시벤질아민 CID # 97472를 가지는 것을 제외하고 실시예 1b.2에 따라서 제조된다.
실시예 1c - 고도 복합 아미노산 곁사슬을 가진 데옥시리보포스포라미다이트 단량체의 제조
실시예 1c.1 - 아르기닌
L-아르기닌 CID # 6322(메탄올 중 10 mg/mml)를 샘플 중 1차 아민에 대해서 4배 몰 과잉량의 무수 아세트산에서 무수 아세틸과 반응시킨다. 이 반응은 연속적으로 혼합하면서 24시간 동안 흄 후드 내에서 실온에서 계속된다.
실시예 1c.2 - 히스티딘
단량체는 출발 물질 II가 L-히스티딘 CID # 6274인 것을 제외하고 실시예 1c.1에 따라서 제조된다. L-히스티딘 아미노산은 L-아르기닌에 대해서 기재된(실시예 1c.1) 것과 마찬가지로 1차 아민 상의 아세틸기로 보호된다.
실시예 1c.3 - 프롤린
포스포라미다이트 단량체는 골격 스페이서에 공유 결합된 아미노산 프롤린의 곁사슬로 제조되었다. 이 실시예에서, 화합물 1은 골격 스페이서, 5' 다이메톡시트리틸, 1' 아민 변형된 환식 데옥시리보스(I)이다. 화합물 2(II)는 프롤린(CAS# 7005-20-1, 화합물 ID 145742)이다. 화합물 I 및 II는 제조사가 제시한 바와 같은 조건을 이용해서 EDC 또는 DCC(각각 써모 사이언티픽사(Thermo Scientific) 파트 번호 22980 및 20320) 등과 같은 2작용성 가교제(III)를 이용하여 가교된다.
실시예 1c.4 - 트립토판
단량체는 출발 물질 II가 아세틸-L-트립토판, CID # 700653인 것을 제외하고, 실시예 1c.1에 따라서 제조된다.
실시예 2 - 리보포스포라미다이트 단량체의 제조
실시예 1의 방법은, 리보스 당 모이어티가 데옥시리보스 당 모이어티 대신에 이용된 것을 제외하고 실시예 1a.1 내지 1c.4에서 언급된 각 아미노산 곁사슬에 대해서 반복된다.
실시예 3 - 2'-O-메틸 리보포스포라미다이트의 제조
실시예 1의 방법은, 2'-O-메틸 리보스 당 기반 모이어티가 2'-데옥시리보스 기반 당 대신에 이용되는 것을 제외하고 실시예 1a.1 내지 1c.4에서 언급된 각 아미노산 곁사슬에 대해서 반복된다. 두 경우에 5'하이드록실기는 DMT기(다이메톡시트리틸)로 탈블록화된다.
실시예 4 - 당 모이어티를 결여하는 포스포라미데이트 단량체의 제조
실시예 1의 방법은, 아미노산 곁사슬이 L기를 통해서 Y 스페이서(화합물 I 실시예 4a)에 연결되고 베타사이아노에틸포스포라미다이트기와 DMT 보호된 산소를 분리하는 것을 제외하고(여기서 스페이서는 당 이외의 것임) 실시예 1a.1 내지 1c.4에서 언급된 각 아미노산 곁사슬에 대해서 반복된다.
실시예 4a. - 도 6에 도시된 알라닌
실시예 4b. - 도 7에 도시된 페닐알라닌
실시예 4c - 도 8에 나타낸 바와 같은 라이신
실시예 4d. - 도 9에 나타낸 바와 같은 티로신
실시예 5 - 최종 단량체가 L기를 결여하는 단량체를 제조하는 대안적인 방법
출발 물질은 메틸프로판다이올 CID #7503이다. 메틸프로판다이올(10 m㏖)을 트라이에틸아민(25 m㏖)의 존재 하에 염화다이메톡시트리틸(12 m㏖)과 반응시키고 Zekri 등(Zekri, Alamdari, and Khalafi-Nezhad. 2010. Bull. Chem. Soc. Ethiop. 24(2): 299-304)에 따라 반응시킨다. 냉각된 반응 혼합물을 클로로폼 100㎖에 용해시키고, 5% NaHCO3 60㎖로 세척한다. 유기 층을 분액시키고 물(2 X 50㎖)로 추출한다. 얻어지는 유기 층을 이어서 건조시키고 역상 크로마토그래피에 의해 DMT-O-메틸프로판-3-올을 단리시켰다. 화합물 I은 실시예 1.a1에 기재된 바와 같이 포스포라미다이트로 전환된다.
실시예 6 - 골격 내 변형
실시예 1 내지 5의 각각의 방법은, 실시예 7의 단계 4의 산화제가 황 산화제, 예컨대, 뷰케이지 시약(Beaucage reagent)(글렌 리서치사(Glen Research) 카탈로그 번호 40-4036-XX)(버지니아주의 스털링시에 소재)에 의해 치환되고, 그 결과 포스포로티오에이트 연쇄가 생성되는 것을 제외하고 반복된다.
실시예 7 - 본 발명의 단량체를 혼입하는 중합체의 합성
본 출원의 단량체는 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성을 위하여 통상 이용되는 화학적 공정을 통해서 중합체에 혼입된다. 이 합성 방법은 초기 탈블록화 단계 전에 초기 합성 단량체에 공유 결합될 수 있거나 그렇지 않을 수도 있는 고체 지지체를 이용한다. 합성 사이클은 4단계, 즉, 탈블록화(탈트리틸화), 커플링, 캐핑(A 및 B 단계) 및 산화로 구성된다. 중합체를 위한 합성 조건은 ABI 익스페다이트(ABI Expedite) DNA 합성기(라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies))와 양립 가능한 조건에서 수행된다. 모든 사이클 및 프로그램 시간은 제조사가 제시한 바와 같다. DNA 합성기는 일반적으로 본 발명의 단량체 모두 그리고 화학적 중합체의 합성을 위하여 요구되는 기타 조절제에 대해서 충분한 시약 슬롯을 가지지 않으므로, 부분적인 수순은 최종 탈블록화 단계가 불능인 상이한 합성기들로 도입될 수도 있다. 중합체의 각 부문이 완결됨에 따라서, 칼럼(고체 지지체에 여전히 결합된 연장된 중합체를 포함함)을 합성을 위한 다음 부분을 위하여 프로그래밍된 합성기로 이동시킨다.
이하에 열거된 단계들의 각각 후에, 성장 중인 지지체 결합 중합체는 무수 아세토나이트릴로 세척되어 미반응 화학물질 및 화학적 부산물이 제거된다.
단계 1: 탈블록화
탈블록화는 산성 조건 하에 중합체의 연장 말단으로부터 DMT기를 제거한다. 비활성 용매 DCM(다이클로로메탄) 중 3% 다이클로로아세트산(DCA) 용액을 탈블록화를 위하여 이용한다. 탈블록화 효율은 오렌지색 반응 생성물의 생성을 통해서 모니터링된다. 탈블록화의 결과는 중합체 연장 지점에서 유리 하이드록실기이다.
단계 2: 커플링
건조 질소 플러싱된 단량체를 0.02 내지 0.2M 농도에서 무수 아세토나이트릴 중에 현탁시킨다. 현탁된 단량체를 합성기에 부착하고, 합성 전에(1 내지 2분) 건조 질소 혹은 아르곤으로 간단히 재차 플러싱한다. 단량체는 0.2 내지 0.7M 1H-테트라졸 또는 2-에틸티오테트라졸(또는 유사한 상용성 화합물)로 활성화시킨다. 단량체와 활성제의 혼합은 이들 성분이 고체 지지체를 포함하는 반응 칼럼으로 전달되는 동안 올리고뉴클레오타이드 합성기의 유체 라인에서 간단히 일어난다. 활성화된 포스포라미다이트는 지지체-결합된 물질 위에 1.5 내지 20배 과량으로 공급되어 5'-하이드록시기와 반응하여 포스파이트 트라이에스터 연쇄를 형성한다. 본 발명의 단량체에 대한 프로그래밍된 반응 시간은 커플링 반응을 위하여 5 내지 15분을 허용한다. 각 커플링 단계의 완결 시, 반응 칼럼을 세척하여 미반응 물질을 제거한다.
단계 3: 캐핑
커플링 단계 동안 단량체가 첨가되지 않았던 경우 중합체의 연장을 방지하기 위하여, 합성 사이클 중 제3 단계는 캐핑이다. 캐핑 시약은 무수 아세트산과 1메틸 아미디졸, 또는 몇몇 경우에 DMAP를 포함한다. 이들 시약은 하이드록실기와 반응하여 추가의 연장을 방지한다. 다른 반응 부위가 중합체 중에 존재할 경우에, 캐핑은 분지화를 방지할 수 있다.
단계 4: 산화
커플링 단계 동안 포스포라미다이트 단량체의 첨가는 포스파이트 트라이에스터 연쇄의 형성을 초래한다. 성장 중인 중합체가 약 염기, 예컨대, 피리딘 또는 루티딘(산화제) 중에서 요오드로 처리될 경우, 연쇄는 중합체의 최종 탈보호 시 포스포다이에스터 연쇄로 되는 테트라배위된 포스페이트 트라이에스터로 된다.
최종 단량체간 결합이 포스포로티오에이트인 경우, 황화 단계는 단계 3으로서의 캐핑 단계 전에 더욱 효과적으로 수행되고, 캐핑 단계는 이어서 단계 4로 된다.
최종 탈블록화, 고체 지지체로부터의 절단 및 탈보호
합성의 결과, 중합체는 최종 시기에 탈블록화되어 말단 DMT기를 제거한다. 중합체는 이어서 염기 조건 하에, 가장 통상적으로 암모니아 하에 고체 지지체로부터 절단된다. 암모니아 처리는 또한 중합체 곁사슬(아미노산 곁사슬 또는 뉴클레오타이드 염기) 상의 보호기를 제거한다.
실시예 7.1 - DNA 분자 내로의 단량체 아단위의 혼입
실시예 7의 방법에 따라, 실시예 1 내지 6의 각각에 따라서 제조된 단량체 아단위들이 이하의 서열 AGTTGCACGT를 가진 DNA 분자 내로 혼입되어 식 AGTTGCACGTM을 가진 합성 중합체 분자(여기서 M은 단량체 아단위를 나타냄)를 얻는다.
실시예 7.2 - DNA 분자 내로의 단량체 아단위의 혼입
실시예 7의 방법에 따라, 실시예 1 내지 6의 각각에 따라서 제조된 단량체 아단위들이 이하의 서열 AGTTGCACGT를 가진 DNA 분자 내로 혼입되어 식 AGTTGCACGTM을 가진 합성 중합체 분자(여기서 M은 단량체 아단위를 나타냄)를 얻고, 이어서 추가적인 뉴클레오타이드를 순차 첨가하여 식 AGTTGCACGTMCGAT를 가진 합성 분자를 얻는다.
실시예 7.3 - RNA 분자 내로의 단량체 아단위의 혼입
실시예 7의 방법에 따라, 실시예 1 내지 6의 각각에 따라서 제조된 단량체 아단위들이 이하의 서열 AGUUGCACGU를 가진 RNA 분자 내로 혼입되어 식 AGUUGCACGUM을 가진 합성 중합체 분자(여기서 M은 단량체 아단위를 나타냄)를 얻는다.
실시예 7.4 - RNA 분자 내로의 단량체 아단위의 혼입
실시예 7의 방법에 따라, 실시예 1 내지 6의 각각에 따라서 제조된 단량체 아단위들이 이하의 서열 AGUUGCACGU를 가진 RNA 분자 내로 혼입되어 식 AGUUGCACGUM을 가진 합성 중합체 분자(여기서 M은 단량체 아단위를 나타냄)를 얻고, 이어서 추가적인 뉴클레오타이드를 순차 첨가하여 식 AGUUGCACGUMCGAU를 가진 합성 분자를 얻는다.
실시예 7.5 - 동종중합체
실시예 7의 방법에 따라, 각각 히스티딘의 결사슬을 가진, 실시예 1 내지 5의 10개의 연속적인 단량체를 포함하는 합성 중합체 분자가 제조된다.
실시예 7.6 - 이종중합체
실시예 7의 방법에 따라, 단량체들의 아미노산 곁사슬을 변화시킨, 실시예 1 내지 5의 30개의 단량체를 포함하는 합성 중합체 분자가 제조된다.
실시예 7.7 - 불균일 골격을 가진 이종중합체
실시예 7의 방법에 따라, 단량체들의 아미노산 곁사슬을 변화시키고 골격기를 변화시킨, 실시예 1 내지 5의 30개의 단량체를 포함하는 합성 중합체 분자가 제조된다.
실시예 7.8 - 불균일 골격 및 불균일 링커기를 가진 이종중합체
실시예 7의 방법에 따라, 단량체들의 아미노산 곁사슬, 골격기 및 링커(L)를 변화시킨, 실시예 1 내지 5의 20개의 단량체를 포함하는 합성 중합체 분자가 제조된다.
실시예 8 - 단량체의 사용
H-태그를 생산하기 위하여 단량체를 사용하는 실시예. 실시예 1 c2에 기재된 바와 같은 6개의 His 곁사슬 단량체(H)가 올리고뉴클레오타이드 합성 동안 20량체 폴리dT의 5' 위치에 첨가되어, 최종 서열은 5'HHH HHH TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT3'이다. H는 합성을 위하여 아세토나이트릴 중 0.1M의 농도에서 사용된다. 키메라 중합체는 ABI 엑스페다이트 합성기(ABI Expedite synthesizer)에 대한 제조사의 권고에 따라서 합성된다. 탈보호 후, H-태그된 폴리dT는 히스티딘 특이적 항체(ABCAM사로부터의 다클론성 IgG ab6442)와 함께 인큐베이팅되었다. 20량체 폴리dT의 대조 샘플이 또한 히스티딘 특이적 항체와 함께 인큐베이팅되었다. 천연 12% 폴리아크릴아마이드(20:1 아크릴아마이드:비스)는 4가지 샘플: 20량체 폴리dT, 20량체 폴리dT + 히스티딘 특이적 항체, His-태그된 20량체 폴리dT, His-태그된 20량체 폴리dT + 히스티딘 특이적 항체와 함께 로딩되었다. (피콜(FICOLL)(등록상표)(GE 헬스케어사(GE Healthcare))이 겔 상에 로딩되기 전에 모든 샘플에 첨가되었다.) 히스티딘 특이적 항체의 첨가는 대조군에 비해서 His-태그된 20량체 폴리dT 올리고뉴클레오타이드에 대해서 겔 이동을 초래하였다.
실시예 9 - 단량체의 사용
시스테인 곁사슬은, 일단 단량체가 올리고뉴클레오타이드 내로 혼입되어 탈보호되면, 2개의 개별의 올리고뉴클레오타이드 단일 가닥을 공유 결합할 수 있는 다이설파이드 결합을 형성할 수 있다. 서열 5'TTT TTT TTT-C-TTT TTT TTT3'(여기서 C는 시스테인 곁사슬을 지니는 본 발명의 단량체를 나타냄)이 합성을 위하여 0.1M의 농도에서 이용되었다. 키메라 분자는 ABI 엑스페다이트 합성기에 대한 제조사의 권고에 따라서 합성된다.
이 실시예의 키메라 중합체의 50nM 규모 합성은 20 마이크로리터 부피의 멸균수 중에서 현탁된다. 1 마이크로리터의 10mM DTT가 10 마이크로리터의 현탁된 중합체에 첨가되고, 이어서 실온에서 10분 동안 유지된다. DTT는 세파덱스(Sephadex) G-10 칼럼에서의 짧은 원심분리에 의해 혹은 푸시 칼럼의 사용에 의해 제거된다. 얻어지는 용액은 질소 하에 건조 상태로 증발된다. 건조된 샘플은 10 마이크로리터의 물에 재현탁된다. 천연 12% 폴리아크릴아마이드(20:1 아크릴아마이드:비스)는 다음의 레인, 즉, 무처리 키메라 중합체, DTT 처리된 중합체 및 20량체 폴리dT 올리고뉴클레오타이드와 함께 로딩되었다. 피콜이 겔 상에 로딩되기 전에 모든 샘플에 첨가되었다.) 얻어지는 밴드는 이량화가 허용되는 키메라 샘플에 대한 겔에서의 보다 높은 명백한 분자량으로의 이동을 보인다.
실시예 10 - 합성 중합체 분자의 사용
아르기닌 바소프레신의 작용을 모방
본 출원에 따른 아르기닌 바소프레신 합성 중합체는 CYS-TYR-PHE-GLN-ASN-CYS-PRO-ARG-GLY의 아미노산 곁사슬의 수순으로 이루어져 있다. 이 수순은 본 출원의 단량체 및 ABI 익스페다이트(ABI Expedite) DNA 합성기를 위한 표준 DNA 합성 조건을 이용해서 모사된다.
성체 붉은털 원숭이의 좌전하행 동맥, 휘돌이 동맥 및 우관상 동맥으로부터의 단일 VMC들을 단리시키고, 새롭게 확산된 것으로서 그리고 초대 배양으로서의 둘 다를 연구한다. 단기 초대 배양된 세포(결코 계대배양되지 않음)는 2 내지 3주 동안 공급원 조직의 특징, 예컨대, 수축, 이완, 수용체 및 막 전기 특성을 유지한다. VMC들은 높은 비율의 살아 있는 수축 중인 세포를 초래하고 그리고 Na+, Ca2+ 또는 Cl-를 이용한 로딩을 방지하는 글루탐산 칼륨 용액(KG) 중 콜라게나제 및 프로테아제 효소를 이용해서 해리된다(Miyagawa et al, Am J Physiol 272:H2645-2654, 1997; Hermsmeyer et, Art Thromb Vasc Biol, 24:955-961, 2004). 배양을 위하여 제조된 세포들은 개별 세포의 선택을 용이하게 하기 위하여 유리 커버글라스 상에 제5 세대 포유동물용의 심혈관 배양 용액(cardiovascular culture solution for mammals, fifth generation: CV5M) 중에서 저밀도로 파종된다. VMC는 커버글라스에 부착된 후에 7 내지 14일에 실험을 위하여 이용된다.
유리 커버글라스 상의 새롭게 확산된 혹은 초대 배양된 VMC들은 악시오버트 반전 형광 현미경(Axiovert inverted fluorescence microscope) 상에서 층류 설계된 챔버 내에 배치되어 제이스 플랜 네오플루어(Zeiss Plan Neofluar) 25X/0.80 침수형 대물렌즈로 관찰된다. 형광 강도는 고감도 교정 비디오 센서로 측정되고, 컴퓨터 획득 및 관리 프로그램을 통해서 디지털 기록된다. 포유동물용 이온 용액 버전 2(ionic solution for mammals version 2: ISM2)는 계속적인 평형과 제제의 세척을 제공하기 위하여 상기 챔버를 통해 (1㎖/분에서) 계속적으로 펌핑된다. 15분 평형 기간 후, VMC는 Ca2+를 감지하기 위한 3μM 플루오(fluo) 3(몰리큘러 프로브사(Molecular Probes, Inc.))를 이용해서 실온에서 15분 동안 로딩된다. 개별의 VMC는 개별의 세포 위에서 본 출원의 아르기닌 바소프레신 또는 아르기닌 바소프레신 유사체를 첨가함으로써 자극된다. 흐름이 없는 조건 하에서 15분 후에, ISM2의 연속 흐름이 회복되고, 대략 300㎕의 챔버 체적이 유지된다. 형광 화상들이 1분에 촬영되고, 그리고 광 강도가 칼슘 신호(형광) 및 세포 수축성의 변화와 동일하게 되는 후속 시점에서 촬영된다. 본 발명의 중합체는 천연 아르기닌 바소프레신과 마찬가지로 VMC의 세포 수축성 및 칼슘 신호에 영향을 미치는 것으로 판명된다.
위에서 기재된 발명의 각종 변형은 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 이하의 청구범위의 범주 내에 포함되는 것이 의도되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CHIMEROCHEM LLC <120> SYNTHETIC POLYMERS CONTAINING AMINO ACID SIDE CHAINS <130> WO2014/158954 <140> PCT/US2014/021076 <141> 2014-03-06 <150> US61/786,302 <151> 2013-03-14 <160> 9 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthesized <400> 1 agttgcacgt 10 <210> 2 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthesized - DNA with monomer subunit <400> 2 agttgcacgt m 11 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthesized - DNA with internal monomer subunit <400> 3 agttgcacgt mcgat 15 <210> 4 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <223> Synthesized <400> 4 aguugcacgu 10 <210> 5 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <223> Synthesized - RNA with monomer subunit <400> 5 aguugcacgu m 11 <210> 6 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <223> Synthesized - RNA with internal monomer subunit <400> 6 aguugcacgu mcgau 15 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthesized - PolyT with synthetic polyH tag <400> 7 hhhhhhtttt tttttttttt tttttt 26 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Synthesized - PolyT with internal synthetic C monomer <400> 8 tttttttttc ttttttttt 19 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Arginine Vasopressin <400> 9 CYFQNCPRG 9

Claims (21)

  1. 다수의 단량체 아단위를 포함하는 합성 중합체 분자로서, 상기 단량체 아단위들 중 적어도 하나는 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기에 연결된 아미노산 곁사슬을 포함하고, 그리고 상기 단량체 아단위의 상기 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기는 포스포다이에스터 또는 변형된 포스포다이에스터 결합에 의해 인접한 단량체 아단위에 연결되는, 합성 중합체 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기에 연결된 아미노산 곁사슬을 포함하는 단량체 아단위는 상기 아미노산 곁사슬과 상기 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기 사이에 당 모이어티를 함유하는, 합성 중합체 분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 당 모이어티는 펜토스 당 모이어티인, 합성 중합체 분자.
  4. 제2항에 있어서, 상기 펜토스 당 모이어티는 데옥시리보스 또는 리보스 당 모이어티인, 합성 중합체 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기에 연결된 아미노산 곁사슬을 포함하는 단량체 아단위는 포스포다이에스터 결합에 의해 상기 인접한 단량체에 연결되는, 합성 중합체 분자.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기에 연결된 아미노산 곁사슬을 포함하는 단량체는 변형된 포스포다이에스터 결합에 의해 상기 인접한 단량체에 연결되는, 합성 중합체 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 변형된 포스포다이에스터 결합은 포스포로티올레이트, 다이포스포로티올레이트, 알킬포스포네이트, 알콕시포스포네이트 및 포스포라미데이트 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 합성 중합체 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기에 연결된 아미노산 곁사슬을 포함하는 단량체 아단위는 하기 화학식을 가지는 합성 중합체 분자:
    Figure pct00014

    식 중,
    A = H, OH, 알킬기, 알콕시기, 아미노기, 카복시기, 바이오틴, 염료, 역전 연쇄(reversed linkage), 아미노산, 폴리펩타이드 또는 유사체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 고체 지지체, 고체 지지체에 대한 연쇄, 또는 인접한 단량체 아단위,
    B = H, OH, 알킬기, 알콕시기, 아미노기, 카복시기, 바이오틴, 염료, 역전 연쇄, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 유사체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 고체 지지체, 고체 지지체에 대한 연쇄, 또는 인접한 단량체 아단위,
    L = R에 공유 결합된 링커,
    Y = L과 F 사이에 있는 스페이서,
    F = 포스포다이에스터기 또는 변형된 포스포다이에스터기, 및
    R = 아미노산 곁사슬.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자의 상기 단량체 아단위들의 각각은 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기에 연결된 아미노산 곁사슬을 포함하고, 그리고 상기 단량체 아단위의 상기 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기는 포스포다이에스터 또는 변형된 포스포다이에스터 결합에 의해 인접한 단량체 아단위에 연결되는, 합성 중합체 분자.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자의 상기 단량체 아단위들 중 하나 이상은 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기에 연결된 아미노산 곁사슬을 포함하는 아단위 이외의 것이고, 그리고 상기 단량체 아단위의 상기 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기는 포스포다이에스터 또는 변형된 포스포다이에스터 결합에 의해 인접한 단량체 아단위에 연결되는, 합성 중합체 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단량체 아단위들 중 하나 이상은 1개 이상의 보호기의 존재에 의해 보호되는, 합성 중합체 분자.
  12. 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기에 연결된 글라이신의 아미노산 곁사슬 이외의 아미노산 곁사슬을 포함하는 단량체 분자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 아미노산 곁사슬과 상기 포스페이트기 또는 변형된 포스페이트기 사이에 당 모이어티를 포함하는, 단량체 분자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 당 모이어티는 펜토스 당 모이어티인, 단량체 분자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 펜토스 당 모이어티는 데옥시리보스 또는 리보스 당 모이어티인, 단량체 분자.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 곁사슬이 포스페이트기에 연결된, 단량체 분자.
  17. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 곁사슬은 변형된 포스페이트기에 연결된, 단량체 분자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 변형된 포스페이트기는 포스포라미데이트기, 포스포라미다이트기, 포스포네이트기, 포스포로티오에이트기, 포스포로다이티오에이트기, 포스포로티올레이트기, 다이포스포로티올레이트기, 알킬포스포네이트기, 알콕시포스포네이트기 및 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단량체 분자.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 보호기의 존재에 의해 보호되는, 단량체 분자.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식을 가지는 단량체 분자:
    Figure pct00015

    식 중,
    A = H, OH, 알킬기, 알콕시기, 아미노기, 카복시기, 바이오틴, 염료, 역전 연쇄, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 유사체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 고체 지지체, 또는 고체 지지체에 대한 연쇄,
    B = H, OH, 알킬기, 알콕시기, 아미노기, 카복시기, 바이오틴, 염료, 역전 연쇄, 아미노산, 폴리펩타이드 또는 유사체, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 고체 지지체, 또는 고체 지지체에 대한 연쇄,
    L = R에 공유 결합된 링커,
    Y = L과 F 사이에 있는 스페이서,
    F = 포스포다이에스터기 또는 변형된 포스포다이에스터기, 및
    R = 아미노산 곁사슬.
  21. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항의 단량체 분자를 얻는 단계 및 상기 단량체 분자를 포스포다이에스터 또는 변형된 포스포다이에스터 결합에 의해 합성 중합체 분자의 단량체 아단위에 연결하는 단계를 포함하는, 합성 중합체 분자를 연장시키는 방법.
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