JP7058645B2 - 核酸測定用新規蛍光消光プローブ - Google Patents
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Description
QProbeは前述の通り修飾が必要な蛍光色素は1種のみであるため、その他の均一溶液系プローブよりも製造コストは一般的に安価となるが、アミノ基と蛍光色素間の反応性が一般的に低いことから、アミノ基に対して大過剰の蛍光色素を添加する必要性がある。蛍光色素のコストは一般的に高額であることから、アミノ基と蛍光色素間の反応効率を向上させることが可能であれば、QProbeの製造コストをこれまで以上に下げることが可能である。
本発明において解決しようとする課題は、蛍光標識コストがより安価なQProbeを提供することにある。
しかしながら、新規アミノリンカーを用いた場合、蛍光色素にて標識した後の分子構造が、既存アミノリンカーを用いた場合の分子構造と異なるため(図3)、新規アミノリンカーに変更することでQProbeの機能面における性能低下が懸念された。
そこで、実際に新規アミノリンカーを適用したQProbe(以下、新規QProbe)を合成し、機能面(標的核酸とハイブリダイズした際の蛍光消光効率)について、既存アミノリンカーを適用した従来のQProbe(以下、既存QProbe)と比較したところ、新規QProbeについて、既存QProbeと同等またはそれ以上の機能性が確認された。本発明は、かかる発見に基づきなされたものである。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2017‐105202の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
(1)5’末端部、好ましくは5’末端が、本発明の実施に有用な蛍光色素で標識され、標的核酸に当該末端部においてハイブリダイゼーションしたとき、当該プローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした5’末端の塩基部分から1~3塩基5’側に離れて、標的核酸の塩基配列にG(グアニン)が少なくとも1塩基以上存在するように、塩基配列が設計されている。
(2)前記(1)のプローブの内、3’末端が蛍光色素で標識されているプローブ。
(3)前記(1)のプローブの内、3’末端、例えば、3’末端のリボース若しくはデオキシリボースの3’位CのOH基がリン酸基等で修飾されているもの、または、3’末端のリボースの2’位CのOH基がリン酸基等で修飾されているもの。
(4)3’末端部、好ましくは3’末端が、本発明の蛍光色素で標識され、3’末端の塩基がG又はCであるもの、または3’末端のリボースの2’位のOH基がリン酸基等で修飾されているもの。
(5)前記(1)のプローブのうち、5’末端部、好ましくは5’末端が、本発明の蛍光色素で標識されているもの。
(6)5’末端部、好ましくは5’末端が、本発明の実施に有用な蛍光色素で標識され、5’末端の塩基がG又はCであるもの。
オリゴDNAと蛍光色素を繋ぐアルキル鎖の長さが異なる既存のアミノリンカーおよび蛍光色素(BODIPY FL)を用いることで、アルキル鎖長が異なるQProbeを複数合成し、QProbeの蛍光消光率に与えるアルキル鎖長の影響を調査した。図4として、本実施例にて準備をしたQProbeの構造を示す。アルキル鎖の長さが異なる3種のアミノリンカー(アルキル鎖の炭素数が3, 6, または12のアミノリンカー)と、アルキル鎖の長さが異なる2種の蛍光色素:BODIPY FL(アルキル鎖の炭素数が2または4のBODIPY FL)を使用することで、オリゴDNAと蛍光色素を繋ぐアルキル鎖長が異なる合計6種のQProbeを合成した。なお、6種のQProbeとも配列は共通であり、5’末端のシトシン(C)をBODIPY FLにて蛍光標識した。
実験は、6種QProbeそれぞれついて、QProbeと相補鎖の両方を添加した系、QProbeのみを添加した系の2系統の反応系を用意し、リアルタイムPCR装置(LightCycler 480[ロシュ・ライフサイエンス社製])にて解離曲線解析を実施した。解離曲線解析における蛍光測定は40~95℃の温度範囲にて行い、蛍光測定の頻度は約0.2℃/測定であった。得られた蛍光強度データを用いて、各測定温度における蛍光消光率を以下の計算式より求め、最も高い値を最大蛍光消光率とし、当該測定値を6種のQProbe間で比較した。
蛍光消光率(%)={(F1 - [F2 × F1 95 / F2 95]) / F1} × 100
F1 :[QProbeのみ]の蛍光強度
F2 :[QProbe + 相補鎖]の蛍光強度
F1 95:[QProbeのみ]の95℃における(解離時の)蛍光強度
F2 95:[QProbe + 相補鎖]の95℃における(解離時の)蛍光強度
その結果を図5として示す。この結果より、アルキル鎖長が炭素数8ときに最も蛍光消光(約82%)したことが分かる。また、炭素数8のQProbeよりも、炭素数で1つ分だけ短い炭素数7のQProbeの場合、その蛍光消光率は約59%であり、炭素数8のQProbeよりも蛍光消光率が大きく低下している。一方、炭素数8のQProbeよりも、炭素数で2つ分だけ長い炭素数10のQProbeの場合、その蛍光消光率は約54%であり、こちらも炭素数8のQProbeと比較して蛍光消光率が著しく低下している。
以上の結果より、アルキル鎖長の僅かな違いが、QProbeの蛍光消光率に大きな影響を与えることが分かる。また、QProbeを用いて標的遺伝子を検出する際の感度および精度は、蛍光消光率が大きく依存することから、アルキル鎖の選定は、QProbeの性能を左右する重要なファクターであることも併せてこの結果より示唆された。
一方、図3として示した既存アミノリンカーにて合成したQProbeと、新規アミノリンカーにて合成したQProbe の化学構造を比較すると、後者のリンカー長のほうが長く、蛍光色素とオリゴDNA間の距離が広いことが分かる。この点と、実施例1の結果を踏まえて考えると、最適な既存アミノリンカーにて合成したQProbe(BODIPY FL[D6140]の場合、C6アミノリンカー)の蛍光消光率と、同じ炭素数の新規アミノリンカーで合成したQProbeの蛍光消光率を比較した場合、後者の蛍光消光率が著しく悪化する可能性が予想された。
以上を検証するため、最適な既存アミノリンカーにて合成したQProbe(合成委託先:つくばオリゴサービス社)と、最適な既存アミノリンカーと同じアルキル鎖長の新規アミノリンカーにて合成したQProbe(合成委託先:ジーンデザイン社)を用意し、その最大蛍光消光率を比較した。
本実施例では、既存アミノリンカーを使用したQProbeを16種用意し、これらQProbe各々について、リンカーのみが新規アミノリンカーに変更されたQProbeを同数用意した。
上記した全32種類のQProbeについて、実施例1と同様の方法にて、最大蛍光消光率を求め、当該測定値を比較することにより、蛍光消光率に与える新規アミノリンカーの影響を調査した。
5'末端のシトシンを蛍光標識したQProbeに関する結果を図6-1として示す。この結果より、標識した何れの蛍光色素についても、新規アミノリンカーを使用したQProbeの蛍光消光率は、既存アミノリンカーを使用したQProbeと同等以上であった。
3'末端のシトシンを蛍光標識したQProbeに関する結果を図6-2として示す。この結果より、5'末端標識したQProbeと同様、何れの蛍光色素についても、新規アミノリンカーを使用したQProbeの蛍光消光率は、既存アミノリンカーを使用したQProbeと同等以上であった。
このように、新規アミノリンカーを用いたQProbeは、性能的に既存アミノリンカーを用いたQProbeと同等以上であり、また前述した通り、製造コストを大幅に削減可能であることから、新規アミノリンカーを用いたQProbeは、産業利用上で非常に有用であることが示された。
実施例1からは、リンカー長の僅かな違いが蛍光消光率に大きな影響を与えることが示され、また、新規アミノリンカーで合成したQProbeのリンカー長は、最適な既存アミノリンカーにて合成したQProbeのリンカー長よりもかなり(少なくとも炭素数で2以上)長くなることから、新規アミノリンカーで合成したQProbeの蛍光消光率は、既存アミノリンカーでの消光率より大幅に悪化することが予想された。しかしながら、前述の通り、新規アミノリンカーで合成したQProbeの蛍光消光率は、既存アミノリンカーにて合成したQProbeの蛍光消光率と同等以上であることを示す結果が得られた。この結果は、実際に検証を行わないと予測することが困難な事象であることから、本特許は、進歩性も担保されていると認識される。
本実施例では、まず以下に示す4種類のアミノ化オリゴDNAを用意した。
具体的には、
[1]配列番号1で表されるオリゴDNAの5’末端に既存アミノリンカーを導入したアミノ化オリゴDNA
[2]配列番号1で表されるオリゴDNAの5’末端に新規アミノリンカーを導入したアミノ化オリゴDNA
[3]配列番号3で表されるオリゴDNAの3’末端に既存アミノリンカーを導入したアミノ化オリゴDNA
[4]配列番号3で表されるオリゴDNAの5’末端に新規アミノリンカーを導入したアミノ化オリゴDNA
の以上、4種類のアミノ化オリゴDNAを用意した。
これら4種類のアミノ化オリゴDNAを、QProbeに使用可能な蛍光色素(8種類)と反応させ、その結果得られた反応生成物量を測定・比較することで、上記蛍光色素に対する既存アミノリンカーと新規アミノリンカーの反応性の違いを比較した。既存アミノリンカーを導入したアミノ化オリゴDNA(上記[1]、[3])はつくばオリゴサービス社に、新規アミノリンカーを導入したアミノ化オリゴDNA(上記[2]、[4])はジーンデザイン社に合成を委託した。
上記[1]~[4]のアミノ化オリゴDNA(1 nmol )と蛍光色素(500 nmol)を、10%(V/V)ジメチルホルムアミド、250mMリン酸緩衝溶液(pH8.0 )に溶解し、全量100μlとした。本溶液を遮光した上で40℃ にてアミノ化オリゴDNAと蛍光色素との反応を開始した。反応開始後30分後に15μl 採取し、NAP5(ファルマシア社製) で脱塩後、本サンプルに含まれる蛍光色素と未反応のアミノ化オリゴDNAと、反応したアミノ化オリゴDNAの量を、逆相HPLCにより求めた。
以上の方法にて求めた蛍光色素と反応したアミノ化オリゴDNAの割合を図7-1、図7-2に示す。
なお、図7-1が5’末端蛍光標識した場合の蛍光色素と反応したアミノ化オリゴDNAの割合を示したグラフであり、図7-2が3’末端蛍光標識した場合の蛍光色素と反応したアミノ化オリゴDNAの割合を示したグラフである。
この結果より、蛍光修飾位置および蛍光色素の種類に関わらず、新規アミノリンカーのほうが、既存アミノリンカーよりも、蛍光色素と反応したアミノ化オリゴDNAの割合が著しく高いことが分かった。以上より、新規アミノリンカーを利用することで、多量のQProbeを容易に得られることが示された。
更に、本実施例、及び実施例2の結果から、新規アミノリンカーを使用することで、品質の良いQProbeを低コストで製造できることが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号1は、5'末端蛍光標識QProbeの配列を示す。
5' CCTACGGGAGGCAGCAG 3'
<配列番号2>
配列番号2は、配列番号1に記載したQProbeの相補鎖配列を示す。
5' CTGCTGCCTCCCGTAGG 3'
<配列番号3>
配列番号3は、3'末端蛍光標識QProbeの配列を示す。
5' AAGGAGGTGATCCAGCC 3'
Claims (5)
- 蛍光色素で標識した末端塩基がC(シトシン)であることを特徴とする請求項1又は2に記載の核酸測定用核酸プローブ。
- 蛍光色素で標識された核酸プローブにおいて、当該蛍光色素が、Pacific Blue(商標)、ATTO(登録商標)465、BODIPY(登録商標) FL、5-CR 6G、6-TAMRA(登録商標)、ATTO(登録商標)655、ATTO(登録商標)680、ATTO(登録商標)700のうち、何れか1つであることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項に記載の核酸測定用核酸プローブ。
- 蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法において、標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、核酸プローブに標識された蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、この発光の減少を測定することを特徴とする核酸の測定方法において、請求項1~4のいずれか1項に記載の核酸測定用核酸プローブを使用することを特徴とする核酸の測定方法。
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