JP2004531205A - 非−標準塩基を使用する固体支持体アッセイ系及び方法 - Google Patents

Abstract

非−標準塩基を使用する固体支持体アッセイが記載される。分子認識配列を含む捕獲オリゴヌクレオチドは固体支持体に付着され、かつ固形支持体は標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。場合によっては、分子認識配列は、１種又は複数の非−標準塩基を含み、かつ標的オリゴヌクレオチドの相補的タグ配列とハイブリダイズする。別の例では、本アッセイにおいて（例えば、ＰＣＲ又はライゲーションによる）非−標準塩基の取込みが使用される。

Description

【０００１】
（発明の背景）
ＤＮＡ又はＲＮＡの断片を含むオリゴヌクレオチドをアッセイするための多種多様な方法が開発されている。このようなアッセイは典型的には、試料が特定の標的オリゴヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含んでいるかどうかの決定に向けられている。一部の例において、オリゴヌクレオチド配列は、多くのアレル配列の場合のように、わずかに数個のヌクレオチドが異なっているだけである。一塩基多型（ＳＮＰ）は、単一のヌクレオチドが異なるアレルを意味する。例えこの単一ヌクレオチドの差異であっても、少なくとも一部の例において、関連した遺伝的反応又は形質を変化することができる。従って、どのアレルが試料中に存在するかを決定するためのアッセイ技術は、密に関連した配列を識別するのに十分な感度がなければならない。
【０００２】
多くのアッセイ技術は、複数の成分を含み、その各々はこのアッセイにおいて別の成分（複数）にハイブリダイズする。成分間の非−特異的ハイブリダイゼーション（すなわち、２種の非−相補配列のハイブリダイゼーション）は、このアッセイにおいてバックグラウンドノイズを生じる。例えば、密に関連しているが同じではない配列は、塩基対形成が２本の一本鎖が相補的でない位置で中断されているような不完全な二重鎖を形成し得る。非−特異的ハイブリダイゼーションは、例えば、多くのアレル及び特にＳＮＰアレルにとってそうであるように、ハイブリダイゼーション成分が類似配列を有する場合に増大する。従って、例えば、どのアレルが試料中に存在するかを決定するためのハイブリダイゼーションアッセイは、非−特異的ハイブリダイゼーションを低下させる方法又は非−特異的ハイブリダイゼーションのこのアッセイに対する影響を低下する方法により恩恵を受けるであろう。
【０００３】
（発明の簡単な概要）
一般に本発明は、オリゴヌクレオチドをアッセイする方法、キット及び組成物に関する。加えて本発明は、非−標準塩基を使用し、オリゴヌクレオチドをアッセイする方法、キット及び組成物に関する。ひとつの態様は、検体−特異的配列をアッセイする方法を提供する。支持体（例えば、単一の固体支持体、例えばチップもしくはウェファー、又は粒子支持体）に結合（カップリング）した少なくとも１個の非−標準塩基を有する分子認識配列を含む捕獲オリゴヌクレオチドは、適切なハイブリダイゼーション条件下で試料と接触され、試料中の標的オリゴヌクレオチドが存在する場合にはこれとハイブリダイズする。この標的オリゴヌクレオチドは、捕獲オリゴヌクレオチドの分子認識配列に相補的なタグ付け配列及び検体−特異的配列又は検体−特異的配列の相補配列を含む。標的オリゴヌクレオチドの捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが検出される。
【０００４】
別の態様は、検体−特異的配列をアッセイする別法を提供する。支持体にカップリングしており検体−特異的配列の少なくとも一部と同じ又は相補的である分子認識配列を含む捕獲オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下で、試料と接触され、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。この標的オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の非−標準塩基を含むタグ付け配列並びに検体−特異的配列又は検体−特異的配列の相補配列を含む。この捕獲オリゴヌクレオチドは、鋳型として標的オリゴヌクレオチドを用い酵素的に伸長され、相補的非−標準塩基はタグ配列の非−標準塩基の対向側に取込まれる。レポーター基も、捕獲オリゴヌクレオチドの伸長された部分に取込まれる。標的オリゴヌクレオチドの捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが検出される。
【０００５】
更に別の態様は、検体−特異的配列をアッセイする別法を提供する。検体−特異的配列を有する検体は、第一のプライマー及び第二のプライマーと接触される。第一のプライマーは、タグ配列及び検体の第一の配列に相補的な配列を含む。第二のプライマーは、検体の第二の配列に相補的な配列及び非−標準塩基を含む。これらの第一及び第二のプライマーは、酵素的に伸長され、各々、標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを形成する。標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドの一方は、検体−特異的配列を含み、他方は、検体−特異的配列に相補的な配列を含む。第一のプライマーの伸長は、第二のプライマーの非−標準塩基に遭遇した場合に、実質的に中断される。第二のプライマーの非−標準塩基に相補的な非−標準塩基は、伸長された第一のプライマー中で第二のプライマーの非−標準塩基の対向側に取込まれる。支持体に結合（カップリング）した検体−特異的配列の少なくとも一部と同じ又は相補的である捕獲オリゴヌクレオチド分子認識配列は、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするハイブリダイゼーション条件下で接触され、タグ配列及び検体−特異的配列又はそれらの相補配列を含む標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。標的オリゴヌクレオチドの捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが検出される。
【０００６】
別の態様は、前述の方法を適用するためのキットを含む。このキットは、支持体（複数）及び捕獲オリゴヌクレオチドを含む。これらのキットは、標的オリゴヌクレオチド又は検体から標的オリゴヌクレオチドを作成する成分も含む。このような成分は、例えば、ポリメラーゼ並びに検体の配列に相補的である第一及び第二のプライマーを含み、ここで第一又は第二のプライマーのいずれかは、タグ配列を含む。一部の方法に関して、キットは、取込みのための非−標準塩基又は非−標準塩基のヌクレオチド三リン酸も含む。
【０００７】
前述の本発明の概要は、本発明の明らかにされた各態様又は全ての履行を説明することを意図するものではない。下記の図面及び詳細な説明は、これらの態様をより詳細に例証するものである。
【０００８】
本発明は、様々な修飾型及び変更型に合わせることができるが、それらの詳細は、図面の例により示されかつ詳細に説明されるであろう。しかし、本発明は、説明された特定の態様に限定されるものではないことは理解されなければならない。対して、本発明は、本発明の精神及び範囲内にある全ての修飾、同等物及び変更に及ぶ。
【０００９】
（好ましい態様の詳細な説明）
本出願は、２０００年１０月１４日に出願された米国特許仮出願第６０／２４０，３９７号、２００１年４月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／２８２，８３１号、及び２００１年５月１８日に出願された米国特許出願第０９／８６１，２９２号、及び２００１年５月２２日に出願された米国特許仮出願第６０／２９３，２５９号に関し、これらは全て本願明細書に参照として組入れられている。
【００１０】
本発明は、オリゴヌクレオチドのアッセイ及びアッセイする方法に関する。特に本発明は、１種又は複数の非−標準塩基を用いるオリゴヌクレオチドのアッセイ及びアッセイする方法に関する。本発明はそのように限定されるものではないが、本願明細書に説明された本発明の様々な局面の理解は、下記に示された議論を通じて得られるであろう。非−標準塩基の使用に関する他の関連アッセイ法は、２０００年１０月１４日に出願された米国特許仮出願第６０／２４０，３９７号に開示されている。
【００１１】
本明細書において使用される「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような高分子、又は塩基が塩基対を形成する能力もしくは相補的化学構造とハイブリダイズする能力を有するような化学骨格により接続された塩基として通常称されるいずれかの配列を含む。適当な非−ヌクレオチド性化学骨格は、例えば、ポリアミド骨格及びポリモルホリノ骨格を含む。用語「核酸」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの配列、及びそれらの断片又は一部を含む。この核酸は、例えば、天然の供給源から単離され、組換えにより作出され、または人工的に合成された、どのような適当な形で提供することもでき、一本鎖又は二本鎖であってよく、及びセンス又はアンチセンス鎖を表し得る。
【００１２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、当該技術分野において現在利用可能な技術、例えば、固体支持体核酸合成、ＤＮＡ複製、逆転写、制限酵素切断、ランオフ転写などを用いて調製されるような、一般に短鎖（例えば、長さが約１００ヌクレオチド未満、及び典型的には長さが６〜５０ヌクレオチド）の核酸配列である。このオリゴヌクレオチドの正確なサイズは、典型的には様々な要因によって決まり、これは次に該オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途によって決まるであろう。
【００１３】
「配列」は、ヌクレオチドの方向づけられた配置を意味する。
用語「試料」は、標本又は培養物（例えば、微生物学的培養物）に加え、生物試料、生物学的液体由来の試料、及び非−生物学的給源からの試料を含む。
【００１４】
用語「検体」は、試料中に存在することが疑われる核酸を意味する。この検体は、アッセイの対象である（例えば、アッセイは、試料中の検体の存在、非存在、濃度又は量を決定する）。この検体は、直接的又は間接的にアッセイされる。間接アッセイに関連する少なくとも一部の態様において、試料中に検体が存在するならば、これは鋳型として使用され、例えばＰＣＲ技術を使用し、標的オリゴヌクレオチドを形成する。その後この標的オリゴヌクレオチドは、試料中の検体の存在、非存在、濃度又は量を示すためにアッセイされる。
【００１５】
用語「標的オリゴヌクレオチド」は、アッセイ手順時に実際にアッセイされるオリゴヌクレオチドを意味する。この標的オリゴヌクレオチドは、例えば、検体であることができ、もしくは検体の配列と同じ又は相補的である検体−特異的配列を含むオリゴヌクレオチドであることができる。例えば、標的オリゴヌクレオチドは、検体又は検体の一部のＰＣＲ増幅産物であることができる。
【００１６】
用語「捕獲オリゴヌクレオチド」は、分子認識配列を有し、かつタグ配列又は分子認識配列と相補的な検体特異的配列を有する標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように固体表面に結合（カップリング）したオリゴヌクレオチドを意味し、これにより固体表面上の標的オリゴヌクレオチドが捕獲される。
本願明細書において使用される「分子認識配列」は、タグ配列又は標的オリゴヌクレオチドの検体−特異的配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列である。
【００１７】
本願明細書において使用される用語「相補的」又は「相補性」は、核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド又は標的核酸のようなヌクレオチド配列）に関して使用される場合は、塩基対形成則により関連付けられた配列を意味する。天然の塩基に関して、塩基対形成則は、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）及びクリック（Ｃｒｉｃｋ）により明らかにされたものである。非−標準塩基に関して、本願明細書に説明されたように、塩基対形成則は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成則に類似した方法での水素結合の形成、又は疎水性、エントロピー、又はファンデルワールス力による特異的塩基対形成を意味する。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ」に関して、相補的配列は「Ａ−Ｃ−Ｔ」である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対形成則に従いマッチするような「部分」であることができる。あるいは、核酸間の「完全な」又は「全体の」相補性であることができる。核酸鎖間の相補性の程度は、それらの核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に影響を及ぼす。
【００１８】
用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対形成に関して使用される。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連したハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度（Ｔ_ｍ）、及び核酸内のＧ：Ｃ比のような要因により影響される。
【００１９】
アッセイは、試料が、特定の核酸配列（又はその相補配列）を有する検体を含むかどうかを決定するために行われる。この核酸配列は、「検体−特異的配列」と称されるであろう。少なくとも一部の例において、元々の試料は直接的にはアッセイされない。代わりに、検体が存在するならば、 （例えばＰＣＲ技術により）クローニング又は増幅され、検出可能量の検体−特異的配列を含む標的オリゴヌクレオチドを伴うアッセイ試料が提供される。増幅のための他の技術は、例えば、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ、例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８７：１８７４（１９９０）、これは本願明細書に参照として組入れられている）、鎖置換増幅（ＳＤＡ、例えばＷａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８９：３９２−９６（１９９２）、本明細書に参照として組入れられている）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、例えばＫａｌｉｎら、Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．、２８３：１１９−２３（１９９２）、本明細書に参照として組入れられている）、転写媒介型増幅（ＴＭＡ、例えば、Ｌａ Ｒｏｃｃｏら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｈｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、１３：７２６−３１（１９９４）、本明細書に参照として組入れられている）、及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ、例えばＬｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、１９：２２５−３２（１９９８）、本明細書に参照として組入れられている）がある。少なくとも標的オリゴヌクレオチドの一部は、典型的には、ａ）検体、ｂ）検体の一部、ｃ）検体の相補物、又はｄ）検体の一部の相補物のいずれかに相当している。このアッセイによる標的オリゴヌクレオチドの検出は、当初の試料中の検体の存在を示している。
【００２０】
一般に、１種又は複数の検体−特異的配列を検出するためのアッセイシステムは、固体支持体（例えば、チップ、ウェファー、又は固体粒子の集合体）を含む。捕獲オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に、捕獲オリゴヌクレオチドの同定を（例えば、チップ又はウェファー上の位置により、もしくは特定の捕獲オリゴヌクレオチドが付着した粒子の固有の特性により）可能にする方法で配置されている。この捕獲オリゴヌクレオチドは、分子認識配列を含む。異なる分子認識配列を伴う異なる捕獲オリゴヌクレオチドを使用し、異なる検体−特異的配列が検出される。これらの異なる捕獲オリゴヌクレオチドを使用し、単独のアッセイシステムが試料を複数の検体−特異的配列について分析するように設計することができる。
【００２１】
検体−特異的配列を含む標的オリゴヌクレオチドは、捕獲オリゴヌクレオチドと接触させられる。検体−特異的配列に加え、標的オリゴヌクレオチドは、更に各々タグ配列を含む。特定のタグ配列は、各検体−特異的配列に会合されている。一般にこのタグ配列は、分子認識配列のひとつと相補的である。従ってハイブリダイゼーション条件下で、この標的オリゴヌクレオチドは、適当な捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。あるいは、本発明のある方法において、この検体−特異的配列は、分子認識配列のひとつに相補的であることができる。
【００２２】
標的オリゴヌクレオチド又はその相補物は、典型的にはレポーター又はレポーターの付着のためのカップリング剤を含む。特定の捕獲オリゴヌクレオチドと関連したレポーターの存在又は非存在を決定するための固体支持体の観察は、特定の検体−特異的配列が試料中に存在するかどうかの指標である。適当なレポーターは、ビオチン、蛍光色素、化学発光体、ジゴキシゲニン、スピン標識、放射性標識、ＤＮＡ切断部分、発色団又は発蛍光団を含むが、これらに限定されるものではない。適当なカップリング部分の例は、アミン、チオール、ヒドロシン（ｈｙｄｒｏｓｉｎｅ）、アルコール又はアルキル基を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
適当なアッセイシステムの例は、図２Ａ及び２Ｂに概略的に示されている。これらのアッセイにおいて、捕獲オリゴヌクレオチド１００ａ、１００ｂは、例えば、単独の固形基体１２０ａ（例えばチップ又はウェファー）、又は多くの固体粒子１２０ｂのような固体支持体１２０にカップリングしている。典型的には、少なくとも１種の捕獲オリゴヌクレオチド（例えば、捕獲オリゴヌクレオチド１００ａ）は、標的オリゴヌクレオチド１１０のタグ配列１１２と相補的である分子認識配列１０２を有し、その結果ハイブリダイゼーション条件下で、標的オリゴヌクレオチド１１０は捕獲オリゴヌクレオチド１００ａにハイブリダイズする。
【００２４】
アッセイは、全体的に（ｇｌｏｂａｌ）同じ分子認識配列を有する捕獲オリゴヌクレオチドの全てにより調製することができるが、典型的には捕獲オリゴヌクレオチド１００ａ、１００ｂの２種以上の異なる群が使用される。捕獲オリゴヌクレオチドの各群は、異なる分子認識配列を有する。単独の固形基体上で、捕獲オリゴヌクレオチドの各群は、典型的には基体の特定の１個又は複数の領域上に配置され、その結果、この領域（複数）は、特定の分子認識配列に会合される。粒子支持体が使用される場合、捕獲オリゴヌクレオチド１００ａ、１００ｂの各群は、固有の特性を有する粒子１２０ｂ、１２０ｃの少なくともひとつの群に配置され、その結果、特定の粒子の捕獲オリゴヌクレオチドは、それが付着された粒子の特性から決定される。このようなアッセイを使用し、例えば、ａ）異なる捕獲オリゴヌクレオチド（及び基体の異なる領域又は粒子の異なる群）の各アレルとの会合による、どのアレルが試料中に存在するかの決定、ｂ）複数の関連した又は関連していないオリゴヌクレオチドのアッセイ、もしくはｃ）両方を行うことができる。図２Ａ及び２Ｂに例示されたように、標的オリゴヌクレオチドは、優先的に対応する捕獲オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、単独の支持体の特定の空間的位置での（図２Ａ）又は粒子の特定の群への付着（図２Ｂ）により、標的オリゴヌクレオチドの存在又は非存在を観察することにより、検体−特異的配列の存在又は非存在の決定を可能にする。
【００２５】
アッセイシステムの追加の成分は、以下に説明したような、標的オリゴヌクレオチド１１０（又はその相補物１２０）に連結しているレポーター１３０である。このレポーター１３０は、標的オリゴヌクレオチドの存在又は濃度を示すために検出技術（例えば、比色、蛍光発光、電気泳動、電気化学、分光光度、クロマトグラフィー、デンシトメトリー又は放射線技術）によりその後検出されるアッセイの成分である。レポーターは、典型的には検出技術（例えば、蛍光技術のための発蛍光レポーター及び放射線技術のための放射性標識）により決定されるであろう。
【００２６】
一部のアッセイにおいて、捕獲オリゴヌクレオチド及び標的オリゴヌクレオチドの一方又は両方が、少なくとも１種の非−標準塩基を含む。非−標準塩基（複数）の使用は、ハイブリダイゼーションを含むアッセイの特異性を向上することができ、その理由は、非−標準塩基は優先的に他の相補的非−標準塩基とハイブリダイズするからである。より長いオリゴヌクレオチドの使用も、特異的ハイブリダイゼーション速度を増大することができる。核酸のハイブリダイゼーションは、一般に、完全な相補性のための約３〜４個の塩基のサンプリングを含む。これらは核形成部位（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を形成する。核形成部位が認められる場合は、ハイブリダイゼーションが鎖の下流へと進む。鎖の下流の塩基が相補的でないならば、その結果これらの２本の鎖は離れる。この核形成プロセスは時間がかかるので、非−標準塩基が使用される場合の核形成部位を発見する可能性は低下し、これにより完全な相補配列を発見するのに必要なサンプリング工程の数が減少する。
【００２７】
あるいは、非−標準塩基は、他の非−標準塩基の配列への追加（例えば、ＰＣＲ技術の使用）を指示するために使用される。追加された非−標準塩基は、レポーター、又はレポーターが付着することができ、これにより標的オリゴヌクレオチドの検出のためのレポーター基の高度に選択的な取込みを可能にするカップリング剤を含み得る。
【００２８】
オリゴヌクレオチド及び塩基
ＤＮＡ及びＲＮＡは、各々、デオキシリボース又はリボースを含むオリゴヌクレオチドであり、ホスホジエステル結合により結合している。デオキシリボース及びリボースの各々は、糖に結合した塩基を含む。天然のＤＮＡ及びＲＮＡに取込まれた塩基は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、及びウリジン（Ｕ）である。これらの５種の塩基は「天然塩基」である。Ｗａｔｓｏｎ及びＣｒｉｃｋにより精巧に作り出された塩基対形成則に従い、これらの天然塩基はハイブリダイズし、プリン−ピリミジン塩基対を形成することができ、ここでＧはＣと対形成し、かつＡはＴ又はＵと対形成する。これらの対形成法則は、オリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションを促進する。
【００２９】
天然塩基によるこれらの塩基対の形成は、各塩基対の２個の塩基の間の２又は３個の水素結合の形成により促進される。これらの塩基の各々は、２又は３個の水素結合ドナー（複数）及び水素結合アクセプター（複数）を含む。塩基対の水素結合は、各々、ひとつの塩基上の少なくとも１個の水素結合ドナーの他方の塩基上の水素結合アクセプターとの相互作用により形成される。水素結合ドナーは、例えば、付着した水素を少なくとも１個有するヘテロ原子（例えば、酸素、窒素）を含む。水素結合アクセプターは、例えば、孤立電子対を有するヘテロ原子（例えば、酸素又は窒素）を含む。
【００３０】
天然塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵは、非水素結合部位での置換により誘導体化され、修飾された天然塩基を形成することができる。例えば、天然塩基は、反応性官能基（例えば、チオール、ヒドラジン、アルコール又はアミン）の塩基の非−水素結合原子へのカップリングによる、支持体への付着のために誘導体化される。別の可能性のある置換基は、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基、及びアルキル基（例えば、メチル又はエチル）である。
【００３１】
水素−結合塩基対を形成する非−標準塩基は、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、第５，９６５，３６４号、第６，００１，９８３号、及び第６，０３７，１２０号、並びに米国特許出願第０８／７７５，４０１号に開示されているように構築することもでき、これらは全て本願明細書に参照として組入れられている。「非−標準塩基」は、オリゴヌクレオチドへ組込まれやすく、かつ水素結合、又は相補的塩基と塩基対を形成する疎水性、エントロピー性、もしくはファンデルワールス相互作用による塩基対形成が可能である、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵ以外の塩基を意味する。図１は、適当な塩基及びそれが対応する塩基対のいくつかの例を例示している。これらの塩基対の具体的例は、塩基対組合せ（イソ−Ｃ／イソ−Ｇ、Ｋ／Ｘ、Ｈ／Ｊ、及びＭ／Ｎ）中の下記の塩基を含む：
【００３２】
【化１】

（式中、Ａは、糖又はポリマー骨格の他の部分が結合した点であり、Ｒは、Ｈ又は置換もしくは未置換のアルキル基である。）。
【００３３】
水素結合を利用する他の非−標準塩基を使用することができ、更には先に定義された非−標準塩基をこれらの塩基の非−水素結合原子での官能基取込みにより修飾することができることも認められるであろう。図の３から９においてこれらの非−標準塩基を示すために、下記の記号を使用する：Ｘはイソ−Ｃを表し、Ｙはイソ−Ｇを表す。
【００３４】
これらの非−標準塩基対の水素結合は、天然塩基のものに類似しており、２又は３個の水素結合が、対形成している非−標準塩基の水素結合アクセプター及び水素結合ドナーの間に形成される。天然塩基とこれらの非−標準塩基との間の差異のひとつは、水素結合アクセプター及び水素結合ドナーの数及び位置である。例えば、シトシンはドナー／アクセプター／アクセプター塩基であり、グアニンは相補的アクセプター／ドナー／ドナー塩基であると考えることができる。本願明細書に参照として組入れられている米国特許第６，０３７，１２０号に開示されたように、イソ−Ｃは、アクセプター／アクセプター／ドナー塩基であり、かつイソ−Ｇは相補的ドナー／ドナー／アクセプター塩基である。
【００３５】
オリゴヌクレオチドにおける使用のための他の非−標準塩基は、例えば、ナフタレン、フェナントレン及びピレンの誘導体を含み、これらは例としてＲｅｎらの論文（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１１８：１６７１（１９９６））及びＭｃＭｉｎｎらの論文（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１２１：１１５８５（１９９９））に記載され、これらは本願明細書に参照として組入れられている。これらの塩基は、安定化のためには水素結合を利用しないが、代わりに疎水性、エントロピー性、又はファンデルワールス相互作用に頼って、塩基対を形成する。
【００３６】
固体支持体
このアッセイは、少なくとも一部は、固体支持体を用いて行われる。一般に、捕獲オリゴヌクレオチドは、支持体の表面に結合されるか、さもなければその上に配置される。多種多様な支持体を使用することができる。一部の態様において、固体支持体は、チップもしくはウェファーのような単独の固体支持体、又はチューブ、円錐もしくは他の商品の内面もしくは外面である。固体支持体は、適当な材料から二次加工し、安定性、寸法、形状、及び表面の平滑度などの望ましい特性の最適な組合せを提供することができる。好ましい材料は、核酸ハイブリダイゼーションとは干渉せず、かつ多量の核酸の非−特異的結合を受けない。適当な材料は、生物的又は非生物的、有機又は無機の材料である。例えば、マスターアレイは、いずれか適当なプラスチック又はポリマー、シリコーン、ガラス、セラミック、又は金属から二次加工することができ、かつ固体、樹脂、ゲル、硬質フィルム、又は柔軟な膜の形状で提供することができる。適当なポリマーは、例えば、ポリスチレン、ポリ（アルキル）メタクリレート、ポリ（ビニルベンゾフェノン）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデンなどである。好ましい材料は、ポリスチレン、ガラス及びシリコーンを含む。
【００３７】
一部の態様において、図３に示されたように、単独固体支持体３００は、各領域内の支持体上に配置された捕獲オリゴヌクレオチドを伴う個別の領域３１０に分割されている。各領域又は各粒子支持体において、捕獲オリゴヌクレオチドは、優先的に（例えば、少なくとも７５％）同じ分子認識配列を有する。好ましくは、捕獲オリゴヌクレオチドの実質的に全て（例えば、少なくとも９０％及びより好ましくは、少なくとも９９％）は、各領域内又は各粒子支持体上に同じ分子認識配列を有する。異なる領域の捕獲オリゴヌクレオチドは、典型的には異なる配列を有するが、一部の例においては、同じ捕獲オリゴヌクレオチドが、例えば対照又は結果の検証として、２個以上の領域において使用することができる。
【００３８】
異なる領域を備えた固体支持体は、試料を試験しかつ多くの異なる検体−特異的配列の存在又は非存在を決定するために規則的又は不規則的アレイを形成することができる。例えば、アレイは、１０、１００、１０００種又はそれ以上の異なる検体−特異的配列を試験するために形成することができる。
【００３９】
固体支持体の寸法は、領域の所望の数及びアッセイされるべき検体−特異的配列の数のような要因を基に決定される。例として、固体支持体は、長さ約０．５ｃｍ〜約７．５ｃｍ及び幅約０．５ｃｍ〜約７．５ｃｍの平面寸法で供することができる。固体支持体は、顕微鏡スライド（例えば、約７．５ｃｍ ｘ 約２．５ｃｍの寸法）のような、他の支持体上に単独又は複数で位置することもできる。固体支持体の寸法は、具体的用途に容易に適合することができる。
【００４０】
他の種類の固体支持体を使用することができる。一部の態様において、固体支持体は粒状支持体である。これらの態様において、捕獲オリゴヌクレオチドは、粒子に結合（カップリング）している。典型的には、これらの粒子は、各群内の粒子が、これらの粒子を他の群の粒子から識別又は分離するために使用することができる、例えば、色、蛍光度数（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、密度、サイズ又は形状のような、特定の特性を有する群を形成している。好ましくは、これらの粒子は、例えばフローサイトメトリーのような技術を用い分離することができる。
【００４１】
本発明において考案されるように、これらの粒子は、実質的に不溶性又は固体材料から二次加工される。例えば、これらの粒子は、シリカゲル、ガラス、ナイロン、樹脂、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（登録商標）、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（登録商標）、セルロース、磁気材料、金属（例えば、鋼鉄、金、銀、アルミニウム、銅もしくは合金）又は金属−塗装された材料、プラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）など、並びにそれらの組合せから二次加工することができる。適当なミクロ−ビーズの例は、例えば、米国特許第５，７３６，３３０号、第６，０４６，８０７号、及び第６，０５７，１０７号などに開示されており、これらは全て本願明細書に参照として組入れられている。適当な粒子の例は、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ社（オースチン、ＴＸ）から入手可能である。
【００４２】
ひとつの態様において、会合された捕獲オリゴヌクレオチドを備えた特定の支持体は、例えば、バイアル、チューブ又はウェルのようなホルダー内に配置される。標的オリゴヌクレオチドは、このホルダーに添加され、アッセイがハイブリダイゼーション条件下で実行される。その後特定の支持体は、支持体各群の固有の特徴を基に分離される。その後支持体の群が、どの支持体（複数）が、付着された標的オリゴヌクレオチドを有するかを決定するために研究される。場合により、支持体は、クロス−ハイブリダイゼーションの作用を低下するために洗滌することができる。１回又は複数回の洗滌を、以下に説明されるようにストリンジェンシーの同じ又は異なるレベルで行うことができる。別の選択肢として、支持体（複数）及び捕獲オリゴヌクレオチドの接触前に、標的オリゴヌクレオチドを含有する溶液には、増幅されないプライマーを除去するため又は標的オリゴヌクレオチドと同じサイズでない他の材料を除去するために、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、示差沈殿、スピンカラム、又はフィルターカラムが施される。
【００４３】
一部の態様において、マルチホルダー（例えば、バイアル、チューブなど）は、複数の試料をアッセイするため又は各ホルダー内に捕獲オリゴヌクレオチド（及び会合された支持体）の異なる組合せを有するために使用される。別の選択肢として、各ホルダーが捕獲オリゴヌクレオチド（及び会合された支持体）の単一の型を含んでもよい。
【００４４】
別の例として、支持体は、場合により、互いに結合している個別の支持体表面の群であることができる。例えば、この支持体は、個別の光ファイバー又は異なる捕獲オリゴヌクレオチドに個別に結合された他の支持体メンバーを含むことができ、その後互いに結合され、単独の商品、例えばマトリックスを形成する。
【００４５】
典型的には、支持体（単独又は粒状支持体）は、本願明細書に記された目的を実現するのに十分に安定した方法で、捕獲オリゴヌクレオチドの支持体表面への結合又はさもなければ保持することが可能である。このような結合は、例えば支持体と捕獲オリゴヌクレオチドの間の共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、又はファンデルワールス結合、又は正もしくは負に帯電した支持体への誘引を含む。捕獲オリゴヌクレオチドは、固体支持体表面へ直接又はリンカーを介して付着される。ある態様において、捕獲オリゴヌクレオチドは、、表面、オリゴヌクレオチドのいずれか、又は両方に１種又は複数の反応基を提供する、又は誘導体化することにより、支持体表面に直接付着される。例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）粒子の表面は、例えばカルボキシレート、マレイミド、又はヒドラジド官能性により修飾することができ、又はアビジン及びガラス表面は、例えばシラン又はアルデヒド（ＤＮＡとのシッフ塩基アルデヒド−アミンの連結を形成）により処理することができる。一部の態様において、支持体又は支持体上に付着された材料（例えば、支持体上のコーティングなど）は、捕獲オリゴヌクレオチド上の反応性官能基と連結することができる反応官能基を含む。例として、支持体は、官能基化することができる（例えば、反応性に官能基化された金属又はポリマー表面）か又は官能基を含む（例えばペンダント官能基を伴うポリマー）ことができ、捕獲オリゴヌクレオチドを連結する部位を提供する。
【００４６】
別法として、捕獲オリゴヌクレオチドは、捕獲オリゴヌクレオチドの架橋により表面上に維持することができる。好ましくは、架橋された捕獲オリゴヌクレオチドは、架橋部分及び捕獲部分を含み、ここで捕獲部分は、標的オリゴヌクレオチドのタグ配列にハイブリダイズする分子認識配列を含む。
【００４７】
更に別の選択肢として、本支持体は、ストレプトアビジン、抗体、抗原、酵素、補酵素又はインヒビター、ホルモン又はホルモン受容体などのカップリング（結合）剤により、部分的に又は完全に被覆することができる。このカップリング剤は、典型的には共有結合又は非−共有結合を介して、別の分子又は巨大分子との高い親和性を有する生体分子又は合成分子である。捕獲オリゴヌクレオチドは、カップリング剤の相補物（例えば、ビオチン、抗原、抗体、補酵素又はインヒビター、酵素、ホルモン受容体、又はホルモン）に結合している。その後捕獲オリゴヌクレオチドはカップリング剤と接触され、支持体上に捕獲オリゴヌクレオチドを保持する。他の公知のカップリング技術を、本願明細書において説明されたシステム及び方法において容易に適合及び使用することができる。
【００４８】
捕獲及び標的オリゴヌクレオチド
捕獲オリゴヌクレオチドは、相補的タグ配列を有する標的オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションにより、捕獲することができる分子認識配列を含む。捕獲オリゴヌクレオチドの分子認識配列及び標的オリゴヌクレオチドのタグ配列のハイブリダイゼーションは、標的オリゴヌクレオチドの固体支持体への連結を生じる。分子認識配列及びタグ配列は、特定の検体−特異的配列（同じく標的オリゴヌクレオチドの一部）と会合され、従って、ハイブリダイゼーションが生じる場合は、検体−特異的配列（又はその相補物）による元々の試料中の検体の存在又は濃度の指標となる。
【００４９】
コード配列及びタグ配列は、典型的には、少なくとも６個のヌクレオチドを含み、場合によっては、少なくとも８、１０、１５、もしくは２０個又はそれ以上のヌクレオチドを含む。一部のアッセイにおいて、以下に説明されるように、分子認識配列及びタグ配列は、１種又は複数の非−標準塩基を含む。別のアッセイにおいて、分子認識配列及びタグ配列は、非−標準塩基を含まない。
【００５０】
捕獲オリゴヌクレオチドは更に、典型的には捕獲オリゴヌクレオチドの固体支持体への結合を可能にする官能基、又は固体支持体上のもしくはそこから伸びた官能基を含む。この官能基は、直接ポリマー骨格に付着することができるか、又はヌクレオチド配列の塩基に付着することができる。別法として、捕獲オリゴヌクレオチドは、前述のように、架橋を促進するために、架橋部分を含むことができるか、又は静電気的にその表面上に保持することができる。この捕獲オリゴヌクレオチドは、例えば、固相合成、ＤＮＡ複製、逆転写、制限消化、ランオフ転写などを含む、様々な技術により形成することができる。
【００５１】
タグ配列に加え、標的オリゴヌクレオチドは、検体中の関心のある配列に相当する又は配列に対し相補的である検体−特異的配列を含む。この検体−特異的配列は、タグ配列から独立であってよいが、タグ配列の一部もしくは全てが、体−特異的配列の一部であってもよい。
【００５２】
この捕獲オリゴヌクレオチドの長さは、望ましいハイブリダイゼーション強度及び速度論のために最適化することができる。通常分子認識配列の長さは、６〜２０（好ましくは、８〜１２）個のヌクレオチド範囲である。好ましい態様において、捕獲オリゴヌクレオチドの異なる分子認識配列は、互いに相補的ではなく、より好ましくは、試験される試料中に実質的量で存在する可能性が顕著であるいかなる公知の天然の遺伝子配列又は遺伝子断片に対して相補的ではない。結果的に、捕獲オリゴヌクレオチドの捕獲分子認識配列は、標的オリゴヌクレオチドの各相補的タグ配列に対し主にハイブリダイズするであろう。
【００５３】
この標的オリゴヌクレオチド（又は、標的オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチド）は、レポーター又はレポーターの付着のためのカップリング剤を含む。このレポーター又はカップリング剤は、ポリマー骨格又は標的もしくは相補的オリゴヌクレオチドのいずれかの塩基に付着することができる。レポーター基をヌクレオチド塩基（天然塩基及び非−標準塩基の両方）に付着させる技術は、公知である。レポーター基の例は、ビオチン、ジゴキシゲニン、スピン標識基、放射性標識基、ＤＮＡ−切断部分、発色団、及びフルオレセインのような発蛍光団を含む。カップリング剤の例は、ビオチン又は反応性官能基を含む置換基である。その後レポーター基は、ストレプトアビジンに付着するように提供されるか、又はレポーター基を標的又は相補的オリゴヌクレオチドへ結合するために、カップリング剤と相互作用する反応性官能基を含む。
【００５４】
ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ） 技術
様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が公知であり、かつ以下に説明されたアッセイにおいて使用することができる。ＰＣＲ技術は、典型的には、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部の増幅に使用される。検体−特異的配列の存在について試験される試料は、第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマー；核酸ポリメラーゼ；及び、ＰＣＲ時に添加されるヌクレオチドに対応するヌクレオチド三リン酸と接触される。天然塩基のヌクレオチド三リン酸は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰを含む。非−標準塩基のヌクレオシド三リン酸も、望ましい又は必要な場合は添加することができる。ＰＣＲに適したポリメラーゼは公知であり、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）、及びＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ （Ｔｔｈ）を含むが、これらに限定されるものではないＴｈｅｒｍｕｓ種の未変性及び変性したポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼ、更にはＤＮＡポリメラーゼＩ及びＨＩＶ−１ポリメラーゼのクレノウ断片を含む。
【００５５】
前述の第一及び第二のプライマーは、増幅されるべき二本鎖オリゴヌクレオチドの異なる鎖の異なる部分に相補的である。この増幅されるオリゴヌクレオチドの配列は、検体にハイブリダイズする２種のプライマー配列及びこれら２種のプライマー間の領域を含む。これらのプライマーは、例えば、固相合成、ＤＮＡ複製、逆転写、制限酵素消化、ラン−オフ転写などを含む、様々な技術により形成することができる。
【００５６】
ＰＣＲは、（ｉ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを、増幅される二本鎖オリゴヌクレオチド又は先にサイクリングにより形成された伸長産物にアニーリングする工程；（ｉｉ）核酸ポリメラーゼによりアニーリングされた第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、プライマー伸長産物を合成する工程；及び、（ｉｉｉ）これらの産物を変性し、一本鎖核酸を得る工程である繰り返し工程を含む。様々なＰＣＲが、これらの工程の修飾又は条件（例えば、時間及び温度）の変更により開発されている。概して、これらの様々なＰＣＲのいずれかを、以下に説明したアッセイにおいて使用することができるが、一部は、特定のアッセイについて他のものよりもより有用であろう。
【００５７】
以下に説明されたいくつかのアッセイについて開発された様々なＰＣＲのひとつは、「ファストショット（ｆａｓｔ−ｓｈｏｔ）ＰＣＲ」であり、これはプライマー伸長時間が短縮又は排除される。本願明細書において使用されるように、用語「ファストショットポリメラーゼ連鎖反応」又は「ファストショットＰＣＲ」は、伸長滞留、ぷおよび、アニーリング工程及び融解工程のための停滞が非常に短時間であるか又は排除されるＰＣＲを意味する。この方法のためには、典型的には、２種のプライマーの３’末端は鋳型核酸上で１０を超えない塩基により隔てられる。
【００５８】
増強された特異性は、伸長滞留、および、アニーリング工程及び融解工程のための停滞が非常に短時間であるか又は排除されるようなファストショットＰＣＲサイクルを用いて達成される。一つの態様において、ＰＣＲ溶液は、約９０〜１００℃で、及び約５５〜６５℃で迅速にサイクリングされ、各温度で最大約１秒間維持され、その結果、ポリメラーゼがミスマッチプライマーを伸長するにはほとんど時間がない。ある態様において、この反応は、約９５℃〜約５８℃で、各温度で約１秒維持し、サイクリングされる。
【００５９】
この迅速なサイクリングは、一般に、第一及び第二のプライマーの３’塩基間の鋳型核酸上に約０〜１０塩基ギャップを残すことによる、短いＰＣＲ産物の作成により容易となる。好ましくは、これらのプライマーは、およそ５５〜６０℃のＴｍを有するように設計される。一部の態様について、３０と少ない標的オリゴヌクレオチドを検出するためには、典型的には合計約３７サイクルが適している。
【００６０】
アレル特異的ＰＣＲプライマーは、ＳＮＰ（一塩基多型）と他のアレルを識別するために使用することができる。ＳＮＰ検出のためには、これらのプライマーは、関心のある多型塩基は、第一又は第二のプライマーの３’末端に、又はその近傍（典型的には、３〜５塩基以内）に位置するように、各アレルに対して相補的であるように設計される。高レベルのアレル識別は、一部、標的ＤＮＡとの、すなわちプライマーが特異的でない対応するアレルとのその３’末端にヌクレオチドミスマッチを有するプライマーを伸長するＴａｑポリメラーゼの能力の制限により実現される。その他のポリメラーゼも使用することができる。
【００６１】
さらに、アレル識別はアレル特異的プライマーの別の位置にミスマッチを配置することにより得ることができる。これらのプライマー内のヌクレオチドミスマッチの別の位置を使用し、２種の基本的方法で選択的増幅を実現することができる：１） サーマルサイクリング時に鋳型ＤＮＡとハイブリダイズしないように単にプライマーのＴ_ｍ（融解温度）を低下させ、このポリメラーゼはプライマーを伸長することができないようにすることにより、もしくは、２）このポリメラーゼが伸長しないような好ましくないプライマー／鋳型構造を作成することによる。
【００６２】
アッセイ例
コード配列及びタグ配列中の非 − 標準塩基によるアッセイ
図４に示されたあるアッセイにおいて、捕獲オリゴヌクレオチド２０２の２種以上の群が調製される。各群の捕獲オリゴヌクレオチド２０２は、固有の分子認識配列２０４を含む。各群の分子認識配列は、少なくとも１種（及び、典型的には、２種又はそれ以上）の非−標準塩基（図中では破線を用いて示した）を含む。非−標準塩基の使用は、捕獲オリゴヌクレオチドが天然塩基のみを含む配列とハイブリダイズする可能性を実質的に低下させる。これは、典型的には、天然塩基のみを伴うオリゴヌクレオチドを用いる同様のアッセイと比較した場合に、より少ない非−特異的ハイブリダイゼーションを生じる。また、この捕獲オリゴヌクレオチドは、典型的には固体支持体２０６への付着のための反応性官能基も含むが、前述のように、他の付着法を使用することもできる。
【００６３】
このアッセイのための支持体は、例えば、単独の固体支持体、例えばガラス、金属、プラスチック、又は無機チップなどであることができる。捕獲オリゴヌクレオチドは、この支持体上に配置され、かつ典型的には前述の方法（例えば、捕獲オリゴヌクレオチド及び支持体上の反応基を介した連結、支持体上に配置された結合剤の使用、又は捕獲オリゴヌクレオチドの架橋）のひとつにより保持される。これらの基の各々は、固体支持体の１種又は複数の固有の領域に配置され、その結果これらの領域（複数）は、特定の捕獲オリゴヌクレオチドと会合することができる。
【００６４】
別の態様（示さず）において、アッセイのための支持体は、粒状支持体（例えば、ビーズ）である。本願明細書において説明されたアッセイのいずれかは、単独の固体支持体上、粒状支持体上、又はいずれか他の支持体上で行うことができることは理解されるであろう。粒状支持体は、粒子の群に分割され、各粒子群は、その粒子群を他の群から識別する特徴（例えば、色、形状、サイズ、密度、又は他の化学的もしくは物理的特性）を有する。捕獲オリゴヌクレオチドの各群は、１種又は複数の粒子群に連結される。これは、特定粒子群の特定捕獲オリゴヌクレオチド群との会合を生じ、固有の粒子支持体特性を観察することにより捕獲オリゴヌクレオチドの決定を可能にする。
【００６５】
図４に戻り、標的オリゴヌクレオチド２０８が、アッセイされる試料中に存在する場合は、これは、検体−特異的配列２１０及び捕獲オリゴヌクレオチド２０２の１群の分子認識配列２０４と相補的なタグ付け配列２１２を含む。タグ配列２１２は、少なくとも１個の非−標準塩基を含み；さもなければ、タグ配列は、捕獲オリゴヌクレオチドの分子認識配列とは相補的ではないであろう。標的オリゴヌクレオチド２０８の一部と相補的なオリゴヌクレオチド２１４は、レポーター２１６又はレポーターの付着のためのカップリング剤（図示せず）を含む。
【００６６】
標的オリゴヌクレオチド２０８及び相補的オリゴヌクレオチド２１４は、例えば、検体−特異的配列又はその相補配列を含む検体のＰＣＲ増幅により形成することができる。ＰＣＲ増幅において、２種の異なるプライマーが使用される（図４のＢに図示されたように）。第一のプライマー２１８は、検体２２０の第一鎖上の第一の配列に相補的な配列を含む。第二のプライマー２２２は、第一の配列の上流又は下流である検体２２０の第二鎖上の第二の配列に相補的な配列を含む。検体−特異的配列は、典型的には、これらのプライマーがハイブリダイズする配列（又は相補配列）の間に伸長し、及びこれらを含む検体の配列を含む。第一のプライマー２１８は、タグ配列２１２を含み、及び第二のプライマー２２２は、レポーター２１６（又は、レポーターのカップリング剤）を含む。第一及び第二のプライマーの伸長並びに増幅は、公知のＰＣＲ増幅技術又は前述のファストショットＰＣＲ技術を使用し進行し、標的オリゴヌクレオチド２０８及び相補的オリゴヌクレオチド２１４（図４のＣに図示されたように）を生成する。例えば、固相合成、ＤＮＡ複製、逆転写などのようなその他の公知の合成法を使用し、標的及び相補的オリゴヌクレオチドを形成することができる。
【００６７】
前記アッセイに戻り、標的オリゴヌクレオチド２０８は、典型的には、捕獲オリゴヌクレオチド２０２が結合した支持体２０６（又は粒状支持体を保持する容器）と接触させられる。適当な捕獲オリゴヌクレオチドが支持体上に存在する場合、標的オリゴヌクレオチドのタグ配列と捕獲オリゴヌクレオチドの相補的分子認識配列との選択的ハイブリダイゼーションが促進されるように条件が制御される（図４のＤに図示されたように）。レポーターも、相補的オリゴヌクレオチド２１４への連結のために添加される（相補的オリゴヌクレオチド２１４が既にレポーターを含まない限り）。場合により、取込まれていないプライマーは、ハイブリダイゼーション前に、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、示差沈殿、スピンカラム、又はフィルターカラムなどのような技術により、ハイブリダイゼーション後に、洗滌により、除去することができる。
【００６８】
平板固体支持体上でのアッセイについて、アッセイは、レポーター基が、支持体上の個別の領域の各々に存在するかどうかを決定することにより、判定することができる。レポーター基の存在は、当初の試料が、支持体のその領域に関する特定のタグ付け配列及び分子認識配列と会合された検体−特異的配列を有する検体を含有することの指標である。レポーター基が存在しないこと、試料が、特定の検体−特異的配列を有する検体を含まないことを示唆している。
【００６９】
粒子の支持体についてのアッセイのためには、これらの粒子は、固有の特性に従い分離され、その後どの粒子が、捕獲オリゴヌクレオチド及び標的オリゴヌクレオチドを介して粒子へ連結されたレポーターを有するかが決定される。分離を実現する技術は、例えば、フローサイトメトリーを含む。レポーター基の存在は、試料が、特定のタグ配列及び、特定の捕獲オリゴヌクレオチドの分子認識配列と会合した検体−特異的配列を有する標的オリゴヌクレオチドを含むことを示している。
【００７０】
図４に図示したアッセイは、試料中のアレルの存在の決定において使用するために適合させることができる。例えば、このアッセイは、２種又はそれ以上のアレルに対応するアレル−特異的プライマー（第一もしくは第二のプライマー２１８、２２２のいずれか又は両方）を含む。各アレル−特異的プライマーは、ただひとつのアレルへ特異的にハイブリダイズする配列を含む。アレル−特異的プライマーに付着したタグ配列又はレポーター（又はカップリング剤）も、アレルに特異的である。アレルが試料中に存在する場合、そのアレルに会合されたアレル−特異的プライマー（複数）は伸長し、かつ支持体上の相補的アレル−特異的捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション、又はアレル−特異的レポーター基の観察のいずれかにより、検出されるであろう。このアッセイは、検体中の非−アレル性検体−特異的配列の存在又は非存在の決定にも使用することができることは認められるであろう。
【００７１】
本方法は、ＳＮＰ（一塩基多型）アレルを検出するために使用することができる。第一又は第二のプライマーのいずれかは、ＳＮＰ−特異的であろう。典型的には、２種（又はそれ以上）の異なるＳＮＰ−特異的プライマーが、このアッセイにおいて使用される。好ましくは、ＳＮＰ−特異的プライマーは、プライマーの伸長可能な末端に位置した又はその近傍（例えば、３又は５塩基以内）であるＳＮＰ部位を有するであろう。「ファストショットＰＣＲ」技術は、このＳＮＰアッセイにおいて有用であることができ、その理由は短い伸長時間は、非−相補的プライマーが伸長する見込みを実質的に低下するからである。
【００７２】
捕獲オリゴヌクレオチド及び標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、本願明細書に記したアッセイの特徴である。このハイブリダイゼーションは、多くの従来型ハイブリダイゼーション法において使用されるような、塩（例えば、ナトリウム塩又はマグネシウム塩）、緩衝液（例えば、ＴＲＩＳ、ＴＡＰＳ、ＢＩＣＩＮＥ、又はＭＯＰ）、非−特異的阻害剤（例えば、ＳＤＳ、ＢＳＡ、又は剪断したゲノムＤＮＡ）、及び保護剤（例えば、ＥＤＴＡ又はアザイド）を含有するハイブリダイゼーション混合液中で行われる。典型的には、このハイブリダイゼーションは、ナトリウムイオン（又は他のカチオン）濃度が少なくとも０．０１〜１．０Ｍ及びｐＨが７．０〜８．３で行われる。一般に、このハイブリダイゼーション及びいずれかの洗浄工程は、ハイブリダイゼーションを維持するための所望のストリンジェンシー条件に合致する温度及び塩濃度で実行される。ストリンジェンシー条件は、配列依存性である。望ましいならば、ストリンジェンシー条件の段階的増加を数回の洗滌工程にわたって使用することができる。
【００７３】
「低ストリンジェンシー条件」は、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔ_ｍ）よりも約１０〜１５℃低く選択される。Ｔ_ｍは、タグ配列の約５０％が平衡状態で相補的分子認識配列にハイブリダイズするような温度（イオン強度、ｐＨ及び核酸濃度）である。
「中ストリンジェンシー条件」は、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔ_ｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。
「高ストリンジェンシー条件」は、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度及びｐＨでの特異的配列の熱融解温度（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低く選択される。
【００７４】
図５に図示した別のアッセイにおいて、２種又はそれ以上の捕獲オリゴヌクレオチド２５２の群が調製され、かつ図５のＡに図示されたように、支持体２５６上に配置される。捕獲オリゴヌクレオチド２５２の各群は、固有の分子認識配列２５４を含む。各群の分子認識配列は、少なくとも１個（及び、典型的には、２個又はそれ以上）の非−標準塩基を含む。標的オリゴヌクレオチド２５８及び相補的オリゴヌクレオチド２６４は、例えば、検体−特異的配列又はその相補配列を含む検体のＰＣＲ増幅により形成することができる。ＰＣＲ増幅において、２種の異なるプライマーが使用される（図５のＢ及びＣに図示されたように）。第一のプライマー２６８は、検体２７０の第一鎖の上の第一の配列に相補的な配列を含む。第二のプライマー２７２は、第一の配列の上流又は下流である、検体２７０の第二鎖の上の第二の配列に相補的な配列を含む。検体−特異的配列は、典型的には、プライマーがハイブリダイズする配列（又は相補配列）の間に伸びる、又はこれを含む、検体の配列を含む。第一のプライマー２６８は、タグ付け配列２６２を含み、第二のプライマー２７２はレポーター２６６（又は、レポーターへのカップリング剤）を含む。
【００７５】
標的オリゴヌクレオチド２５８は、典型的には、捕獲オリゴヌクレオチド２５２が結合した支持体２５６（又は粒状支持体を保持する容器）と接触させられる。適当な捕獲オリゴヌクレオチドが支持体上に存在する場合には、標的オリゴヌクレオチドのタグ配列と、捕獲オリゴヌクレオチドの相補的分子認識配列との選択的ハイブリダイゼーションを促進するように条件が制御される（図５のＤに示されたように）。相補的オリゴヌクレオチド２６４への連結に関して、レポーターも、添加される（相補的オリゴヌクレオチド２６４が既にレポーターを含まない限りは）。場合により、取込まれていないプライマーを、ハイブリダイゼーション前に、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーなどの技術により、もしくはハイブリダイゼーション後に、例えば洗滌により、除去することができる。
【００７６】
次に酵素２８０が、相補的オリゴヌクレオチド２６４の捕獲オリゴヌクレオチド２５２への共有結合のために提供される。適当な酵素にはリガーゼが含まれる。場合により、標的オリゴヌクレオチド２５８は、相補的オリゴヌクレオチド２６４から変性され、かつ標的オリゴヌクレオチド及びアッセイの他の成分は洗滌除去され、図５のＥに図示したように、支持体２５６に結合した相補的オリゴヌクレオチド２６４が残留する。その後レポーター２６６を検出することができる。
【００７７】
更に図６に図示された別のアッセイにおいて、標的オリゴヌクレオチド３１４は、ヘアピン又はステム−ループ構造３２１、３２３（又は典型的二重らせん以外の構造）を形成する。このアッセイにおいて、第一及び第二の各プライマー３１８、３２２は、タグ配列３１２ｂの一部又はタグ配列の一部の相補配列３１２ａを含む。加えて、プライマー３２２のひとつは、タグ配列３１２ｂの一部に付着したレポーター３１６（又はレポーターへのカップリング剤）を含む。例えばＰＣＲ技術を用い、第一及び第二のプライマー３１８、３２２は、検体３２０を増幅し、標的オリゴヌクレオチド３１４及びその相補物３０８を生成する。標的オリゴヌクレオチド３１４のタグ配列３１２ｂ、３１３ａは、標的オリゴヌクレオチドの両端に配分される。
【００７８】
標的オリゴヌクレオチド３１４は、その相補物３０８から変性され、分子認識配列３０４を伴う捕獲オリゴヌクレオチド３０２を有する固体支持体３０６に接触させられる。ひとつの捕獲オリゴヌクレオチドの分子認識配列３０４が、標的オリゴヌクレオチド３１４のタグ配列３１２ｂ、３１３ａと相補的であるならば、標的オリゴヌクレオチド３１４は、その捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするであろう。一部の態様において、捕獲オリゴヌクレオチドは、ふたつの部分に分割され、各部分は、タグ配列３１２ｂ、３１３ａの部分のひとつと相補的である。これらふたつの部分は、リンカーにより連結される。このリンカーは、追加のヌクレオチドであっても他のいかなる化学連結部分であってもよい。標的オリゴヌクレオチド３１４の標的配列は、ステム−ループ構造３２１、３２３（又は二重らせん以外の構造）の少なくとも一部を形成する。その後検出が、先の例において考察されたように行われる。
【００７９】
図７に図示した別のアッセイにおいて、検体４２０は、初期プライマー４４０、４４２により接触され、この各々は、図７のＡに図示されたように、検体４２０の配列に相補的である配列を有する。初期プライマー４４０のひとつは、基質４５０への付着のためのカップリング基４４４（例えば、ビオチン又は反応官能性を含む置換基）も含む。初期プライマー４４０、４４２は、例えば、図７のＢに図示されたように、ＰＣＲ技術を用いて伸長される。伸長された初期プライマー４４６、４４８は、各々、検体−特異的配列又はその相補配列を含む。
【００８０】
伸長された初期プライマー４４６、４４８は、次に、図７のＣに図示されたように、伸長された初期プライマー４４６のカップリング基４４４と相互作用する基質４５０と接触され、伸長された初期プライマー４４６を基質４５０へ付着する。例えばこの基質は、ストレプトアビジンで被覆し、伸長された初期プライマーはビオチンを含むことができる。
【００８１】
次に、第一及び第二のプライマー４１８、４２２は、図７のＣに図示されたように、伸長された初期プライマー４４６、４４８と接触される。第一のプライマー４１８は、タグ付け配列４１２を有し、及び第二のプライマー４２２はレポーター４１６（又はレポーターのカップリング剤）を有する。両プライマーは、伸長された初期プライマー４４６、４４８の断片（ｓｅｃｔｉｏｎ）に相補的な配列も含む。図７に図示したアッセイは、その他のプライマー４２２ａを追加することができることも示している。これは、本アッセイの必要な特徴ではないが、アレルを検出するアッセイのひとつの態様を例証するために使用される。アレル特異的プライマーの使用は、本願明細書に例証した他のいかなるアッセイにおいても使用することができる。
【００８２】
図示されたアッセイにおいて、プライマー４２２、４２２ａは、アレル−特異的レポーター４１６、４１６ａを伴うアレル−特異的プライマーである。図示された例において、これらのアレルは１個のヌクレオチドが異なるが、１個よりも多いヌクレオチド差異を伴う別のアレル−特異的アッセイを、これらの技術を用いて行うことができることは理解されるであろう。プライマー４２２は、伸長された初期プライマー４４６上の配列と相補的であるので、伸長される。プライマー４２２ａは、伸長された初期プライマー４４６と相補的でないので、伸長されない。別のアッセイは、（アレル−特異的レポーターとは異なって）アレル−特異的タグ配列を有するいくつかの異なるアレル−特異的プライマーを含むことは認められるであろう。検体中に非−アレル性の検体−特異的配列が存在する又はしないことを決定するために非−アレル的プライマーを含むことは、認められるであろう。
【００８３】
これらのプライマー４１８、４２２は、タグ配列４１２を伴う標的オリゴヌクレオチド４０８及びレポーター４１６（又はレポーターのカップリング剤）を伴う相補的オリゴヌクレオチド４１４を形成するために伸長される。標的オリゴヌクレオチド４０８及び相補的オリゴヌクレオチド４１４は、伸長された初期プライマー４４６、４４８から変性され、かつ固体支持体４０６（例えば、チップ、ウェファー、又は粒子）上の捕獲オリゴヌクレオチド４０２と接触させられる。標的オリゴヌクレオチド４１４は、タグ配列４１２に相補的な分子認識配列４０４を有する捕獲オリゴヌクレオチド４０２へハイブリダイズする。検体中の特定の検体−特異的配列の存在又は非存在は、捕獲オリゴヌクレオチドの各固有の基と関連したレポーターの存在又は非存在の観察により決定される。
【００８４】
別のアッセイの例において、第一のプライマー４６８及び第二のプライマー４７２は、検体４７０と接触させられ、伸長され、標的オリゴヌクレオチド４５８及び相補的オリゴヌクレオチド４６４を形成する。図示した例において、第一及び第二のプライマー４６８、４７２は、両方ともアレル−特異的であるが、異なるアレルに対して特異的である。第一及び第二のプライマー４６８、４７２に加え、他の第一及び第二のプライマー４６９、４７３が、他のアレルが試料中に存在する場合にはこれを増幅するために含まれる。
【００８５】
第一のプライマー４６８は、タグ配列の第一の部分４６２ａを含み、かつ第二のプライマー４７２は、タグ配列の第二の部分４６２ｂを含む。これらの部分４６２ａ、４６２ｂのひとつは、レポーター４６６（又はレポーターのカップリング剤）を含む。典型的には、タグ配列の部分４６２ａ、４６２ｂは、プライマー４６８、４７２の伸長が、タグ配列を介して進行しないように、構成されるであろう。例えば、部分４６２ａ、４６２ｂは、タグ配列部分をプライマー４６８、４７２の伸長可能な部分に連結する塩基として、非−標準塩基を含むことができる。この態様において、非−標準塩基の相補物であるヌクレオチド三リン酸は、ＰＣＲ増幅過程には含まれない。あるいは、化学リンカーを用い、タグ配列部分を、このプライマーの伸長可能な部分に連結することができる。適当なリンカーの例は、ｎ−プロピル、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、１’，２’ジデオキシリボース、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、デオキシイソシチジン、又はポリメラーゼを中断するいずれかの連結を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
連結オリゴヌクレオチド４５２は、支持体４５６上に提供される。この連結オリゴヌクレオチド４５２は、タグ配列の部分４６２ａ、４６２ｂに相補的な部分４５３ａ、４５３ｂを含む。これらの部分４５３ａ、４５３ｂは、２種のヌクレオチド配列の５’（又は３’）末端への連結が可能な化学的又はヌクレオチド性リンカー４５４により連結される。
【００８７】
標的オリゴヌクレオチド４５８及び相補的オリゴヌクレオチド４６４は、支持体４５６と接触させられ、かつ捕獲オリゴヌクレオチド４５２は、タグ配列の各部分４６２ａ、４６２ｂを有する捕獲オリゴヌクレオチドの対応する部分４５３ａ、４５３ｂにハイブリダイズする。標的オリゴヌクレオチド４５８及び相補的オリゴヌクレオチド４６４の残余は、典型的には図８に図示されたような構造を形成するであろう。
【００８８】
非 − 標準塩基が ＰＣＲ 技術により追加されるアッセイ
標識された天然のヌクレオチド塩基は多くの用途を有するが、標識された天然のヌクレオチドに関連した欠点がある。例えば、標識された天然のヌクレオチド塩基の位置特異的取込みは、実現が困難である。一般に、アデニンを含むオリゴヌクレオチド中のある位置を標識するためには、標識されたアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ^＊）が、オリゴヌクレオチド鋳型ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、並びにポリメラーゼ酵素を含有する反応混合液に基質として添加される。反応混合液中の全てのｄＡＴＰが標識されている場合は、そのオリゴヌクレオチド配列中の全てのアデニン残基が標識されるであろう。反応混合液中の一部のｄＡＴＰが標識されている場合は、その配列中の無作為な位置のアデニン残基が標識される。従って、オリゴヌクレオチド中の単独のヌクレオチド残基を標識することは、極めて難しい。
【００８９】
複数の標識ヌクレオチド残基の取込みに関連した問題を克服するために、標識されたジデオキシリボ核酸が使用される。ジデオキシリボ核酸は、３’のヒドロキシル基を欠いているので、このオリゴヌクレオチドは、標識されたジデオキシリボ核酸が導入された位置で終結している。標識されたヌクレオチドの位置を決定するために、このオリゴヌクレオチドを配列決定するためにラダー（ｌａｄｄｅｒ）が泳動される。このオリゴヌクレオチドは、ジデオキシリボ核酸が導入された位置で終結しているので、ジデオキシリボ核酸は一般にはオリゴヌクレオチド鎖の増幅による連結には使用されない。
【００９０】
図９は、非−標準塩基のＰＣＲによる取込みを含む、本発明のアッセイのひとつの型を図示している。第一及び第二のプライマー５１８、５２２は、検体５２０とハイブリダイズされ、伸長される。プライマー５２２のひとつは、伸長された場合に標的オリゴヌクレオチド５０８となる非−標準塩基５５０を含む。場合により、追加の塩基は、非−標準塩基５５０の後に提供され得る。非−標準塩基５５０を有する標的オリゴヌクレオチド５０８は、その後捕獲オリゴヌクレオチド５０２ａ、５０２ｂを含む固体支持体５０６ａ、５０６ｂと接触させられる。図９に図示された固体支持体は、前述の粒状支持体であるが、単独の固体支持体（例えばチップ又はウェファー）を使用することもできることは認められるであろう。
【００９１】
捕獲オリゴヌクレオチド５０２ａ、５０２ｂは異なり、かつ各々、異なる支持体５０６ａ、５０６ｂに付着され、その結果この捕獲オリゴヌクレオチドは、それが付着された支持体の固有の特性を観察することにより認識され得る。ひとつの捕獲オリゴヌクレオチド５０２ａは、標的オリゴヌクレオチド５０８とハイブリダイズしている。この態様の捕獲オリゴヌクレオチド５０２ａは、標的オリゴヌクレオチド５０８の検体−特異的配列の少なくとも一部と相補的である配列を有する。
【００９２】
標的オリゴヌクレオチド５０８のハイブリダイゼーション後、捕獲オリゴヌクレオチド５０２ａは、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及び標的オリゴヌクレオチド５０８上の非−標準塩基５５０に相補的な第二の非−標準塩基（例えば、ｄイソ−ＧＴＰ）５５２のヌクレオチド三リン酸を含有するＰＣＲ溶液中で伸長される。第二の非−標準塩基５５２は、レポーター５１６（又はレポーターのカップリング剤）で標識される。捕獲オリゴヌクレオチドは伸長されるので、レポーター５１６を伴う第二の非−標準塩基５５２は、非−標準塩基５５０に対向して伸長された捕獲オリゴヌクレオチドに取込まれる。従って、粒状支持体の特定の群上のレポーターの存在又は非存在は、捕獲オリゴヌクレオチドと会合した特定の標的オリゴヌクレオチドの存在又は非存在を示している。
【００９３】
図１０は別のアッセイを図示している。このアッセイにおいて、第一のプライマー６１８はタグ配列６１２を含み、かつ第二のプライマー６２２はその５’末端に非−標準塩基６２１（又は非−標準塩基を含む配列）を有する。プライマー６１８、６２２は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及び非−標準塩基６２１と相補的な非−標準塩基のヌクレオチド三リン酸の存在下で、検体６２０を増幅する。この非−標準塩基ヌクレオチド三リン酸は、レポーター６１６（又はレポーターのカップリング基）で標識され、かつ非−標準塩基６２１に対向して取込まれ、標的オリゴヌクレオチド６０８を形成する。
【００９４】
標的オリゴヌクレオチド６０８は、分子認識配列を有する捕獲オリゴヌクレオチド６０２を有する固体支持体６０６と接触させられる。この分子認識配列のひとつが標的オリゴヌクレオチド６０８のタグ配列６１２と相補的であるならば、標的オリゴヌクレオチド６０８は、捕獲オリゴヌクレオチド６０２とハイブリダイズするであろう。その後前述の例に説明したように検出が行われる。
【００９５】
図１１は更に別のアッセイを図示している。このアッセイにおいて、第一のプライマー７１８はタグ配列７１２を含み、及び第二のプライマー７２２は非−標準塩基７２１、それに続けてその５’末端に天然塩基７２３（又は天然の塩基配列）を有する。プライマー７１８、７２２は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの存在下において、検体７２０を増幅し、部分的に伸長された標的オリゴヌクレオチド７０７及びその相補物７１４のみを形成する。部分的に伸長された標的オリゴヌクレオチドの伸長は、非−標準塩基７２１により制限される。この最初の増幅の後、増幅産物７０７、７１４は洗滌され、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰが除去される。
【００９６】
その後、第二の伸長工程が、非−標準塩基７２１に相補的な非−標準塩基の三リン酸及び少なくとも天然塩基７２３に相補的な天然の塩基の三リン酸の存在下で実行される。この天然塩基の三リン酸は、レポーター７１６（又はレポーターのカップリング基）により標識されており、かつ天然塩基７２３に対向して取込まれ、標的オリゴヌクレオチド７０８を形成する。
【００９７】
標的オリゴヌクレオチド７０８は、分子認識配列を備えた捕獲オリゴヌクレオチド７０２を有する固体支持体７０６と接触させられる。分子認識配列の一つが標的オリゴヌクレオチド７０８のタグ付け配列７１２と相補的であるならば、その標的オリゴヌクレオチド７０８は捕獲オリゴヌクレオチド７０２とハイブリダイズするであろう。その後後前述の例に説明したように検出が行われる。
【００９８】
一つの態様において、アレル−特異的第二のプライマーが第一のプライマーと同様に使用される。アレル−特異的第二のプライマーは、検体にアニーリングする第二のプライマーの一部において差別化される。異なる天然塩基７２３が各アレルについて選択される。第二の伸長工程時に、塩基が非−標準塩基７２１及び天然塩基７２３に対向して追加される場合、２種又はそれ以上の天然塩基のヌクレオチド三リン酸が伸長混合物に添加される。異なるヌクレオチド三リン酸は、異なるレポーターで標識される。従って、天然塩基７２３がＡ又はＣである場合、そのアレルに応じて、伸長工程において使用されるｄＴＴＰ及びｄＧＴＰは異なるレポーターで標識される。レポーターの固有の性質は、特定の、会合されたアレルの存在を決定するために使用され得る。従って、例えば、４種の異なるアレルを、本方法を用いて同時に試験し、レポーターを適切に選択して、異なる４色を用いて表示することができる。
【００９９】
その他のアッセイ
図１６に図示したひとつのアッセイにおいて、捕獲オリゴヌクレオチド９０２の２種又はそれ以上の群が調製される。捕獲オリゴヌクレオチド９０２の各群は、固有の分子認識配列９０４を含む。場合により、各群の分子認識配列は少なくとも１個又は複数の非−標準塩基を含む。捕獲オリゴヌクレオチドも、典型的には固体支持体９０６への付着のための反応性官能基を含むが、前述のような他の付着法も使用することができる。
【０１００】
ある態様において、アッセイのための支持体は、粒状支持体（例えば、ビーズ）である。本願明細書において説明されたアッセイのいずれかは、単独の固体支持体上、粒状支持体上、又はいずれか他の支持体上で行うことができることは理解されるであろう。粒状支持体は、粒子群に分割され、各粒子群は、その粒子群を他の群から識別する特徴（例えば、色、形状、サイズ、密度、又は他の化学的もしくは物理的特徴）を有する。捕獲オリゴヌクレオチドの各群は、１種又は複数の粒子の群に連結される。これは、捕獲オリゴヌクレオチドの特定群と特定粒子群との会合を生じ、固有の粒子支持体特性の観察による捕獲オリゴヌクレオチドの決定を可能にする。
【０１０１】
別の態様（示さず）において、アッセイのための支持体は、例として単独の固体支持体、例えば、ガラス、金属、プラスチック、又は無機チップなどであることができる。捕獲オリゴヌクレオチドは、支持体上に配置され、典型的には前述の方法（例えば、捕獲オリゴヌクレオチド及び支持体上の反応基を介した連結、支持体上に配置された結合剤の使用、又は捕獲オリゴヌクレオチドの架橋）のひとつにより保持される。これらの基の各々は、固体支持体の１種又は複数の固有の領域に配置され、その結果この領域（複数）は、特定の捕獲オリゴヌクレオチドと会合することができる。
【０１０２】
図１６に戻り、標的オリゴヌクレオチド９０８は、アッセイされた試料中に存在する場合は、第一のプライマー９０９及び第二のプライマー９１１と接触させられる。第一及び第二のプライマー９０９、９１１は、アレル−特異的であるか、もしくは好ましくは、標的オリゴヌクレオチドのアレル特異的部分に相補的でない（すなわち、関心のあるアレル特異的部分は、これら２種のプライマーにハイブリダイズする領域の間の標的オリゴヌクレオチド内に位置している）。第二のプライマー９１１は、非−相補的付着領域９０５も含む。この非−相補的レポーター付着領域９０５は、場合により１個又は複数の非−標準塩基を含む。標的オリゴヌクレオチド９０８は、第一及び第二のプライマー９０９、９１１並びにＰＣＲ技術を用い増幅され、レポーター付着領域９０５を含む増幅産物９０７を得る。
【０１０３】
その後、増幅産物９０７は、伸長されるアレル特異的プライマー９２０ａ、９２０ｂと接触され、これは次に特定のアレルが存在する場合には、ＰＣＲに類似した反応条件及び反応成分を用い、アレル特異的伸長産物９２２を産生する。各アレル特異的プライマー９２０ａ、９２０ｂは、異なる分子認識配列９０４及び捕獲オリゴヌクレオチド９０２に対して相補的であるアレル−特異的タグ配列９１２ａ、９１２ｂを有する。アレル特異的プライマー９２０ａ、９２０ｂが伸長される場合、付着領域９０５の１個又は複数の塩基に対し相補的である標識されたヌクレオチド９２５（又はオリゴヌクレオチド）が提供される。標識されたヌクレオチド９２５又はオリゴヌクレオチドは、レポーター又はビオチンのようなレポーターの付着のためのカップリング剤を含むことができる。
【０１０４】
伸長産物９２２の形成後、捕獲オリゴヌクレオチド９０２及びレポーター９３０（レポーターが既に付着されていない限りは）が接触される。捕獲オリゴヌクレオチド９０２及び支持体９０６は、どのアレル（複数）が試料中に存在するかを同定し、かつレポーターは、伸長産物９２２の検出を提供する。粒子支持体のアッセイに関しては、粒子は、固有の特性に従い分離され、その後、どの粒子９０６が捕獲オリゴヌクレオチド９０２及び伸長産物９２２を介して粒子に連結されたレポーターを有するかが決定される。分離を達成する技術は、例えば、フローサイトメトリーを含む。レポーター基の存在は、試料が特定のアレル−特異的タグ配列と会合したアレルを含むことの指標である。
【０１０５】
分子認識配列の選択
複数の分子認識配列が、単一の試料の適用により１種よりも多い検体−特異的配列を検出することができるアッセイシステムの構築において使用される場合、典型的には異なる分子認識配列の集団が必要である。これらの分子認識配列は、ストリンジェンシー条件の望ましいセットの下で検体−特異的配列の信頼できる検出を可能にするのに十分な程に異なることが好ましい。様々な異なる方法を用い、分子認識配列の収集を選択することができる。いくつかの使用することができる方法及び判定基準を以下に説明する。これらの方法及び判定基準は、個別に又は組合せて使用することができる。
【０１０６】
以下は、分子認識配列集団の作成において使用することができる判定基準の例である：配列中の塩基の数、配列中の非−標準塩基の数、配列中の連続した天然の塩基の数、任意の２個の配列中で同一の連続した塩基の数（前向き又は後向きのいずれか）、特異的に必要な配列（例えば、３’もしくは５’末端又は両方のＧＣクランプ）及び見積もった融解温度又は実際の融解温度。Ｔ_ｍを決定する方法の一例は、Ｐｅｙｒｅｔらの論文（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：３４６８−７７（１９９９））に説明されており、これは本願明細書に参照として組入れられている。非−標準塩基は、例えば他の塩基の値を用い（例えば、イソ−Ｇ／イソ−ＣはＧ／Ｃを用いて推定される）、もしくは以下に説明したような実験データを用いて、推定又は説明することができる。
【０１０７】
下記は、分子認識配列の収集を形成するために使用することができる一連の工程である：
１）天然の塩基及び望ましい非−標準塩基（例えば、イソ−Ｃ、イソ−Ｇ、又は両方）を使用する、長さｎ_１（例えば、８、９、又は１０個のヌクレオチド）を有するあらゆる可能性のあるオリゴヌクレオチドのセットの作成。
２）場合により、オリゴヌクレオチドは特定のサブ配列（例えば、３’もしくは５’末端又は両末端のＧＣクランプ）を有することが必要。
３）少なくともｎ_２個の非−標準塩基を伴わない（例えば、少なくとも２個のイソ−Ｃ塩基を伴わない）オリゴヌクレオチド、もしくはｎ_３個より多い非−標準塩基を伴う（例えば、２個より多いイソ−Ｃ塩基を伴う）オリゴヌクレオチド、又は両方（例えば、正確に２個のイソ−Ｃ塩基を伴うオリゴヌクレオチドのみを許容）のオリゴヌクレオチドの除去。
４）場合により、続けてｎ_４個（例えば、４又は５個）の天然塩基を伴うオリゴヌクレオチドの除去。
【０１０８】
５）残余オリゴヌクレオチドのひとつの選択およびオリゴヌクレオチド配列のいずれかの場所に同じ順でｎ_５個の塩基（例えば、５又は６個の塩基）を有する残余のオリゴヌクレオチドの排除。排除されなかったオリゴヌクレオチドの各々についての繰り返し。
６）場合により、残余オリゴヌクレオチドのひとつの選択およびその逆相補物（例えば、「ＡＣＴ」の逆相補物は「ＡＧＴ」である）の決定、続いて、逆相補物の配列の一部と同じであるｎ_６個の連続する塩基（例えば、４又は５個の塩基）を有する他のオリゴヌクレオチドの排除。排除されなかったオリゴヌクレオチドの各々についての繰り返し。
７）場合により、望ましい温度範囲内、望ましい温度限界を上回る、又は望ましい温度限界を下回る、推定される又は実際の融解温度（Ｔ_ｍ）を有する残余オリゴヌクレオチドのみの選択。例えば、室温（約２２℃）を下回る融解温度を有するオリゴヌクレオチドを排除することができる。
【０１０９】
本発明は、添付図面と共に、上記の本発明の様々な態様の詳細な説明を考慮し、より完全に理解することができる。
【０１１０】
（実施例）
実施例 １
コード配列及びタグ配列のクロス − ハイブリダイゼーション分析
この分析に使用される装置には、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００及びＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ミクロビーズ、ＤＮＡ合成装置（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社）、スポットチェック合成の収量のための分光光度計、オリゴヌクレオチド品質管理のための薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（Ｓ１２５０Ｆ ＴＬＣプレート−シリカゲル、ＪＴＢａｋｅｒ社）、遠心分離機、音波処理装置（Ｎｅｙ Ｄｅｎｔａｌ社）、Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅ（Ｖｏｒｔｅｘ社）、及び様々なピペット（２、２０、２００、及び１０００μＬ）が含まれる。
【０１１１】
１００を超えるオリゴヌクレオチド（分子認識配列）及びそれらの相補物（タグ配列）のセットを設計して合成した。これらオリゴヌクレオチドのふたつのセットは、非−標準ヌクレオチド（イソＣ及びイソＧ）（ＥｒａＧｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マジソン、ＷＩ）及び天然ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＡＢＩ社）を含み、かつ長さは９〜１０塩基とした。オリゴヌクレオチドの第一のセットは、分子認識配列に割り当て、これをアミノ修飾剤（Ｃ６−ＴＦＡ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で５’末端を標識した。オリゴヌクレオチドの相補物セットは、タグ配列として割り当て、Ｃｙ３（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で５’末端を標識した。
【０１１２】
以下の試薬は、分子認識配列の固有のＬｕｍｉｎｅｘビーズへの連結に使用した：０．１ｍＭ ｐＨ４．５、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（Ｓｉｇｍａ社）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ＨＣｌ（ＥＤＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ社）、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ社）、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ社）。
ハイブリダイゼーション工程は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ社）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社）、２００ｍＭ ＮａＣｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Ａｌｄｒｉｃｈ社）、及び１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ社）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液Ｓｏｕｒａｖ ０．５を含ませた。
【０１１３】
分子認識配列の９８種は、ＭＥＳ中に１ｎｍｏｌ／μＬとなるように希釈した。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズの９８種の固有セットを連結のために調製した。これらのビーズを２０秒間音波処理し、１０秒間ボルテックスした後、小分けした。ストックビーズ（１．２５ｘ１０^７ビーズ／ｍＬ）から、５，０００，０００個のビーズを選択し、１．５ｍＬ微量遠心管に入れた。ビーズを、１０，０００ｒｃｆで１分間遠心した。その後ビーズをデカントし、ビーズを撹乱しないように注意した。最後に、ビーズを５０μＬ のＭＥＳに入れ、音波処理し、ボルテックスした。分子認識配列を個別のビーズに連結するために、各分子認識配列１ｎｍｏｌを、独自のビーズセットのひとつに添加した。次に、この混合物へ新鮮なＥＤＣ（２０ｍｇ ＥＤＣ／１ｍＬ ｄｄＨ_２Ｏ）１．７５μＬを添加し、音波処理し、ボルテックスした。その後この混合物を、室温暗所で３０分間インキュベーションし、１０分毎にボルテックスした。３０分後、更に新鮮なＥＤＣを１．７５μＬを添加し、３０分間インキュベーションし、１０分毎にボルテックスした。
【０１１４】
連結後、Ｔｗｅｅｎ−２０ ４００μＬを添加し、ボルテックスし、遠心し（１０，０００ｒｃｆ／１分）かつデカントすることによりビーズを洗滌した。次にＳＤＳを４００μＬ添加し、遠心し、デカントし、最後にＭＥＳ中に１００μＬとし、計数した。
相補的オリゴヌクレオチド（タグ配列）を、ＴＬＣ及びポリアクリルアミドゲルを用いて定量及び定性し、ＭＯＰＳ中５０ｆｍｏｌ／μＬの最終作業濃度に希釈した。
【０１１５】
計数後、分析のために、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズ／分子認識配列を、９８種ビーズセット（１０００ビーズ／ビーズ領域／ウェル）と一緒にした。９８種ビーズセットから、５０種ビーズセット（２５００ビーズ／ビーズ領域／ウェル）を作成した。表１は、５０種ビーズセット用の分子認識配列を含み、かつ表２は、９８種ビーズセット用の分子認識配列を含む。
【０１１６】
クロスハイブリダイゼーション実験を設定するために、５０フェムトモルのタグ配列（１−＞９８）を、ふたつの９６ウェルプレート中のウェルにピペッティングした（ウェル１及び２は対照に使用した）。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００の現在の制限により、バックグラウンドの差し引きのための２個の対照（タグ配列なし）と共に、データセットは９８種のタグ配列へと刈り込まれる。
【０１１７】
ビーズのマスターミックス（９８ｍｉｘ）１０μＬ／ウェルを、その後、各ウェルへ、２Ｘ Ｓｏｕｒａｖ ０．５ハイブリダイゼーション緩衝液３１μＬ及びｄｄＨ_２Ｏの十分量と共に添加し、最終容量６２μＬ／ウェルとした。これらの試薬をよく混合し、室温でおよそ１０分間インキュベーションした。試料は、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００上でフローサイトメトリーにより直ぐに分析した。
【０１１８】
５０種ビーズのマスターミックスも、その相補的分子認識配列及びタグ付け配列と共に試行したが、タグ配列は１ウェル当り５００ｆｍｏｌとした。
【０１１９】
得られたデータは、両方のセットに関するビーズ１個当りの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として報告した。図１２は、９８種ビーズマスターミックス実験において収集されたデータの３Ｄ表面図のグラフを描いた結果を示す。Ｙ軸は、分子認識配列を表し、Ｘ軸は、タグ配列を表す。図１３は、５０種ビーズマスターミックス実験において収集されたデータの３Ｄ表面図のグラフを描いた結果を示す。
【０１２０】
表１ ５０ビーズ分子認識配列（Ｙ＝イソ−Ｃ、Ｘ＝イソ−Ｇ）
【表１】

【０１２１】
表２．９８ビーズ分子認識配列（Ｙ＝イソ−Ｃ、Ｘ＝イソ−Ｇ）
【表２】

【０１２２】
表２．つづき
【表３】

【０１２３】
実施例 ２
核酸二重鎖安定性の予測に関する最隣接パラメータに対する非 − 標準塩基分布寄与の予備的決定
温度コントローラ及び試料キャリッジを備えたＢｅｃｋｍａｎ ＤＵ−７５００分光計を利用した。６個の試料を、正確に温度制御しながら同時に測定した。試料濃度について１００倍濃度範囲をカバーするために、路長０．１ｃｍ、０．２ｃｍ、０．５ｃｍ及び１．０ｃｍの石英キュベットをＨｅｌｌｍａ社（ＵＳＡ）から入手した。ＤＮＡはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＡＢＩ社のＭｏｄｅｌ ３９２ ＤＮＡ合成装置上で合成した。ＴＬＣ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｔａｎｋ（Ｆｉｓｈｅｒ社）、及びＴＬＣプレート（Ｓｉ２５０Ｆ、ＪＴＢａｋｅｒ社）。Ｓａｖａｎｔ ＳｐｅｅｄＶａｃおよびＳｅｐ−ｐａｋ Ｃ−１８精製カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社）、ＵＶランプ、ボルテックス、１０ｃｃシリンジ、及び様々なピペッター（２、２０、２００、１０００μＬ）をＤＮＡ調製に使用した。
【０１２４】
オリゴヌクレオチドは、天然の（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ）ヌクレオチド（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＡＢＩ）並びにイソＣ、及びイソＧ（ＥｒａＧｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マジソン、ＷＩ）から合成した。この合成した自己相補的配列及び非−自己相補的配列を、表３及び４に示した。
【０１２５】
表３：自己−相補的配列（イソＧ＝Ｘ、イソＣ＝Ｙ）
【表４】

【０１２６】
表４：非−自己相補的配列（イソＧ＝Ｘ、イソＣ＝Ｙ）
【表５】

【０１２７】
下記試薬を、オリゴヌクレオチドの精製及び融解実験に使用した：ＴＬＣ精製を、５〜６時間、ｎ−プロパノール／アンモニア／水（容積比５５：３５：１０）による溶離により行った（Ｃｈｏｕ， Ｓ．−Ｈ．、Ｆｌｙｎｎ， Ｐ．、及びＲｅｉｄ， Ｂ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８：２４２２−２４３５ （１９８９）、これは本願明細書に参照として組入れられている）。ハイブリダイゼーション実験は、脱気した１ｘ ＳＬ緩衝液（１．０Ｍ ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ社）、１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ社）、０．５ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ（Ｆｉｓｈｅｒ社）、ｐＨ７）中で行った（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ， Ｊ．、Ａｌｌａｗｉ， Ｈ．、及びＳｅｎｅｖｉｒａｔｎｅ， Ｐ．Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：３５５５−３５６２ （１９９６）、これは本願明細書に参照として組入れられている）。
【０１２８】
熱力学的パラメータの決定は、Ｍｅｌｔｗｉｎ（登録商標）ｖ３ ．０を、Ｐｅｔｅｒｓｈｅｉｍ， Ｍ．及びＴｕｒｎｅｒ， Ｄ． Ｈ．の論文（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２：２５３−２６３ （１９８３）、これは本願明細書に参照として組入れられている）に説明されたように使用し、融解曲線データから得た。
【０１２９】
オリゴヌクレオチドは、合成後に、アンモニア中５０℃で一晩脱保護した後、凍結乾燥し、各試料を１７５μＬ ｄｄＨ_２Ｏ中に溶解し、かつ５〜６時間溶離することによりＴＬＣで精製した。ほとんどの場合、最少の移動バンドが可視化され、これをプレートから掻出し、３ｍＬ ｄｄＨ_２Ｏで３回溶離した。これらのオリゴヌクレオチドは、更に脱塩し、Ｓｅｐ−ｐａｋ（登録商標）カラムにより、３０％アセトニトリル、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ７で溶離することにより、精製し（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ， Ｊ．、Ａｌｌａｗｉ， Ｈ．、及びＳｅｎｅｖｉｒａｔｎｅ， Ｐ．Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：３５５５−３５６２ （１９９６））、かつ最終的にＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）において乾燥した。
【０１３０】
自己相補的オリゴヌクレオチドを定量し、各々２．０ ＯＤ_２６０を収集し、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）において再度乾燥した。その後オリゴヌクレオチドを連続希釈し、１ｘ ＳＬ緩衝液中の１００倍希釈シリーズを得た。吸光度対温度のプロフィールを、様々な注文生産したミクロ−キュベット、試料キャリッジ及び温度制御装置を用い、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−７５００分光光度計で測定した。試料の希釈シリーズに関しては、表５及び６を参照のこと。この希釈シリーズは、表３及び４の各試料について調製した。
【０１３１】
表５．Ａシリーズ
【表６】

【０１３２】
試料Ａ１−Ａ５を試行した後、第二シリーズの希釈液を集めた。Ｂシリーズに関しては、最後の試料の残りの２４．７μＬを、キュベットＡ−３、Ａ−４及びＡ−５（合計〜１７２．５μＬ）中の希釈液及び追加の１ｘＳＬ緩衝液３４５μＬを一緒にした。
表６．Ｂシリーズ
【表７】

【０１３３】
キュベット中に入れた体積は、融解時の試料の熱膨張のために、各キュベット中において、およそ４％の上部空間を残すようにした。
各試行に関して、試料は、更に脱気し、その後温度を８５℃に５分間上昇し、次に１０℃で５分間以上冷却することによりアニーリングした。凝縮を制限するために、乾燥アルゴンのブランケットを低温で使用した。Ａ及びＢシリーズについて、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで同時に測定した。試料は、１０℃から９０℃へ１．０℃／分の一定速度で加熱した。
【０１３４】
融解実験から収集したデータは、その後、Ｔｍ^−１対ｌｎ（Ｃ_Ｔ）のカーブフィット分析によりＭｅｌｔｗｉｎ（登録商標）ソフトウェアを用い解析した。Ｃ_Ｔは総鎖濃度であり、及びＴｍ^−１は融解温度逆数である（Ｂｏｒｅｒ， Ｐ． Ｎ．、Ｄｅｎｇｌｅｒ， Ｂ．、Ｔｉｎｏｃｏ， Ｉ，． Ｊｒ．、及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ， ０． Ｃ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｄ．、８６：８４３−８５３ （１９７４）、本願明細書に参照として組入れられている）。
【０１３５】
非−自己相補的オリゴヌクレオチドは、２．０ ＯＤ_２６０（２６０ｎｍでの光学密度）になるように等モル量で一緒にし、表５及び６の自己−相補的オリゴヌクレオチド希釈シリーズと同じ方法で希釈した。同様の融解データを収集し、Ｍｅｌｔｗｉｎ（登録商標）で非−自己−相補的オリゴヌクレオチドについて解析した。
自己−相補的及び非−自己相補的オリゴヌクレオチドについてＭｅｌｔｗｉｎ（登録商標）で決定された得られた熱力学的パラメータを、表７及び８に要約した。
【０１３６】
表７．自己相補性配列の熱力学的データ（イソＣ＝Ｙ、イソＧ＝Ｘ）
【表８】

【０１３７】
表８．非自己相補性配列の熱力学的データ（イソＣ＝Ｙ、イソＧ＝Ｘ）
【表９】

【０１３８】
全ての試料は、濃度依存型Ｔ_Ｍ及び単相性の融解相転移を有する。二重鎖形成に対するイソＣ及びイソＧの寄与はかなり大きいように見え、天然のワトソン−クリックオリゴヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ）に対し、イソＣ／イソＧ対当りさ５℃（試料３Ｂ及び４Ｃ）〜１０℃ （試料３Ｃ及び４Ｅ）まで増大した。
表７及び８は、ＡＥＧＩＳ塩基が天然のＤＮＡと混合された場合の、最近接効果の程度をいくつか示している。
【０１３９】
実施例 ３ 及び比較例
位置ゲート （Ｓｉｔｅ Ｇａｔｅｄ） 取込み
第一のプライマー ５’ＡＧＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣ （配列番号：１０４）
標的 ５’ ＡＡＧＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＧＣＡＧＧＡＴＡＣＴＴＡＡＣＡＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴ（配列番号：１０５）
第二プライマー ＣＴＡＣＧＴＣＣＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＹＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧ ５’（配列番号：１０６ ）
Ｙ＝イソＣＴＰ
第一のプライマー、標的、及び第二のプライマーの配列を、各々、配列番号：１０４、配列番号：１０５、及び配列番号：１０６に示した。
【０１４０】
ＰＣＲは、下記の混合物を用いて行った：２０μｌ反応容量中に、０．２μＭ第一のプライマー、０．２μＭ第二のプライマー、５０ｆＭ標的、各５０μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｃＴＴＰ及びｄＣＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１μｇ／μｌ分解したニシン精子ＤＮＡ、４０ｍＭ ＫＡｃ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１Ｕ Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｓｔｏｆｆｅｌ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フォスターシティ、ＣＡ）。混合物は、９５℃で２分間維持した。その後、９５℃で３０回サイクルリングし、１秒維持し、５８℃で１秒維持した。最後に、混合物を、５８℃で２分間維持した。
【０１４１】
ふたつのＰＣＲ反応混合物を調製した。取込まれなかったｄＮＴＰを除去するために、各ＰＣＲ反応混合物を、ＡｕｔｏＳｅｑ（登録商標）Ｇ−５０ミクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用い脱塩し、このカラム緩衝液を、ｄｄＨ_２Ｏと交換し、その後試料を脱塩した。脱塩した試料を、下記の反応成分についてそれらの最終濃度に調節した：２５μｌ反応容量中に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１μｇ／μｌ分解したニシン精子ＤＮＡ、４０ｍＭ ＫＡｃ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１Ｕ／反応Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｓｔｏｆｆｅｌ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、フォスターシティ、ＣＡ）及び１０μＭ Ｃｙ３−ｄＴＴＰ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｓ社、ボストン、ＭＡ）。加えて、ｄイソＧＴＰを、下記の濃度で添加した：０μＭ（比較例）又は４０μＭ（実施例３）。反応混合液を、６８℃で１５分間インキュベーションし、得られた反応液５μｌを、１０％変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により試験した。このゲルを、５９５ フルオロイメージャー（Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ） （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社、サニーベール、ＣＡ）を用い、Ｃｙ３含有伸長産物について画像化した。
【０１４２】
結果（データは示さず）は、ｄイソＧＴＰが存在しない場合は、最終ＰＣＲ工程時には、第一のプライマーの更なる伸長がないことを示した（すなわち、第二のプライマーのイソ−Ｃに対する塩基の誤取込みはほとんど又は全くない）。
【０１４３】
実施例 ４
標識されたデオキシイソグアノシン ５’− 三リン酸の合成
下記の化学反応に関して、ピロリン酸トリブチルアンモニウムは、Ｓｉｇｍａ社から購入し；ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入し；他の化学物質は全て、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社又はＦｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入し、更に精製することなく使用した。溶媒は、４Å分子篩上で乾燥した。反応は、乾燥炉で乾燥したガラス製品中、乾燥アルゴン下で行った。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（２３０〜４２５ｍｅｓｈ）で行った。
【０１４４】
略号：
Ａｃ_２Ｏ：無水酢酸
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＡＰ：４，４’−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
Ｅｔ_３Ｎ：トリエチルアミン
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＭｅＯＨ：メチルアルコール
Ｔｏｌ：ｐ−トルイル
【０１４５】
１−（ｐ，ｐ’− ジメトキシトリチル ）− ヘキサメチレンジアミン （２）
ヘキサメチレンジアミン（１０ｅｑ．， ３７５ｍｍｏｌ， ４３．５ｇ）を、ピリジンから２回共蒸発させ、１００ｍｌピリジンに溶解した。ＤＭＡＰ（０．１ｅｑ．， ３．７５ｍｍｏｌ， ４５７ｍｇ）を添加し、反応フラスコを氷浴に入れた。１００ｍｌピリジン中に溶解したＤＭＴ−クロリド（１ｅｑ．， ３７．５ｍｍｏｌ， １２．６９ｇ）を、２時間かけて滴下した。これを、室温で４時間攪拌し、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）を添加し、この反応混合液を濃縮し、残留した残渣を、水性ＮａＨＣＯ_３／酢酸エチルで抽出した。有機層を、ＮａＨＣＯ_３で水溶液で２回洗滌し、乾燥し、かつ溶媒を蒸発させた。得られた生成物を、更に精製することなく、次工程で使用した。
収量：１４．８９５ｇ（３５．６３４ｍｍｏｌ， ９５％）、粘着性の油状物。
【０１４６】
２− クロロ −６−（６−ｐ，ｐ’− ジメトキシトリチルアミノヘキシル ）− アミノプリン −２’− デオキシ −３’，５’− ジトルイルリボシド （３）
化合物２（１．３ｅｑ．， ３１．９１６ｍｍｏｌ， １３．３４ｇ）を、ＤＭＦと共蒸発させ、１００ｍｌ ＤＭＦ中に溶解した。１００ｍｌ ＤＭＦ中に溶解したジイソプロピルエチルアミン（３．９ｅｑ．， ９５．７４８ｍｍｏｌ， １６．６５ｍｌ）及び化合物１（１ｅｑ．， ２４．５５１ｍｍｏｌ， １３．２８２ｇ）を添加し、これを室温で３時間攪拌した。これを濃縮し、残渣を水性ＮａＨＣＯ_３／酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥し、かつ溶媒を蒸発させた。残渣を、エーテルで２回粉砕し、得られた固形生成物を、真空乾燥後に、更に精製することなく、使用した。
【０１４７】
２− ベンジルオキシ −６−（６−ｐ，ｐ’− ジメトキシトリチルアミノヘキシル ）− アミノプリン −２’− デオキシリボシド （４）
化合物３（１ｅｑ．， １９．２３ｍｍｏｌ， １７．７４ｇ）を、ＤＭＦ（２５ｍｌ）中に溶解し、かつベンジルアルコール（１２８ｍＬ）中のＮａＨ溶液（１０ｅｑ．， １９２．３ｍｍｏｌ， 鉱油の６０％分散体７．６９ｇ）に添加した。この反応混合液を加熱し（１２０℃， ６時間）、その後室温で攪拌し（１５時間）、その後セライト上で濾過し、濾液を蒸発させ、残渣を抽出し（酢酸エチル／水）、有機層を洗浄し（ＮａＨＣＯ_３−溶液）、乾燥し、溶媒を蒸発させ、残渣をエーテル／ヘキサン１：１０で５回粉砕した。
ＴＬＣ：ＣＨＣｌ_３／１０％ ＭｅＯＨ、Ｒ_ｆ＝０．２６
収量：１０．２８０ｇ（１３．５６２ｍｍｏｌ， ２工程について７０．５％）、泡状物。
【０１４８】
２− ベンジルオキシ −６−（６−ｐ，ｐ’− ジメトキシトリチルアミノヘキシル ）− アミノプリン −２’− デオキシ −５’−Ｏ−ｐ，ｐ’− ジメトキシトリチルリボシド （５）
化合物４（１４．７３８８ｍｍｏｌ， １１．１７２ｇ）を、ピリジンと共沸し、ピリジン１５０ｍｌ中に溶解し、及び ｐｙｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ ＤＭＡＰ（０．２５ｅｑ．， ３．６８４７ｍｍｏｌ， ４５０ｍｇ）を添加した。フラスコを氷浴中に入れ、ＤＭＴＣｌ（１．５ｅｑ．， ２２．１０８ｍｍｏｌ， ７．４８４ｇ）を２時間かけてゆっくり添加した。これを、室温で２２時間攪拌し、その後ＭｅＯＨ（１ｍｌ）を添加し、この反応混合液を濃縮し、残渣を抽出した（クロロホルム／水性ＮａＨＣＯ_３）。有機層を乾燥し、溶媒を蒸発し、残渣をエーテル／ヘキサン１：１で粉砕し、過剰なＤＭＴを除去し、不溶性固形生成物を乾燥し、更に追加の精製を行うことなく使用した。
収量：１４．８９０ｇ（１４．０４７ｍｍｏｌ， ９５％）、明褐色の泡状物。
【０１４９】
２− ベンジルオキシ −６−（６−ｐ，ｐ’− ジメトキシトリチルアミノヘキシル ）− アミノプリン −３’−Ｏ− アセチル −２’− デオキシ −５’−Ｏ−ｐ，ｐ’− ジメトキシトリチルリボシド （６）
化合物５（１４．０４７ｍｍｏｌ， １４．８９ｇ）を、ピリジンと共沸し、ピリジン２００ｍｌに溶解し、ＤＭＡＰ（０．２５ｅｑ．， ３．５１１７ｍｍｏｌ， ４２８ｍｇ）、Ｅｔ_３Ｎ（５ｅｑ．，７０．２３５ｍｍｏｌ， ９．７ｍｌ）及びＡｃ_２Ｏ（２．５ｅｑ．， ３５．１１７５ｍｍｏｌ， ３．５８２ｇ）を添加した。これを室温で４．５時間攪拌し、その後ＭｅＯＨ（２ｍｌ）を添加し、この反応混合液を濃縮し、かつ残渣を抽出した（酢酸エチル／水性ＮａＨＣＯ_３）。有機層を乾燥し、溶媒を蒸発し、かつ残渣を酢酸エチル／ヘキサン／Ｅｔ_３Ｎの３０：６０：１、その後６５：３５：３の一段階勾配を用いカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：５．９３ｇ（５．３８５ｍｍｏｌ， ３８％）、黄色泡状物。
【０１５０】
２− ベンジルオキシ −６−（６− アミノヘキシル ）− アミノプリン −３’−Ｏ− アセチル −２’− デオキシリボシド （７）
化合物６（２．４７１ｍｍｏｌ， ２．７２３ｇ）を、アセトニトリル５０ｍｌ／水２ｍｌ中に溶解し、Ｃｅ（ＮＨ_４）_２（ＮＯ_３）_３ （０．３ｅｑ．， ０．７４ｍｍｏｌ， ４０６ｍｇ）を添加した。これを４５分間還流し、その後更に０．１５ｅｑ．のＣｅ（ＮＨ_４）_２（ＮＯ_３）_３ （０．３７ｍｍｏｌ， ２０５ｍｇ）を添加し、かつ還流を１時間続けた。次にこれを蒸発し、残渣をエーテルで粉砕し、ＤＭＴを除去し、不溶性生成物を乾燥し、更に精製することなく使用した。
【０１５１】
２− ベンジルオキシ −６−（６− トリフルオロアセトアミドヘキシル ）− アミノプリン −３’−Ｏ− アセチル −２’− デオキシリボシド （８）
先に得た化合物７（最大５．３８５ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ ３０ｍｌ／トリフルオロ酢酸エチル５Ｏｍｌ／Ｅｔ_３Ｎ ５ｍｌに溶解し、この反応混合液を室温で２１．５時間攪拌した。ＴＬＣ（クロロホルム／１７．５％ ＭｅＯＨ：Ｒ_ｆ＝０．７２）は、完全な転換を示した。これを蒸発させ、残渣を抽出し（ブライン／酢酸エチル）、有機層を乾燥し、溶媒を蒸発させ、かつ残渣を、クロロホルム／１．５％ ＭｅＯＨ、その後１７．５％ＭｅＯＨの一段階勾配を用い、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。収量：２．８０ｇ （４．７１４ｍｍｏｌ， ８７％）泡状物。
【０１５２】
２− ベンジルオキシ −６−（６− トリフルオロアセトアミドヘキシル ）− アミノプリン −３’−Ｏ− アセチル −５’− トリホスホリル −２’− デオキシリボシド （９）
イミダゾール（６１ｅｑ．， ３０６ｍｇ， ４．５ｍｍｏｌ， 再結晶）を、アセトニトリル（３．６ｍＬ）中に溶解し、急冷した（０℃）。その後ＰＯＣｌ_３（１９ｅｑ．， ０．１２８ｍＬ）及びトリエチルアミン（６１ｅｑ．， ０．６３３ｍＬ）を添加し、この混合液を攪拌し（０℃， ０．５時間）、その後一部（０．３０９ｍＬ）を、化合物８（１ｅｑ．， ０．０７４ｍｍｏｌ， ４４ｍｇ）へ添加した。この混合液を攪拌し（室温、０．５時間）、その後ピロリン酸トリブチルアンモニウム （２ｅｑ．， ０．１６ｍｍｏｌ， ７３ｍｇ）を含有するＤＭＦ（１．５ｍＬ）を添加した。その後反応を２４時間後に停止し（２ｍＬ， １０％ＮＨ_４ＣＯＯ）、凍結乾燥した。生成物を、アニオン−交換クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＳＡＸ−１０）により２０％ＭｅＣＮ及び（ＮＨ_４）_２ＣＯ_３／２０％ＭｅＣＮ勾配を用い精製した。収集した生成物を繰り返し凍結乾燥し、過剰な塩を除去した。収量０．００７ｍｍｏｌ（１０％）、白色固形物。
【０１５３】
６−（６− アミノヘキシル ）− アミノプリン −５’− トリホスホリル −２’− デオキシリボシド （１０）
化合物９（０．００７ｍｍｏｌ）は、メタノール（２．５ｍＬ）に溶解し、その後Ｐｄ／Ｃ（１０％， ５ｍｇ）及びＮＨ_４ＣＯＯ（０．０５ｍｍｏｌ， ３１ｍｇ）に添加した。懸濁液を還流し（１時間）、その後触媒を濾過除去し、溶媒を蒸発した。その後残基を２８％水酸化アンモニウム（１．５ｍＬ， ３時間， 室温）で処理し、その後反応液を乾燥し、生成物をアニオン−交換クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＳＡＸ−１０）により２０％ＭｅＣＮ及び（ＮＨ_４）_２ＣＯ_３／２０％ＭｅＣＮ勾配を用い精製した。収集した生成物を繰り返し凍結乾燥し、過剰な塩を除去した。収量０．００６３ｍｍｏｌ（９０％）、白色固形物。
【０１５４】
６−（６− ビオチニルアミドヘキシル ）− アミノプリン −５’− トリホスホリル −２’− デオキシリボシド （１１）
Ｈ_２Ｏ（４０μＬ）を溶媒とする化合物１０（０．８８μｍｏｌ， トリエチルアンモニウム塩）に、ホウ酸ナトリウム（１０．５μＬ， １Ｍ， ｐＨ８．５）を添加し、その後ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２．６μｍｏｌ， ３ｅｑ．）を含有するＤＭＦ（２１６μＬ）を添加した。この反応を進行させ（３時間、５５℃）、その後２０％ＭｅＣＮで希釈し、生成物を、アニオン−交換クロマトグラフィー（Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＳＡＸ−１０）によりＨ_２Ｏ及びＮＨ_４ＨＣＯ_３溶液の勾配を用い精製した。収率はおよそ７０％であった。
【０１５５】
【化２】

【０１５６】
実施例 ５
標識された塩基の取込み及び固体支持体微小球上の捕獲を利用する、ゲノム ＤＮＡ のマルチプレックス遺伝子型タイピング
ゲノムＤＮＡ試料由来の標的化された核酸配列の増幅、クエリー（ｑｕｅｒｙ）、及び捕獲の後、９種類の多型性座位の遺伝子型を決定した。第一の工程であるマルチプレックスＰＣＲ反応は、対形成したＰＣＲプライマーのマルチプレックス化されたセットを含んだ。ＰＣＲプライマーの各対は、公知の多型性部位を包含しているマウスのゲノムＤＮＡの領域とハイブリダイズし、かつ増幅するように設計された第一のプライマーＡ及び第二のプライマーＢを含ませた。第二の工程であるマルチプレックスアレル−特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）反応は、タグを付けたアレル−特異的プライマーのマルチプレックス化されたセットを含ませた。各タグ付けしたアレル−特異的プライマーは、非−標準ヌクレオチド（イソ−Ｇ）を含む５’タグ配列、それに続くｃ３（ｎ−プロピレン）スペーサー、それに続く先のマルチプレックスＰＣＲ工程において増幅されたＤＮＡ鎖のひとつにハイブリダイズするように設計された３’配列を含む。アレル特異性は、各々タグ付けしたアレル−特異的プライマーの３’ヌクレオチドにより決定した。タグ付けしたアレル−特異的プライマーのマルチプレックス化したセットは、マルチプレックスＰＣＲ増幅した配列のセット中に包埋された（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）公知の多型性部位のセットをクエリーするように設計した。標識された三リン酸（ｄＡＴＰ−ビオチン）は、ＡＳＰＥ反応に添加し、その結果タグ付けしたアレル−特異的プライマーのアレル−特異的伸長は、ｄＡＴＰ−ビオチンの取込みを生じさせた。取込まれていないｄＡＴＰ−ビオチンは、引き続きの捕獲工程の前に除去した。
【０１５７】
第三の工程であるマルチプレックスＡＳＰＥ反応生成物の捕獲は、独自のＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）微小球ＩＤ（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に各々共有結合された非−標準ヌクレオチド（イソ−Ｃ）を含む捕獲配列を使用した。これらの捕獲配列は、ＡＳＰＥ反応を進行する際にタグ付けしたアレル−特異的プライマーのセットにおいて使用したタグ付け配列に相補的であった。フィコエリトリンを添加し、伸長されたタグ付けしたアレル−特異的プライマー鎖上のビオチン標識に結合し、かつ蛍光シグナルを発した。捕獲配列とタグ配列間のハイブリダイゼーションの後、微小球を、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）装置に注入し、各々固有の微小球ＩＤと関連したシグナルを検出した。
マウスゲノムの９種の多型性領域を、この実施例において標的化した：
【０１５８】
【表１０】

【０１５９】
下記核酸を、本実施例のマルチプレックスＰＣＲ工程において使用した：
【０１６０】
【表１１】

【０１６１】
【表１２】

【０１６２】
ＰＣＲプライマーを合成し、１ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中に希釈した。ＰＣＲプライマーの一部の上にある６ＦＡＭ又はＣｙ３フルオロ（ｆｌｕｏｒ）は、ポリアクリルアミドゲル上のマルチプレックスＰＣＲ反応を調べることが可能であるように追加した。
【０１６３】
マウスのゲノムＤＮＡ試料は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（バーハーバー、ＭＥ）から購入した。全てのゲノムＤＮＡ試料を、１ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中に５ｎｇ／μＬで希釈した。ＰＣＲ反応成分は以下のようであった：
【０１６４】
【表１３】

【０１６５】
列記した成分の全てのマスターミックスは、最終反応容量２５μＬに対して１．０９Ｘ濃度で調製した。２３μＬのマスターミックスを個々のＰＣＲチューブ内のゲノムＤＮＡ鋳型（５ｎｇ／μＬ）２μＬと一緒にした。陰性対照は、ゲノムＤＮＡ鋳型の代わりに水を含ませた。ＰＣＲ反応は下記のようにサイクリングした：
【０１６６】
【表１４】

【０１６７】
ＰＣＲサイクリング後、各ＰＣＲ反応液２μＬを、マルチプレックスＡＳＰＥ反応において鋳型として作用するために移した。下記の合成核酸は、マルチプレックスＡＳＰＥ反応のタグ付けしたアレル−特異的（ＴＡＳ）プライマーとして使用した：
【０１６８】
【表１５】

【０１６９】
ＡＳＰＥ反応の成分は以下のようにした：
【０１７０】
【表１６】

【０１７１】
ＴＡＳプライマー以外の前記成分全てを含有するマスターミックスは、１．３６Ｘで調製した。各ＡＳＰＥ反応液は、１１μＬのマスターミックス、２μＬのマルチプレックスＴＡＳプライマー混合物（各０．５μＭ）、２μＬのＰＣＲ反応物（先の工程より）からなる。ＡＳＰＥ反応は、下記のようにサイクリングした：
【０１７２】
【表１７】

【０１７３】
ＡＳＰＥサイクリングの後、１０μＬの反応物を、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液５μＬと一緒にし、ポリメラーゼ活性を停止した。この反応液を、Ｇ−５０カラム上で精製し、取込まれていないｄＡＴＰ−ビオチンを除去した。その後精製したマルチプレックスＡＳＰＥ反応液をＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）微小球（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、ヒューストン、ＴＸ）に連結された捕獲配列によりデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）した。連結微小球は下記の通りである：
【０１７４】
【表１８】

【０１７５】
連結された微小球は、保存用緩衝液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＰＥＧ８０００、０．０５％ＳＤＳ）中で各微小球ＩＤを同数含有する混合物となるように合わせた。捕獲ハイブリダイゼーション反応の成分は以下の通りである：
【０１７６】
【表１９】

【０１７７】
列記した成分全てのマスターミックスは、６０μＬの最終反応体積に対して１．２Ｘ濃度で調製した。５０μＬのマスターミックスを精製したマルチプレックスＡＳＰＥ反応液１０μＬと一緒にし、室温で１０分間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション用緩衝液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＰＥＧ８０００、０．０５％ＳＤＳ）中のストレプトアビジンフィコエリトリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージン、ＯＲ）の０．０１ｍｇ／ｍＬ溶液１０μＬを各捕獲ハイブリダイゼーション反応液に添加し、その後Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）装置に注入した。
【０１７８】
各捕獲ハイブリダイゼーション反応に関して、５５μＬをＬｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）に６０μＬ／分の速度で注入し、各微小球ＩＤの５０個を計測するまで読取りを継続した。蛍光強度の中央値を、各微小球ＩＤに関連した蛍光シグナルの測定値として使用した。この結果は図１４に示した。
【０１７９】
実施例 ６
標識された非 − 標準塩基の部位 − 特異的取込み及び固体支持体微小球上の捕獲を使用する、ゲノム ＤＮＡ のマルチプレックス化された遺伝子型タイピング
ゲノムＤＮＡ試料由来の標的化された核酸配列の増幅、クエリー、及び捕獲の後、９種類の多型性座位の遺伝子型を決定した。第一の工程であるマルチプレックスＰＣＲ反応は、対形成したＰＣＲプライマーのマルチプレックス化されたセットを含んだ。ＰＣＲプライマーの各対は、第一のプライマーＡ及び第二のプライマーＢを含み、第二のプライマーＢは、その５’末端近傍に非−標準ヌクレオチド（イソ−Ｃ）を含んだ。各プライマー対は、公知の多型性部位を包含しているマウスゲノムＤＮＡの領域とハイブリダイズし、増幅するように設計した。次工程であるマルチプレックスアレル−特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）反応は、タグを付けたアレル−特異的プライマーのマルチプレックス化されたセットを含ませた。各タグ付けしたアレル−特異的プライマーは、非−標準ヌクレオチド（イソ−Ｇ）を含む５’タグ配列、それに続くｃ３（ｎ−プロピレン）スペーサー、それに続く先のマルチプレックスＰＣＲ工程において増幅されたＤＮＡ鎖のひとつにハイブリダイズするように設計した３’配列を含ませた。アレル特異性は各々タグ付けしたアレル−特異的プライマーの３’ヌクレオチドにより決定した。タグ付けしたアレル−特異的プライマーのマルチプレックス化したセットは、マルチプレックスＰＣＲ増幅した配列のセット中に包埋された公知の多型性部位のセットをクエリーするように設計した。標識された非−標準三リン酸（イソＧＴＰ−ビオチン）をＡＳＰＥ反応に添加し、その結果タグ付けしたアレル−特異的プライマーのアレル−特異的伸長は、マルチプレックスＰＣＲ反応を進行する際に作成された鋳型鎖の非−標準ヌクレオチド（イソ−Ｃ）の対向側の標識された非−標準三リン酸（イソＧＴＰ−ビオチン）の取込みを生じさせた。取込まれなかったイソＧＴＰ−ビオチンは、その後の捕獲工程の前に除去した。
【０１８０】
第三の工程であるマルチプレックスＡＳＰＥ反応生成物の捕獲は、固有のＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）微小球ＩＤに各々共有結合された非−標準ヌクレオチド（イソ−Ｃ）を含む捕獲配列を使用した。これらの捕獲配列は、前に行ったＡＳＰＥ反応の際にタグ付けしたアレル−特異的プライマーのセットにおいて使用したタグ配列に相補的である。フィコエリトリンを添加して伸長されたタグ付けしたアレル−特異的プライマー鎖上のビオチン標識に結合させ、蛍光シグナルを生じさせた。捕獲配列とタグ配列間のハイブリダイゼーションの後、微小球を、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）装置に注入し、各々固有の微小球ＩＤと関連するシグナルを検出した。
この実施例においてマウスゲノムの９種の多型性領域を標的化した：
【０１８１】
【表２０】

【０１８２】
下記核酸を本実施例のマルチプレックスＰＣＲ工程において使用した：
【０１８３】
【表２１】

【０１８４】
【表２２】

【０１８５】
ＰＣＲプライマーを合成し、１ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中に希釈した。マウスのゲノムＤＮＡ試料は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（バーハーバー、ＭＥ）から購入した。全てのゲノムＤＮＡ試料を、１ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中に５ｎｇ／μＬで希釈した。ＰＣＲ反応成分は以下の通りである：
【０１８６】
【表２３】

【０１８７】
列記した成分の全てのマスターミックスは、最終反応体積２５μＬに対して１．０９Ｘ濃度で調製した。２３μＬのマスターミックスを個々のＰＣＲチューブ内のゲノムＤＮＡ鋳型（５ｎｇ／μＬ）の２μＬと一緒にした。陰性対照は、ゲノムＤＮＡ鋳型の代わりに水を含ませた。ＰＣＲ反応は下記のようにサイクリングした：
【０１８８】
【表２４】

【０１８９】
ＰＣＲサイクリング後、２μＬの各ＰＣＲ反応物を、マルチプレックスＡＳＰＥ反応において鋳型として機能させるために移した。下記の合成核酸は、マルチプレックスＡＳＰＥ反応におけるタグ付けアレル−特異的（ＴＡＳ）プライマーとして使用した：
【０１９０】
【表２５】

【０１９１】
ＡＳＰＥ反応の成分は以下の通りである：
【０１９２】
【表２６】

【０１９３】
前記成分全てを含有するマスターミックスは、１．１５Ｘで調製した。各ＡＳＰＥ反応液は、１３μＬ マスターミックス及び２μＬ ＰＣＲ反応（先の工程より）からなる。ＡＳＰＥ反応は、下記のようにサイクリングした：
【０１９４】
【表２７】

【０１９５】
ＡＳＰＥサイクリングの後、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液５μＬを、マルチプレックスＡＳＰＥ反応液へ添加し、ポリメラーゼ活性を停止した。この反応液を、Ｇ−５０カラム上で精製し、取込まれていないｄ−イソＧＴＰ−ビオチンを除去した。その後精製したマルチプレックスＡＳＰＥ反応液を、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）微小球（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、ヒューストン、ＴＸ）に連結された捕獲配列によりデコンボリューションした。連結微小球は下記の通りである：
【０１９６】
【表２８】

【０１９７】
連結微小球は、保存用緩衝液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＰＥＧ８０００、０．０５％ＳＤＳ）中で、各微小球ＩＤを同数含有する混合物となるように合わせた。捕獲ハイブリダイゼーション反応の成分は以下の通りである：
【０１９８】
【表２９】

【０１９９】
列記した成分全てのマスターミックスは、６０μＬの最終反応体積に対して１．２Ｘ濃度で調製した。５０μＬのマスターミックスを精製したマルチプレックスＡＳＰＥ反応液１０μＬと一緒にし、室温で１０分間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション用緩衝液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＰＥＧ８０００、０．０５％ＳＤＳ）中のストレプトアビジンフィコエリトリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージン、ＯＲ）の０．０１ｍｇ／ｍＬ溶液の１０μＬを、各捕獲ハイブリダイゼーション反応液に添加し、その後Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）装置に注入した。
【０２００】
各捕獲ハイブリダイゼーション反応のために、５５μＬをＬｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）に６０μＬ／分の速度で注入し、各微小球ＩＤの５０個を計測するまで読取りを継続した。蛍光強度の中央値を各微小球ＩＤに関連した蛍光シグナルの測定値として使用した。この結果は図１５に示した。
【０２０１】
本発明は、先に説明した具体例に限定されると考えてはならず、添付の「特許請求の範囲」において明瞭に記載された本発明の全ての側面を包含すると解するべきである。、本明細書を参照すれば、様々な修飾、同等の方法、更には本発明を利用可能な多くの構造は本発明が対象としている当業者には容易に明らかとなるであろう。
【０２０２】
実施例 ７
レポーターオリゴヌクレオチドのアレル特異的伸長産物に対する位置 − 特異的ライゲーション及び固体支持体微小球上の捕獲を利用するゲノム ＤＮＡ の遺伝子型タイピング
ゲノムＤＮＡ試料由来の標的核酸配列の増幅、クエリー、及び捕獲の後、多型性座位の遺伝子型を決定した。第一の工程であるＰＣＲ反応は、以下のＰＣＲプライマーのセットを含ませた：第一のプライマーＡ及び第二のプライマーＢ。第二のプライマーＢは、検体特異的及び非相補的部分の接合点にイソ−Ｃを有する標的と相補的でない５’配列を含んだ。このプライマー対は、公知の多型性部位を包含しているマウスゲノムＤＮＡの領域とハイブリダイズし、かつ増幅するように設計した。第二の工程であるアレル−特異的プライマー伸長（ＡＳＰＥ）反応は、タグを付けたアレル−特異的プライマーのセットを含ませた。各タグ付けしたアレル−特異的プライマーは、非−標準ヌクレオチド（イソ−Ｇ）を含む５’タグ配列、それに続くｃ３スペーサー、それに続く先のＰＣＲ工程において増幅されたＤＮＡ鎖のひとつにハイブリダイズするように設計した３’配列を含ませた。アレル特異性は、各々タグ付けしたアレル−特異的プライマーの３’ヌクレオチドにより決定した。タグ付けしたアレル−特異的プライマーのセットは、増幅した配列に包埋された公知の多型性部位をクエリーするように設計した。ＡＳＰＥ反応にはＤＮＡリガーゼ並びに５’リン酸及び３’ビオチン修飾を含むレポーターオリゴヌクレオチドを含ませた。このレポーターオリゴヌクレオチドは、クエリーされるアンプリコンの作製に使用したプライマーＢの５’領域に相補的である。この非−標準塩基含有領域を含む増幅産物の鎖をＡＳＰＥ反応の鋳型として利用した。アレル特異的プライマーの伸長の間に、ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型鎖のイソ−Ｃの前の塩基で停止し、その結果、レポーターオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしている一本鎖領域を残した。伸長されたＡＳＰＥプライマー、鋳型、及びレポーターオリゴヌクレオチドの間の複合体は、ＤＮＡリガーゼのライゲーションに適したニック構造を生じる。
【０２０３】
第三の工程であるマルチプレックスＡＳＰＥ反応生成物の捕獲は、固有のＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）微小球ＩＤに各々共有結合された非−標準ヌクレオチド（イソ−Ｃ）を含む捕獲配列を使用した。これらの捕獲配列は、前に行ったＡＳＰＥ反応の際にタグ付けアレル−特異的プライマーセットにおいて使用したタグ配列に相補的である。ストレプトアビジン−フィコエリトリンを添加し、伸長されかつライゲーションされたアレル−特異的プライマー鎖上のビオチン標識に結合させ、蛍光シグナルを生じさせた。捕獲配列とタグ配列の間のハイブリダイゼーションの後、微小球をＬｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）装置に注入し、各々固有の微小球ＩＤと関連したシグナルを検出した。
マウスゲノムの単独の多型性領域を、この実施例において標的化した：
【０２０４】
【表３０】

【０２０５】
マウスのゲノムＤＮＡ試料は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（バーハーバー、ＭＥ）から購入した。全てのゲノムＤＮＡ試料を、１ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中に１０ｎｇ／μＬで希釈した。ＰＣＲ反応成分は以下の通りである：
【０２０６】
【表３１】

【０２０７】
列記した成分の全てのマスターミックスは、最終反応体積３０μＬに対して１．０７Ｘ濃度で調製した。２３μＬのマスターミックスを個々のＰＣＲチューブ内のゲノムＤＮＡ鋳型（５ｎｇ／μＬ）の２μＬと一緒にした。陰性対照は、ゲノムＤＮＡ鋳型の代わりに水を含ませた。ＰＣＲ反応は下記のようにサイクリングした：
【０２０８】
【表３２】

【０２０９】
ＰＣＲサイクリング後、５Ｕ／μｌラムダエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、ＭＡ）３μｌを各反応液に添加し、ＰＣＲプライマーＡにより作製されたアンプリコンの非−鋳型鎖を除去した。ラムダエキソヌクレアーゼの添加後、この反応チューブを３７℃で５分間加熱し、その後９５℃で２分間加熱した。この消化の後、各ＰＣＲ反応液１μｌをＡＳＰＥ反応の鋳型として作用するために移した。下記核酸配列、ＡＳＰＥ反応においてタグ付けしたアレル−特異的（ＴＡＳ）プライマーとして使用した：
【０２１０】
【表３３】

【０２１１】
ＡＳＰＥ反応の成分は以下の通りである：
【０２１２】
【表３４】

【０２１３】
前記成分全てを含有するマスターミックスは、１．１１Ｘで調製した。各ＡＳＰＥ反応液は、９μＬ マスターミックス及び１μＬ ＰＣＲ反応（先の工程より）からなる。ＡＳＰＥ反応は、下記のようにサイクリングした：
【０２１４】
【表３５】

【０２１５】
ＡＳＰＥサイクリングの後、この反応液を、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）微小球（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、ヒューストン、ＴＸ）に連結された捕獲配列によりデコンボリューションした。この連結微小球は下記の通りである：
【０２１６】
【表３６】

【０２１７】
この連結された微小球は、保存用緩衝液（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＰＥＧ８０００、０．０５％ＳＤＳ）中で各微小球ＩＤを同数含有するように混合した。捕獲ハイブリダイゼーション反応の成分は以下の通りである：
【０２１８】
【表３７】

【０２１９】
前記成分全てを含むマスターミックスは、６０μＬの最終反応体積に対して１．２Ｘ濃度で調製した。５０μＬのマスターミックスを各ＡＳＰＥ反応液に添加し、室温で１０分間ハイブリダイズさせた。ストレプトアビジンフィコエリトリン（０．０７５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＰＥＧ８０００、０．０５％ＳＤＳ） （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージン、ＯＲ）の溶液１０μＬを各捕獲ハイブリダイゼーション反応液に添加し、その後Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）装置に注入した。
【０２２０】
各捕獲ハイブリダイゼーション反応のために、反応混合液４５μＬを、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００（登録商標）に６０μＬ／分の速度で注入し、各微小球ＩＤの１００個を計測するまで読取りを継続した。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を各ＩＤに関連した蛍光シグナルの測定値として使用した。この結果は図１７に示した。
【０２２１】
前記例において、５’側非−相補的配列及び検体−特異的配列の接合部におけるプライマーＢの非−標準塩基は、タグ配列及び検体特異的配列の接合部でのポリメラーゼによる伸長を妨害するように設計した。例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのような２’−Ｏ−メチル塩基を含む、他の適当なリンカーを使用し、ポリメラーゼを停止することができることが特に想定されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、多くの非−標準塩基の化学構造を示す（式中、Ａは高分子骨格への結合点であり、ＸはＮ又はＣ−Ｚであり、ＹはＮ又はＣ−Ｈであり、及びＺはＨ又は置換もしくは未置換のアルキル基である。）。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、本発明の固体支持体へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのふたつの例を概略的に説明している。
【図３】図３は、本発明の、検体−特異的配列の第一のアッセイにおける工程を図示している。
【図４】図４は、本発明の、検体−特異的配列の第二のアッセイにおける工程を図示している。
【図５】図５は、本発明の、検体−特異的配列の第三のアッセイにおける工程を図示している。
【図６】図６は、本発明の、検体−特異的配列の第四のアッセイにおける工程を図示している。
【図７】図７は、本発明の、検体−特異的配列の第五のアッセイにおける工程を図示している。
【図８】図８は、本発明の、検体−特異的配列の第六のアッセイにおける工程を図示している。
【図９】図９は、本発明の、検体−特異的配列の第七のアッセイにおける工程を図示している。
【図１０】図１０は、本発明の、検体−特異的配列の第八のアッセイにおける工程を図示している。
【図１１】図１１は、本発明の、検体−特異的配列の第九のアッセイにおける工程を図示している。
【図１２】図１２は、９８種の分子認識配列（ｙ−軸）に関する、１００種の分子認識配列の各々についての相補的タグ配列（ｘ−軸）のハイブリダイゼーションを説明する、３Ｄ表面図である。
【図１３】図１３は、５０種の分子認識配列（ｙ−軸）に関する、５０種の分子認識配列の各々についての相補的タグ配列（ｘ−軸）のハイブリダイズを説明する、３Ｄ表面図である。
【図１４】図１４は、本発明のアレルアッセイ結果を説明するグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の別のアレルアッセイ結果を説明するグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の、検体−特異的配列の第十のアッセイにおける工程を図示している。
【図１７】図１７は、本発明のアレルアッセイ結果を説明するグラフである。

Claims (25)

1. 試料中の標的オリゴヌクレオチドのアッセイ方法であって：
   （ａ）少なくとも１種の捕獲オリゴヌクレオチドを、標的オリゴヌクレオチドが前記捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするために適切なハイブリダイゼーション条件下で試料と接触させる工程であって、前記捕獲オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の非−標準塩基を含む分子認識配列を含み、前記捕獲オリゴヌクレオチドは支持体に結合しており、前記標的オリゴヌクレオチドが捕獲オリゴヌクレオチドの分子認識配列に相補的なタグ配列及び検体−特異的配列又は検体−特異的配列の相補配列を含む、前記工程；
   （ｂ）前記標的オリゴヌクレオチドと前記捕獲オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出する工程
   を含む、前記アッセイ方法。
2. 支持体が、単一の固体支持体を含む、請求項１記載の方法。
3. 支持体が固体粒子を含む、請求項１記載の方法。
4. 支持体が、少なくとも２種の異なる型の捕獲オリゴヌクレオチドを含み、捕獲オリゴヌクレオチドの各型の配列は他の型の捕獲オリゴヌクレオチドの分子認識配列と少なくとも１塩基が異なり、かつ標的オリゴヌクレオチドのタグ配列が前記捕獲オリゴヌクレオチドの一つの型の分子認識配列と相補的である、請求項１記載の方法。
5. 少なくとも２種の異なる型の捕獲オリゴヌクレオチドが複数の支持体に結合しており、各前記捕獲オリゴヌクレオチドの各型の分子認識配列は少なくとも互いに１塩基が異なり、かつ各標的オリゴヌクレオチドが前記捕獲オリゴヌクレオチドの一つの型の分子認識配列と相補的であるタグ配列を含む、請求項１記載の方法。
6. 複数の支持体が少なくとも二つの群を形成し、各群がそのメンバーを他の群のメンバーと識別する特徴を有する、請求項５記載の方法。
7. 各支持体群上の捕獲オリゴヌクレオチドが、他の支持体群上のものとは異なる配列を有する、請求項６記載の方法。
8. 標的オリゴヌクレオチドが更に、レポーター又はカップリング部分を含み、検出する工程が、支持体に会合したレポーター又はカップリング部分の存在を検出することを含む、請求項１記載の方法。
9. レポーター又はカップリング部分が非−標準塩基と会合する、請求項８記載の方法。
10. 接触させる工程が、中又は高ストリンジェンシー条件下で実行される、請求項１記載の方法。
11. 接触させる工程が、高ストリンジェンシー条件下で実行される、請求項１０記載の方法。
12. 少なくとも１種の標的オリゴヌクレオチドが、
    少なくとも１種の検体−特異的配列を含む検体を、少なくとも１種のプライマー対と接触させることであって、前記プライマー対の各々は標的オリゴヌクレオチドタグ配列及び検体の第一の配列に相補的な配列を含む第一のプライマー及び検体の第二の配列に相補的な配列を含む第二のプライマーを含むプライマー対であり；および、
    第一及び第二のプライマーを酵素的に伸長させ、標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを形成させることであって、標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドの一方は検体−特異的配列を含み、他方は検体−特異的配列に相補的な配列を含むように調製される、請求項１記載の方法。
13. 第二のオリゴヌクレオチドがレポーター又はカップリング部分を含む、請求項１２記載の方法。
14. 標的オリゴヌクレオチドのタグ配列が第一の配列及び第二の配列を含み、前記第一の配列が標的オリゴヌクレオチドの５’末端に位置し、かつ前記第二の配列が標的オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する、請求項１記載の方法。
15. 第一及び第二のプライマーの少なくとも一方が第一のアレル−特異的プライマーであり、更に検体を前記第一のアレル−特異的プライマーとは異なる少なくとも１種の追加のアレル−特異的プライマーと接触させることを含む、請求項１２記載の方法。
16. 標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドの両方がタグ配列を含み、捕獲オリゴヌクレオチドが第一の分子認識配列及び第一の分子認識配列にリンカーを介して結合した第二の分子認識を含み、前記第一及び前記第二の分子認識配列の各々が前記標的オリゴヌクレオチド及び前記第二のオリゴヌクレオチドのタグ配列に相補的である、請求項１２記載の方法。
17. 更に、第二のオリゴヌクレオチドを捕獲オリゴヌクレオチドに共有結合させ、標的オリゴヌクレオチドを除去することを含む、請求項１２記載の方法。
18. 共有結合の工程が、第二のオリゴヌクレオチドの捕獲オリゴヌクレオチドへのライゲーションを含む、請求項１７記載の方法。
19. 試料中の標的オリゴヌクレオチドのアッセイ方法であり：
    （ａ）支持体に結合した捕獲オリゴヌクレオチドを、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするに適切なハイブリダイゼーション条件下で試料と接触させる工程であって、前記標的オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の非−標準塩基を含むタグ配列及び検体−特異的配列又はそれらの相補配列を含み、前記捕獲オリゴヌクレオチドが検体−特異的配列と同じ又は相補的な配列を含む分子認識配列を含む、前記工程；
    （ｂ）前記標的オリゴヌクレオチドを鋳型として用い、前記捕獲オリゴヌクレオチドを酵素的に伸長し、タグ配列の非−標準塩基に対向する相補的非−標準塩基を取込む工程；並びに
    （ｃ）レポーター又はカップリング部分を捕獲オリゴヌクレオチドの伸長された部分に取込む工程、及び
    （ｄ）レポーター又はカップリング部分の取込みを検出することにより、試料中の標的オリゴヌクレオチドの存在を検出する工程、
    を含む前記アッセイ方法。。
20. 標的オリゴヌクレオチドのアッセイ方法であって：
    （ａ）検体−特異的配列を含む検体を第一のプライマー及び第二のプライマーと接触させる工程であって、前記第一のプライマーがタグ配列及び検体の第一の配列に相補的な配列を含み、第二のプライマーが検体の第二の配列に相補的な配列及び非−標準塩基を含む前記工程；
    （ｂ）前記第一及び前記第二のプライマーを酵素的に伸長し、標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを形成する工程であって、前記標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドの一方は検体−特異的配列を含み、他方は検体−特異的配列に相補的な配列を含み、前記第一のプライマーの伸長が前記第二のプライマーの非−標準塩基に対向する位置で実質的に停止する、前記工程；
    （ｃ）前記第二のプライマーの非−標準塩基に対向させて、相補的非−標準塩基を伸長させた第一のプライマーに取込む工程；
    （ｄ）支持体に結合した捕獲オリゴヌクレオチドを、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするに適切な条件下で標的オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、前記標的オリゴヌクレオチドはタグ配列及び検体−特異的配列又は検体−特異的配列の相補配列を含み、前記捕獲オリゴヌクレオチドは検体−特異的配列の少なくとも一部と同じ又は相補的である分子認識配列を含む、前記工程；及び
    （ｅ）標的オリゴヌクレオチドの捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを検出する前記工程、
    を含む、前記アッセイ方法。
21. ゲノムＤＮＡを含有する試料中の少なくとも２種のアレルを同時に検出する方法であり：
    （ａ）試料と、第一のプライマー及び第二のプライマーを含む少なくとも２種のプライマー対とを、前記プライマー対の前記第一及び前記第二のプライマーの各々がゲノムＤＮＡとハイブリダイズする条件下で接触させる工程；
    （ｂ）前記各プライマー対の前記第一及び前記第二のプライマーに挟まれるＤＮＡ配列を増幅させる工程；
    （ｃ）工程（ｂ）において増幅されたＤＮＡ配列を、少なくとも２種のタグ付けられたアレル−特異的プライマーとハイブリダイズさせる工程であって、各前記タグ付けされたアレル特異的プライマーが、５’から３’方向へ順に、少なくとも１個の非−標準ヌクレオチドを含む５’タグ配列、リンカー、及び工程（ｂ）で増幅された配列とハイブリダイズすることが可能な３’配列を含むプライマーである、前記工程；
    （ｄ）標識された三リン酸塩基の存在下で工程（ｃ）のアレル−特異的プライマーを酵素的に伸長し、標識された伸長産物を形成させる工程；
    （ｅ）工程（ｄ）の伸長産物を、支持体に結合した少なくとも２種の捕獲オリゴヌクレオチドと、伸長産物にハイブリダイズするに適切なハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、前記伸長産物が少なくとも１種の非−標準塩基及びアレル−特異的配列を含むタグ配列を含み、前記捕獲オリゴヌクレオチドがタグ配列と相補的な配列を含む分子認識配列を含み、前記分子認識配列が前記非−標準塩基と相補的な非−標準塩基を含む、前記工程；及び
    （ｆ）少なくとも２種の捕獲オリゴヌクレオチドに対する少なくとも伸長産物のハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、方法。
22. 工程（ａ）の各プライマー対の一方のプライマーが第一の非−標準塩基を含み、該プライマーの伸長産物が工程（ｃ）のアレル−特異的プライマーと相補的であり、工程（ｄ）の標識された非−標準三リン酸塩基が工程（ａ）のプライマーの第一の非−標準塩基と相補的であり、かつ工程（ｄ）の伸長産物が第一の非−標準塩基を含むプライマーの伸長産物の第一の非−標準塩基と対向する標識された第二の非−標準塩基を含む、請求項２１記載の方法。
23. 工程（ａ）の各プライマー対の一方のプライマーが、３’から５’方向へ順に、工程（ａ）のゲノムＤＮＡとハイブリダイズする３’領域、前記ゲノムＤＮＡにハイブリダイズしない非−標準塩基、及び前記ゲノムＤＮＡに非−相補的な５’配列を含み、前記プライマーの伸長産物が工程（ｃ）のアレル−特異的プライマーと相補的であり、工程（ｄ）の産物の伸長はプライマーの非−標準塩基と対向する相補的非−標準塩基、第一の非−標準塩基の領域を含まない、請求項２１記載の方法。
24. 標的オリゴヌクレオチドのアッセイ方法であって：
    （ａ）検体−特異的配列を含有する検体を第一のプライマー及び第二のプライマーと接触させる工程であって、前記第二のプライマーが、５’から３’方向へ順に、非−相補的配列、非−標準塩基、及び検体−特異的配列を含む、前記工程；
    （ｂ）プライマーを酵素的に伸長し、標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを形成する工程であって、前記標的オリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドの一方が検体−特異的配列を含み、他方が検体−特異的配列に相補的な配列を含む、前記工程；
    （ｃ）工程（ｂ）の第二のプライマーの伸長産物に、５’から３’方向へ順に、非−標準塩基を含む５’タグ配列、リンカー、及び第二のプライマーの伸長産物に相補的な３’配列を含むタグ付けしたアレル−特異的プライマーをハイブリダイズさせる工程；
    （ｄ）工程（ｃ）のアレル−特異的プライマーを酵素的に伸長する工程；
    （ｅ）工程（ａ）の第二のプライマーの５’側非−相補的配列に相補的なレポーターオリゴヌクレオチドを、工程（ｄ）の伸長産物にハイブリダイズさせる工程であって、前記レポーターオリゴヌクレオチドが５’リン酸及びレポーター部分を含み、リガーゼによるライゲーションに適したニック構造を形成する工程；
    （ｆ）工程（ｅ）のニック構造をリガーゼと接触させ、レポーターオリゴヌクレオチドをアレル−特異的伸長産物に連結する工程；
    （ｇ）支持体に結合した捕獲オリゴヌクレオチドを、工程（ｆ）のライゲーション産物と接触させる工程；並びに
    （ｈ）ライゲーションされたオリゴヌクレオチドの捕獲オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを検出する工程、
    を含む前記方法。
25. 検体をアッセイするためのキットであり：
    支持体；
    支持体に結合した捕獲オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１個の非−標準塩基を有する分子認識配列を含む前記捕獲オリゴヌクレオチド；
    タグ配列及び検体の第一の配列に相補的な配列を含む第一のプライマー；および、
    検体の第二の配列に相補的な配列を含む第二のプライマー、
    を含む前記キット。

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