CN104684921A - 用于暂时性生物缀合物合成的具有二芳基硫化物骨架的光可裂解的衔接物分子 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及光可裂解的化合物，其可用作连接两个生物分子的光可裂解的衔接物，所述生物分子为例如寡核苷酸和肽。本申请还涉及所述光可裂解的化合物的合成方法。

Description

用于暂时性生物缀合物合成的具有二芳基硫化物骨架的光可裂解的衔接物分子
技术领域
本申请涉及光可裂解的化合物，其可用作连接两个生物分子的光可裂解的衔接物(linker)，所述生物分子为例如寡核苷酸和肽。本申请还涉及所述光可裂解的化合物的合成方法。
背景技术
光可裂解的化合物作为保护基在阻断核苷、核苷酸、糖和氨基酸中存在的官能团中发挥重要作用，其可用于合成生物分子例如核苷酸及其衍生物、蛋白质、肽和碳水化合物。上述化合物具有以下优点：保护的官能团可经由光暴露简单地进行脱保护。因此，光可裂解的化合物为寡核苷酸或肽在固体载体例如微阵列上基于光刻的空间解析合成提供基础。对光不稳定的化合物在微阵列合成中的用途是公知的(Pease等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(1994)5022-5026,Hasan等人,Tetrahedron 53(1997)4247-4264)。
光可裂解的化合物还可用作连接不同组成部分的光可裂解的衔接物分子，所述不同组成部分为例如两个生物分子、一个生物分子和一个固相、一个生物分子和一个抗生蛋白链菌素。例如，两个不同的寡核苷酸可经由光可裂解的化合物连接，从而向生物化学或生物学测试递送单链分子，其经光照射释放两个单独的寡核苷酸，然后所述寡核苷酸可形成双链DNA并展现出生物学功能。另一个可能的应用是寡核苷酸可经由光可裂解的化合物与生物素分子连接，使得寡核苷酸可通过亲和纯化捕获例如被来自测定的抗生蛋白链菌素包衣的磁珠捕获且接着可用光照射从亲和树脂释放。
另一个可能的应用是当寡核苷酸为蛋白结合适体时，上述寡核苷酸-光可裂解的化合物-生物素结构可用于下拉(pull-down)纯化或测定。
通过上述化合物进行光可裂解连接的组成部分由于光暴露而可彼此简单地分离。上述组分是公知的(Olejnik等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7590-7594；Olejnik等人,Nucleic Acids Res.26(1998)3572-3576；Olejnik等人,Nucleic Acids Res.27(1999)4626-4631)。
本领域所述光可裂解的化合物的主要缺点是为了裂解光可裂解的化合物必须使用用于裂解共价键的近UV范围的光(365nm或更短)。适于产生上述波长的光源为例如汞弧光灯、受激准分子激光器、UV-LED和倍频固态激光器。上述光源特征在于高购买成本，提供有限的发光功率并具有短寿命，这导致运行的总成本高。因为一些上述光源含有有害物质例如汞，采取适当措施确保职业安全和妥善处置是必要的，这进一步增加了成本。
一些上述光源产生宽波长谱，例如汞弧光灯发射UV至IR范围的光，如果用于生物分子的情况下，所述两种光都具有不利的影响。UV光例如可被合成的DNA吸收，这导致由磷酸酯骨架基团裂解引起的链内随机断裂、鸟嘌呤碱基氧化和随后的链断裂或光二聚化(尤其是胸腺嘧啶碱基)。此外，UV光还可导致某些氨基酸的破坏，例如通过基团氧化破坏色氨酸或通过硫氧化破坏半胱氨酸和甲硫氨酸。因此，涉及生物分子的实验受上述UV光用于裂解光可裂解的化合物的影响。相反，IR光导致实验装置的升温，这也影响实验结果。
因此，本申请的目的是提供不表现出上述缺点的光可裂解的化合物。
发明内容
本申请涉及光可裂解的化合物，其可用作连接两个生物分子的光可裂解的衔接物，所述生物分子为例如寡核苷酸和肽。一经用可见光照射，所述衔接物裂解，从而释放两个生物分子。更准确地讲，本申请涉及光可裂解的下式化合物：
[式I]
其中A为-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH(CH3)-CH2-，且R3为H、甲基或乙基，且R2为亚磷酰胺(phosphoramidite)、H-磷酸酯、磷酸二酯或磷酸三酯，其中当R2为式-O-P(O)-(OR4)-(OH)的磷酸二酯时，R4为烷基或取代的烷基或核苷或寡核苷酸，且其中当R2为式-O-P(O)-(OR4)-(OR5)的磷酸三酯时，R4和R5各自为烷基或取代的烷基或核苷或寡核苷酸，或R4和R5一起形成寡核苷酸的核苷酸间部分，且R1为苯基酰胺(phenylcarboxylicamide)，其中官能团经由氨基与所述苯基酰胺连接。
本申请还涉及上述光可裂解的化合物的制备方法，其包括以下步骤：a)提供对二乙基苯(p-diethylbenzene)作为起始物质，b)对苯基环进行溴化，c)将所得化合物在硝酸和硫酸中在溴的对位进行硝化，d)纯化和结晶，e)在苄位(benzylic position)将化合物进行羟基甲基化，f)使用取代的苯硫酚将芳族溴基团转化为芳基硫化物，g)纯化，h)将醇转化为氯甲酸酯，i)使所述氯甲酸酯与核苷反应并使核苷与亚磷酸化试剂反应，或使所述氯甲酸酯与氨基酸衍生物反应。
附图说明
图1：本图显示作为用于寡核苷酸合成的构建砌块的光可裂解的间隔物酰胺(amidite)。
图2：本图显示作为用于寡核苷酸合成的构建砌块的光可裂解的氨基修饰物(modifier)酰胺。
图3：本图显示作为用于寡核苷酸合成的构建砌块的光可裂解的生物素修饰物酰胺。
图4：本图显示光可裂解的衔接物连接的两个示例性寡核苷酸和经光照射的裂解位点的标示。
具体实施方式
下列定义用于说明和定义本申请所用多个术语的意思和范围。
基团-A-O-中的字母A表示包含1至2个直链共价连接的原子的“片段衔接物(fragmentation linker)”，例如亚甲基或亚乙基。本申请所用的术语“片段衔接物”是本领域技术人员已知的且是指这样的部分，其用作光化学中通过将初始光学过程(primary photoprocess)转化成化学裂解反应影响光可裂解的化合物的光诱导裂变的部分。
术语“烷基”表示具有1至12个碳原子的单价的直链或支链的饱和烃基。在具体实施方案中，烷基具有1至7个碳原子且在更具体的实施方案中具有1至4个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
术语“氨基”表示式-NR’R”的基团，其中R’和R”独立地地为氢、烷基、烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。可替换地，R’和R”可与它们所连接的氮一起形成杂环烷基。术语“伯氨基”表示其中R’和R”均为氢的基团。术语“仲氨基”表示其中R’为氢且R”不为氢的基团。术语“叔氨基”表示其中R’和R”均不为氢的基团。具体的仲胺和叔胺为甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、苯胺、苄胺、二甲胺、二乙胺、二丙胺和二异丙胺。
术语“芳基”表示包含6至10个碳环原子的单价芳族碳单环或二环。芳基部分的实例包括苯基和萘基。
本申请所用的术语“生物分子”是本领域技术人员已知的且是指由有生命的有机体产生的任意有机分子或上述化合物的任意人造衍生物，其包括大聚合物分子例如蛋白质、多糖、碳水化合物、脂质、核酸和寡核苷酸及小分子例如初级代谢产物、次级代谢产物和天然产物。
本申请所用的术语“官能团”是本领域技术人员已知的且是指原子的多种组合中的任意一种，其形成化学分子中的部分、自身经历特征性反应且在多种情况下影响分子中其余部分的反应性。典型的官能团为羟基、羧基、醛、羰基、氨基、叠氮、炔基、巯基和腈。
术语“杂芳基”表示具有5至12个环原子的单价芳族杂环的单环或二环系统，所述环原子包括1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，其余环原子为碳。杂芳基部分的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮杂基、二氮杂基、异噁唑基、苯并呋喃基、异噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、异苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基或喹喔啉基。
本申请所用的术语“核苷酸间部分”是本领域技术人员已知的且是指任意在两个核苷酸之间形成桥的共价连接的原子或分子。DNA中典型的核苷酸间部分是磷酸二酯部分。
术语“核酸”或“多核苷酸”可互换使用且是指可对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物的聚合物或其类似物。其包括核苷酸的聚合物例如RNA和DNA及其合成的形式、修饰的(例如化学或生物化学修饰的)形式和混合的聚合物(例如包括RNA和DNA亚单位)。示例性修饰包括甲基化、用类似物代替一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰例如不带电荷的连接(例如磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)、悬垂部分(pendent moiety)(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰的连接(例如α异头物核酸(anomeric nucleic acid)等)。还包括合成的分子，其模拟多核苷酸经由氢键和其它化学相互作用与指定序列结合的能力。通常，核苷酸单体经由磷酸二酯键连接，虽然核酸的合成形式可包含其它连接(例如如Nielsen等人,Science 254(1991)1497-1500中所述的肽核酸)。核酸可为或可包括例如染色体或染色体片段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸露的DNA或RNA聚合物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可为例如单链的、双链的或三链的且不限于任何具体长度。除非另有说明，除任何明确指出的序列外，具体的核酸序列包括或编码互补序列。
本申请所用的术语“核苷”是本领域技术人员已知的且是指具有含氮碱基部分的分子，所述含氮碱基部分为例如嘌呤或嘧啶，其中所述碱基部分与戊糖连接，所述戊糖为例如脱氧核糖、核糖、阿拉伯糖、木糖或来苏糖，或其中所述碱基部分与己糖部分连接。典型的形成核苷的嘌呤或嘧啶碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶和尿嘧啶。
术语“寡核苷酸”通常是指典型地被设计为单链DNA且长度小于75个核苷酸的核酸序列。
本申请所用的术语“肽”是本领域技术人员已知的且是指由以直链排列的氨基酸构成且通过相邻氨基酸残基的羧基与氨基之间的肽键连接在一起的有机化合物。
本申请所用的术语“亚磷酰胺”是本领域技术人员已知的且是指经由糖羟基部分与(III)价磷连接的核苷，所述(III)价磷本身经由氧与保护基(例如β-氰基乙氧基)连接并与二烷基化的氮连接。
本申请所用的术语“光可裂解的”是本领域技术人员已知的且是指具有通过在特定波长处照射可被裂解的特定键的基团。术语“光可裂解的化合物”是指含有经照射解离成两个或更多个独立分子的部分的化合物，所述照射尤其为用光照射。
在通常与合成化学相关的意思中，术语“保护基”表示这样的基团，其在多官能化合物中选择性地阻断一个反应位点，由此可选择性地在另一个未被保护的反应位点进行化学反应。可在适当时机除去保护基。示例性保护基为氨基保护基、羧基保护基或羟基保护基。
适于本申请的现有的光不稳定性保护基包括但不限于2-硝基苄基氧基羰基(NBOC)、2-硝基苯基-乙基氧基羰基(NPEOC)、2-(3,4-亚甲二氧基-2-硝基苯基)-丙基氧基羰基(MeNPPOC)、2-(3,4-亚甲二氧基-2-硝基苯基)氧基羰基(MeNPOC)、2-(2-硝基苯基)-丙基氧基羰基(NPPOC)、二甲氧基-安息香基氧基羰基(DMBOC)、2-(2-硝基苯基)-乙基磺酰基(NPES)、(2-硝基苯基)-丙基磺酰基(NPPS)等。
在对术语连接基团进行定义的情况下，术语“饱和”是本领域技术人员已知的且是指这样的连接基团，其中基团的所有成员经由单键与彼此相邻的一个或多个原子连接。因此，饱和烃链由式-(CH2)n-表示，其中n为1至2的整数。
本申请所用的术语“固体载体”是本领域技术人员已知的且是指任何不可溶的且刚性或半刚性的具有大表面积的无机或有机材料，有机分子可通过成键与所述表面连接或通过电性或静电相互作用(例如通过经由官能团成键)与所述表面吸附。
术语“取代”表示所描述的基团带有一个或多个取代基。当任意基团可携带多个取代基且提供多种可能的取代基时，独立地选择所述取代基且不必相同。术语“未取代”是指所描述的基团不带有取代基。术语“任选取代”是指所描述的基团未被取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自可能的取代基。当指出取代基的数量时，术语“一个或多个”是指从一个取代基至最多可能数量的取代情况，即用取代基代替一个氢直至代替所有氢。
本申请涉及光可裂解的下式化合物：
[式I]
其中A为-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH(CH3)-CH2-，且R3为H、甲基或乙基，且R2为亚磷酰胺、H-磷酸酯或磷酸二酯或磷酸三酯，其中当R2为式-O-P(O)-(OR4)-(OH)的磷酸二酯时，R4为烷基或取代的烷基或核苷或寡核苷酸，且其中当R2为式-O-P(O)-(OR4)-(OR5)的磷酸三酯时，R4和R5各自为烷基或取代的烷基或核苷或寡核苷酸，或R4和R5一起形成寡核苷酸的核苷酸间部分，且R1为苯基酰胺，其中官能团经由氨基与所述苯基酰胺连接。
在一个实施方案中，所述官能团选自4,4’-二甲氧基三苯甲基-氧基-烷基-、三氟乙酰基-氨基-烷基-、烷基酰氨基-生物素和半抗原。
在一个实施方案中，A为-CH(CH3)-CH2-。在一个实施方案中，R3为乙基。在一个实施方案中，R2为亚磷酰胺。
在另一个实施方案中，第一分子与所述官能团连接且第二分子与所述亚磷酰胺连接。第一分子可经由氨基-烷基-或氧基-烷基-与所述官能团连接。第二分子可通过标准寡核苷酸合成与所述亚磷酰胺连接。
在另一个实施方案中，第一分子和第二分子可为任意生物分子。在一个实施方案中，第一和第二分子独立地选自蛋白质、肽、多糖、碳水化合物、脂质、核酸、寡核苷酸、初级代谢物、次级代谢物和天然产物。在具体的实施方案中，第一和第二分子独立地选自肽和寡核苷酸。在另一个实施方案中，第一分子为DNA且第二分子为DNA。在另一个实施方案中第一分子为肽且第二分子为DNA，或反之亦然。
通过使用范围为375nm至420nm的可见光可裂解本申请的光可裂解的化合物。在具体的实施方案中，使用范围为390至405nm的可见光。在更具体的实施方案中，分别使用390nm或405nm处的可见光。这两种波长都可使用比在约365nm附近的UV范围进行脱保护所需要的光源廉价得多的光源产生。在一个实施方案中，使用在375nm至420nm范围内尤其是在390nm和405nm处的固态激光器作为光源来进行本申请的裂解反应。在更具体的实施方案中，使用在375nm至420nm范围内尤其是在390nm和405nm处具有足够发射的LED(发光二极管)作为光源来进行本申请的裂解反应。特别地，LED由于产量大而是低成本产品，其例如用于蓝光播放器。
在本申请的光可裂解的化合物的裂解反应中，可存在本领域技术人员已知的稳定剂，其提高裂解反应的有效性并抑制光产生的自由基的副反应。本领域技术人员可使用碱和还原性化合物的组合作为稳定剂，例如咪唑、羟胺、亚苄基丙酮(Benzalacetone)等。
在具体的实施方案中，所述官能团选自4,4’-二甲氧基三苯甲基-氧基-烷基-、三氟乙酰基-氨基-烷基-和烷基酰氨基-生物素，A为-CH(CH3)-CH2-，R3为乙基，R2为亚磷酰胺，第一分子与所述官能团连接且第二分子与所述亚磷酰胺连接，其中第一和第二分子独立地选自肽和寡核苷酸且其中裂解反应可在375nm至420nm波长处进行。
在一个实施方案中，图1描述的光可裂解的间隔物酰胺可用于在化学寡核苷酸合成期间在其5’-末端延长寡核苷酸。然后通过寡核苷酸合成中的标准方法除去DMT基团且可在游离的OH基团上合成第二个寡核苷酸，从而在合成末期得到如图4所示的寡核苷酸，其中存在光可裂解的化合物且可在箭头所示位置通过光将其裂解。
在一个实施方案中，图2所示的化合物将释放具有5’-游离氨基的寡核苷酸，其可与例如肽或抗体偶联，从而进行被称为“免疫-PCR”的测定，随后可将其光解裂解成寡核苷酸和抗体，例如用于基于测定的多重分析。此外，抗体或蛋白质的DNA引导固定可按光可逆的方式完成。
在一个实施方案中，图3所示的化合物可用于以下方法，其中当捕获的适体-蛋白质复合物通过光从亲和基质中裂解时，经由光可裂解的衔接物携带生物素分子的适体样寡核苷酸用于从复杂的生物样品中纯化合适的靶蛋白质，这作为样品富集策略。
本申请还涉及上述光可裂解的化合物的制备方法，其包括以下步骤：a)提供对二乙基苯作为起始物质，b)对苯基环进行溴化，c)将所得化合物在硝酸和硫酸中在溴的对位进行硝化，d)纯化和结晶，e)在苄位将化合物进行羟基甲基化，f)使用取代的苯硫酚将芳族溴基团转化为芳基硫化物，g)纯化，h)将醇转化为氯甲酸酯，i)使所述氯甲酸酯与核苷反应并使核苷与亚磷酸化试剂反应，或使所述氯甲酸酯与氨基酸衍生物反应。
在一个实施方案中，A为-CH(CH3)-CH2-。在一个实施方案中，R3为乙基。在一个实施方案中，R2为亚磷酰胺。
在一个实施方案中，所述官能团选自4,4’-二甲氧基三苯甲基-氧基-烷基-、三氟乙酰基-氨基-烷基-、烷基酰氨基-生物素和半抗原。
提供下列实施例以有助于理解本申请，而本申请的真实范围描述在所附权利要求书中。应当理解的是，可在不偏离本申请主旨的情况下对所描述的程序进行修改。
实施例1
合成作为寡核苷酸合成构建砌块的光可裂解的衔接物酰胺
将231g 2,5-二乙基-4-硝基苯(0.895mol)、106.2g硫代水杨酸(0.688mol)和285g碳酸钾(2.064mol)在1.2L二甲基甲酰胺(DMF)中加热至回流且保持1h。然后真空蒸馏DMF，残余物用水稀释至总体积为3.5L且用0.5L己烷/乙酸乙酯1:1萃取6次。用稀HCl将水性残余物调节至pH 6.0且用0.5L乙酸乙酯萃取两次，将其合并且用1L水洗涤。通过旋转蒸发器除去乙酸乙酯，将残余物溶于二氯甲烷中且通过硅胶柱色谱/二氯甲烷纯化。
产率：蒸发后得到173.1g(76％)无定形淡红色泡沫状物(P3-酸)。
将173g P3-酸(0.522mol)、59g多聚甲醛(0.652mol)和437g Triton B(40％的MeOH溶液,1.044mol)在1.4L DMSO加热至90℃且保持2h。冷却后，加入0.2L乙酸和6L水。其用1L二氯甲烷萃取，用0.2L水洗涤两次且真空蒸发。固体残余物在静置时结晶，在少量二氯甲烷中研碎且抽滤。
1H-NMR(300MHz,DMSO):13.32ppm(s,1H,COOH)；7.95ppm(dd,1H,Ar-H硫代水杨酸)；7.83ppm(s,1H,Ar-H硝基芳环)；7.56ppm(s,1H,Ar-H硝基芳环)；7.46-7.38ppm(m,1H,Ar-H硫代水杨酸)；7.32-7.25ppm(m,1H,Ar-H硫代水杨酸)；6.73ppm(d,1H,Ar-H硫代水杨酸)；4.75ppm(s,1H,OH)；3.44ppm(d,2H,Ar-C(CH3)H-CH2-OH)；3.26-3.11ppm(m,1H,Ar-C(CH3)H-CH2-OH)；2.68ppm(q,2H,Ar-Et的CH2)；1.19-1.08ppm(m,6H,2×CH3)
产率：82g(43％)淡黄色晶体(P3-酸-醇)
在室温(RT)将16.0g P3-酸-醇(44.3mmol)、16.0g t-BdMS-Cl(106mmol)和14.5g N-甲基咪唑(177mol)在0.1L二氯甲烷中搅拌过夜。混合物用每份0.4L水萃取3次且蒸发。将固体残余物溶于0.2L甲醇中，加入16g碳酸钾且在40℃搅拌90min。真空除去约70％甲醇，加入0.2L水，用枸橼酸酸化至约pH 2.0且用乙酸乙酯萃取。萃取物用水洗涤且蒸发，得到澄清淡褐色油状物(22.7g；108％,P3-酸-(tBdMS-醚)，其无需进一步纯化和表征即用于下一步。
将4.9g P3-酸-(tBdMS-醚)溶于30mL二氯甲烷中，加入2.2g N-乙基-N’-二乙基氨基丙基-碳二亚胺*HCl且在RT搅拌45min。加入4.9g O-二甲氧基三苯甲基-1-氨基-6-己醇在15mL二氯甲烷中的溶液且继续搅拌过夜。混合物用水洗涤，有机残余物用饱和NaCl/水萃取两次且真空蒸发。
残余物通过柱色谱(硅胶/二氯甲烷-甲醇梯度)纯化且蒸发，得到黄色泡沫状物。
4.4g(50％)经tBdMS保护的光可裂解的间隔物
1H-NMR(300MHz,DMSO):8.39ppm(t,1H,酰胺-H)；7.72ppm(s,1H,Ar-H硝基芳环)；7.55-7.47ppm(m,1H,Ar-H)；7.40-7.32ppm(m,4H,Ar-H)；7.30-7.16(m,9H,Ar-H)；7.08-7.02ppm(m,1H,Ar-H)；6.90-6.82ppm(m,4H,Ar-H)；3.72ppm(s,6H,2×DMT的甲氧基)；3.59-3.46ppm(m,2H,Ar-C(CH3)H-CH 2 -OTBDMS)；3.33-3.24ppm(m,1H,Ar-C(CH3)H-CH2-OTBDMS)；3.25-3.14ppm(m,2H,R-CH 2 -O-DMT)；2.97-2.91ppm(m,2H,R-CH 2 -NH-CO-R’)；2.67ppm(q,2H,Ar-Et的CH2)；1.56-1.20ppm(m,8H,4×CH2“中段(Mittelteil)己基”)；1.12-1.04ppm(m,6H,Ar-Et+Ar-C(CH 3 )H-CH2-OTBDMS的CH3)；0.71ppm(s,9H,TBDMS的t-Bu)；0.14ppm(d,6H,TBDMS的Si(CH3)2).
通过在RT在3g TBAF*3*H2O在30mL THF中的混合物中搅拌1h来除去tBdMS-基团。
混合物用碳酸氢钠溶液洗涤，真空蒸发，通过柱色谱(硅胶/二氯甲烷-甲醇梯度2％)纯化且蒸发，得到黄色泡沫状物。
产率：2.9g(76％)光可裂解的间隔物醇
1H-NMR(300MHz,DMSO):8.33ppm(t,1H,酰胺-H)；7.71ppm(s,1H,Ar-H硝基芳环)；7.53-7.46ppm(m,1H,Ar-H)；7.44-7.33ppm(m,4H,Ar-H)；7.33-7.11(m,10H,Ar-H)；6.92-6.84ppm(m,4H,Ar-H)；4.74ppm(t,1H,R-OH)；3.73ppm(s,6H,2×DMT的甲氧基)；3.35-3.31ppm(m,2H,Ar-C(CH3)H-CH 2 -OH)；3.25-3.11ppm(m,3H,R-CH 2 -O-DMT+Ar-C(CH3)H-CH2-OH)；2.98-2.90ppm(m,2H,R-CH 2 -NH-CO-R’)；2.67ppm(q,2H,Ar-Et的CH2)；1.56-1.18ppm(m,8H,4×CH2中心(centerbody)己基)；1.13ppm(t,3H,Ar-Et的CH3)；1.03ppm(d,3H,Ar-C(CH 3 )H-CH2-OH)
将2.9g光可裂解的间隔物醇溶于30mL无水二氯甲烷中，加入0.68g氰基乙基-四异丙基-亚磷酰二胺和0.22g二氰基咪唑且在氩气下搅拌过夜。
反应混合物用己烷稀释直至轻微浑浊，通过柱色谱(硅胶/己烷-乙酸乙酯梯度4:1-1:1)纯化且蒸发，得到黄色泡沫状物。
产率：0.95g(25％)图1的光可裂解的间隔物酰胺
HPLC:92.4％纯
1H-NMR(300MHz,DMSO):8.38ppm(m,1H,酰胺-H)；7.74ppm(s,1H,Ar-H硝基芳环)；7.54-7.46ppm(m,1H,Ar-H)；7.40-7.16ppm(m,12H,Ar-H)；7.12-7.00ppm(m,1H,Ar-H)；6.92-6.82ppm(m,4H,Ar-H)；3.72ppm(s,6H,2×DMT的甲氧基)；3.68-3.34ppm(m,7H,Ar-C(CH3)H-CH 2 -OPA+Ar-C(CH3)H-CH2-OH+2×氰基乙基的CH2)；3.24-3.14ppm(m,2H,R-CH 2 -O-DMT)；2.97-2.90ppm(m,2H,R-CH 2 -NH-CO-R’)；2.73-2.61ppm(m,4H,Ar-Et的CH2+2×异丙基的CH)；1.57-1.39ppm(m,4H,2×CH2中心己基)；1.39-1.21ppm(m,4H,2×CH2中心己基)；1.21-0.90ppm(m,18H,6×CH3)。
31P-NMR(121.53MHz,DMSO):143,76ppm；143,24ppm。
实施例2：
合成图2的化合物即光可裂解的氨基-修饰物-酰胺
以类似的方式由P3-酸-(tBdMS-醚)和N-三氟乙酰基-1,6-二氨基己烷制备光可裂解的氨基-修饰物，得到标题化合物，其总产率为12％(4步)。
实施例3：
合成图3的化合物即光可裂解的生物素-修饰物-酰胺
以类似的方式由P3-酸-(tBdMS-醚)和N-二甲氧基三苯甲基-生物素-6-氨基己基酰胺(N-dimethoxytrityl-biotin-6-aminocaproylamide)制备光可裂解的生物素-修饰物，得到标题化合物，其总产率为9％(4步)。

Claims (9)

1.光可裂解的下式化合物：
其中A为-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-或-CH(CH3)-CH2-，
R3为H、甲基或乙基，
R2为亚磷酰胺、H-磷酸酯、磷酸二酯或磷酸三酯，
其中当R2为式-O-P(O)-(OR4)-(OH)的磷酸二酯时，R4为烷基或取代的烷基或核苷或寡核苷酸，且
其中当R2为式-O-P(O)-(OR4)-(OR5)的磷酸三酯时，R4和R5各自为烷基或取代的烷基或核苷或寡核苷酸，或R4和R5一起形成寡核苷酸的核苷酸间部分，
R1为苯基酰胺，且
其中官能团经由氨基与所述苯基酰胺连接。
2.权利要求1的化合物，其特征在于所述官能团选自4,4’-二甲氧基三苯甲基-氧基-烷基-、三氟乙酰基-氨基-烷基-、烷基酰氨基-生物素和半抗原。
3.权利要求1或2的化合物，其特征在于A为-CH(CH3)-CH2-。
4.权利要求1至3的化合物，其特征在于R3为乙基。
5.权利要求1至4的化合物，其特征在于R2为亚磷酰胺。
6.权利要求1至5的化合物，其特征在于第一分子与所述官能团连接且第二分子与所述亚磷酰胺连接。
7.权利要求6的化合物，其特征在于所述第一分子和所述第二分子独立地选自寡核苷酸和肽。
8.权利要求1至7的化合物，其特征在于所述光可裂解的化合物可在375nm至420nm的波长处进行裂解。
9.权利要求1至8中任一项的光可裂解的化合物的制备方法，其包括以下步骤：
a)提供对二乙基苯作为起始物质
b)对苯基环进行溴化
c)将所得化合物在硝酸和硫酸中在溴的对位进行硝化
d)纯化和结晶
e)在苄位将化合物进行羟基甲基化
f)使用取代的苯硫酚将芳族溴基团转化为芳基硫化物
g)纯化
h)将醇转化为氯甲酸酯
i)使所述氯甲酸酯与核苷反应并使核苷与亚磷酸化试剂反应，或使所述氯甲酸酯与氨基酸衍生物反应。
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