CN101374851A - 使用可光裂解的连接体合成寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备由两个或更多个单独寡聚物构成的寡聚化合物的方法，在所述的寡聚化合物中，单独寡聚物被可光裂解的连接体隔开，该方法包括使所述的连接体进行光活化裂解的步骤。
Description
发明背景
双链DNA或RNA的制备通常包括两个独立的多步方法(即合成、脱保护、纯化和质量保证)。虽然对于大部分应用而言这不是问题，但是对于将该技术放大规模而言这将是限速的，例如对于需要大量寡核苷酸的高流通量应用或治疗应用而言。由Pon等人[1]描述的称为串联合成的一种方法以如下原理为根据：制备含有在合成后可裂解的连接体的一个(长)寡核苷酸。然后，随后的裂解产生两条互补链(在流程1中有说明)。根据Pon，Richard T.；Yu，Shuyuan(Nucleic Acids Research 2005，33(6)，1940-1948)和Pon，Richard T.；Yu，Shuyuan(PCT国际申请2002，WO 2002020537A2)以及Ferreira，Fernando；Meryer，Albert；Vasseur，Jean-Jacques；Morvan，Francois(J.Org.Chem.联机出版物，2005)，依次合成了用对碱不稳定的连接体隔开的两个或更多个寡核苷酸。然后连接体在用于寡核苷酸的载体裂解和碱/磷酸二酯脱保护的条件下裂解。这种方法的一个缺点是它不允许通过加三苯甲基(trityl-on)方法将寡核苷酸纯化，因为仅5’-末端寡核苷酸将带有该残基。已经描述了在寡核苷酸中加入可光裂解的残基用于对寡核苷酸进行可逆性标记或固定化以及诸如SNP基因分型(WO 9967619)或者在RNA合成中作为保护基团(Stutz，Alfred；Pitsch，Stefan.Synlett 1999(专刊)，930-934)的应用。近来，已经报道了可光活化的siRNA或“笼罩干扰RNA(caged interfering RNAs)”。在这些情况中，siRNA反义链进行了如下修饰：在其5’-末端引入载有标记基团的可光裂解的部分(WO2004045547)，或者在内部将4，5-二甲氧基-2-硝基苯基与寡核糖核苷酸磷酸二酯骨架共价连接(Shah，Samit；Rangarajan，Subhashree；Friedman，Simon，H.Angew.Chem.Int.Ed.2005，44，1328-1332)。照此，可以在所需的生物学实验的时间点、例如其在细胞中转染后将寡核苷酸进行光活化。
发明人已经开发了可用于简化通过合成制备双链核糖核酸的方法的化合物，并提供了具有优于现有方法的数种优点的方法。尤其是本发明化合物的使用简化了合成制备双链核糖核酸如siRNA的方法。通过实施本发明的方法，双链核糖核酸的两条链可以由单一合成法获得而不损害试剂的质量，因为在通过照射释放两条链之前将可光裂解的寡核苷酸进行纯化是可能的。这种特点在高流通量应用(例如siRNA文库)或大规模应用(例如siRNA治疗)中可以是特别重要的。可光裂解的核酸还可以本身用于酶应用(例如在质粒中加入)或生物学实验(例如细胞试验或动物模型试验)，并且可以在实验的任意阶段释放出。最后，寡核苷酸内的可光裂解的连接体可以被设计成结合有另外的官能团、例如可以允许检测改善药理学性质的标签残基或负荷残基(cargo residues)。
发明人已经开发了使用新的可光裂解的连接体来一步合成多种化合物的新的合成策略。连接体及其用途可应用于制备多种生物聚合物如多肽、多糖或多核苷酸或其组合。它在需要控制两种或更多种试剂的比例的应用中可以是尤其有用的。它特别适于但不限于制备短干扰RNA(siRNA)，因为它允许通过一条具有可光裂解的连接体的长自身互补寡核苷酸合成两条链，其发生于在一条长寡核苷酸(还称为可光裂解的短发夹RNA，光-shRNA)中的寡核苷酸脱保护和纯化之后。
关于siRNA合成，这种策略提供了优于标准siRNA制备的以下优点：仅有一种分子被合成、纯化和分析；可以对纯化的光-shRNA进行光照射，其因而确保了以理想的化学计量进行siRNA双链体的退火；不需要对单条链进行样品示踪，因为根本不存在非退火链；对光-shRNA进行光照射以释放siRNA可以在任意时间进行，甚至可以在生物学实验(例如在转染后或注射后对光-shRNA进行原位照射)中进行；以及连接体可以被衍生化以载有可提高细胞摄取或组织特异性传递的官能团。
本文公开的结果表明，所提出的基于邻-硝基苄基的连接体可以与采用亚磷酰胺化学进行的标准RNA或DNA寡核苷酸合成很好地相适应。连接体在释放粗寡核苷酸所需的裂解和脱保护条件下以及除去末端5’-二甲氧基三苯甲基所需的水性酸性条件下是稳定的。本发明提供了允许以单一合成方法合成多种纯化的寡核苷酸的化合物和该化合物的用途。在其当前的形式中，通过光照射使连接体裂解可以释放出在连接体锚定末端载有末端磷酸酯残基的寡核苷酸。虽然这对于一些需要末端羟基的应用而言可以是缺点，但是对于制备如下的siRNA而言又是优点：对于生物学功能而言，其在指导链的5’-末端需要磷酸酯基(Meister，Gunter；Tuschl，Thomas.Nature 2004，431(7006)，343-349)。
图1显示了本发明的方法的简单性。
在第一方面，本发明涉及制备由两个或更多个单独寡聚物构成的寡聚化合物的方法，在所述的寡聚化合物中，单独寡聚物被可光裂解的连接体隔开，该方法包括使所述的连接体进行光活化裂解的步骤。
单独寡聚物可以独立地选自寡核苷酸、寡糖、寡肽。
在一项实施方案中，单独寡聚物是可以互补或不互补的寡核苷酸。优选寡聚物是完全或部分互补的。部分互补表示在寡核苷酸中有50％-99％核苷酸是互补的。
在优选的实施方案中，单独寡聚物是可以完全或部分互补的寡核糖核苷酸。
在优选的实施方案中，连接体在各单独寡聚物的脱保护条件下是稳定的。
连接体基团优选可通过UV或可见光照射被裂解。
在优选的实施方案中，所述的寡核苷酸是两个寡核糖核苷酸。
在另外的实施方案中，连接体是式I化合物：
其中：
PG是(Ar1)(Ar2)(Ar3)C-，其中Ar1、Ar2、Ar3独立地选自CH3OC6H4-和C6H5-，
或者PG是被取代的甲硅烷基(R1＇)(R2＇)(R3＇)Si-，其中R1＇、R2＇、R3＇独立地选自低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基氧基或芳氧基；
X是O、N或S；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、NH2、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基，并且取代基R1-R5中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
取代基R1、R2、R3、R4和R5中两个或更多个可以形成一个或数个环，所述的环可以进一步被如R1、R2、R3、R4或R5中所定义的基团取代；
取代基R1、R2、R3、R4或R5中至少一个是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的磷酸二酯或硫代磷酸酯链结的载有亚磷酰胺、膦酸酯或磷酸三酯的基团，或者是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的酰胺、脲或硫脲链结的胺基、活化羧酸酯基、异氰酸酯基或异硫氰酸酯基；
R6选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基。
该连接体优选可通过光如UV光或可见光或者激光束裂解。
甚至更优选其中连接体是式II化合物的如上所述的方法：
其中：
PG是(Ar1)(Ar2)(Ar3)C-，其中Ar1、Ar2、Ar3独立地选自CH3OC6H4-、C6H5-，
或者PG是被取代的甲硅烷基(R1＇)(R2＇)(R3＇)Si-，其中R1＇、R2＇、R3＇独立地选自低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基氧基或芳氧基；
X是O、N或S；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、NH2、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基，并且取代基R1-R5中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
取代基R1、R2、R3、R4和R5中两个或更多个可以形成一个或数个环，所述的环可以进一步被如R1、R2、R3、R4或R5中所定义的基团取代；
R6选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基；
U、V、W形成在一端替换取代基R1至R5之一且在另一端替换取代基R7至R11之一的链；
U、V、W可以独立地不存在或者是亚烷基(-R-)、亚环烷基(-R-)或亚芳基(-Ar-)、-O-、-S-、-NR＇-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NR＇-、-OC(O)O-、-OC(O)NR＇-、-NR＇C(O)NR＂-、-OC(S)NR＇-、-NR＇C(S)NR＂-、-S(O)-、-S(O2)-、-S(O2)NR＇-、-OP(O2)O-，并且可以含有标记或荧光团或用于改善寡核苷酸的药理学性质的基团；
R7、R8、R9、R10和R11独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、NH2、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基，并且取代基R7至R11中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
R12选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基；
Y是O、N或S；
Z是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的磷酸二酯或硫代磷酸酯链结的亚磷酰胺、膦酸酯或磷酸三酯基团，或者是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的酰胺、脲或硫脲链结的胺基、活化羧酸酯基、异氰酸酯基或异硫氰酸酯基；
甚至更优选其中连接体是式I化合物的根据上文所述的方法：
式I
其中：
PG是二甲氧基三苯基甲基；
X是O；
R1是硝基；
R3是-CH2-O-P(N[iPr]2)-O-CH2-CH2-CN)；
R2、R4、R5和R6是氢。
更优选其中连接体是式II化合物的根据上文所述的方法：
式II
其中：
PG是二甲氧基三苯基甲基；
X和Y是O；
R1和R7是硝基；
R2、R4、R5、R6、R8、R10、R11和R12是氢；
U是氧且替换R3；
V是-CH2-CH2-CH2-；
W是氧且替换R9；
Z是-P(N[iPr]2)-O-CH2-CH2-CN)。
在另外的实施方案中，本发明提供了式I化合物：
式I
其中：
PG是(Ar1)(Ar2)(Ar3)C-，其中Ar1、Ar2、Ar3独立地选自CH3OC6H4-和C6H5-，
或者PG是被取代的甲硅烷基(R1＇)(R2＇)(R3＇)Si-，其中R1＇、R2＇、R3＇独立地选自低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基氧基和芳氧基；
X是O、N或S；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、NH2、N-低级烷基/芳基和NHC(O)低级烷基/芳基；并且取代基R1至R5中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
取代基R1、R2、R3、R4和R5中两个或更多个可以形成一个或数个环，所述的环可以进一步被如R1、R2、R3、R4或R5中所定义的基团取代；
取代基R1、R2、R3、R4或R5中至少一个是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的磷酸二酯或硫代磷酸酯链结的载有亚磷酰胺、膦酸酯或磷酸三酯的基团，或者是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的酰胺、脲或硫脲链结的胺基、活化羧酸酯基、异氰酸酯基或异硫氰酸酯基；
R6选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、N-低级烷基/芳基和NHC(O)低级烷基/芳基。
更优选式II化合物：
式II
其中：
PG是(Ar1)(Ar2)(Ar3)C-，其中Ar1、Ar2、Ar3独立地选自CH3OC6H4-、C6H5-，
或者PG是被取代的甲硅烷基(R1＇)(R2＇)(R3＇)Si-，其中R1＇、R2＇、R3＇独立地选自低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基氧基或芳氧基；
X是O、N或S；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、NH2、N-低级烷基/芳基和NHC(O)低级烷基/芳基，并且取代基R1至R5中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
取代基R1、R2、R3、R4和R5中两个或更多个可以形成一个或数个环，所述的环可以进一步被如R1、R2、R3、R4或R5中所定义的基团取代；
R6选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、N-低级烷基/芳基和NHC(O)低级烷基/芳基；
U、V、W形成在一端替换取代基R1至R5之一且在另一端替换取代基R7至R11之一的链；
U、V、W可以独立地不存在或者是亚烷基(-R-)、亚环烷基(-R-)或亚芳基(-Ar-)、-O-、-S-、-NR＇-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NR＇-、-OC(O)O-、-OC(O)NR＇-、-NR＇C(O)NR＂-、-OC(S)NR＇-、-NR＇C(S)NR＂-、-S(O)-、-S(O2)-、-S(O2)NR＇-、-OP(O2)O-，并且可以含有标记或荧光团或用于改善寡核苷酸的药理学性质的基团；
R7、R8、R9、R10和R11独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、NH2、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基，并且取代基R7至R11中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
R12选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR＇R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR＇R＂、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基；
Y是O、N或S；
Z是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的磷酸二酯或硫代磷酸酯链结的亚磷酰胺、膦酸酯或磷酸三酯基团，或者是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的酰胺、脲或硫脲链结的胺基、活化羧酸酯基、异氰酸酯基或异硫氰酸酯基。
甚至更优选式I化合物：
式I
其中：
PG是二甲氧基三苯基甲基；
X是O；
R1是硝基；
R3是-CH2-O-P(N[iPr]2)-O-CH2-CH2-CN)；
R2、R4、R5和R6是氢。
更优选式II化合物：
式II
其中：
PG是二甲氧基三苯基甲基；
X和Y是O；
R1和R7是硝基；
R2、R4、R5、R6、R8、R10、R11和R12是氢；
U是氧且替换R3；
V是-CH2-CH2-CH2-；
W是氧且替换R9；
Z是-P(N[iPr]2)-O-CH2-CH2-CN)。
与有机基团或化合物有关的术语“低级”表示可以是含有最多且包括8个碳原子、优选1-6个或更优选1-4个或2-6个碳原子的支链或直链化合物或基团。低级烷基例如代表甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和支链戊基、正己基和支链己基、正庚基、支链庚基、正辛基和支链辛基。
iPr表示异丙基。
材料和方法
可光裂解的亚磷酰胺的合成
流程2
3-羟基甲基-4-硝基-苯酚(1)
根据文献R.Reinhard，B.F.Schmidt，J.Org.Chem.，1998，63，2434-2441合成了化合物1。
{5-[3-(3-羟基甲基-4-硝基-苯氧基)-丙氧基]-2-硝基-苯基}-甲醇(2)
将化合物1(2.02g，12mmol)溶解在DMF(26ml)中。加入1，3-二溴丙烷(560μl，5.4mmol)、K2CO3(2.0g，14.4mmol)和碘化钾(0.2g，1.2mmol)，于90℃将该橙色混悬液搅拌3小时。然后将反应溶液冷却至室温，倒入140ml水中。将沉淀物过滤，用水、饱和NaHCO3水溶液洗涤，然后再用水洗涤2次，干燥，得到1.82g微黄色结晶。产率89％。TLC(AcOEt/己烷 1:1)：Rf0.21。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：2.27(q，J＝6.2，CH2CH2CH2)；4.30(t，J＝6.2，CH2CH2CH2)；4.84(s，CH2OH，C’H2OH)；5.59(s，CH2OH，C’H2OH)；7.05(dd，J＝9.1，2.8，2芳香性H)；7.36(d，J＝2.8，2芳香性H)；8.12(d，J＝9.1，2芳香性H)。13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：28.2；60.3；65.0；112.8；113.2；127.5；139.4；142.4；162.9。HR-ESI-MS(正模式)：401.0959([M+Na]+；计算值401.0960)
[5-(3-{3-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-4-硝基-苯氧基}-丙氧基)-2-硝基-苯基]-甲醇(3)
在氮气下将2(1.8g，4.76mmol)溶解在45ml吡啶中。于室温加入1.61g(4.76mmol)DMTCl在20ml无水吡啶中的溶液。将该反应混合物搅拌过夜，用饱和NaHCO3水溶液稀释，用AcOEt萃取2次。将合并的有机相用水和盐水洗涤，干燥(K2CO3)，在减压下蒸发。将所得油状物通过柱色谱法(硅胶；AcOEt/己烷 1:3，2％ Et3N→AcOEt，2％ Et3N)进行纯化，得到1.45g黄色泡沫状物3。产率45％。TLC(AcOEt/己烷 1:1)：Rf0.43。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：2.40(q，J＝6.0，CH2CH2CH2)；2.56(t，J＝6.4，CH2OH)；3.78(s，2OMe)；4.33(t，J＝6.0，CH2CH2CH2)；4.65(s，CH2ODMT)；4.99(d，J＝6.4，CH2OH)；6.8-6.95(m，6 芳香性H)；7.2-7.4(m，8 芳香性H)；7.47(m，2 芳香性H)；7.70(m，2 芳香性H)；8.12(d，J＝9.1，1 芳香性H)；8.18(d，J＝9.1，1芳香性H)。HR-ESI-MS(正模式)：703.2264([M+Na]+；计算值703.2267)二异丙基-氨基亚磷酸5-(3-{3-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-4-硝基-苯氧基}-丙氧基)-2-硝基-苄基酯2-氰基-乙基酯(4)(其中氨基亚磷酸相应于英文phosphoramidous acid，下同)
在氮气下将3(1.0g，1.47mmol)溶解在6ml CH2Cl2中。然后加入0.6mlHünig氏碱和0.38g(1.62mmol)二异丙基氨基氯-亚磷酸2-氰基乙基酯(2-cyanoethyl diisopropylamidochlorido-phosphite)，于室温将该混合物搅拌3小时。将反应混合物直接应用于硅胶上，通过柱色谱法(硅胶(50g)；AcOEt/己烷 3:7，2％ Et3N→AcOEt，2％ Et3N)进行纯化。得到1.05g黄色泡沫状物4。产率81％。TLC(AcOEt/己烷 1:1)：Rf 0.79。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：1.21(d，J＝6.9，2 MeCHN)；2.40(q，J＝6.0，CH2CH2CH2)；2.60(t，J＝6.3，CH2CN)；3.6-4.0(m，OCH2CH2CN，2Me2CHN)；3.78(s，2 OMe)；4.32(t，J＝6.0，CH2CH2CH2)；4.65(s，CH2ODMT)；5.14(m，CH2OP)；6.8-6.95(m，6 芳香性H)；7.2-7.4(m，8 芳香性H)；7.47(m，2 芳香性H)；7.70(m，2 芳香性H)；8.11(d，J＝9.0，1 芳香性H)；8.18(d，J＝9.1，1 芳香性H)。31P-NMR(162MHz，CDCl3)：149.12。HR-ESI-MS(正模式)：903.3326([M+Na]+；计算值903.3346)
流程3
{4-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-3-硝基-苯基}-甲醇(5)和{4-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-2-硝基-苯基}-甲醇(6)
在氩气下将(4-羟基甲基-2-硝基-苯基)-甲醇(东京梯希爱化成株式会社(TCI Tokyo Kasei)，3.0g，16.4mmol)溶解在吡啶(30ml)中。历经30分钟分批加入4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(5.55g，16.4mmol)，同时将溶液冷却至0℃。于室温将该反应混合物搅拌过夜，用饱和NaHCO3水溶液稀释，用AcOEt萃取2次。将合并的有机相用水和盐水洗涤，干燥(NaHCO3)，在减压下蒸发。将所得油状物通过柱色谱法(硅胶；AcOEt/己烷 1:4，1％Et3N→AcOEt，1％Et3N)进行纯化，得到0.91g5(11％)和3.18g6(40％)，为黄色泡沫。
5的分析数据：TLC(AcOEt/己烷 1:2)：Rf0.11。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：1.90(t，J＝6.4，CH2OH)；3.70(s，2 OMe)；4.52(s，CH2ODMT)；4.68(s，CH2OH)；6.72-6.79(m，4芳香性H)；7.06-8.03(m，12芳香性H)。EI-MS：485[M+]
6的分析数据：TLC(AcOEt/己烷 1:2)：Rf0.24。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：1，71(t，J＝6.4，CH2OH)；3.71(s，2 OMe)；4，19(s，CH2ODMT)；4，85(s，CH2OH)；6.73-6.78(m，4 芳香性H)；7.06-8.03(m，12 芳香性H)。EI-MS：485[M+]
二异丙基-氨基亚磷酸4-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-3-硝基-苄基酯2-氰基-乙基酯(7)
在氩气下将醇5(300mg，0.62mmol)溶解在2.4ml CH2Cl2中。加入溶解在CH2Cl2(2.4ml)中的双(二异丙基氨基)亚磷酸2-氰基乙基酯(2-Cyanoethyl-2(diisopropylamido)phosphite)(0.28ml，0.77mmol)和四唑化物(tetrazolide)(145mg，0.846mmol)。将该混合物于室温搅拌3小时，用饱和NaHCO3水溶液稀释，用CH2Cl2萃取2次。将合并的有机相干燥(NaHCO3)，在减压下浓缩。将所得油状物通过柱色谱法(硅胶；AcOEt/己烷1:4，1％N-甲基-吗啉)进行纯化，得到黄色泡沫状物7(253mg，61％)。TLC(AcOEt/己烷 1:2)：Rf0.50。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：1.20(2d，J＝6.8，4MeCHN)；2.65(t，J＝6.4，CH2CN)；3.61-3.69(m，OCH2CH2CN)；3.77(s，OMe)；3.79-3.91(m，2Me2CHN)；4.57(s，CH2ODMT)；4.76(m，CH2OP)；6.78-6.84(m，4 芳香性H)；7.20-7.48(m，10 芳香性H)7.64(d，J＝8.1，1 芳香性H)；8.01(s，1 芳香性H)；8.09(d，J＝8.1，1 芳香性H)。31P-NMR(162MHz，CDCl3)：150.84。ESI-MS(正模式)：708([M+Na]+；计算值708)
二异丙基-氨基亚磷酸4-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-2-硝基-苄基酯2-氰基-乙基酯(8)
在氩气下将醇6(300mg，0.62mmol)溶解在CH2Cl2(2.4ml)中。加入溶解在CH2Cl2(2.4ml)中的双(二异丙基氨基)亚磷酸2-氰基乙基酯(0.28ml，0.77mmol)和四唑化物(145mg，0.85mmol)。将该混合物于室温搅拌3小时，用饱和NaHCO3水溶液稀释，用CH2Cl2萃取2次。将合并的有机相干燥(NaHCO3)，在减压下浓缩。将所得油状物通过柱色谱法(硅胶；AcOEt/己烷1:4，1％N-甲基-吗啉)进行纯化，得到黄色泡沫状物8(352mg，85％)。TLC(AcOEt/己烷 1:2)：Rf 0.42。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：1.14(2d，J＝6.8，4 MeCHN)；2.58(t，J＝6.4，CH2CN)；3.54-3.66(m，OCH2CH2CN)；3.72(s，OMe)；3.75-3.96(m，2Me2CHN)；4.18(s，CH2ODMT)；5.00(m，CH2OP)；6.75-6.80(m，4 芳香性H)；7.12-7.42(m，10 芳香性H)；7.58(d，J＝8.1，1 芳香性H)；7.71(d，J＝8.1，1 芳香性H)；7.97(s，1 芳香性H)。31P-NMR(162MHz，CDCl3)：150.35。ESI-MS(正模式)：708([M+Na]+；计算值708)
寡核苷酸的合成
按照亚磷酰胺化学[6，7]，在392 DNA/RNA合成仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))上合成了寡脱氧核苷酸。脱氧核苷亚磷酰胺来自环球基因(Transgenomic)公司(格拉斯哥，英国)。通过标准合成方法(“去三苯甲基(trityl-off)”模式)制得寡脱氧核苷酸。通过于55℃用30％氢氧化铵处理过夜而实现了从固体载体上分离和最后的脱保护。
按照TOM保护的RNA亚磷酰胺化学[3]，在Mermade DNA板合成仪(生物自动化公司(Bioautomation Inc.))上合成了寡核糖核苷酸。核糖核苷亚磷酰胺来自凯杰公司(Qiagen AG)(Hombrechtikon，CH)。按照标准合成方法(“加三苯甲基”模式)制得寡核苷酸。通过于65℃用氨水/甲胺溶液(1:1)处理30分钟而实现了从固体载体上分离和碱/磷酸二酯骨架脱保护。通过于65℃用TEA-HF溶液处理1小时而实现了2’-TOM脱保护。
寡核苷酸的纯化
具体而言，将寡核苷酸用OASIS柱(沃特世(Waters AG)公司)进行纯化。首先，用1ml乙腈、然后用1ml 0.1M乙酸三乙基铵溶液(TEAA)使柱子适应。将粗寡核苷酸装载到柱子上，将柱子用在0.1M TEAA中的15％乙腈溶液洗涤以除去所有去三苯甲基的截短的序列。用1ml 3％二氯乙酸水溶液进行了柱上脱三苯甲基化。在用1:1 乙腈/水溶液洗脱纯化的去三苯甲基寡核苷酸之前，将柱子用1-2ml 0.1M TEAA或水洗涤。
流程3：经由可光裂解的连接体连接的寡核苷酸
寡核苷酸的光裂解
通过将寡核苷酸(0.1至10光密度)在水(10-100微升，在普通的塑料比色杯中)中的溶液用光(352nm波长；两个8瓦管)照射15至180分钟，进行了寡核苷酸的裂解。该处理导致形成了两个单独寡核苷酸(流程4和图1)。
流程4：通过合成后照射产生两个寡脱氧核苷酸的实施例
表1：寡核苷酸在照射前后的MS分析
| M计算 | M实测 | |
| 照射前 | 3506 | 3506.00 |
| 照射后 | 15751539 | 1574.631538.63 |
流程5：通过合成后照射DNA-RNA寡核苷酸嵌合体产生两个寡核苷酸的实施例
表2：寡核苷酸在照射前后的MS分析
| M计算 | M实测 | |
| 照射前 | 10754.9 | 10757.87 |
| 照射后 | 6744.23668.2 | 6745.563668.82 |
采用标准亚磷酰胺化学，通过在五脱氧核苷酸(序列5’-AAAAT-3’)的5’末端同时加上亚磷酰胺8和7以及通过五胸苷酸进一步延伸，制得第一个可光裂解的寡脱氧核苷酸。裂解/脱保护和脱盐后，将可光裂解的寡脱氧核苷酸在16W UV灯上于352nm照射2小时。通过电雾化质谱测定法(ES-MS)直接测得，被照射的溶液显示出两个峰，这两个峰相应于由两个邻苯基部分裂解所产生的两个五脱氧核苷酸(在5’或3’-末端载有末端磷酸酯)(流程4)。
采用亚磷酰胺4，使用标准亚磷酰胺化学在96孔Mermade合成仪上合成了可光裂解的嵌合DNA/RNA。寡核苷酸由十二胸苷酸(dodecathymilydate)组成，后者跟随有双-邻硝基苄基连接体并用跟随有19nt长寡核糖核苷酸的两个脱氧核苷酸进一步延伸。以“加三苯甲基”模式制得嵌合体，将其通过反相柱进行纯化，在光照射(于室温在366nm处照射15分钟)前后通过质谱测定法进行分析。检测出两个峰，这两个峰相应于在其5’-末端载有磷酸酯残基的十二胸苷酸和具有3’-磷酸酯残基的21nt长DNA/RNA嵌合体。
然后我们在96孔Mermade合成仪上合成了一条长DNA/RNA嵌合体，其由通过双-邻硝基苄基连接体隔开的两条互补链组成。每条链由在其3’-末端的脱氧核苷酸二聚物和19-nt长寡核糖核苷酸组成。以“加三苯甲基”模式制得嵌合体，将其通过反相柱进行纯化，在光照射(于室温在366nm处照射15分钟)前后通过质谱测定法进行分析。在照射前，我们观察到相应于全长物质的单一峰。在照射后，观察到相应于两条链的物质，而原料完全消失。
Claims (16)
1.制备由两个或更多个单独寡聚物构成的寡聚化合物的方法，在所述的寡聚化合物中，单独寡聚物被可光裂解的连接体隔开，该方法包括使所述的连接体进行光活化裂解的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中单独寡聚物独立地选自寡核苷酸、寡糖、寡肽。
3.根据权利要求1的方法，其中单独寡聚物是寡核苷酸。
4.根据权利要求1的方法，其中单独寡聚物是完全或部分互补的寡核苷酸。
5.根据权利要求1的方法，其中单独寡聚物是完全或部分互补的寡核糖核苷酸。
6.根据权利要求1的方法，其中连接体在各单独寡聚物的脱保护条件下是稳定的。
7.根据权利要求1的方法，其中连接体基团通过UV或可见光照射被裂解。
8.根据权利要求4的方法，其中所述的寡核苷酸是两个寡核糖核苷酸。
9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中连接体是式I化合物:
式I
其中:
PG是(Ar1)(Ar2)(Ar3)C-，其中Ar1、Ar2、Ar3独立地选自CH3OC6H4-和C6H5-，
或者PG是被取代的甲硅烷基(R1′)(R2′)(R3′)Si-，其中R1′、R2′、R3′独立地选自低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基氧基或芳氧基；
X是O、N或S；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、NH2、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基，并且取代基R1-R5中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
取代基R1、R2、R3、R4和R5中两个或更多个可以形成一个或数个环，所述的环可以进一步被如R1、R2、R3、R4或R5中所定义的基团取代；
取代基R1、R2、R3、R4或R5中至少一个是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的磷酸二酯或硫代磷酸酯链结的载有亚磷酰胺、膦酸酯或磷酸三酯的基团，或者是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的酰胺、脲或硫脲链结的胺基、活化羧酸酯基、异氰酸酯基或异硫氰酸酯基；
R6选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基。
10.根据权利要求1-8任一项的方法，其中连接体是式II化合物:
式II
其中:
PG是(Ar1)(Ar2)(Ar3)C-，其中Ar1、Ar2、Ar3独立地选自CH3OC6H4-、C6H5-，
或者PG是被取代的甲硅烷基(R1′)(R2′)(R3′)Si-，其中R1′、R2′、R3′独立地选自低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基氧基或芳氧基；
X是O、N或S；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、NH2、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基，并且取代基R1-R5中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
取代基R1、R2、R3、R4和R5中两个或更多个可以形成一个或数个环，所述的环可以进一步被如R1、R2、R3、R4或R5中所定义的基团取代；
R6选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基；
U、V、W形成在一端替换取代基R1至R5之一且在另一端替换取代基R7至R11之一的链；
U、V、W可以独立地不存在或者是亚烷基(-R-)、亚环烷基(-R-)或亚芳基(-Ar-)、-O-、-S-、-NR′-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NR′-、-OC(O)O-、-OC(O)NR′-、-NR′C(O)NR＂-、-OC(S)NR′-、-NR′C(S)NR＂-、-S(O)-、-S(O2)-、-S(O2)NR′-、-OP(O2)O-，并且可以含有标记或荧光团或用于改善寡核苷酸的药理学性质的基团；
R7、R8、R9、R10和R11独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、NH2、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基，并且取代基R7至R11中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
R12选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基；
Y是O、N或S；
Z是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的磷酸二酯或硫代磷酸酯链结的亚磷酰胺、膦酸酯或磷酸三酯基团，或者是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的酰胺、脲或硫脲链结的胺基、活化羧酸酯基、异氰酸酯基或异硫氰酸酯基。
11.根据权利要求1-8的方法，其中连接体是式I化合物:
式I
其中:
PG是二甲氧基三苯基甲基；
X是O；
R1是硝基；
R3是-CH2-O-P(N[iPr]2)-O-CH2-CH2-CN)；
R2、R4、R5和R6是氢。
12.根据权利要求1-8的方法，其中连接体是式II化合物:
式II
其中:
PG是二甲氧基三苯基甲基；
X和Y是O；
R1和R7是硝基；
R2、R4、R5、R6、R8、R10、R11和R12是氢；
U是氧且替换R3；
V是-CH2-CH2-CH2-；
W是氧且替换R9；
Z是-P(N[iPr]2)-O-CH2-CH2-CN)。
13.式I化合物:
式I
其中:
PG是(Ar1)(Ar2)(Ar3)C-，其中Ar1、Ar2、Ar3独立地选自CH3OC6H4-和C6H5-，
或者PG是被取代的甲硅烷基(R1′)(R2′)(R3′)Si-，其中R1′、R2′、R3′独立地选自低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基氧基和芳氧基；
X是O、N或S；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、NH2、N-低级烷基/芳基和NHC(O)低级烷基/芳基；并且取代基R1至R5中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
取代基R1、R2、R3、R4和R5中两个或更多个可以形成一个或数个环，所述的环可以进一步被如R1、R2、R3、R4或R5中所定义的基团取代；
取代基R1、R2、R3、R4或R5中至少一个是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的磷酸二酯或硫代磷酸酯链结的载有亚磷酰胺、膦酸酯或磷酸三酯的基团，或者是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的酰胺、脲或硫脲链结的胺基、活化羧酸酯基、异氰酸酯基或异硫氰酸酯基；
R6选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、N-低级烷基/芳基和NHC(O)低级烷基/芳基。
14.根据权利要求13的化合物，其中:
PG是二甲氧基三苯基甲基；
X是O；
R1是硝基；
R3是-CH2-O-P(N[iPr]2)-O-CH2-CH2-CN)；
R2、R4、R5和R6是氢。
15.式II化合物:
式II
其中:
PG是(Ar1)(Ar2)(Ar3)C-，其中Ar1、Ar2、Ar3独立地选自CH3OC6H4-、C6H5-，
或者PG是被取代的甲硅烷基(R1′)(R2′)(R3′)Si-，其中R1′、R2′、R3′独立地选自低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基氧基或芳氧基；
X是O、N或S；
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、NH2、N-低级烷基/芳基和NHC(O)低级烷基/芳基，并且取代基R1至R5中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
取代基R1、R2、R3、R4和R5中两个或更多个可以形成一个或数个环，所述的环可以进一步被如R1、R2、R3、R4或R5中所定义的基团取代；
R6选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、N-低级烷基/芳基和NHC(O)低级烷基/芳基；
U、V、W形成在一端替换取代基R1至R5之一且在另一端替换取代基R7至R11之一的链；
U、V、W可以独立地不存在或者是亚烷基(-R-)、亚环烷基(-R-)或亚芳基(-Ar-)、-O-、-S-、-NR′-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NR′-、-OC(O)O-、-OC(O)NR′-、-NR′C(O)NR＂-、-OC(S)NR′-、-NR′C(S)NR＂-、-S(O)-、-S(O2)-、-S(O2)NR′-、-OP(O2)O-，并且可以含有标记或荧光团或用于改善寡核苷酸的药理学性质的基团；
R7、R8、R9、R10和R11独立地选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、OH、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、SH、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、NH2、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基，并且取代基R7至R11中至少一个是硝基、亚硝酰基或重氮基；
R12选自氢、低级烷基、芳基、芳基低级烷基、低级烷基芳基、低级烷基卤素、CN、COOH、C(O)O低级烷基/芳基、CONR′R＂、CHO、C(O)低级烷基/芳基、O-低级烷基/芳基、OC(O)低级烷基/芳基、S-低级烷基/芳基、SO3H、SO2O-低级烷基/芳基、SO2NR′R＂、N-低级烷基/芳基、NHC(O)低级烷基/芳基；
Y是O、N或S；
Z是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的磷酸二酯或硫代磷酸酯链结的亚磷酰胺、膦酸酯或磷酸三酯基团，或者是能够形成与生长的寡核苷酸链连接的酰胺、脲或硫脲链结的胺基、活化羧酸酯基、异氰酸酯基或异硫氰酸酯基。
16.根据权利要求15的化合物，其中:
PG是二甲氧基三苯基甲基；
X是O；
R1是硝基；
R3是-CH2-O-P(N[iPr]2)-O-CH2-CH2-CN)；
R2、R4、R5和R6是氢。
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