CN101155821A - 用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺活化剂 - Google Patents

用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺活化剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了改进的亚磷酰胺活化剂，该活化剂包含(5)－苄基硫醇基四唑在乙腈和N－烷基咪唑中的溶液。进一步提供了改进的合成寡核苷酸的方法，其中包含(5)－苯甲基硫醇基四唑在乙腈和N－烷基咪唑中的溶液的亚磷酰胺活化剂用于制备核苷间的键。

Description

用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺活化剂
发明领域：
本发明涉及用于寡核苷酸合成的改进的组合物。更明确地，本发明涉及用于寡核苷酸合成的改进的亚磷酰胺活化剂和相关使用方法。
背景：
已发现寡核苷酸合成在制造用于多聚酶链式反应(PCR)复制过程的引物中非常有效。特别地，寡核苷酸可与互补DNA的特定区域结合，从而扩增DNA的特异性片段。寡核苷酸的该方面在用寡核苷酸进行治疗和诊断应用方面很有意义，特别是可用于以序列特异性的方式影响表达基因和蛋白功能。在这些和其它的应用中，可大量产生高纯度的寡核苷酸。
DNA和RNA寡核苷酸合成包括多个串联核苷的结合。该过程通常需要以下步骤：(1)第一核苷、核苷酸或寡核苷酸上5′-羟基的去封闭；(2)亚磷酰胺单体碱的活化；(3)将第一活化的核苷与活化的亚磷酰胺通过亚磷酸键(phosphite linkage)结合；和(4)氧化亚磷酸键形成更稳定的磷酸键(phosphate linkage)。可重复这四个步骤直至产生所需寡核苷酸。
因此，亚磷酰胺为寡核苷酸合成中的重要构件。用于各种核苷的亚磷酰胺可从许多供应商那里购买得到。3′-O-亚磷酰胺为应用最广泛的亚磷酰胺(amidites)，但是寡核苷酸的合成还可包括5′-O-和2′-O-保护的亚磷酰胺(Wagner et al.，nucleosides&Nucleotides，1997，17，1657-1660；Bhan et al.，nucleosides&Nucleotides，1997，17，1195-1199)。还有许多不是核苷的亚磷酰胺可以使用(Cruachem Inc.，Dulles，Va.；Clontech，Palo Alto，Calif.)。
如上所述，寡核苷酸合成通常涉及3′-O-亚磷酰胺与核苷、核苷酸或寡核苷酸的5′-OH的偶联。该合成过程的一个步骤为亚磷酰胺的活化，其可通过裂解保护亚磷键(phosphorous linkage)的其中一个基团来完成。然后，所得的活化亚磷可与核苷基(nucleoside base)上的活性5′-羟基结合。下面的方案显示了该反应的实例，其中亚磷酰胺(I)与连接在引物载体上的寡核苷(II)在亚磷酰胺活化剂存在下反应，形成核苷间的键(internucleoside linkage)(III)：
在该实例中，R为如下部分：二甲氧基三苯甲基(DMT)、2′-O-(叔丁基)-二甲基甲硅烷基(TBDMS)、2′-O-[(三异丙基-甲硅烷基)氧基]甲基(TOM)、寡核苷酸及其类似物或类似的基团；Pg为亚磷(phosphorous)保护基团如烷基、-CH2CH2CN、-CH2CH＝CHCH2CN、对-CH2C6H4CH2CN、-(CH2)2-5N(H)COCF3、-CH2CH2Si(C6H5)2CH3、CH2CH2N(CH3)COCF3等；X和X′独立为氢、氟、烷氧基、-O-叔丁基二甲基甲硅烷基(OTBDMS)、-O-甲氧基甲基(OMOM)、2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE)或类似的基团；B和B′独立为衍生自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶的部分。
通过上述方案形成的寡核苷酸为本领域已知的，如Rüdiger Welzand Sabine Müller，″5-苄基硫醇基-1H-四唑作为RNA合成中2′O-TBDMS亚磷酰胺构件的活化剂(5-benzylmercapto-1H-tetrazole asactivator for 2′O-TBDMS phosphoramidite building blocks in RNAsynthesis)″，Tetrahedron Letters 43，2002，p.795-97。为了满足对这些寡核苷酸的不断增长的需要，需要在商业规模上改良寡核苷酸的合成(Noe，Kaufhold，New Trends in Synthetic Medicinal Chemistry，Wiley-VCh Weinheim，2000，261)。为了该目的，已在开发亚磷酰胺活化剂方面做了很多努力。
最先被描述的亚磷酰胺化学活化剂为1H-四唑。后来，开发了更多的有效的活化剂，包括5-甲硫基-1H-四唑、5-硝基苯基-1H-四唑、5-乙硫基-1H-四唑和4，5-二氰基咪唑。最近，5-苄基硫醇基四唑(BMT)(也被称为苄基硫基四唑(BTT)或苄基-1H-四唑)被认为是某些RNA合成技术如TOM-保护的和TBDMS-保护的RNA亚磷酰胺的活化的理想活化剂。参见如X.Wu和S.Pitsch，Nucleic Acitds Research，1998，26，4315-23)；S.Pitsch，et al.，HeIv.Chvn.Acta，2001，84，3773-3795；和R.Welz和S.Muller，″5-苄基硫醇基-1H-四唑作为RNA合成中2′O-TBDMS亚磷酰胺构件的活化剂(5-benzylmercapto-1H-tetrazole as activator for 2 O-TBDMS phosphoramidite building blocks inRNA synthesis)″，Tetrahedron Letters 43，2002，p.795-97。
相比之下，采用BMT进行有效RNA合成所需的TBDMS或TOM单体比采用1H-四唑的方法所需的TBDMS或TOM减少50％。另外，BMT在较低的温度下比1H-四唑具有更高的溶解度，且BMT在19E C以下不结晶也不堵塞管道。但是，据报道BMT在乙腈中的最大溶解度为约0.33M(参见http://www.eurogentec.be/code/EN/what.asp？pk_id_what＝85)，且BMT的疏水性质将其商业应用限制在低于或等于0.25M的乙腈溶液。在此浓度以上，BMT的乙腈溶液变得不太稳定，在商业操作中易于堵塞溶剂管道。因此，尽管大于0.3M以上的溶液可能具有更有效和快速活化以及更少的亚磷酰胺消耗的优势，但是BMT的乙腈溶液的商业用途被限制在低于或等于0.25M的浓度。另外大于0.3M的BMT的乙腈溶液更安全，不易爆炸，因此可大量生产并可在金属容器中如200L的不锈钢压力配药系统中贮存和装运。
申请者用本发明克服了先有技术中的这些和其它缺点。
发明说明书以及优选的实施方案：
本发明描述了用于寡核苷酸合成的改良亚磷酰胺活化剂溶液。更明确地，申请者发现通过加入某些极性共溶剂如N-烷基咪唑(N-alklimidazole)、四氢呋喃(tetrahydrofan)和二氧六环，可增加5-苄基硫醇基四唑(BMT)(也被称为苄基硫基四唑(BTT)或苄基-1H-四唑)在乙腈中的浓度。可用于本发明的共溶剂必须能溶解亚磷酰胺，且它们的官能性必须不能阻碍常规DNA和RNA合成技术。优选的共溶剂为N-烷基咪唑。已发现BMT的乙腈和N-烷基咪唑溶液的浓度稳定在0.25M以上。当用作亚磷酰胺活化剂时，超过0.25M的BMT溶液可增大亚磷酰胺的活化作用，从而导致更有效和快速的寡核苷酸合成和更少的亚磷酰胺损耗。
本发明的亚磷酰胺为式I的化合物：
Figure A20068001122800081
其中Pg为亚磷保护基团如烷基、-CH2CH2CN、-CH2CH＝CHCH2CN、对-CH2C6H4CH2CN、-(CH2)2-5N(H)COCF3、-CH2CH2Si(C6H5)2CH3、-CH2CH2N(CH3)COCF3；
R1为核苷或寡核苷；和
R2为吗啉代、二烷基氨基(dialklamino)或-N(R3)2，其中R3独立为具有最多3个选自氮、硫和氧的杂原子的C1-C6烷基或4-7元杂环烷基或杂环烯基环。
本发明的核苷化合物(Nucleosidic compounds)包括单体和连接的DNA或RNA核苷。术语″核苷″包括天然或非天然存在的核苷和具有修饰的碱基(nucleobases)和/或修饰的糖部分的核苷，包括连接的核酸(Linked Nucleic Acid)(LNA)衍生物和被其它基团如卤素(halogene)取代基取代的核苷，检测器-包含的核苷包括生物素-或萤光素-连接的化合物；具有配体增强反义作用的效应器-包含的化合物；以及衍生自两个或更多这些化合物的寡聚结构。合适的DNA和RNA核苷的实例包括受保护的核苷，如5′-O-保护的核苷(有或没有另外的N-保护，如通过苯甲酰基、异丁酰基、叔丁基苯氧基乙酰基″TAC″等的保护)，包括腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷、去氧腺苷、去氧胞苷和去氧鸟苷的5′-O-保护的核苷；5′-O-保护的-2′-保护的核苷(有或没有另外的N-保护)，包括腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷的5′-O-保护的-2′-保护的核苷(其中优选的2′-保护基团包括叔丁基二甲基甲硅烷基、甲氧基甲基(MOM)、甲氧基乙基(MOE)和烷氧基如甲氧基)，以及腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧鸟苷的3′-O-保护的核苷(有或没有另外的N-保护)和衍生自这些化合物的寡聚结构。连接核苷的核苷间的键包括天然磷酸二酯键和修饰的键如硫代磷酸酯键(phosphoro-thioate)。其它本领域中已知的核苷间的键也适用于本发明。
糖的修饰在先有技术中为已知的，包括如2′取代基如F和2′-O-取代基如取代或未取代C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、醚和聚醚，其中所述取代基选自一个或几个氨基、咪唑、卤素、氰基、羧基、羟基、硝基和巯基。优选的聚醚为直链和环状聚乙二醇(PEGs)和包含(PEG)的基团如冠醚和Ouchi，et al.，Drug Design and Discovery1992，9，93，Ravasio，et al.，J.Org.Chem.1991，56，4329和Delgardo et.al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992，9，249中公开的化合物，每个文献都通过引用并入本文。另外在Cook，P.D.，supra.中也公开了糖的修饰。在1995年3月6日提交的申请号为08/398,901标题为″含2′和5′有取代的嘧啶核苷酸的寡聚物(OligomericCompounds having Pyrimidine Nucleotide(s)with 2′and 5′Substitutions)″的美国专利申请中描述了氟、O-烷基、O-烷基氨基、O-烷基咪唑、O-烷基氨基烷基和烷基氨基取代，其通过引用并入本文。
在核糖基环上具有O-取代的糖也适用于本发明。环O上的代表性取代基包括S、CH2、CHF和CF2，参见如Secrist，et al.，″Abstract 21，Program&Abstracts″，Tenth International Roundtable，nucleosides，Nucleotides and their Biological Applications，Park City，Utah，Sep.16-20，1992，通过引用并入本文。
本文所用术语″烷基″包括但不限于直链、支链和脂环烃基。本发明的烷基可为被取代的。美国专利No.5,212,295第12栏41-50行中公开了代表性的烷基取代基，通过引用并入本文。
″芳基″基团为芳香性环状化合物，包括但不限于苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基和二甲苯基。
通常，术语″杂″表示不为碳的原子，优选但不仅为N、O或S。因此，术语″杂环烷基″表示具有一个或多个杂原子(即非碳原子)的烷基环系。优选的杂环烷基包括如吗啉代。本文所用术语″杂环烯基″表示具有一个或多个双键和一个或多个杂原子的环系。优选的杂环烯基包括如通过N连接的吡咯烷基(pyrrolidino)。
在本发明的一些优选的实施方案中，氨基连在烷基或其它基团，如2′-烷氧基(如其中R1为烷氧基)上。这样的氨基通常还存在于天然和非天然存在的碱基上。在本发明的寡聚化合物合成过程中，这些氨基通常优选以受保护的形式存在。在Greene and Wuts，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，Chapter 7，2d ed，John Wiley&Sons，NewYork，1991中讨论了适用于这些目的的代表性的氨基保护基团。通常，当与分子部分如″碱基″一起应用时，本文所用术语″受保护的″是指分子部分包含一个或多个被保护基团保护的官能团。
在本发明申请中所用术语″碱基″包括天然存在的碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶(uridine)和胸腺嘧啶，以及被修饰的碱基如黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-卤代、氨基、巯基、烷硫基、羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤。还包括美国专利No.3,687,808以及ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering，第858-859页，Kroschwitz，J.L，ed.John Wiley&Sons，1990和Englisch et al.，Angewandte Chemie，International Edition 1991，30，613，Limbach，A.，et al.，Nucleic Acids Research，1994，22，2183-2196中公开的其它嘌呤和嘧啶。术语″核苷碱基(nucleosidic base)″还包括可用作类似核苷碱基的杂环化合物，包括某些不是最经典意义上的核苷碱基但可充当核苷碱基的“广义碱基”。特别要提到的广义碱基为3-硝基吡咯。
在先有技术中已知的修饰核苷间键，包括如甲基磷酸酯(methylphosphates)、单硫代磷酸酯(monothiophosphates)、二硫代磷酸酯(dithiophosphates)、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、磷酸酯(phosphate esters)、桥氨基磷酸酯(bridged phosphoroamidates)、桥硫代磷酸酯(bridged phosphorothioates)、桥亚甲基膦酸酯(bridgedmethylenephosphonates)、脱磷酸核苷间类似物与硅氧烷桥(dephosphointernucleotide analogs with siloxane bridges)、碳酸酯桥(carbonatebridges)、羧甲基酯桥(carboxymethyl ester bridges)、乙酰胺桥(acetamidebridges)、氨基甲酸酯桥(carbamate bridges)、硫醚、硫酰氧基(sulfoxy)、磺酰氧基桥(sulfono bridges)、各种″可塑性″DNA、-端基异构桥(anomeric bridges)和硼烷衍生物。
寡核苷酸合成中亚磷酰胺活化的效率直接关系到终产物的产率。可通过提供具高浓度BMT的亚磷酰胺活化剂溶液来提高该效率。申请者发现可通过加入N-烷基咪唑作为共溶剂来增加BMT在乙腈中的溶解度。因此，本发明的一个方面提供了包含BMT在乙腈和约0.1％-约10％N-烷基咪唑中的溶液的亚磷酰胺活化剂组合物。在优选的实施方案中，本发明的活化剂组合物包含约0.1％-约1.5％N-烷基咪唑，更优选包含约0.5％-约1.5％N-烷基咪唑，甚至更优选包含约1.0％-约1.5％N-烷基咪唑。N-烷基咪唑的浓度大于10％会干扰DNA或RNA的合成过程。优选地，所述N-烷基咪唑为N-甲基咪唑。
在另一优选的实施方案中，亚磷酰胺活化剂组合物包含摩尔浓度为约0.25-约1.0的BMT在合成级乙腈中的溶液。更优选地，所述组合物包含摩尔浓度为约0.30-约0.40的BMT溶液，而甚至更优选的组合物包含摩尔浓度为约0.35-约0.40的BMT溶液。优选地，将所述组合物保持在约-1E C以上的温度，更优选在约4E C以上。延长所述组合物暴露在-4E C以下的温度的时间会在溶液中产生沉淀，这会对商业寡核苷酸合成过程产生不良影响。
本发明的另一方面提供了亚磷酰胺活化的新型方法。不想被理论束缚，据信BMT活化亚磷酰胺的机理首先涉及亚磷酰胺的三价磷的质子化，然后与吗啉代、二烷基氨基(dialkamino)或胺离去基团连接形成中间产物。接着，脱去离去基团，使亚磷与核苷或寡核苷酸的有效5′-O位点结合，从而在寡核苷酸内产生糖间共价键。该反应机理的实例如下面的方案所示：
Figure A20068001122800131
亚磷酰胺和羟基在亚磷酰胺活化剂存在下的反应可在溶剂如乙腈存在下进行。
因此，在一些优选的实施方案中，本发明涉及制备糖间共价键的方法，包括以具式II化合物为代表的化合物：
Figure A20068001122800132
其中Pg和R1如上述定义；和
R4为核苷或寡核苷。
所述方法包括以下步骤：
(a)提供式I的亚磷酰胺；和
(b)将所述亚磷酰胺与核苷或寡核苷的糖部分的羟基在亚磷酰胺活化剂存在下反应；
其中所述亚磷酰胺活化剂包含大于0.25M的BMT在乙腈和N-烷基咪唑中的溶液。
在某些优选的实施方案中，R4与固相载体相连，如在标准固相寡核苷酸合成方案中。本发明的固相载体包括本领域中众所周知的适用于固相方法的固相载体，包括如可控多孔玻璃(CPG)、乙二酰基-可控多孔玻璃(参见如Alul，et al.，Nucleic Acids Research 1991，19，1527，通过引用以其整体并入本文)；TentaGel载体，氨基聚乙二醇衍生的载体(参见如Wright，et al.，Tetrahedron Letters 1993，34，3373，通过引用以其整体并入本文)和Poros，聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物。
本发明还提供了制备寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供3′-单核苷亚磷酰胺或3′-寡核苷亚磷酰胺；和
(b)将所述3′-单核苷亚磷酰胺或3′-寡核苷亚磷酰胺与核苷、核苷酸或寡核苷酸的5′羟基在亚磷酰胺活化剂存在下反应；
所述亚磷酰胺活化剂包含大于0.25M的BMT在乙腈和N-烷基咪唑中的溶液。
本文所用术语″寡核苷酸″包括天然存在或非天然存在(即“合成的”)的寡核苷酸。天然存在的寡核苷酸为自然界存在的寡核苷酸；如具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶碱基的核糖和去氧核糖磷酸二酯寡核苷酸。本文所用非天然存在的寡核苷酸为包含修饰的糖、核苷间键和/或碱基部分的寡核苷酸。这些寡核苷酸类似物通常与天然存在的或合成的野生型寡核苷酸结构上有差别，但功能可互换。因此，非天然存在的寡核苷酸包括可有效模拟(例如，通过与靶杂交)所需RNA或DNA链的结构和/或功能的所有结构。
在一些优选的实施方案中，3′-单核苷亚磷酰胺或3′-寡核苷亚磷酰胺与固相载体结合的核苷、核苷酸或寡核苷酸的5′羟基反应。
在更优选的实施方案中，重复进行上述每种方法，以得到具有预定核苷酸碱基序列的寡核苷酸或其类似物。
通常，在合成方案的最后除去被称为″Pg″的亚磷保护基团，优选在完成寡核苷酸或其类似物从固相载体上裂解之后进行。
本领域熟练技术人员应了解，可根据本发明的方法合成寡核苷酸，不仅可通过批量和/或连续法，还可采用自动寡核苷酸合成技术，如Applied BioSystems User′s Manual for Models 392 and 394DNA/KNA Synthesizers；Section 6 Chemistry for Automated DNA/RNASynthesis(March 1994)和MJ.Gait，″寡核苷酸合成，A PracticalApproach″，IRL Press at Oxford University Press(1984，ISBN 0-904147-74-6)中所描述，这些文献都通过引用并入本文。在这些实施方案中，核苷和/或寡核苷酸含羟基化合物为固定在固相载体上，在自动DNA合成仪中与核苷亚磷酰化剂(phosphitylating agent)在亚磷酰化活化剂(phosphitylation activator)存在下反应，生成寡核苷酸。可进行特定数目和序列的亚磷酰化反应(phosphitylation reactions)以得到本发明的包含不同长度和序列的核苷的寡核苷酸。
任何合适的固相载体材料都可适用于本发明。合适的固相载体材料的实例包括可控多孔玻璃(controlled-pore glass)(″CPG″)、聚苯乙烯、二氧化硅、纤维素纸和它们中两个或多个的组合。优选的固相载体材料包括可控多孔玻璃、聚苯乙烯及其组合。
用于本发明的固相载体可具有任何适合孔径的孔。本领域熟练技术人员应了解孔径的选择至少部分取决于要生产的寡聚物的大小和所用的核苷酸合成方法。在本文中，本领域熟练技术人员可容易地选择用于各种应用的适当孔径的固相载体材料。
许多固相载体固定的核苷都可购买得到。如，固定在CPG上(包括在1000埃CPG的0.2微摩尔的苯甲酰基保护的去氧胞嘧啶)许多N-保护的去氧核苷可得自Applied Biosystems(ABI)。
任何自动DNA/RNA合成仪都可适用于本发明。合适的DNA合成仪的实例包括Applied Biosystems的Model Nos.3900、3948、3400、380、380B、392和394，Expedite 8800、8905、8909；得自Amersham/GE Healthcare的Gene Assembler、OligoPilot II、AKTAoligopilot 10和AKTAoligopilot 100；和Beckmann Oligo 1000和1000M，MWG Biotech Oligo 2000，PolyPlex GeneMachine，IlluminaOligator、MerMade I、II和V，Intelligent Biolnstruments Primer Station960，Proligo Polygen，Syntower等。优选的合成仪包括Model ABA-394等。
下面的实施例提供了本发明的其它特征，其不应被理解为是对权利要求的限制。
实施例：
实施例1-12：
下面的实施例表明了加入共溶剂N-甲基咪唑(imidiazoles)(NMI)后BMT在乙腈中的溶解度增加。
  Ex.   共溶剂   BMT浓度(M)   温度(EC)   溶解时间(分钟)   振摇   沉淀(一定时间之后/温度)
  1   --   0.25   25   5   中等   */25EC
  2   --   0.30   25   30   剧烈   */25EC
  3   --   0.30   35   2   中等   */25EC
  4   -   0.40   35   10   剧烈   */25EC
  5   NMI(0.5％)   0.35   25   15   超声处理   无(16hrs./4EC)
  6   NMI(0.5％)   0.40   25   15   超声处理   无(16hrs./4EC)
  7   NMI(0.5％)   0.35   25   15   超声处理   无(16hrs./-1EC)
  8   NMI(0.5％)   0.40   25   15   超声处理   有(16hrs./-1EC)
  9   NMI(0.5％)   0.35   25   15   超声处理   有(16hrs./-4EC)
  10   NMI(0.5％)   0.40   25   15   超声处理   有(16hrs./-4EC)
  11   NMI(1.0％)   0.30   25   5   轻微   无(24hrs./-4EC)
12 NMI(1.5％) 0.30 25 5 轻微 无(24hrs./-4EC)
*在室温下，浓度大于0.25M的BMT在乙腈中的混合物不易形成稳定溶液
如上述实施例所显示，可通过加入共溶剂NMI来增加BMT在乙腈中的浓度。
实施例13-37：
下面的实施例比较了用不同亚磷酰胺活化剂进行RNA合成的偶联产率和全长产物。每个实施例的平均值采用rU20序列或RNA2-mer序列由总共3次实验的平均值计算。
实施例13的实验方法如下：
将包含用r-DMT-U和Q-接头衍生的LCAA--CPG载体(15.4mg)的合成柱装在ABI 394DNA合成仪上。该合成仪配有0.1M 2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基保护的RNA亚磷酰胺溶液(Trahsgenomics)和常用的去封闭、加帽和氧化溶液。所用的活化剂溶液为0.3M BMT+2.5％NMI。进行标准0.2μmol规模的RNA合成循环(300秒偶联时间)(Tr-off/手工终止)。合成后，留下的粗产物吸附在载体上。打开合成柱，移出一部分CPG(5.2mg)置于氢氧化铵中(48h，RT)。将该溶液轻轻倒出，蒸发除去NH4OH，所得残留物溶于水。在260nm的UV定量分析显示回收率为27.3A260单位(或52.5A260单位/10mgCPG))。移出等分部分的2′-O-甲硅烷基化的粗物质(5A260单位)，溶于3∶1DMSO/TEA-3HF(10μl)，加热(3h@65°)以脱去2′-OH的保护基团。加入正丁醇(1.5ml)以沉淀出完全脱保护的产物。离心后，收集片状沉淀物，然后用如上所述的毛细管凝胶电泳分析，只不过用手套和无菌DEPC水以避免RNA酶污染。
在实施例14-16中重复该方法，只不过用标明的组合物代替0.45M四唑活化剂。
  序列：rGCC CAU AUC GUU UCA UAG CUU(RNA混合为基础的21-mer)
  Ex.   活化剂   亚磷酰胺   偶联时间(s)   平均全长产物(％)   平均偶联产率(％)
  13   0.3M BMT+2.5％NMI   Transgenomic   300   58.20   97.3
  14   0.3MBMT+2.5％NMI   Pierce   120   30.64   94.3
  15   0.3MBMT+0.5％NMI   Transgenomic   300   68.79   98.1
  16   0.3MBMT+0.5％NMI   Transgenomic   180   52.95   96.9
  17   0.3MBMT+0.5％NMI   Pierce   120   56.86   97.2
  18   0.3M BMT+0.5％NMI   Transgenomic   120   53.07   96.9
  19   0.3MBMT+0.5％NMI   Transgenomic   60   44.32   96.0
  20   0.3M BMT   Pierce   120   47.35   96.3
  21   0.5MDIEA+TFA   Transgenomic   300   52.45   96.8
  22   0.5MDIEA+TFA   Transgenomic   180   53.42   96.9
  23   0.5MDIEA+TFA   Transgenomic   120   54.39   97.0
  24   0.5MDIEA+TFA   Transgenomic   60   41.02   95.6
  25*   0.45M四唑   Pierce   600   27.84   93.8
  序列：rGCC CAU AUC GUU UCA UAG CUU(RNA混合为基础的21-mer)[连续的]
  Ex.   活化剂   亚磷酰胺   偶联时间(s)   平均全长产物(％)   平均偶联产率(％)
  26   0.45M四唑   Transgenomic   300   47.34   96.3
  27   0.45M四唑   Transgenomic   180   21.67   92.6
  28   0.45M四唑   Transgenomic   120   3.30   84.3
  29   0.45M四唑   Transgenomic   60   0.00   0.0
**5次试验均值
  序列：rUUU UUU UUU UUU UUU UUU UU(RNA 20-mer)
  Ex.   活化剂   亚磷酰胺   偶联时间(s)   平均全长产物(％)   平均偶联产率(％)
  30   0.3M BMT+2.5％NMI   Transgenomic   300   62.04   97.5
  31   0.3MBMT+0.5％NMI   Transgenomic   300   67.68   98.0
  32   0.3M BMT+0.5％NMI   Pierce   120   66.58   98.0
  33***   0.3M BMT   Transgenomic   300   66.95   97.9
  34**   0.3M BMT   Pierce   120   63.60   97.8
  35***   0.25MBMT   Transgenomic   300   68.82   98.1
  36   0.45M四唑   Transgenomic   300   55.27   96.9
  37   0.5M DIEA+TFA   Transgenomic   300   59.48   97.3
**6次试验均值。
***尽管在实验室操作中可成功地使用无NMI的0.25M-0.3M的BMT溶液，但这些浓溶液无法用于工业应用，因为BMT会迅速从溶液中沉淀出来，导致转运管道堵塞。
如上述实施例所示，0.3M BMT的亚磷酰胺活化剂可得到的偶联产率和全长寡核苷酸产物等于或高于其它特定活化剂。但是，高浓度的NMI会降低合成过程的效率。
实施例38-43：
下面的实施例比较了用不同亚磷酰胺活化剂进行RNA合成的偶联产率和全长产物。每个实施例的平均值采用标明的DNA序列由总共3次实验的平均值计算。
实施例38的实验方法如下：
将包含用d-DMT-G(iBu)和Q-接头衍生的LCAA-CPG载体的合成柱装在ABI 394DNA合成仪上。该合成仪配有0.1M亚磷酰胺溶液(Transgenomics)和常用的去封闭、加帽和氧化溶液。所用活化剂溶液为0.3M BMT+0.5％NMI。进行标准0.2μmol规模的DNA合成循环(Tr-off/自动终止)。合成后，用氢氧化铵(5min，RT)使粗产物自动从载体上分裂。然后将所得物质加热(55°，16h)以除去保护基团。蒸发除去NH4OH，所得残留物溶于水，在260nm用UV定量(产量为59A260单位)。移出粗物质的等分部分(0.5A260单位)，重新溶于水(50μl)，用正丁醇(1.5ml)沉淀以脱盐。将该样品离心(2min)，除去液层，真空干燥片状沉淀物。将该样品重新溶于7∶3甲酰胺/水(100μl)，变性(95°，2min)，在冰上冷却(2min)，然后用毛细管凝胶电泳分析。用Agilent仪器在PEG溶液和Agilent PVA涂渍的毛细管(总长100μm×33cm)中按照Agilent条件进行CGE(publication#5988-4303EN)。对样品进行一式三份分析，用最大峰的平均积分峰面积(进行流动性校正)作为全长产物的总产率。
在实施例20和21中重复该方法，只不过用标明的组合物代替0.5M ETT活化剂。
  序列：dGCC CAA GCT GGC ATC CGT CA(DNA混合为基础的20-mer)
  Ex.   活化剂   亚磷酰胺   偶联时间(s)   平均全长产物(％)   平均偶联产率(％)
  38   0.3M BMT+0.5％NMI   Transgenomic   60   80.59   98.9
  39   0.5MDIEA+TFA   Transgenomic   60   74.85   98.5
  序列：dGGC TAA ATC GCT CCA CCA AG(DNA混合的为基础的20-mer)
  Ex.   活化剂   亚磷酰胺   偶联时间(s)   平均全长产物(％)   平均偶联产率(％)
  40   0.3MBMT+0.5％NMI   Transgenomic   60   83.99   99.1
  41***   0.3M BMT   Transgenomic   60   86.68   99.2
  42***   0.25MBMT   Transgenomic   60   85.28   99.2
  43   0.5M DIEA+TFA   Transgenomic   60   79.55   98.8
***尽管在实验室操作中可成功地使用无NMI的0.25M-0.3M的BMT溶液，但这些浓溶液无法用于工业应用，因为BMT会迅速从溶液中沉淀出来，导致转运管道堵塞。
如上述实施例所示，与其它活化剂相比，0.3M BMT的亚磷酰胺活化剂溶液可得到较高的偶联产率和全长DNA寡核苷酸产物。

Claims (16)

1.一种亚磷酰胺活化剂，所述活化剂包含5-苄基硫醇基四唑在乙腈和N-烷基咪唑中的溶液。
2.权利要求1的活化剂，包含至少约0.5％重量的N-烷基咪唑。
3.权利要求2的活化剂，包含至少约1.0％重量的N-烷基咪唑。
4.权利要求3的活化剂，包含至少约1.5％重量的N-烷基咪唑。
5.权利要求1的活化剂，其中所述N-烷基咪唑为N-甲基咪唑。
6.权利要求1的活化剂，包含至少约0.25M的苄基硫醇基四唑溶液。
7.权利要求1的活化剂，包含至少约0.30M的苄基硫醇基四唑溶液。
8.权利要求1的活化剂，包含至少约0.35M的苄基硫醇基四唑溶液。
9.权利要求1的活化剂，包含至少约0.40M的苄基硫醇基四唑溶液。
10.一种活化亚磷酰胺的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供亚磷酰胺；和
(b)将步骤(a)的亚磷酰胺与权利要求1的亚磷酰胺活化剂反应，得到可与核苷或寡核苷酸的5′-O位反应的中间产物。
11.权利要求10的方法，其中所述亚磷酰胺具下式：
Figure A2006800112280002C1
其中Pg为选自下列的亚磷保护基团：-CH2CH2CN、-CH2CH＝CHCH2CN、对-CH2C6H4CH2CN、-(CH2)2-5N(H)COCF3、-CH2CH2SiC6H5)2CH3和CH2CH2N(CH3)COCF3；
R1为核苷或寡核苷；和
R2为吗啉代、二烷基氨基或-N(R3)2，其中R3独立为C1-C6烷基或具有最多3个选自氮、硫和氧的杂原子的4-7元杂环烷基或杂环烯基环。
12.一种制备寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供3′-核苷亚磷酰胺或3′-寡核苷酸亚磷酰胺；和
(b)在亚磷酰胺活化剂存在下，将所述3′-核苷亚磷酰胺或3′-寡核苷酸亚磷酰胺与核苷或寡核苷酸的5′-羟基反应；
其中所述亚磷酰胺活化剂包含5-苄基硫醇基四唑的乙腈和N-烷基咪唑溶液，所述溶液的5-苄基硫醇基四唑浓度大于约0.25M。
13.权利要求12的方法，其中所述核苷或寡核苷酸结合在固相载体上。
14.一种制备糖间共价键的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供亚磷酰胺；和
(b)在亚磷酰胺活化剂存在下，将所述亚磷酰胺与核苷或寡核苷的糖部分的羟基反应，得到具下式的化合物：
Figure A2006800112280003C1
其中Pg为选自下列的亚磷保护基团：-CH2CH2CN、-CH2CH＝CHCH2CN、对-CH2C6H4CH2CN、-(CH2)2-5N(H)COCF3、-CH2CH2Si(C6H5)2CH3和CH2CH2N(CH3)COCF3；
R1为核苷或寡核苷；和
R4为核苷或寡核苷；
所述亚磷酰胺活化剂包含至少0.25M的5-苄基硫醇基四唑的乙腈和N-烷基咪唑溶液。
15.权利要求14的方法，其中所述亚磷酰胺具下式：
Figure A2006800112280004C1
其中Pg为选自下列的亚磷保护基团：-CH2CH2CN、-CH2CH＝CHCH2CN、对-CH2C6H4CH2CN、-(CH2)2-5N(H)COCF3、-CH2CH2Si(C6H5)2CH3和CH2CH2N(CH3)COCF3；
R1为核苷或寡核苷；和
R2为吗啉代、二烷基氨基或-N(R3)2，其中R3独立为C1-C6烷基或具有最多3个选自氮、硫和氧的杂原子的4-7元杂环烷基或杂环烯基环。
16.权利要求14的方法，其中反复进行步骤(a)和(b)得到按照预定核苷酸碱基序列的寡核苷酸。
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