JP2002509155A - 核酸塩基オリゴマー - Google Patents

核酸塩基オリゴマー

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JP2002509155A JP2000540144A JP2000540144A JP2002509155A JP 2002509155 A JP2002509155 A JP 2002509155A JP 2000540144 A JP2000540144 A JP 2000540144A JP 2000540144 A JP2000540144 A JP 2000540144A JP 2002509155 A JP2002509155 A JP 2002509155A
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Abstract

(57)【要約】 プリン、ピリミジン、および他の核酸塩基モノマーから構成されるオリゴマーによって例示される新規なクラスの化合物を開示する。反対の鎖における相補的な核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）に対するワトソン／クリック塩基対合を介する核酸塩基オリゴマーの水素結合。オリゴマー中の各内部核酸塩基は、２つの付着部位を有し、そしてリンカーにより２つの核酸塩基に付着される。終結基は、反応性機能性、標識、レポーター、または核酸を含み得る。この核酸塩基オリゴマー化合物は、相補的な核酸に対する配列特異的認識分子として有用である。この分子が、核酸塩基オリゴマーおよび核酸の部分からなる場合、このキメラは、切断、連結、およびプライマー伸長方法（例えば、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定）での酵素基質であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （背景） ＤＮＡおよびＲＮＡの多数の核酸アナログが合成されており、そして顕著に異
なる分子認識性質を有することが示されている。核酸の線状鎖の間の秩序だった
分子間水素結合による分子認識の中心的な特性（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．
およびＧａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、「ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ、第２版（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ
、１５〜２２頁）は、構造的な改変により大きく影響され得る。いくつかのアナ
ログは、より高い熱的な融解値（Ｔｍ）により例証される、それらの相補的なＤ
ＮＡおよびＲＮＡに対してより高い親和性を有する。この効果において、親和性
は、ハイブリダイゼーション強度および二本鎖安定性と同義である。理想的には
、核酸アナログは、通常のワトソン／クリック法則（Ａ＋Ｔ、Ｇ＋Ｃ）に従う高
程度の塩基弁別を実証する。弁別、または特異性のレベルは、完全なワトソン／
クリック相補性を有する二本鎖のＴｍ値を、１つ以上のミスマッチ（例えば、Ａ
＋ＧまたはＡ＋Ｃ）を有する二本鎖のＴｍ値に対して比較する実験において最も
よく測定される。Ｔｍの減少によりみられる不安定化は、構造の改変、ハイブリ
ダイゼーション条件、または他の実験的パラメータに関係する特異性の尺度であ
る。いくつかの核酸アナログは、より優れた性質を有するが、大部分は、障害性
および欠乏性の熱的な融解値を示す。
【０００２】 さらに、いくつかの核酸およびアナログは、二本鎖以外の高次構造を形成し得
る。例えば、三本鎖構造は、配列依存的な様式で結合した３つの鎖を含む。高次
構造は、天然に存在し、そして遺伝子発現、組換え、および複製に重要な役割を
果たすが、それらは、外因性の核酸アナログの意図された、標的化された活性を
減少させるかまたは複雑にさせ得る。従って、核酸アナログが明確および予測可
能な分子認識の性質を有することは、大部分の目的にとって所望される。核酸ア
ナログの最も所望される分子認識の性質は、ワトソン／クリック塩基対における
高親和性および特異性である。
【０００３】 細胞核および複製性の細胞小器官の外側に存在する外因性の核酸は、酵素によ
り迅速に分解され、そして代謝される。核酸の構造的なアナログは、しばしば、
外来ＤＮＡおよびＲＮＡを迅速に分解する、ホスホジエステラーゼ、エキソヌク
レアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対して不十分な基質である。従って、ヌク
レアーゼ耐性アナログは、より高い、より安定な細胞内濃度を有し、そしてイン
ビトロまたはインビボの時期の有用な期間にわたって、それらのアンチセンス効
果、および他のハイブリダイゼーション依存効果を発揮し得る。核酸アナログは
、ヌクレアーゼ耐性であることが望ましい。
【０００４】 多数の核酸アナログは、いくつかの所望される性質を有するが、このようなア
ナログは、多数の他の性質を有し、ＰＣＲまたは核酸配列決定のような共通の分
子生物学の技術を不適切にする。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｎｉｅｌｓ
ｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１４９７〜１５００）
は、プライマー伸長鋳型またはプライマーとして機能し得ない。なぜなら、それ
らは、リガーゼ、ポリメラーゼ、または制限酵素の基質ではないからである。従
って、このような有用な性質を有する核酸アナログを提供することが目的である
。対応するＤＮＡ分子に関する利点である１つ以上の性質を有する核酸アナログ
を提供することもまた目的であるが、また、アニーリング、ライゲーション、配
列決定、切断、ＰＣＲ、および他のプライマー伸長反応を含む種々の分子生物学
の方法において使用され得る。このようなアナログを使用する方法を提供するこ
とはさらなる目的である。
【０００５】 （要旨） 本発明は、相補的な核酸の配列特異的な分子認識に有用である新規な核酸塩基
オリゴマーのクラスおよび新規な核酸塩基オリゴマーの使用に関する。
【０００６】 天然の核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、ならびに核酸アナログと比較し
て、増加した分子内および分子間二本鎖安定性を有する核酸塩基オリゴマーを提
供することは、本発明の特定の実施態様の目的である。
【０００７】 核酸塩基オリゴマー鎖が核酸鎖（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）と塩基対化す
る場合（例えば、図４〜図７）、Ａ型またはＢ型ヘリックス形成を誘導するヘテ
ロ二本鎖構造を有する核酸塩基オリゴマーを提供することは、本発明の特定の実
施態様の別の目的である。
【０００８】 天然の核酸と比較して、ヌクレアーゼ分解に増加した耐性を有する核酸塩基オ
リゴマーを提供することは、本発明の特定の実施態様のさらに別の目的である。
【０００９】 既知の核酸と比較して増加した化学的安定性を有する核酸塩基オリゴマーを提
供することは、本発明の特定の実施態様のさらに別の目的である。
【００１０】 既知の核酸と比較して生存細胞への増加した輸送速度を有する核酸塩基オリゴ
マーを提供することは、本発明の特定の実施態様の別の目的である。
【００１１】 シグナル伝達、標識化、共有結合付着、捕捉誘導体化、および検出能力を提供
する核酸塩基オリゴマーを提供することは、本発明の特定の実施態様のさらに別
の目的である。
【００１２】 核酸塩基オリゴマーおよび核酸を含み、そして上記の性質の１つ以上を有する
、キメラを提供することは、本発明の特定の実施態様のさらに別の目的である。
このキメラは、任意の比率、配列順、または配列組成で核酸塩基モノマーおよび
ヌクレオチドモノマーを含む。本発明の好ましい実施態様において、このキメラ
は、核酸塩基モノマーの部分およびヌクレオチドモノマーの部分からなり、ここ
で、ヌクレオチド部分の５’末端が核酸塩基部分に付着され、そしてこのヌクレ
オチド部分が３’ヒドロキシルを保有する。このようなキメラは、プライマー伸
長反応においてポリメラーゼ酵素に対する有用な基質であり得る。
【００１３】 本発明の核酸塩基オリゴマー（またはそのキメラ）の実施態様は、プリン、ピ
リミジンまたはアナログ核酸塩基の反復ポリマー構造であって、このポリマーの
各核酸塩基上に２つの付着部位を有する反復ポリマー構造を有する。１つの実施
態様において、この核酸塩基は、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−グアニン
、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群から選択
され得、ここで、この付着部位は、炭素原子または窒素原子である。好ましい実
施態様において、この付着部位は、ピリミジンおよびアナログのＮ−１およびＣ
−５またはＣ−６のいずれか、ならびにプリンおよびアナログのＮ−９およびＣ
−８またはＣ−７−デアザである（図１Ａ〜図１Ｄ）。１つ以上の核酸塩基は、
反応性官能基、検出標識、および捕捉標識を有する、別の核酸塩基または終結基
（ＸまたはＹ）に付着されない、第３の部位で置換され得る。この付着部位は、
リンカーによって架橋される。適切なリンカーは、アルキレン、置換アルキレン
、置換アリール、中性および陰イオン性リン基、ジスルフィド、アミド、エステ
ル、カルボニル、スルホンアミド、カルバメート、尿素、エチレンオキシおよび
ポリエチレンオキシを含む。好ましい実施態様において、このリンカーは、アミ
ド基またはホスホジエステル基である。特に好ましい実施態様において、このリ
ンカーは、ホスホジエステル基である。核酸塩基オリゴマーの末端は、終結基（
例えば、水素、置換アルキル、置換アリール、ヘテロ原子基、反応性官能基、検
出標識、補足標識、および核酸）を含み得る。好ましい実施態様において、この
末端は、蛍光色素、化学発光前駆体、ビオチン、ヒドロキシメチル、アミノメチ
ル、メルカプトメチル、およびカルボキシメチルを含む。特に好ましい実施態様
において、この末端は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびヌクレオチド間、糖、または核
酸塩基改変体を有する他の核酸アナログからなる群から選択される核酸を含む。
【００１４】 種々の新規な核酸塩基オリゴマーを提供することに加えて、本発明はまた、対
象の核酸塩基オリゴマーを合成するために使用され得るモノマーサブユニットを
含む。さらに、本発明は、対象の核酸塩基オリゴマーを合成する方法を含む。
【００１５】 （定義） 他に述べない限り、本明細書中で使用される以下の用語および句は、以下の意
味を有することが意図される： 「核酸」とは、生物体の全ての遺伝情報をコードし、貯蔵し、複製しそして発現
するＤＮＡおよびＲＮＡの生体高分子（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）である。他の生
体高分子（例えば、タンパク質、ペプチドおよび多糖類）のような核酸は、反復
モノマー単位、すなわちヌクレオチドからなる。
【００１６】 本明細書中で使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌ
クレオチド」とは、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド「ＤＮＡ」
、リボヌクレオチド「ＲＮＡ」、そのαアノマー型などを含む、天然のヌクレオ
チドモノマーまたはそのアナログの線状ポリマーを呼ぶ。言い換えれば、「オリ
ゴヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）
をそれぞれ含む構造単位である、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオ
チドの鎖である。
【００１７】 用語「ヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのような生体高分子の核酸に
おけるモノマー単位である。ヌクレオチドは、３つの部分：糖、ホスフェート、
および核酸塩基からなる。二本鎖の部分の場合、ヌクレオチドはまた、「塩基」
または「塩基対」と呼ばれる。用語「ヌクレオシド」とは、リン酸部分を欠くヌ
クレオチドをいう。通常、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合で連
結され、ここで本明細書中で用いられるように、用語「ホスホジエステル結合」
とは、関連する対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4 +、Ｎａ+など）を含む、ホスホジ
エステル結合またはそのホスフェートアナログを含む結合を呼ぶ。ポリヌクレオ
チドは、代表的には、少数のモノマー単位（例えば、８〜４０）から数千のモノ
マー単位のサイズにわたる。ポリヌクレオチドについてのほとんどの分子生物学
的適用は、１５〜３０ヌクレオチド長の独特の配列を必要とする。ＤＮＡポリヌ
クレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字配列により示される場合はいつで
も、このヌクレオチドは、別に記載されない限り、左から右に５’〜３’の順で
あり、そして「Ａ」は、デオキシアデノシンを示し、「Ｃ」は、デオキシシチジ
ンを示し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」は、チミジンを
示すことが理解される。
【００１８】 用語「ワトソン／クリック塩基対」および「ワトソン／クリック相補性」とは
、水素結合を介して共に結合する、ヌクレオチド、およびそのアナログの特異的
な対のパターンをいう（例えば、チミン（Ｔ）と対のアデニン（Ａ）、シトシン
（Ｃ）と対のグアニン（Ｇ））。
【００１９】 用語「核酸塩基」とは、ワトソン／クリック塩基対合の官能基（ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎａｌｉｔｙ）を保有するヌクレオチドの部分をいう。図１は、従来の核酸塩
基番号付けの模式図を示す。最も一般的な天然に生じる核酸塩基、アデニン（Ａ
）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ、およびチミン（Ｔ）は、
配列特異的な様式で１つの核酸鎖が別の核酸鎖に結合する水素結合官能基を有す
る。
【００２０】 「核酸アナログ」はまた、組成が、モノマーのヌクレオチドアナログ単位から
の化学合成により作製されるポリマーまたは「オリゴマー」であり、そして核酸
に関連したいくつかの特性および性質を有する。
【００２１】 「核酸塩基オリゴマー」とは、モノマー単位としてヌクレオチドの「核酸塩基
」部分を含むポリマーを呼び、ここで各成分の核酸塩基モノマーは、２つの付着
部位を有する。各核酸塩基モノマーは、末端を除く２つの核酸塩基モノマーに付
着される。図２および図３は、それぞれ、いくつかの好ましいピリミジンおよび
プリン核酸塩基の例を示す。
【００２２】 用語「付着部位」とは、上記の核酸塩基を隣接する核酸塩基に連結するリンカ
ーに付着された核酸塩基の環状系上の原子を呼ぶ。 用語「リンカー」とは、核酸塩基を連結し、そして基を終結させる鎖を含む１つ
以上の原子を呼ぶ。
【００２３】 用語「終結基」とは、核酸塩基オリゴマーの末端に位置する１つ以上の原子を
呼ぶ。終結基は、ほかの分子を連結するか、または他の分子内の変化をもたらす
化学反応についての官能基を有し得る。終結基は、核酸アナログのいずれかを含
む、補足標識、検出標識、および核酸を含み得る。
【００２４】 本明細書中で使用される用語「キメラ」とは、１つ以上の核酸塩基オリゴマー
モノマー単位を含み、そしてまたＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドのいずれかを
含むオリゴヌクレオチドをいう。用語「ホスホジエステルアナログ」とは、２’
，５’−連結、３’，３’−連結、５’，５’−連結、メチルホスホネート、ア
ルキル化ホスホトリエステル、３’−Ｎ−ホスホラミデート、およびＰＮＡを含
むがこれらに限定されない、それらの組成および／またはヌクレオチドへの付着
位置が異なる天然のホスホジエステル３’，５’−ヌクレオチド間連結のアナロ
グをいう。用語「低級アルキル」、「低級アルキレン」および「低級置換アルキ
レン」とは、１〜１２の炭素原子からなる、直鎖、分枝状または環状の基を呼ぶ
。
【００２５】 用語「標識」とは、核酸塩基オリゴマーの一方または両方の末端で共有結合的
に付着される基を呼ぶ。この標識は、蛍光、化学発光、および電気化学的な発光
のような手段により分子の検出のためのシグナルを生じるような機能を導き得る
。（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．「Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ」（１９９２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ、３〜２８頁）。あるいは、この標識は、特異的または非特異的な捕捉
方法（Ａｎｄｒｕｓ、Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５’
ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｂｅ
ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ」ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａ
ｃｈ、（１９９５）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘ
ｆｏｒｄ、３９〜５４頁）によって分子の分離または固定化を可能にする。
【００２６】 用語「化学発光」とは、化合物の光または光子生成能力をいう。代表的には、
化学発光は、結合の切断のような現象で開始され、これは高エネルギー状態減衰
プロセスの一部として光または光子を細分化し、そして放出する不安定な中間体
を生成する（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．、Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｂ．およびＶｏｙｔ
ａ，Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．（１９８９）４：９９
〜１１１；ＵＳＰ ４，９３１，２２３；ＵＳＰ４，９６２，１９２）。 用語「検出」とは、共有結合的に付着した検出標識の性質に基づく核酸塩基オリ
ゴマーを検出、観察、または測定することをいう。検出標識は、フルオレセイン
およびローダミン誘導体のような蛍光色素、シアニン色素、およびエネルギー転
移色素を含むがこれらに限定されない（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７８）４７：８１９〜４６）。
【００２７】 用語「捕捉」とは、共有結合的に核酸塩基オリゴマーに付着された捕捉標識の
性質に基づいて核酸塩基オリゴマーを捕捉し、固定化し、分離し、または隔離す
ることをいう。捕捉標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、２，
４−ジニトロフェニル、ならびに疎水性修飾因子（例えば、コレステロール、ト
リチルおよびトリチル誘導体、ポリエチレングリコール、ポリリジン、トリグリ
セリド、および高分子量炭化水素）を含むがこれらに限定されない。
【００２８】 用語「プライマー」とは、特定の標的核酸に選択的にアニーリングし、その後
、プライマー伸長反応（ここでこのプライマーは、５’から３’の方向に伸長）
の開始点に供し得るオリゴヌクレオチドをいう。
【００２９】 「プライマー伸長反応」とは、標的／プライマー二本鎖と、プライマーの３’
末端へのヌクレオチドの付加を生じるヌクレオチドとの間の反応を呼ぶ（ここで
付加されたヌクレオチドは、標的核酸の対応するヌクレオチドに相補的である）
。 (詳細な説明） 本発明は、以下の構造を有する核酸塩基オリゴマー化合物に関する： Ｘ−−（−−Ｂ−−Ｌ−−）n−−Ｂ−−Ｙ Ｂは、ピリミジンおよびアナログのＮ−１およびＣ−５かまたはＣ−６のいず
れか、ならびにプリンおよびアナログのＮ−９およびＣ−８かまたはＣ−７デア
ザに、２つの連結付着部位を有するワトソン／クリック塩基対合特性を有する核
酸塩基である。核酸塩基付着部位の例は、図１に示される。本発明の核酸塩基オ
リゴマーにおいて、核酸塩基ユニットＢは、プリン塩基またはピリミジン塩基で
あり得る。このような塩基は、プリンであるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）お
よびヒポキサンチン（Ｈ）、またはピリミジンであるウラシル（Ｕ）、シトシン
（Ｃ）、もしくはチミン（Ｔ）であり得る。Ｂはまた、他の核酸塩基であり得る
。プリン塩基またはピリミジン塩基の使用について、本明細書中で参照する場合
、このよう表現は、このような塩基のアナログを含むことが意図される。ピリミ
ジン塩基およびプリン塩基のアナログとしては、アミノ−、アザ−、またはデア
ザ−およびイソ−アナログなどが挙げられる（図２および図３）。あるいは、天
然の供給源から単離された、任意の他の核酸塩基が使用され得る。多くの異なる
核酸塩基配列は、核酸塩基オリゴマーであり得る。Ｌは、付着部位を介して核酸
塩基を連結するリンカーである。所定のオリゴマー化合物におけるリンカーは、
同一または互いに異なり得る。ＸおよびＹは、ポリマーの末端基である。そして
、ｎは整数であり、１と等しいかまたはそれより大きい。
【００３０】 本発明の核酸塩基は、塩基対に特異的な様式で、相補的なヌクレオチドとの水
素結合相互作用を導く能力、および核酸塩基間リンカーＬ、ならびに末端基Ｘお
よびＹを介する共有結合のための少なくとも２つの部位を有することによっての
み限定される。リンカーは、核酸塩基の付着部位で炭素および窒素で連結する。
末端における核酸塩基は、１つの部位においてリンカーに連結される。好ましい
実施態様において、リンカーＬは、核酸塩基の非不安定化部位に付着し、ここで
非不安定化部位は、置換基の付着が、二重鎖におけるその相補鎖に対する核酸塩
基オリゴマーのハイブリダイゼーションか、または核酸塩基の末端基ＸまたはＹ
に対するリンカーＬの結合のいずれかでの、有意な妨害を生じない部位として、
定義される。このような非不安定化部位は、プリンおよびプリンアナログのＣ−
８、Ｃ−７−デアザ、およびＮ−９位、ならびにピリミジンおよびピリミジンア
ナログのＣ−５、Ｃ−６、およびＮ−１位で見出される（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，
Ｄ．「Ｃ−５−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ
ｓ」（１９９２）Ｓｙｎｌｅｔｔ．Ｍａｒｃｈ、１７９〜８８）。
【００３１】 好ましい実施態様において、Ｂは、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−グア
ニン、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、２−デアザ−２−チ
オ−グアノシン、２−チオ−７−デアザ−グアノシン、２−チオ−アデニン、２
−チオ−７−デアザ−アデニン、イソグアニン、７−デアザ−グアニン、５，６
−ジヒドロウリジン、５，６−ジヒドロチミン、キサンチン、７−デアザ−キサ
ンチン、ヒポキサンチン、７−デアザ−キサンチン、２，６ジアミノ−７−デア
ザプリン、５−メチル−シトシン、５−プロピニル−ウリジン、５−プロピニル
−シチジン、２−チオ−チミンまたは２−チオ−ウリジンである（図２および図
３）。
【００３２】 リンカーＬは、共有結合を介して核酸塩基オリゴマーを形成するために、核酸
塩基モノマーどうしを付着するために役立つ。これらは、オリゴマー化合物およ
びモノマーユニットの効率的および低コストな合成を可能にする官能基（ｆｕｎ
ｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を含む（例えば、４（図８）および１２（図９））。本
発明は、多くの種々のリンカー構築物の使用を可能にする。好ましいリンカーは
、核酸塩基オリゴマーの合成において、効率的な、自動化した、高収率なカップ
リング反応を可能にする官能基を含む。リンカーは、ヌクレアーゼ耐性を与える
ために使用され得る。リンカーは、ハイブリダイゼーションにおける塩基対合の
親和性および特異性に影響する、核酸塩基の好ましい立体配座を決定する。ホス
ホジエステル結合を有する核酸塩基オリゴマーの例は、図１０および図１１に示
される。中性のアミドリンカーを有する核酸塩基オリゴマーの例は、図１２およ
び図１３に示される。
【００３３】 別の好ましい実施態様において、Ｌは、メチレン、アルキレン、置換されたア
ルキレン、置換されたアリール、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、アル
キルホスホネート、ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホ
スホロチオエート、ジスルフィド、アミド、エステル、カルボニル、スルホンア
ミド、カルバメート、尿素、エチレンオキシ、反応性官能基、検出標識、または
捕獲標識である。
【００３４】 末端基ＸおよびＹは、以下を含む種々の目的に役立つ：塩基対特性の最適化、
正味の疎水性／親水性の最適化、および他の基への共有結合のための反応性官能
基の産生。ＸおよびＹに付着する基は、核酸塩基オリゴマーの検出および捕獲の
ための標識を含む。本発明は、多くの種々の末端基の使用を可能にする（Ｈｅｒ
ｍａｎｓｏｎ，Ｇ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（１
９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、４０〜５６頁）
。
【００３５】 第３の好ましい実施態様において、ＸおよびＹは、独立して、水素、一置換ア
ルキル、二置換アルキル、メチレン、一置換メチレン、アルキレン、一置換アル
キレン、アリール、置換されたアリール、反応性官能基、検出標識、捕獲標識、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸アナログである。さらに、Ｌ、Ｘ、Ｙは、核酸塩基
オリゴマーの塩基対合特性を増強する基で置換されてもよいし、または置換され
なくてもよい。
【００３６】 第２の局面において、本発明は、以下の構造を有する核酸塩基モノマー化合物
に関する： ＬＰ−Ｂ−ＬＰ ここで、Ｂは、核酸塩基オリゴマー（図２および図３）に記載されるような核
酸塩基であり、そして２つの付着部位の各々でリンカー前駆体ＬＰを有する。Ｂ
に対する付着部位は、ピリミジンおよびアナログのＮ−１およびＣ−５かＣ−６
のいずれかであり、ならびにプリンおよびアナログのＮ−９およびＣ−８かまた
はＣ−７−デアザのいずれかである。核酸塩基モノマー化合物の例の例示は、図
１に示される。リンカー前駆体ＬＰは、結合を形成し得る反応性官能基から構成
される。
【００３７】 リンカー前駆体の反応性の官能基は、以下の構造を有し得る： Ｒ−Ｄ−（ＣＨ2）n−Ｂ−（ＣＨ2）n−Ｅ ここで、Ｒは、ジメトキシトリチル、フルオレニルメチルオキシカルボニルの
ような、酸または塩基感受性の保護基である。Ｄは、酸素、窒素、または硫黄で
ある。Ｅは、ＣＯ2Ｈまたは以下の構造を有するホスホラミダイト部分である：
【００３８】
【化９】 ここで、Ｒ1は、メチルまたはシアノエチルのような保護基であり得る。Ｒ2は
、イソプロピルのような低級アルキル保護基である。少なくとも１つのメチレン
基が核酸塩基に付着し、ここで、ｎは１と等しいかまたはそれより大きい整数で
ある。核酸塩基モノマー化合物の例は、４（図８）および１２（図９）である。
核酸塩基モノマーは、核酸塩基オリゴマーの合成において有用であり得、ここで
１つの核酸塩基モノマーのＥは、カップリング試薬を用いて反応性の求電子試薬
へと活性化され、そして第２の核酸塩基モノマーの求核原子Ｄと新しい結合を形
成する。第１および第２の核酸塩基モノマーのリンカー前駆体ＬＰは、核酸塩基
オリゴマーのリンカーＬを形成する。
【００３９】 本発明の利点は、非ワトソン／クリック塩基対合の減少または除去である。核
酸およびアナログは、非ワトソン／クリック塩基対特異的（Ａ＋Ｔ、Ｇ＋Ｃ）で
ある分子間相互作用および分子内相互作用を有し得る。これらの相互作用は、プ
ライマーおよびプローブ実験の間に、二重鎖においてミスマッチ（例えば、Ｇお
よびＴ）を不安定化させ得る。ピリミジンおよびプリン核酸塩基の付着部位にお
けるリンカーの存在は、プリンのＮ−７部位に関与するＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基
対合のような非ワトソン／クリック水素結合を阻止し、崩壊し、または最小化す
る（Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｗ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」（１９８４）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１１６〜５８頁）。より高い親和性および／または特異性は
、Ｃ−５プロピニル核酸塩基アナログの使用によって達成され得る（Ｆｒｏｅｈ
ｌｅｒ，Ｂ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９２）３３：５３
０７〜１０）。イソグアニンおよび７−デアザ−イソグアニンのような他の核酸
塩基アナログもまた、相補的な核酸に対するハイブリダイゼーションの親和性お
よび特異性のような特性を改良するために使用され得る（Ｓｅｅｌａ，Ｆ、Ｈｅ
ｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９７）８０：７３〜８５）。
【００４０】 親和性および特異性の特性は、標準的な熱融解実験によって精密にそして正確
に測定され得る。制御された条件下で、試験される核酸塩基オリゴマーは、その
相補的な核酸とともに混合され、そしてその最も安定な立体配座（代表的には、
各々の塩基対間で水素結合を有する、二分子の二重らせん二重鎖）を形成し得る
（図４〜７）。この混合物は、分光光度計中で温度制御されたキュベット中に置
かれ、そしてこのキュベットの温度を、ゆっくり上昇させる。加熱する間の、Ｕ
Ｖ光（代表的には約２６０ｎｍ）の吸光度の連続的な測定は、濃色効果を示す。
水素結合は加熱に伴い崩壊し、核酸塩基の正味の吸光度が増大する。得られるシ
グモイド曲線の一次微分によって得られた変曲点を、吸光度が温度に対してプロ
ットされる場合に観察する。二重鎖が通常の融解挙動に従う場合、一本鎖オリゴ
マーへの二重鎖の二状態転移が起こる。変曲点は、二重鎖中のオリゴマーの半分
および半分の一本鎖に対応する。この点におけるこの温度は、Ｔmと呼ばれ、そ して親和性および特異性のような塩基対の特性の直接的な測定を提供する。適切
なコントロールを用いて、他の核酸およびアナログとの比較がなされ得、そして
結論が塩基対の特性に関してなされた（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．およびＧ
ａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第
２版（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、７０〜７
１頁；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，Ｋ．Ｊ．、Ｆｒａｎｋ，Ｒ．、Ｂｌｏｃｋｅｒ，Ｈ
．、およびＭａｒｋｙ，Ｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８３：３７４６〜５０）。
【００４１】 核酸塩基オリゴマーおよびそれらのキメラは、受容可能な速度で安定な二重鎖
を形成し得るために十分許容的な配列特異性をさらに保証する、十分にストリン
ジェントな条件下で実施されるアニーリング反応において使用され得る。アニー
リングのために必要な温度および時間の長さは、核酸またはアナログ鎖の塩基組
成、長さおよび濃度、使用される溶媒の性質（例えば、ＤＭＳＯ、ホルムアミド
、またはグリセロールのような共溶媒の濃度、およびマグネシウムのような対イ
オンの濃度）を含む、いくつかの因子に依存する。代表的に、テンプレートへの
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション（アニーリング）は、アニーリン
グ溶媒中の二重鎖の推定される融解温度よりもおよそ５〜１０℃低い温度で実行
される。最適化された条件下で、アニーリング反応は、２、３秒以内に完了する
（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第１巻、第２章（１９９３）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００４２】 プライマー伸長反応は、いくつかの重要な分子生物学的方法（例えば、遺伝子
の存在または非存在についてのプローブに対する標的核酸配列へのプライマーの
アニーリング、ポリヌクレオチド配列決定、およびポリヌクレオチドの増幅）に
おいて重要な役割を果たす。本発明の核酸塩基オリゴマーは、種々のプライマー
伸長手順におけるプライマーとして使用され得る。従来のテンプレート媒介プラ
イマー伸長反応において、一本鎖テンプレート核酸に対してワトソン／クリック
塩基対相補性を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、アニーリングされ、次
いで、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーの３’末端を伸長して、テンプレート核
酸に対して相補的な鎖を形成するような条件下において、ヌクレオシド三リン酸
の存在下でＤＮＡポリメラーゼが提供される。
【００４３】 本発明の核酸塩基オリゴマーおよびそれらのキメラは、プライマー伸長反応（
例えば、ポリヌクレオチド配列決定実験）におけるプライマーとして使用され得
る。Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定反応において、プライマーは、鎖終結剤（例
えば、プライマー伸長の塩基特異的終結を生じるために、２’，３’−ジデオキ
シヌクレオシド三リン酸）の存在下でＤＮＡポリメラーゼによって伸長される（
Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（１９７７）
７４：５４６３〜６７） 核酸塩基オリゴマーのキメラはまた、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ））におけるプライマーとして使用され得る（Ｍｕｌｌｉｓ、米国特
許番号第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，１９５号、および同第４，６
８３，２０２号）。一般に、ＰＣＲは、二本鎖標的核酸サンプルの鎖を分離する
最初の変性工程、次いで以下の繰り返しからなる：１．アニーリング工程（これ
は、増幅プライマーが標的の反対の鎖に対して特異的に、そして標的配列に隣接
する位置でアニーリングすることを可能にする）；２．５’→３’方向にプライ
マーを伸長し、それによって標的の相補的なコピーを形成する伸長工程；ならび
に３．コピーおよび標的の分離を引き起こす、変性工程。上記の工程の各々は、
異なる温度で実施され得、ここで、この温度変化は、サーモサイクラー装置を使
用して達成され得る。サンプルの単純な温度循環による工程１〜３の繰り返しは
、複製の指数関数的な相を生じ、代表的には２０〜４０サイクルで標的二重鎖の
１００万コピーが生成される（Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、（
１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（
１９８８）２３９：４８７）。
【００４４】 （一般的な合成方法） 核酸塩基オリゴマーおよびそれらのキメラは、好ましくはモノマー単位から、
固体支持体によって、オートメーション化された合成で調製される。各々の反応
性モノマーは、反対側の末端が固相のベッドまたは物質に共有結合している間に
、成長する鎖の反応性末端に連続的に添加される。オリゴマー合成のカップリン
グ反応において形成される結合は、成長する鎖のリンカー上の反応性の官能基と
モノマーとの間で形成される。反応条件、プロトコル、試薬、固体支持体、およ
び保護基を含むモノマーおよびオリゴマー合成方法は、リンカーに依存する。核
酸塩基オリゴマーの調製における使用のためのモノマーは、以下のように調製さ
れ得る。モノマー単位 １は、５−ヒドロキシメチルウリジン ２（図８）から
調製され得る。塩基の存在下で４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを用いる
２の反応によって、主生成物としてＣ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル中間体 ３
を得る。パラホルムアルデヒドでの３の処理は、Ｎ−１ヒドロキシメチル中間体
４を形成する。あるいは、ヒドロキシメチル化は、公知のアルキル化試薬（例
えば、ベンジルオキシメチルクロリド）に続いてパラジウム触媒または２−トリ
メチルシリルエチルクロリド（ＳＥＭ−Ｃｌ）を用いてベンジルの水素付加的な
除去、続いて、テトラヒドロフラン中でテトラブチルアンモニウムフルオリドを
用いて脱シリル化を用いて実行され得る。あるいは、ヒドロキシメチル化は、他
の公知のアシル化試薬を用いて行われ、続いて還元（例えば、ギ酸エチルを用い
るホルミル化およびホウ化水素ナトリウムを用いる還元）され得る。ホスホラミ
ダイトモノマー単位 １への４の変換は、ホスフィチル化（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙ
ｌａｔｉｎｇ）試薬（例えば、ビス−ジイソプロピルアミン−シアノエトキシホ
スフィン、および触媒、ジイソプロピルアンモニウム−１−Ｈ−テトラゾリド（
ｔｅｔｒａｚｏｌｉｄｅ））を用いて行われ得る。
【００４５】 支持体に結合した核酸塩基は、酸／エステル ５を得るために、無水コハク酸
を用いる４のスクシニル化によって合成され得る。あるいは、より加水分解性の
ある不安定なリンカーが使用され得る。無水ジグリコールアミド酸またはオキサ
リルクロリドを用いる４の反応によって、それぞれ酸／エステル ６および７を
得る。アミノメチル高架橋ポリスチレンに対する５のカップリングは、核酸塩基
の固体支持体 ８を生成し、リン酸に結合した核酸塩基オリゴマーの自動化合成
を可能にする。
【００４６】 本発明の別の実施態様において、アミド結合基を有する核酸オリゴマー合成の
ためのモノマーを調製するために、５−ヒドロキシメチルウラシル １は、５−
アミノメチルウラシル ９（図９）に変換される。ｐ−トルエンスルホニルクロ
リドを用いる１の反応によって、５−ｐ−トルエンスルホネートエステルを得、
続いて、アジドナトリウムによる置換によって５−アジゾメチルウラシルを、そ
してトリフェニルホスフィンによる還元によって９を得る。Ｆｍｏｃ誘導体 １
０のようなアミンの保護は、ジイソプロピルエチルアミンおよびジメチルホルム
アミド中の９−フルオレニルメチルクロロホルメートを用いて進行する。あるい
は、９のアミンは、トリフルオロ酢酸エチルで保護され得、トリフルオロアセチ
ル保護された１０を得る。炭酸カルシウムおよびメタノール中のｔｅｒｔ−ブチ
ルブロモアセテートを用いる１０のアルキル化によって、エステル １１を得る
。このエステルのけん化によって１２（アミド結合された核酸塩基オリゴマーの
ためのモノマー）を得る。
【００４７】 一般に、核酸塩基オリゴマーおよびそれらのキメラは、公知の合成技術を使用
して合成され得る。オリゴヌクレオチドを形成するために使用される化学の詳細
な説明は、他で提供される（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｕ
ｓｅｒｓ Ｍａｎｕａｌ Ｍｏｄｅｌ ３９２および３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ）。本発明のホスホジエステル核酸塩基オリゴマーお
よびそれらのキメラを作製するためのオリゴヌクレオチド合成のホスホラミダイ
ト方法は、その効率的および迅速なカップリングならびに開始物質の安定性のた
めに、好ましい方法である（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．
Ｐ．「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９２）４８：２２２３〜２３
１１、「Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｖｉａ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｄｅｒｉｖａ
ｔｉｖｅｓ」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９３）４９：１９２５〜６３、「Ｔ
ｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ａｐｐｒｏａｃ
ｈ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
（１９９３）４９：６１２３〜９４、「Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｕｎｒｅｌａｔｅ
ｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｔｈｅ
ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｍｅｔｈｏｄ」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（
１９９３）１０４４１−８８）。合成は、固体支持体に対して付着された成長す
るオリゴマー鎖で実施される。そのため、過剰の試薬（これは、液相中にある）
は濾過によって容易に除去され得、それにより、サイクル間の精製工程の必要性
をなくす。
【００４８】 以下に、ホスホラミダイト方法を使用する本発明の核酸塩基オリゴマーを合成
するためのサイクルの工程を簡単に記載する。第一に、固体支持体に３’で結合
した核酸塩基（例えば、８）を有する固体支持体を、酸（例えば、トリクロロ酢
酸）を用いて処理し、ヒドロキシル保護基(例えば、ジメトキシチチル基）を５ ’ヒドロキシルから除去する。次いで、カップリング反応を、保護されたホスホ
ラミダイト核酸塩基（例えば、４）および弱酸（例えば、テトラゾールなど）を
固体支持体に同時に添加することによって形成された活性化中間体を送達するこ
とによって開始する。成長する核酸塩基オリゴマー鎖の末端の求核性５’ヒドロ
キシルは、モノマー（これは、過剰に存在する）のリンにおいてテトラゾリルま
たはプロトン付加したアミン基を置換する。次に、カップリング工程を行い、こ
れは、カップリングをうけなかった任意の核酸塩基オリゴマー鎖を終結する。カ
ップリングは、好ましくは、無水酢酸および１−メチルイミダゾールを用いてな
される。次いで、核酸塩基間結合は、好ましい酸化剤としてのヨウ素および酸素
供与体としての水を使用して、三価の亜リン酸塩から、所望の、そしてより安定
なホスホトリエステルに変換される。あるいは、酸化は、ｔｅｒｔ−ブチルヒド
ロペルオキシドのようなヒドロペルオキシド試薬を用いて実施され得る。酸化後
、ヒドロキシル保護基は、プロトン酸（ｐｒｏｔｉｃ ａｃｉｄ）（例えば、脱
トリチル化と呼ばれる工程における、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸）を用
いて除去され、そして、このサイクルは、鎖の伸長が完了するまで繰り返される
。合成後、核酸塩基オリゴマー鎖は、塩基（例えば、水酸化アンモニウムまたは
ｔ−ブチルアミン）を使用して支持体から切断される。この切断反応はまた、任
意のホスフェート保護基（例えば、シアノエチル）を除去する。最終的に、塩基
の環外のアミン上の保護基は、高温（例えば、５５℃で１〜８時間）で、塩基中
の核酸塩基オリゴマー溶液を処理することによって除去される。核酸塩基オリゴ
マーの例は、図１０〜１３に示される。
【００４９】 核酸塩基オリゴマーおよびそれらのキメラは、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮ
Ａ 合成機またはＡＢＩ ４３３ ペプチド合成機（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上で合成され得る。例え
ば、核酸塩基オリゴマー／核酸キメラは、ＤＮＡヌクレオシドホスホラミダイト
およびＲＮＡヌクレオシドホスホラミダイト（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）および、２’−ＯＭｅ ＲＮＡ
ヌクレオシドホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎ
ｇ、ＶＡ）ホスホラミダイトを用いて作製される。環外アミン核酸塩基保護基は
、ＤＮＡおよび２’−ＯＭｅ ＲＮＡヌクレオシドの両方について、ベンゾイル
（ＡおよびＣ）ならびにジメチルホルムアミジン（Ｇ）である。１μモルスケー
ルにおける合成の各々のカップリングサイクルについて、アセトニトリル中の１
００μｌの０．１Ｍ モノマー（ｃａ．１０ｍｇ）は、アセトニトリル中の３２
０μｌの０．５Ｍ ５−Ｈテトラゾールとともに送達される。カップリング時間
は、ＤＮＡヌクレオシドについて２５秒および核酸塩基モノマー、２’−ＯＭｅ
ＲＮＡヌクレオシド、ＰＥＯ、および他のアナログならびに非ヌクレオシドモ
ノマーについて４分である。核酸塩基オリゴマー（ｏｌｉｍｅｒ）／核酸キメラ
の例は、図１４および図１５に示される。
【００５０】 合成効率は、トリチル伝導性モニターを備える反応カラムから脱トリチル化溶
出物を測定することによって、実時間における合成の間、続き得る。平均の段階
的収率は、一般に９８％より大きい。１μモルスケールによって、約１００の粗
（ｃｒｕｄｅ）ｏｄｕ（ｏｄｕ＝１ｃｍ長セルにおける、１ｍｌ容量の２６０ｎ
ｍでの吸光度）（ｃａ．４ｍｇ）のキメラを得た。核酸塩基保護基は、濃水酸化
アンモニウム（１時間、６５℃）中での匹敵する脱保護率について選択され、キ
メラオリゴヌクレオチドの分解または修飾を最小化する。
【００５１】 核酸の分析および精製の従来的な方法である、高速液体クロマトグラフィ（Ｈ
ＰＬＣ）および７Ｍの尿素を用いるスラブポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）は、核酸塩基オリゴマーおよびそれらのキメラの分析および精製につい
て、好ましい方法である。ＰＡＧＥの精製は、代表的には、１００μｇの生成物
を生じ、これは、３ｍｍ厚のゲル上に１０〜２０粗ｏｄｕをロードし、標準的な
条件下で電気泳動し、ＴＬＣプレート（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｐａｒｔ ＃
５７３５）にＵＶ光照射下で可視化した後のバンドを切り出し、室温で一晩、水
中に浸し、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｐａｒｔ ＃ ４００７７１）上で脱塩／濃縮する電気泳動
から単離される。ポリマー付着剤上の陰イオン交換ＨＰＬＣは、核酸塩基オリゴ
マーおよびキメラの分析ならびに精製において、良好な分解能、予測可能な溶出
パターン、および再現性のある反応時間を与え得る。代表的なプロトコルは、以
下である：移動相Ａ−１０％ アセトニトリル中の１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０
ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ １２）；移動相Ｂ−１０％ アセトニトリル中の８００
ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ １２）；溶出流量−１．０ｍｌ／
ｍｉｎ；直線勾配−０分において０％ Ｂ〜２５分において８０％ Ｂ。
【００５２】 （実施例） 以下の実施例は、多いに予言的であり、そして本発明の核酸塩基オリゴマーの
調製および適用を例示することが意図される。示される化合物および使用される
パラメーターの値は、本発明を例示することを意図するのみであり、限定するも
のとはみなされない。
【００５３】 （実施例１） （５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−ウラシル ２の合
成） ５−（ヒドロキシメチル）−ウラシル水和物 １（１０．００ｇｍ、０．０７
０モル）を、５０ｍｌの乾燥ピリジンで３回共エバポレートし、そして室温で、
２００ｍｌの乾燥ピリジンに溶解する。トリエチルアミン（９．８ｍｌ、０．０
７０モル）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（２３．７ｇｍ、０．
０７０モル）を添加し、そしてこの混合物を、窒素雰囲気下で６時間撹拌する。
ほとんどのピリジンを、減圧下で除去し、そしてこの残渣を、酢酸エチルと飽和
炭酸水素ナトリウムとの間で分配する。この有機相を飽和塩化ナトリウムで２回
洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして減圧下でエバポレートする
。この油性の残渣を、酢酸エチルおよびヘキサンで粉砕し、オフホワイトの固体
として、５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−ウラシル ２を
得る。
【００５４】 （実施例２） （Ｎ−１−（ヒドロキシメチル），５−（４，４’−ジメトキシトリチルオ
キシメチル）−ウラシル ３の合成） ５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−ウラシル ２（１５．
００ｇｍ、０．０３４モル）を、０℃、窒素雰囲気下で、２００ｍｌの乾燥テト
ラヒドロフランおよび２０ｍｌのジイソプロピルエチルアミンに溶解する。パラ
ホルムオルデヒド（５．１ｇｍ、０．１７モル）を一部添加する。氷浴槽を取り
除き、そしてこの混合物を１８時間撹拌した。ほとんどの溶媒を、減圧下で除去
し、そしてこの残渣を、酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウムとの間で分配する
。この有機相を飽和塩化ナトリウムで２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、
濾過し、そして減圧下でエバポレートする。この油性の残渣を、酢酸エチルおよ
びヘキサンで粉砕し、オフホワイトの固体として、Ｎ−１−（ヒドロキシメチル
），５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−ウラシル ３を得る
。
【００５５】 （実施例３） （Ｎ−１−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホラミダイ
ト，オキシメチル），５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）
−ウラシル ４の合成） Ｎ−１−（ヒドロキシメチル），５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオ
キシメチル）−ウラシル ３（１２．００ｇｍ、０．０２５モル）を、窒素雰囲
気下で、２５０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解する。ジイソプロピルアンモニ
ウム，１−Ｈ テトラゾリド（１．２８ｇｍ、０．００７モル）を、溶解し、続
いて、ビス−ジイソプロピルアミン、シアノエトキシホスフィン（９．２３ｇｍ
、０．０３１モル）を添加する。一晩撹拌後、１７ｍｌのジメチルホルムアミド
：グリセロール／２：１（ｖ／ｖ）の混合物を添加する。１時間後、この混合物
をジクロロメタンで希釈し、そして、飽和炭酸水素ナトリウムで２回、水で２回
、および飽和塩化ナトリウムで連続的に洗浄する。この有機相を、硫酸ナトリウ
ム上で乾燥し、濾過し、そして減圧下で乾燥して、固体を得、これを、最小限の
酢酸エチルで溶解し、そして氷浴によって冷却した。数容量のヘキサンを添加し
て、沈降を誘導する。この白色固体、Ｎ−１−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピル−ホスホラミダイト，オキシメチル），５−Ｏ−（４，４’−ジメ
トキシトリチルオキシメチル）−ウラシル ４を、濾過によって回収し、吸引下
で乾燥させた。
【００５６】 （実施例４） （Ｎ−１−（オキシメチルコハク酸），５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシト
リチルオキシメチル）−ウラシル ５の合成） Ｎ−１−（ヒドロキシメチル），５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ
メチル）−ウラシル ３（１．５０ｇｍ、０．００３４モル）、無水コハク酸（
０．４２ｇｍ、０．００４２モル）、４−ジメチルアミノピリジン（０．２０ｇ
ｍ、０．００１７モル）、および１０ｍｌの乾燥ピリジンを、窒素雰囲気下で、
室温で、１６時間撹拌する。この混合物を、酢酸エチルで希釈し、そして、５％
のクエン酸および飽和塩化ナトリウムで２回洗浄する。この有機相を、硫酸マグ
ネシウム上で乾燥し、濾過し、そして、減圧下でエバポレートする。この残渣を
、少量の暖かい酢酸エチルで溶解し、続いて、数容量のヘキサンの添加によって
粉砕する。この生成物、Ｎ−１−（オキシメチルコハク酸），５−Ｏ−（４，４
’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−ウラシル ５を、オフホワイトの固体
として、濾過によって回収する。
【００５７】 （実施例５） （固体支持体、ポリスチレン−Ｎ−１−（オキシメチルスクシンアミド メチル），５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−ウラシル
８の合成） Ｎ−１−（オキシメチルコハク酸），５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチ
ルオキシメチル）−ウラシル ５（１．０ｇｍ、０．００１７モル）を、室温、
窒素雰囲気下で、８ｍｌの乾燥ジオキサンおよび０．５ｍｌの乾燥ピリジンに溶
解する。４−ニトロフェノール（０．２４ｇｍ、０．００１７モル）および１，
３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．８８ｇｍ、０．００４３モル）を添
加し、そして５時間、窒素雰囲気下で撹拌する。ジシクロヘキシルウレアの微細
な沈澱物を、濾過し、そしてその濾液を、５ｍｌのジメチルホルムアミドおよび
１ｍｌのトリエチルアミン中の１０００オングストローム孔、直径５０〜７０ミ
クロンの、高架橋のアミノメチルポリスチレン（２５μモル アミノ／ｇｍ、５
．０ｇｍ）懸濁液に添加する。この混合物に栓をし、そして室温で１６時間、リ
ストアクション（ｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ）シェーカーで振盪させる。この支
持体を濾過し、メタノールおよびジエチルエステルで洗浄し、そして減圧下で乾
燥する。この支持体を、２０ｍｌのピリジン、２．５ｍｌの無水酢酸、および２
．５ｍｌのＮ−メチルイミダゾールの混合物で処理する。この混合物に栓をして
、そして室温で１時間、リストアクションシェーカーで振盪させる。この支持体
を濾過し、ピリジン、メタノールおよびジエチルエーテルで洗浄し、そして減圧
下で乾燥する。ジメトキシトリチル分析を、ポリスチレン支持体上で５−Ｏ−（
４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−ウラシルのローディングを決定
するために実行した。少量の支持体を、正確に重量測定し、メスフラスコに入れ
、そしてアセトニトリル中の正確な量の０．１モル濃度のｐ−トルエンスルホン
酸に希釈し、そして、数分間、撹拌する。１ｃｍ幅のキュベット中のこのオレン
ジ色の溶液の４９０ｎｍにおける吸光度、および吸光係数を７０，０００と仮定
して、Ｂｅｅｒの法則によって、ポリスチレン−Ｎ−１−（オキシメチルスクシ
ンアミド メチル），５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）
−ウラシル ８から遊離されるジメトキシトリチルカチオンを、おおよそ２０μ
モル／ｇｍであると計算する。
【００５８】 （実施例６） （自動化固相合成による、ポリ−（Ｎ−１，Ｃ−５ ホスホジエステル ビ
ス−メチル）−ウラシルの合成） （５’） ＵＵＵ ＵＵＵ ＵＵＵ ＵＵＵ ＵＵＵ Ｕ （３’） ポリスチレン−Ｎ−１−（オキシメチルスクシンアミド メチル），５−Ｏ−
（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−ウラシル ８（５０ｍｇ、１
μモル、２０μモル／ｇｍ）を、合成カラム中に充填し、フリットによって保持
し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３９４合成機
に取り付ける。自動化合成によって処理されるホスホラミダイト化学法のための
通常の試薬を、モノマー、Ｎ−１−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ル−ホスホラミダイト， オキシメチル）、５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシト
リチルオキシメチル）ウラシル ４（これは、乾燥アセトニトリル中の０．１Ｍ
溶液として使用される）を除いて使用する。おおよそ１０ｍｇのモノマー ４を
、各のカップリング反応のために使用し、これは、完了のために２４０秒を要す
る。１５サイクルのカップリング、キャッピング、酸化、および脱トリチル化反
応の後、１６マーのポリウラシル核酸塩基オリゴマーを完了する。このジメトキ
シトリチル基を、ＨＰＬＣ精製を容易にするために末端でインタクトのままにす
る。この支持体を、Ｍｏｄｅｌ ３９４合成機上においてアルゴン化で乾燥し、
ここで、ポリスチレンへのエステル結合の切断およびシアノエチルホスホトリエ
ステル結合の脱保護を、室温で１時間、濃水酸化アンモニウムを用いて実施する
。粗オリゴマーを含む、得られた水酸化アンモニウム溶液を、真空下で濃縮し、
０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテートに溶解し、そして逆相ＨＰＬＣに
よって精製し、おおよそ０．５〜１ｍｇの精製されたジメトキシトリチル−Ｕ16 核酸塩基オリゴマーを得る；この精製された画分を、真空下で濃縮し、そして、
室温で３０分間、１ｍｌの酢酸：水の４：１混合物に溶解する。１００μｌの３
Ｍ 酢酸ナトリウムおよび３ｍｌのイソプロパノールを添加し、そして生成物の
沈澱を生じさせるために混合し、Ｕ16核酸塩基オリゴマー（図１６）を精製し、
これは、遠心分離そして上清の除去によって単離される。
【００５９】 （実施例７） （核酸塩基オリゴマーおよびキメラのＤＮＡとのハイブリダイゼーションの
熱融解研究） 熱ＵＶ融解実験を、核酸塩基オリゴマーおよびキメラについてＤＮＡとともに
実施し、ハイブリダイゼーションの基準として、分子内のＴmを決定する。核酸 塩基オリゴマーまたはキメラ、および相補的ＤＮＡを、約１μＭの濃度で、そし
て１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）および２５ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液
に溶解する。２６０ｎｍにおける吸光度を、０．５℃ｍｉｎ-1の加熱速度で、３
０〜９０℃の間の温度の関数として観測する。このＴmの研究を、ＰＣ−ｃｏｎ ｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｅｌｔｉｅｒ加熱ユニットを備えたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｌａｍｂｄａ １２ 分光計を使用して実施する。
【００６０】 加熱すると、吸光度対温度のプロットは、二重鎖の独立鎖への融解の単純な二
状態モデルに一致する、単一の鋭い転移を有するシグモイド型を示す。この一次
微分曲線の最大値は、融解温度Ｔmであり、この値は、二重鎖の安定性、または 親和性の相対的な指標である。核酸塩基オリゴマーおよびキメラにおける、また
はＤＮＡ鎖における、単一塩基のミスマッチを伴う実験は、特異性に関する情報
を提供する。
【００６１】 本明細書における全ての論文および書類（特許を含む）は、本明細書中で参考
として援用される。
【００６２】 本発明は、その特定の好ましい態様（ｖｅｒｓｉｏｎｓ）を参照して、かなり
詳細に記載しているが、他の態様も可能である。化学の分野における当業者は、
本発明の試演の中に含まれる上記のモノマーおよびオリゴマー、ならびにこれら
の合成のための方法の多くの改変が存在することを理解する。
【００６３】 一般に、本発明の核酸塩基オリゴマーおよびそのキメラは、線状ポリマーであ
る。好ましい実施態様の例証は、図に示される。これらの例証は、至適な長さま
たは配列組成物を示すことも、あるいは可能な構造を全て示すことも意図しない
。示される例証は、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 例示の核酸塩基位置の番号付け：図１Ａは、Ｎ−１、Ｃ−５ ウラシル；図１
Ｂは、Ｎ−１、Ｃ−６ シトシン；図１Ｃは、Ｎ−９、Ｃ−８ グアニン；図１
Ｄは、Ｎ−９、Ｃ−７−デアザアデニン。
【図２】 ピリミジン核酸塩基の例示。
【図３】 プリン核酸塩基の例示。
【図４】 デオキシリボ核酸のアデニンおよびシチジンに対するＣ−５−メチル、Ｎ−１
−エチルホスホジエステルウラシル、Ｃ−７−メチル、Ｎ−９−エチルホスホジ
エステル７−デアザ−グアニン核酸塩基オリゴマーのワトソン／クリック塩基対
合。
【図５】 デオキシリボ核酸のアデニンおよびシチジンに対するＣ−５−メチル、Ｎ−１
−メチルホスホジエステルウラシル、Ｃ−８−メチル、Ｎ−９−メチルホスホジ
エステルグアニン核酸塩基オリゴマーのワトソン／クリック塩基対合。
【図６】 デオキシリボ核酸のグアニンおよびチミンに対するＣ−５−メチル、Ｎ−１−
メチルアミドシトシン、Ｃ−８−メチル、Ｎ−９メチルアミドアデニン核酸塩基
オリゴマーのワトソン／クリック塩基対合。
【図７】 デオキシリボ核酸のグアニンおよびチミンに対するＣ−５、Ｎ−１−メチルア
ミドシトシン、Ｃ−７、Ｎ−９−メチルアミドアデニンのワトソン／クリック塩
基対合。
【図８】 ホスホジエステルビスメチル連結を有する核酸塩基オリゴマーについての試薬
の合成。
【図９】 アミドメチル、アミドエチル連結を有する核酸塩基オリゴマーについての試薬
の合成。
【図１０】 ホスホジエステルメチル、ホスホジエステルエチル連結を有するポリウラシル
核酸塩基ヘキサマーオリゴマー。
【図１１】 ヘテロ配列、ホスホジエステルビスメチル連結を有する核酸塩基オリゴマー。
【図１２】 ヘテロ配列、アミドビスメチル連結を有する核酸塩基オリゴマー。
【図１３】 ヘテロ配列、アミドメチル連結を有する核酸塩基オリゴマー。
【図１４】 ヘテロ配列、ホスホジエステル連結を有する核酸塩基／ＤＮＡキメラ。
【図１５】 ヘテロ配列、アミド連結およびホスホジエステル連結を有する核酸塩基／ＤＮ
Ａキメラ。
【図１６】 ホスホジエステルビスメチル連結を有するポリウラシル核酸塩基１６マーオリ
ゴマー。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA05 DA06 GA11 HA19 4B063 QA13 QQ42 QR32 QR62 QS25 QS32 4C057 BB05 MM05 4H050 AA01 AA02 AB84 AB99 AC50

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の式を有する化合物であって、 【化１】 ここで： Ｂは、２つの連結付着部位を有するピリミジン核酸塩基またはプリン核酸塩基で
    あり； Ｌは、連結付着部位を介して、４〜７の結合を有し、そして２つの核酸塩基を連
    結するリンカーであり； ＸおよびＹが終結基であり、ここでＸおよびＹの少なくとも１つが水素、低級ア
    ルキル、置換低級アルキル、低級アルキレン、置換低級アルキレン、アリール、
    および置換アリールからなる群から選択されるか、またはビオチン、ジニトロフ
    ェニル、アクリジン、フルオレセイン、およびジゴキシゲニンからなる群から選
    択される標識であり、ならびに ｎは、１以上の整数である、 化合物。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の化合物であって、ここで、前記連結付着部
    位が、以下； ピリミジンのＮ−１、およびＣ−５またはＣ−６のいずれか、ならびにプリンの
    Ｎ−９およびＣ−８またはＣ−７−デアザのいずれかである、化合物。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の化合物であって、ここで、Ｂが７−デアザ
    アデニン、７−デアザグアニン、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラ
    シル、２−デアザ−２−チオグアノシン、２−デアザ−２−チオ−７デアザグア
    ノシン、２−チオアデニン、２−チオ−７−デアザアデニン、イソグアニン、７
    −デアザイソグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５，６−ジヒドロチミン、
    キサンチン、５−アミノシチジン、５−アミノウラシル、７−デアザキサンチン
    、ヒポキサンチン、７−デアザキサンチン、２，６−ジアミノ−７−デアザプリ
    ン、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フル
    オロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシチジン、２−チオチ
    ミンおよび２−チオウリジンからなる群から選択される、化合物。
  4. 【請求項４】 Ｂが７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、アデニン、
    グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルからなる群から選択される、請求
    項３に記載の化合物。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の化合物であって、ここで、Ｌが、メチレン
    、低級アルキレン、低級置換アルキレン、置換アリール、ホスホトリエステル、
    アルキルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、ジスルフィド
    、エステル、カルボニル、スルホンアミド、カルバメート、尿素、エチレンオキ
    シ、およびポリエチレンオキシからなる群から選択される、化合物。
  6. 【請求項６】 Ｌが、ホスホジエステルおよびアミドからなる群から選択さ
    れる、請求項１に記載の化合物。
  7. 【請求項７】 ＸおよびＹの少なくとも１つが、フルオレセイン、ローダミ
    ン、およびシアニンからなる群から選択される標識である、請求項１に記載の化
    合物。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の化合物であって、ここで、ＸおよびＹの少
    なくとも１つが、以下の構造 【化２】 を有する化学発光前駆体であり、ここで、Ｒ1は、水素またはハロゲン；Ｒ2は、
    ホスフェート、ガラクトシド、グルコシド、グルクロニド、トリアルキルシリル
    オキシ、アシルオキシ、または水素；ならびにＲ3は、メチル、エチル、および 低級アルキルである、化合物。
  9. 【請求項９】 ＸおよびＹの少なくとも１つが、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯ2 Ｈ、および−ＳＨからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
  10. 【請求項１０】 ＸおよびＹの少なくとも１つがＤＮＡ、ＲＮＡ、および５
    ’または３’のヒドロキシル基で終結する核酸アナログからなる群から選択され
    る、請求項１に記載の化合物。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の化合物であって、ここで、キメラ中の
    前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸アナログに対する前記核酸塩基オリゴマーの付
    着部位が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸アナログの５’または３’のヒドロキシ
    ルで生じる、化合物。
  12. 【請求項１２】 核酸アナログが以下からなる群から選択される、請求項１
    ０に記載の化合物： 【化３】 ここで、Ｒは、フルオロ、クロロ、アミノ、−ＯＣＨ3、−ＯＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2 、および−ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、 【化４】 ならびに 【化５】
  13. 【請求項１３】 オリゴヌクレオチドプライマー伸長の方法であって、以下
    の工程： 請求項１０に記載の核酸塩基オリゴマーキメラをポリヌクレオチド鋳型にアニー
    リングさせる工程；およびポリメラーゼ反応によりヌクレオチドを該キメラに結
    合する工程、 を包含する、方法。
  14. 【請求項１４】 前記プライマー伸長が、ポリヌクレオチド配列決定反応で
    生じる、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記プライマー伸長が、ポリヌクレオチド増幅反応で生じ
    る、請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 以下の式を有する化合物であって、 【化６】 ここで： Ｂは、２つの連結付着部位を有するピリミジン核酸塩基またはプリン核酸塩基で
    あり； Ｒは、ジメトキシトリチル、フルオレニルメチルオキシカルボニル、あるいは他
    の酸感受性保護基または塩基感受性保護基であり； Ｄは、酸素、窒素、または硫黄であり； Ｅは、ＣＯ2Ｈまたは 【化７】 であり、ここでＲ1は、メチル、シアノエチル、および他の保護基から選択され ；Ｒ2は、イソプロピルおよび他の低級アルキル保護基であり；ならびにｎは、 １以上の整数である、化合物。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の化合物であって、ここで、Ｂに対する
    前記付着部位が以下； ピリミジンのＮ−１およびＣ−５またはＣ−６のいずれか、ならびに； プリンのＮ−９およびＣ−８またはＣ−７−デアザのいずれか、 である、化合物。
  18. 【請求項１８】 請求項１６に記載の化合物であって、ここで、Ｂは、７−
    デアザアデニン、７−デアザグアニン、アデニン、グアニン、シトシン、チミン
    、ウラシル、２−デアザ−２−チオグアノシン、２−デアザ−２−チオ−７−デ
    アザグアノシン、２−チオアデニン、２−チオ−７−デアザアデニン、イソグア
    ニン、７−デアザイソグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５，６−ジヒドロ
    チミン、キサンチン、５−アミノシチジン、５−アミノウラシル、７−デアザキ
    サンチン、ヒポキサンチン、７−デアザキサンチン、２，６−ジアミノ−７−デ
    アザプリン、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、
    ５−フルオロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシチジン、２
    −チオチミンおよび２−チオウリジンからなる群から選択される、化合物。
  19. 【請求項１９】 請求項１６に記載の化合物であって、ここで、Ｂが、７−
    デアザアデニン、７−デアザグアニン、アデニン、グアニン、シトシン、チミン
    、およびウラシルからなる群から選択される、化合物。
  20. 【請求項２０】 Ｌが、以下の構造からなる群から選択される、請求項１に
    記載の化合物。 【化８】
JP2000540144A 1998-01-16 1998-12-21 核酸塩基オリゴマー Withdrawn JP2002509155A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015143698A (ja) * 2007-09-19 2015-08-06 ユニヴァーシティ コート オブ ザユニバーシティ オブ エディンバラ 核酸塩基の特徴づけ

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7282581B2 (en) * 2001-11-02 2007-10-16 Wallac Oy Oligonucleotide labeling reactants based on acyclonucleosides and conjugates derived thereof
EP1389638A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-18 Roche Diagnostics GmbH Improved fluorescent resonance energy transfer probes
US8394944B2 (en) * 2002-09-20 2013-03-12 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Dual-purpose primers and probes for providing enhanced hybridization assays by disruption of secondary structure formation

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4962192A (en) * 1986-07-17 1990-10-09 Board Of Governors Of Wayne State University Chemiluminescent 1,2-dioxetane compounds
US4931223A (en) * 1986-07-24 1990-06-05 Tropix, Inc. Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes
DD275692C2 (de) * 1988-09-20 1990-10-24 Univ Halle Wittenberg Verfahren zur herstellung von cytokin(inertferon)-induktoren und aktivatoren natuerlicher killerzellen
EP0472648A4 (en) * 1989-05-18 1992-09-16 Microprobe Corporation Crosslinking oligonucleotides
AU6296294A (en) * 1993-01-26 1994-08-15 Microprobe Corporation Bifunctional crosslinking oligonucleotides adapted for linking to a desired gene sequence of invading organism or cell
DE4331011A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit C-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
WO1995008556A1 (en) * 1993-09-21 1995-03-30 Amersham International Plc Reagents comprising chimeric molecules of nucleic acids and nucleic acid analogs
WO1997014708A1 (en) * 1995-10-04 1997-04-24 Research Corporation Technologies, Inc. Oligonucleotides containing thiol-substituted nucleoside derivatives and methods of use thereof
EP0816379A3 (de) * 1996-06-27 1998-04-01 Bayer Ag Nukleinsäure-bindende Oligomere
DE19640974A1 (de) * 1996-10-04 1998-04-16 Bayer Ag Bausteine für DNA/PNA-Cooligomere
US6017702A (en) * 1996-12-05 2000-01-25 The Perkin-Elmer Corporation Chain-termination type nucleic acid sequencing method including 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate
AU6659898A (en) * 1997-03-03 1998-09-22 Perkin-Elmer Corporation, The Improved chimeric oligonucleotide vectors
US6893815B1 (en) * 1997-06-30 2005-05-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nucleobase heterocyclic combinatorialization

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015143698A (ja) * 2007-09-19 2015-08-06 ユニヴァーシティ コート オブ ザユニバーシティ オブ エディンバラ 核酸塩基の特徴づけ

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