DE60109739T2

DE60109739T2 - Verfahren zur herstellung und immobilisierung von nukleinsäure auf einem silan-modifizierten festträger

Info

Publication number: DE60109739T2
Application number: DE60109739T
Authority: DE
Inventors: Bernard Bennetau; Jamal Bousbaa; Franck Choplin; Eliane Souteyrand; Jean-Rene Martin; Jean-Pierre Cloarec
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Centrale de Lyon
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Centrale de Lyon
Priority date: 2000-01-20
Filing date: 2001-01-17
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2021-01-18
Also published as: EP1248859B1; ES2240413T3; CA2397606C; US6979540B2; ATE292192T1; US20030138796A1; FR2804129A1; EP1248859A1; WO2001053523A1; JP2003520350A; DE60109739D1; FR2804129B1; CA2397606A1; AU2001235530A1; JP4744054B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung, zur Synthese oder Immobilisierung von Nucleinsäuren, eines festen Trägers, der durch eine selbstorganisierte Monoschicht aus ein oder mehreren siliciumorganischen Verbindungen modifiziert ist, sowie Verfahren zur Synthese und Immobilisierung von Nucleinsäuren auf einem festen Träger.
Zur chemischen Synthese oder zur Immobilisierung von Molekülen auf einer anorganischen Oberfläche ist es zu allererst erforderlich, Kupplungsmittel auf sie aufzupfropfen, die die Fixierung der organischen Moleküle auf dem anorganischen Substrat sicherstellen.
Zu diesem Zweck wurden von L. A. CHRISEY et al. (Nucleic Acids Research, 1996, 24, 15, 3031–3039) und U. MASKOS et al. (Nucleic Acids Research, 1992, 20, 7, 1679–1684) siliciumorganische Kupplungsmittel vorgeschlagen. Die eingesetzten Mittel, nämlich 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und verschiedene Aminosilane, haben jedoch den Nachteil, dass sie sich willkürlich und nicht reproduzierbar auf der Oberfläche abscheiden. Dort bilden sie einen inhomogenen Film, dessen Dicke sich nicht regulieren lässt, wobei dieser Film gegenüber späteren chemischen Behandlungen auch noch wenig beständig ist und die Inhomogenität des Films tatsächlich zu einem schlechten Schutz der Siloxanbindungen führt. Ein reproduzierbares Aufpfropfen dieser Moleküle ist daher sehr schwierig. Bevor man Oligonucleotide auf dem Substrat fixiert oder synthetisiert, sind zusätzliche Oberflächenreaktionen erforderlich, um die sterische Hinderung an der Oberfläche zu verringern (beispielsweise Aufpfropfen von bifunktionellen heterocyclischen Molekülen, wie bei L. A. CHRISEY et al. beschrieben), um die Oberfläche hydrophiler zu machen (U. MASKOS et al. beschreiben das Aufpfropfen von Ethylenglycol, Penta- oder Hexaethylenglycol) und/oder um die schwache Reaktivität der Oberflächenfunktionen zu verbessern, alles zusätzliche Arbeitsschritte, die sich ebenfalls nicht kontrollieren lassen.
A. ULMAN, in Chem. Rev., 1996, 96, 1533–1554, hat die Bildung von selbstorganisierten Monoschichten auf festen Trägern mit Hilfe von siliciumorganischen Verbindungen vom Typ funktionalisierter Alkyltrichlorsilane beschrieben. Es wird ihre Verwendung zur Fixierung von Biomolekülen vorgeschlagen, eine Methode, die in diesem Zusammenhang wahrscheinlich eine Modifikation des Biomoleküls mit einer Thiolfunktion und eine Modifikation der Oberfläche durch heterobifunktionelle Moleküle erforderlich macht.
Die Erfinder haben sich also die Aufgabe gestellt, die Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen und Verfahren zur Synthese und Immobilisierung von Biomolekülen, insbesondere Nucleinsäuren, auf festen Trägern bereitzustellen, die durch dichte und organisierte Monoschichtfilme modifiziert sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung, zur Synthese oder Immobilisierung von Nucleinsäuren, eines festen Trägers, der durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifiziert ist, die wenigstens eine siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst:
wobei

– n zwischen 15 und 35, vorzugsweise zwischen 20 und 25 liegt,
– m gleich 0 oder 1 ist,
– X₁, X₂ und X₃, die gleich oder voneinander verschieden sein können, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus unverzweigten oder verzweigten gesättigten C₁-C₆-Alkylgruppen und hydrolysierbaren Gruppen, wobei wenigstens eines von X₁, X₂ oder X₃ eine hydrolysierbare Gruppe darstellt,
– A die Gruppe -O-(CH₂-CH₂-O)_k-(CH₂)_i- darstellt, worin k zwischen 0 und 100, vorzugsweise zwischen 0 und 5 liegt und i eine ganze Zahl höher oder gleich 0, vorzugsweise 0 oder 1 ist,
– falls m = 0, B eine Gruppe -OCOR, -OR, -COOR oder ein Halogenatom darstellt, wobei R ein Wasserstoffatom oder eine unverzweigte oder verzweigte C₁-C₆-Alkylgruppe darstellt,
– falls m = 1:
• wenn k = 0 und i = 0, B eine Gruppe R₁ darstellt,
• wenn k = 1 und i ≥ 1, B eine Gruppe -OR₁, -OCOR₁, -NR₁R₂, -COOR₁, -CONR₁R₂, -SR₁ oder ein Halogenatom darstellt,
• wenn k ≥ 1 und i = 0, B eine Gruppe -R₁, -COR₁, -COOR₁ oder -CONR₁R₂ darstellt,
• wenn k ≥ 1 und i ≥ 1, B eine Gruppe -OR₁, -OCOR₁, -NR₁R₂, -COOR₁, -CONR₁R₂, -SR₁ oder ein Halogenatom darstellt,
• R₁ und R₂, die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom, eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte und unverzweigte oder verzweigte Kohlenwasserstoff-kette mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen oder eine aromatische Gruppe darstellen.

Wenn B, ungeachtet der Werte für i, eine Gruppe -OR₁, -OCOR₁ oder -COOR₁ darstellt und wenn k ≥ 1, versteht es sich von selbst, dass B jede Gruppe darstellen kann, die beim Schutz der Hydroxy- oder Carbonsäurefunktion resultiert, wie die Schutzgruppen, die in Protective groups in organic synthesis (T. W. GREENE et al., 2. Auflage, Wiley Interscience) beschrieben sind, beispielsweise eine cyclische Schutzgruppe.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung und im nachfolgenden Text versteht man unter "Nucleinsäuren" sowohl Oligonucleotide wie DNA oder RNA als auch Nucleinsäuren mit modifiziertem Grundgerüst oder modifizierten Basen, wie Peptidnucleinsäuren (PNA: Peptide Nucleic Acids), die anstelle von Phosphodiesterbindungen Peptidbindungen haben.
Unter "aromatisch" wird jede Gruppe verstanden, die ein oder mehrere Arylringe, beispielsweise einen Phenylring, aufweist. Unter "selbstorganisierte Monoschicht" ("Monocouche autoassemblée organisée") wird eine Anordnung von Molekülen verstanden, bei der die Moleküle organisiert sind, wobei die Organisation aufgrund von Wechselwirkungen und einer starken Kohäsion zwischen den Molekülketten erfolgt, was zu einem stabilen und geordneten anisotropen Film führt (A. ULMAN, Chem. Rev., 1996, 96, 1533–1554).
Eine auf einem festen Träger gebildete selbstorganisierte Monoschicht erlaubt es, eine dichte und homogene organische Oberfläche mit sowohl chemisch als auch strukturell gut definierten Parametern zu erhalten. Die Bildung dieser Monoschicht, die dank der Selbstorganisierungseigenschaften der Verbindungen der Formel (I) für gut definierte Werte von n, m, k und i erhalten wird, ist für jede siliciumorganische Verbindung vollkommen reproduzierbar. Ferner schützt die Bildung einer selbstorganisierten sehr dichten Monoschicht die Siloxanbindungen gegen chemische Behandlungen (sauer oder basisch), was es erlaubt, verschiedene chemische Reaktionen auf dieser Oberfläche durchzuführen.
Die siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I), die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, haben wegen der Art der Gruppe A und der Diversität der verwendbaren terminalen Gruppen B vorteilhaft sehr verschiedene Funktionalitäten und eine hohe Reaktivität, wobei diese Gruppen B selbstverständlich mit fachmännisch allgemein bekannten Reaktionen der organischen Chemie wie gewünscht modifiziert und funktionalisiert werden können.
Die erfindungsgemäße Verwendung erlaubt es wegen der Homogenität und der Stabilität der auf dem Träger gebildeten selbstorganisierten Monoschicht, Nucleinsäuren besonders vorteilhaft und mittels der ausgewählten siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I) zuverlässig und reproduzierbar auf dem Träger zu synthetisieren oder zu immobilisieren. Die Nucleinsäuren werden auf dem modifizierten Träger über starke kovalente Bindungen synthetisiert oder immobilisiert, ohne dass die zwischen den siliciumorganischen Verbindungen und dem festen Träger entwickelten Siloxanbindungen abgebaut werden.
Geeignete feste Träger sind allgemein solche mit einer hydratisierten Oberfläche und/oder solche, deren Oberfläche Hydroxylgruppen aufweist. Vorzugsweise wird der Träger ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus Glasmaterialien, Keramikmaterialien (beispielsweise vom Oxidtyp), Metallen (beispielsweise Aluminium oder Gold) und Metalloiden (wie Silicium).
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird unter "hydrolysierbar" jede Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer Säure in wässrigem Milieu so zu reagieren, dass die Verbindungen X₁H, X₂H oder X₃H gebildet werden, wobei X₁, X₂ und X₃ wie in Formel (I) definiert sind.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist die hydrolysierbare Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogenatomen, der Gruppe -N(CH₃)₂ und der Gruppe -OR', wobei R' eine unverzweigte oder verzweigte gesättigte C₁-C₆-Alkylgruppe ist.
Was die Gruppen B und die hydrolysierbaren Gruppen betrifft, so sind geeignete Halogenatome sowohl Fluor als auch Chlor, Brom oder Iod.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform stellen X₁, X₂ und X₃ Chloratome dar, n ist gleich 22, m ist gleich 1, i ist gleich 0, k ist gleich 1 oder 3 und B stellt eine Gruppe -COCH₃ dar.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform stellen X₁, X₂ und X₃ Chloratome dar, n ist gleich 22, m ist gleich 1, i ist gleich 1, k ist gleich 2 und B stellt eine Gruppe -COOCH₃ dar.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform stellen X₁, X₂, und X₃ Chloratome dar, n ist gleich 16, 22 oder 27, m ist gleich 0 und B stellt eine Gruppe -OCOCH₃ dar.
Gemäß noch einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform stellen X₁, X₂ und X₃ Chloratome dar, n ist gleich 21, m ist gleich 0 und B stellt eine Gruppe -COOCH₃ dar.
Die Verwendung von erfindungsgemäßen modifizierten festen Trägern ist besonders zur Herstellung von DNA-Chips geeignet, d. h. Trägern, auf denen eine Gruppe bekannter DNA-Sequenzen in einer sehr genauen Anordnung kovalent fixiert ist, wobei diese Chips mehrmals wiederverwendet werden können. Solche DNA-Chips erlauben es, durch Hybridisierung der auf dem Träger immobilisierten DNA mit Target-Nucleinsäuren oder -Oligonucleotiden die Sequenz dieser Targetmoleküle zu bestimmen oder die Expression von Genen zu verfolgen. Es gibt zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten: Entdeckung von neuen Genen und neuen Medikamenten, diagnostische Anwendungen, Toxizitätsstudien usw.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifiziert ist, die wenigstens eine wie oben definierte siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst, und dadurch, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung eines festen Trägers, der durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifiziert ist, die wenigstens eine wie sie oben definierte siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst, wobei die siliciumorganischen Verbindungen an ihrem Ende eine geschützte Hydroxy- oder Aminfunktion aufweisen;
b) gegebenenfalls Entschützen der Hydroxy- oder Aminfunktion;
c) lokalisierte kovalente Kupplung eines Nucleotids an den in den Schritten a) oder b) erhaltenen modifizierten festen Träger;
d) wenigstens einmaliges Wiederholen von Schritt c) mit gleichen oder anderen Nucleotiden.

Schritt a) wird vorteilhaft mit den folgenden Schritte durchgeführt:

i) Eliminierung der Verunreinigungen von dem festen Träger und Hydratation und/oder Hydroxylierung seiner Oberfläche,
j) Einbringen in eine Mischung aus wenigstens zwei Lösungsmitteln, die wenigstens ein unpolares Lösungsmittel auf Kohlenwasserstoffbasis umfassen, unter Inertatmosphäre, einer wie oben definierten siliciumorganischen Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei die Verbindung an einem Ende eine geschützte Hydroxy- oder Aminfunktion aufweist,
k) Silanisierung des in Schritt i) erhaltenen Trägers durch Eintauchen in die in Schritt j) hergestellte Lösung,
l) gegebenenfalls Tempern des in Schritt k) erhaltenen silanisierten Trägers, der die selbstorganisierte Monoschicht trägt, bei einer Temperatur zwischen 50 und 120°C für eine Dauer von 5 Minuten bis zu einer Nacht, und
m) Spülen des in Schritt k) oder l) erhaltenen modifizierten Trägers mit einem vorzugsweise polaren Lösungsmittel.

Unter "Verunreinigungen" des festen Trägers wird jede Verbindung wie Fett, Staub oder sonstiges verstanden, die auf der Oberfläche des Trägers vorhanden ist und die nicht Teil der chemischen Strukturen des Trägers selbst ist.
Abhängig von der Art des festen Trägers kann Schritt i) mit ein oder mehreren Lösungsmitteln und/oder Oxidationsmitteln und/oder Hydroxylierungsmitteln (beispielsweise eine Chromschwefelsäuremischung), eines Detergens (beispielsweise Hellmanex^®), einer photochemischen Behandlung mit Ozon oder jeder anderen geeigneten Behandlung durchgeführt werden.
Als Beispiele für geschützte Hydroxy- oder Aminfunktionen in Schritt j) sind die Gruppen -OCOR' und -NR'R'' zu nennen, in denen R' und R'' Alkylketten darstellen. Ebenso kommt jede andere Gruppe in Betracht, die aus dem Schutz einer Hydroxy- oder Aminfunktion resultiert.
Schritt j) kann vorteilhaft in einer Mischung aus wenigstens einem unpolaren Lösungsmittel auf Kohlenwasserstoffbasis und wenigstens einem polaren Lösungsmittel durchgeführt werden. In diesem Fall liegt das Volumenverhältnis von unpolarem Lösungsmittel zu polarem Lösungsmittel vorzugsweise zwischen 70/30 und 95/5.
Ein in keiner Weise einschränkendes Beispiel für ein unpolares Lösungsmittel auf Kohlenwasserstoffbasis, das in Schritt j) verwendet werden kann, ist Cyclohexan, und ein Beispiel für ein verwendbares polares Lösungsmittel ist Chloroform.
Vorzugsweise liegt die Konzentration der siliciumorganischen Verbindung in der Lösungsmittelmischung in Schritt j) zwischen 1 × 10^–5 und 1 × 10^–2 mol/Liter.
Schritt k) zur Silanisierung des Trägers kann abhängig von den verwendeten Lösungsmitteln über einen Zeitraum zwischen 1 Minute und 3 Tagen und bei einer Temperatur zwischen –10°C und 120°C durchgeführt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger kann Schritt b) nach jeder dem Fachmann bekannten Methode durchgeführt werden, beispielsweise durch eine Behandlung mit Kaliumhydroxid. Die Schritte c) und d) können mittels Phosphoramiditchemie oder jeder anderen dem Fachmann bekannte chemischen Methode, die die kovalente Kupplung von Nucleotiden erlaubt, durchgeführt werden, wie beispielsweise bei A. ELLINGTON und J. D. POLLARD in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New York, beschrieben.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Syntheseverfahrens wird nach Schritt a) oder b) und vor Schritt c) ein Schritt des Aufpropfens von Spacer-Armen, die endständige Hydroxy- oder Aminfunktionen tragen, an das Ende der siliciumorganischen Verbindungen durchgeführt.
Solche Spacer-Arme können abhängig von den gewünschten Eigenschaften in Ladung, Länge und Polarität variieren. Beispielsweise können sie eine geladene Kette (wie ein Phosphoramidit mit einer nichtbasischen Stelle), eine ungeladene hydrophile Kette (wie ein Polyethylenglycol), eine ungeladene hydrophobe Kette (wie eine Alkylkette) oder auch eine Kette mit einer Ammoniak-labilen Gruppe (wie die -SO₂-Gruppe) umfassen.
Schritt c) zur kovalenten Kupplung eines Nucleotids an den modifizierten Träger erfolgt lokal, d. h. an einer bestimmten Stelle des Trägers.
Die Wiederholung von Schritt c) kann so oft wie gewünscht wiederholt werden; beispielsweise kann Schritt c) etwa hundertmal durchgeführt werden, wobei man weiß, dass die Ausbeute ab einer solchen Zahl abnimmt.
Die in den Schritten c) und d) gekuppelten Nucleotide werden vorzugsweise in geeigneter Weise geschützt, wie in der Oligonucleotidsynthesen an festen Trägern betreffenden Lite ratur beschrieben wird. Selbstverständlich können die an dem festen Träger synthetisierten Nucleinsäuren nach Schritt d) durch jede geeignete chemische Behandlung, beispielsweise mit Ammoniak, entschützt werden. Diese Behandlung wird nicht von einer Abspaltung der Nucleinsäuren des Trägers begleitet, außer wenn ein Ammoniak-labiler Spacer-Arm zwischen diese Nucleinsäuren und die silanisierte Oberfläche eingebracht wurde.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren auf einem festen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifiziert ist, die wenigstens eine wie oben definierte siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst, und dadurch, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) Herstellung eines festen Trägers, der durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifiziert ist, die wenigstens eine wie oben definierte siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst, wobei die siliciumorganischen Verbindungen an ihrem Ende eine geschützte Carbonsäure- oder Aminfunktion aufweisen;
b) gegebenenfalls Entschützen der Carbonsäure- oder Aminfunktion;
c) gegebenenfalls, wenn der modifizierte feste Träger endständige Carbonsäurefunktionen trägt, Aktivierung dieser Funktionen;
d) In-Kontakt-Bringen des in Schritt a), b) oder c) erhaltenen modifizierten festen Trägers mit ein oder mehreren Lösungen, lokal aufgebracht, der zu immobilisierenden Nucleinsäure(n) in ein oder mehreren polaren Lösungsmitteln, wobei die Nucleinsäuren an einem ihrer Enden einen Spacer-Arm tragen, der entweder mit einer Aminfunktion funktionalisiert ist, wenn der modifizierte feste Träger gegebenenfalls geschützte endständige Carbonsäurefunktionen trägt, oder mit einer aktivierten Carbonsäurefunktion, wenn der modifizierte feste Träger gegebenenfalls geschützte endständige Aminfunktionen trägt; und
e) Waschen des festen Trägers, auf dem die Nucleinsäuren immobilisiert sind.

Schritt a) wird vorteilhaft wie zuvor bei dem Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger angegeben durchgeführt, mit dem Unterschied, dass die siliciumorganische Verbindung bei Schritt j) an einem Ende eine geschützte Carbonsäure- oder Aminfunktion aufweist.
Schritt c) zur Aktivierung der Carbonsäurefunktionen kann beispielsweise mit einer N-Hydroxysuccinimid- oder Carbodiimidlösung oder auch mit jedem anderen geeigneten und dem Fachmann bekannten Aktivierungsreagens durchgeführt werden.
Es versteht sich, dass bei Schritt d) zum Solubilisieren der Nucleinsäuren jede Lösung verwendet werden kann, die eine gute Löslichkeit der Letzteren und eine Kontrolle der Verdampfung der Lösung erlaubt; als nicht einschränkendes Beispiel ist hier eine Mischung aus Acetonitril/Wasser zu nennen. Jede Lösung einer zu immobilisierenden Nucleinsäure wird mit einer zur Mikroabscheidung geeigneten Einrichtung an einer bestimmten Stelle des Trägers abgeschieden.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immobilisierungsverfahrens wird nach Schritt a) oder b) und vor Schritt c) ein Schritt des Aufpfropfens von Spacer-Armen, die endständige Carbonsäure- oder Aminfunktionen tragen, an das Ende der siliciumorganischen Verbindungen durchgeführt. Geeignete Spacer-Arme sind die oben beschriebenen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein DNA-Chip, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren erhalten wird, wobei die Nucleinsäuren DNA sind.
Der erfindungsgemäße DNA-Chip hat den Vorteil, dass er stabil ist und somit in zahlreichen Hybridisierungs- und Denaturierungszyklen wiederverwendet werden kann.
Neben den obigen Anwendungsmöglichkeiten umfasst die Erfindung noch andere Anwendungsmöglichkeiten, die sich aus der folgenden Beschreibung ergeben, die sich auf Beispiele zur Synthese von siliciumorganischen Verbindungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, und zur Synthese oder Immobilisierung von Nucleinsäuren auf mit einer selbstorganisierten Monoschicht von diesen siliciumorganischen Verbindungen modifizierten festen Trägern bezieht, sowie auf die anliegenden Zeichnungen, von denen:
die 1, 2 und 3 die Synthese ungesättigter Vorläufer von siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I) veranschaulichen, wobei m = 1,
4 die Silylierung dieser ungesättigten Vorläufer veranschaulicht,
5 ungesättigte Vorläufer von siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I) darstellt, wobei m = 0,
6 Infrarotspektren darstellt, die nach drei Experimenten zum Aufpfropfen der siliciumorganischen Verbindung 14 auf die Siliciumoxidoberfläche von Au/Si/SiO₂-Substraten aufgenommen wurden,
7a die mittels Raman-Spektroskopie analysierte Dichte der Oberfläche des Au/Si/SiO₂-Substrats darstellt, auf das die siliciumorganischen Verbindungen 14 gepfropft wurden;
die 7b und 7c die Raman-Spektren darstellen, die an zwei verschiedenen Punkten dieser Oberfläche aufgenommen wurden, und
8 aufeinanderfolgende Hybridisierungs- (8d, 8f und 8h) und Denaturierungsexperimente (8e, 8g und 8i) ausgehend von durch eine Monoschicht aus siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I) modifizierten Au/Si/SiO₂-Substraten darstellt, auf denen die Oligonucleotide L185 und U226 synthetisiert wurden (8a).
Es versteht sich jedoch, dass diese Beispiele lediglich zur Veranschaulichung des Gegenstands der Erfindung dienen und diesen in keiner Weise einschränken.
BEISPIEL 1: Synthese von siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I), worin m = 1.
1) Synthese eines ungesättigten Alkohols (1).
• Herstellung der Magnesiumverbindung 2
In einen 500-ml-Dreihalsrundkolben wird unter Inertatmosphäre Magnesium (1,8 g; 70 mmol) vorgelegt. Das ungesättigte bromierte Derivat 1 (16,3 g; 70 mmol), das zuvor in 70 ml wasserfreiem THF (Tetrahydrofuran) gelöst wurde, wird zugetropft. Es können einige Tropfen Dibromethan erforderlich sein, um das Magnesium zu aktivieren. Die Reaktionsmischung wird 1 h 30 zum Rückfluss gebracht, um die Magnesiumverbindung 2 zu erhalten, die sofort verwendet wird.
• Herstellung des Lithiumalkoholats 4
Der Bromalkohol 3 (17,7 g; 70 mmol; 1 Äq.) wird in einem trockenen 250-ml-Dreihalsrundkolben unter Inertatmosphäre in 70 ml wasserfreiem THF gelöst. Die Lösung wird auf –78°C abgekühlt und dann wird Methyllithium (50 ml; 80 mmol; 1,1 Äq.) zugetropft. Man erhält das Lithiumalkoholat 4.
• Herstellung des ungesättigten Alkohols 5
Die Magnesiumverbindung 2 wird auf –78°C abgekühlt und dann wird Kupferiodid (1,1 g; 3,5 mmol; 0,05 Äq.) zugegeben. Die Lösung wird 25 Minuten bei –78°C gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmt, bis eine violette Farbe erhalten wird. Dann wird die Lösung sofort auf –78°C abgekühlt und das Lithiumalkoholat 4 wird mit Hilfe einer Kanüle unter Argonatmosphäre zugeführt. Die Lösung wird 1 h bei –78°C und dann 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Das überschüssige Methyllithium wird durch Zugabe von Ethanol zerstört, gefolgt von einer Hydrolyse in saurem Milieu durch Zugabe einer 10%igen wässrigen Salzsäurelösung. Die organische Phase wird dreimal mit Diethylether extrahiert. Die Etherphasen werden vereinigt und mit einer 10%igen wässrigen Salzsäurelösung, mit Wasser und schließlich mit einer gesättigten wässrigen NaHCO₃-Lösung gewaschen. Dann wird die organische Phase bis zur Neutralität gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und dann unter Vakuum eingeengt. Das Produkt wird durch Umkristallisation aus Aceton gereinigt. Verbindung 5 wird in Form eines weißen Feststoffs erhalten (19,8 g; Schmelzpunkt 61,7–62,8°C; Ausbeute 87%). Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (ν (cm^–1)); 3330; 3079; 2919; 2851; 1642.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 6,0–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 3,6 (t; 2H); 2,2–1,9 (m; 2H) und 1,7–1,2 (m; 37H, wobei 1H mit D₂O austauschbar ist).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 139,3; 113,8; 62,8; 33,6–25,8 (19 CH₂).
2) Einbringen eines Ethylenglycols (1).
• Synthese des ungesättigten chlorierten Derivats 6
Der oben erhaltene Alkohol 5 (15 g; 46 mmol; 1 Äq.) und Pyridin (40,36 ml; 6 mmol; 0,1 Äq.) werden in einen 250-ml-Zweihalsrundkolben eingebracht, der mit einem Magnetrührer ausgestattet und mit einem Rückflusskühler versehen ist. Dann wird Thionylchlorid (6 ml; 70 mmol; 1,5 Äq.) zugetropft. Das Reaktionsmedium wird 1 h gerührt und dann bis zum vollständigen Verschwinden der OH-Bande (verfolgt durch Infrarotspektroskopie) zum Rückfluss gebracht. Anschließend wird das Reaktionsmedium hydrolysiert und dann dreimal mit Diethylether extrahiert. Die Etherphasen werden vereinigt und mit einer 10%igen wässrigen Salzsäurelösung, mit Wasser und dann mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung gewaschen. Anschließend wird die Etherphase bis zur Neutralität gewaschen, über MgSO₄ ge trocknet und unter Vakuum eingeengt. Verbindung 6 wird in Form eines gelben Feststoffs erhalten und dann durch Chromatographie an Silicagel gereinigt (Eluens: Petrolether/Ether, v/v 70/30); man erhält einen weißen Feststoff (14 g; Schmelzpunkt 34,1–34,9°C; Ausbeute 75%). Seine Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3076; 2917; 2849; 1641.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 6,0–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 3,5–3,3 (t; 2H); 2,2–1,9 (m; 2H) und 1,7–1,2 (m; 36H).
¹³C-NMR (CDCl₃ δ (ppm)): 139,2; 113,8; 33,8–25,6 (20 CH₂).
• Synthese des ungesättigten iodierten Derivats 7
Die ungesättigte chlorierte Verbindung 6 (10,6 g; 32 mmol) und Natriumiodid (22 g; 140 mmol; 4 Äq.) werden in einem 250-ml-Rundkolben in Aceton (40 ml) solubilisiert. Dann wird die Lösung 18 h zum Rückfluss gebracht. Anschließend wird das Reaktionsmedium mit Diethylether extrahiert, die Etherphasen werden vereinigt und dann mit Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Das Produkt wird durch Ausfällen aus Aceton gereinigt. Verbindung 7 wird in Form eines gelben Feststoffs erhalten (11 g; Schmelzpunkt 41,1–42,0°C; Ausbeute 81%). Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) (ν (cm^–1)); 3076; 2917; 2849; 1641.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 6,0–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 3,2–3,0 (t; 2H); 2,2–1,9 (m; 2H) und 1,7–1,2 (m; 36H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 139,2; 113,8; 33,8–25,6 (20 CH₂).
• Synthese des ungesättigten Alkohols 8
Eine Lösung von Ethylenglycol (11,5 g; 180 mmol; 10 Äq.) und zuvor zu Pulver zerkleinertem Natriumhydroxid (3,7 g; 90 mmol; 5 Äq.) in 20 ml wasserfreiem THF wird 30 Minuten zum Rückfluss gebracht. Die iodierte Verbindung 7 (8 g; 18 mmol; 1 Äq.) und Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,62 g; 1,8 mmol; 0,1 Äq.) werden zugegeben. Anschließend wird das Reaktionsmedium 72 h zum Rückfluss gebracht. Nach Rückkehr auf Raumtemperatur wird eine wässrige Salzsäurelösung (10%, 50 ml) zugegeben. Anschließend wird das Reaktionsmedium dreimal mit Diethylether extrahiert; die Etherphasen werden vereinigt und dann zweimal mit einer 10%igen Salzsäurelösung, mit Wasser und dann mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung gewaschen. Die Etherphase wird anschließend bis zur Neutralität gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Der erhaltene Feststoff wird aus Dichlormethan umgefällt und dann durch Chromatographie an Silicagel gereinigt (Eluens: Dichlormethan/Ethylacetat; v/v: 30/70). Verbindung 8 wird in Form eines weißen Feststoffs erhalten (1,4 g, Schmelzpunkt 61,2–62,4°C; Ausbeute 21%). Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3330; 3080; 2917; 2849; 1643.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 6,0–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 3,75–3,65 (m; 2H); 3,55–3,4 (m; 4H); 2,2–1,9 (m; 2H) und 1,7–1,0 (m; 37H, wobei 1H mit D₂O austauschbar ist).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)) : 139,2; 113,8; 71,7 (2 CH₂); 63,7; 33,6–25,8 (19 CH₂).
• Synthese des estergeschützten ungesättigten Alkohols 9
Der ungesättigte Alkohol 8 (0,9 g; 2,7 mmol) wird in einem 100-ml-Zweihalsrundkolben in Dichlormethan (10 ml) und Triethylamin (0,6 ml; 5,4 mmol; 2 Äq.) suspendiert. Das Reaktionsmedium wird auf 0°C abgekühlt und dann wird Acetylchlorid (0,5 ml; 4 mmol; 1,5 Äq.) mit einer Spritze zugetropft. Das Reaktionsmedium wird 15 Minuten bei 0°C und dann 1 h 30 bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird es hydrolysiert und dann dreimal mit Diethylether extrahiert. Die Etherphasen werden vereinigt und mit einer 10%igen Salzsäurelösung, mit Wasser und dann mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung gewaschen. Dann wird die Etherphase bis zur Neutralität gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Verbindung 9 wird in Form eines weißen Feststoffs erhalten (0,9 g; Ausbeute 100%). Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3080; 2917; 2849; 1742; 1643.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 6,0–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 4,25–4,15 (m; 2H); 3,60–3,50 (t; 2H); 3,45–3,35 (t; 2H); 2,2–1,9 (m; 5H) und 1,7–1,0 (m; 36H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 172,0; 139,2; 113,8; 71,5; 68,5; 63,7; 33,6–25,8 (19 CH₂); 21, 0.
3) Einbringen von drei Ethylenglycoleinheiten (2).
Ausgehend von dem oben erhaltenen ungesättigten iodierten Derivat 7 und von Triethylenglycol wird ein ungesättigter Alkohol 10 erhalten und dann zum Produkt 11 verestert, wobei dies nach den gleichen Vorschriften wie oben erläutert erfolgt.
Die Analyse von Produkt 10 mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3380; 3079; 2919; 2850; 1641.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 5,9–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 4,3–4,2 (t; 2H); 3,7–3,4 (m; 10H); 3,4–3,3 (t; 2H); 2,2–1,9 (m; 2H) und 1,7–1,0 (m; 37H, wobei 1H mit D₂O austauschbar ist).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 139,3; 114,0; 71,6–68,2 (6 CH₂); 63,6; 33,6–25,8 (19 CH₂).
Die Analyse von Produkt 11 mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3079; 2919; 2850; 1740; 1641.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 5,9–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 4,3–4,2 (t; 2H); 3,7–3,4 (m; 10H); 3,4–3,3 (t; 2H); 2,2–1,9 (m; 5H) und 1,7–1,0 (m; 36H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,5; 139,3; 114,0; 71,6–68,3 (6 CH₂); 63,6; 33,6–25,8 (19 CH₂); 21,0.
4) Herstellung der ungesättigten Ester (3).
Ausgehend von dem oben erhaltenen ungesättigten Alkohol 10 wurden die entsprechende Säure und der entsprechende Ester wie folgt hergestellt.
• Herstellung der Säure 12
Der ungesättigte Alkohol 10 (3 g; 6,6 mmol) wird in einem 100-ml-Dreihalsrundkolben in 10 ml Aceton suspendiert. Zu dieser Suspension werden 80 ml 2 M Jones-Reagens gegeben (BOWDEN et al., J. Chem. Soc., 1946, 39). Die Suspension wird 2 h zum Rückfluss gebracht. Nach Rückkehr auf Raumtemperatur wird das Aceton abgedampft, der Feststoff wird filtriert und dann fünfmal mit Wasser und dreimal mit auf 0°C gekühltem Aceton gespült. Anschließend wird der Feststoff durch Umkristallisieren aus einer Mischung von THF/Aceton (v/v: 9/1) gereinigt, was Verbindung 12 in Form eines weißen Feststoffs liefert (2,9 g; Ausbeute 94%). Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3370; 3080; 2917; 2849; 1707; 1643.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 11,2 (breites s; 1H); 6,0–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 4,1–4,0 (s; 2H); 3,6–3,3 (m; 10H); 2,2–1,9 (m; 2H) und 1,7–1,0 (m; 36H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)) : 172,1; 139,1; 114,0; 71,6–68,7 (5 CH₂); 63,5; 33,6–25,8 (19 CH₂).
• Herstellung des Esters 13
Die Säure 12 (2,9 g; 6,4 mmol) wird in einem 100-ml-Dreihalsrundkolben in wasserfreiem Toluol (7 ml) unter Inertatmosphäre bei 0°C solubilisiert. Es wird Oxalylchlorid (1,22 g; 9,6 mmol; 1,5 Äq.) zugetropft und dann wird die Mischung 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend werden das überschüssige Reagens und das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft. Das Acylchlorid wird vorübergehend unter Argon aufbewahrt. Methanol (6 ml; 128 mmol; 20 Äq.), das zuvor über Calciumchlorid destilliert worden war, wird langsam zugegeben. Anschließend wird das Reaktionsmedium 18 h zum Rückfluss gebracht, bevor es wieder auf Raumtemperatur gebracht wird, und dann wird das überschüssige Methanol abgedampft. Dann wird das Reaktionsmedium dreimal mit Diethylether extrahiert. Die Etherphasen werden vereinigt und mit einer 10%igen Salzsäurelösung, mit Wasser und mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung gewaschen. Anschließend wird die Etherphase bis zur Neutralität gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Verbindung 13 wird in Form eines weißen Feststoffs erhalten und dann durch Chromatographie an Silicagel gereinigt (Eluens: Petrolether/Ether, Volumenverhältnis 50/50). Man erhält 300 mg eines weißen Feststoffs (Ausbeute 10%). Seine Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3080; 2917; 2849; 1742; 1643.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 6,0–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 4,1–4,0 (s; 2H); 3,6–3,3 (m; 13H); 2,2–1,9 (m; 2H) und 1,7–1,0 (m; 36H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,8; 139,1; 114,0; 71,6–68,7 (5 CH₂); 63,6; 51,7; 33,6–25,8 (19 CH₂).
Es versteht sich von selbst, dass man bei Verwendung von Alkohol 8 mit einem einzigen Ethylenglycolmotiv die entsprechenden Säuren und Ester nach der gleichen Versuchsvorschrift wie hier ausgehend von Alkohol 10 beschrieben erhalten könnte.
5) Silylierung der ungesättigten Vorläufer (4).
Der Ester 9 (150 mg; 0,33 mmol) wird unter Inertatmosphäre in einen Schlenkkolben gegeben. Man gibt frisch destilliertes Trichlorsilan (0,3 ml; 2,2 mmol; 6 Äq.), wasserfreies Toluol (0,3 ml) sowie einen Tropfen Kärsted-Katalysator (PCO 72), vertrieben von ABCR (Referenz 68478-92-2) hinzu. Dann wird das Reaktionsmedium 2 h auf 40°C gebracht. Nach Rückkehr auf Raumtemperatur werden Toluol und überschüssiges Trichlorsilan unter reduziertem Druck mittels einer Drehschieberpumpe (Druck 0,5 mm Hg) abgedampft. Verbindung 14 wird in Form eines weißen Feststoffs erhalten und unter Argon aufbewahrt (Ausbeute 99%). Es handelt sich um eine wie oben definierte siliciumorganische Verbindung der Formel (I), in der X₁, X₂ und X₃ Chloratome darstellen, n gleich 22 ist, m gleich 1 ist, i gleich 0 ist, k gleich 1 ist und B eine -COCH₃-Gruppe darstellt. Die Analyse von Verbindung 14 mit Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)) : 4,25–4,15 (m; 2H); 3,60–3,50 (t; 2H); 3,45–3,35 (t; 2H); 2,2–1,9 (s; 3H) und 1,7–1,0 (m; 42H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,0; 71,5; 68,5; 63,7; 31,9–22,3 (21 CH₂); 21,0.
Ausgehend von der oben erhaltenen Verbindung 11 und nach der gleichen Vorschrift erhält man die entsprechende siliciumorganische Verbindung 15. Es handelt sich um eine siliciumorganische Verbindung der Formel (I), in der X₁, X₂ und X₃ Chloratome darstellen, n gleich 22 ist, m gleich 1 ist, i gleich 0 ist, k gleich 3 ist und B eine Gruppe -COCH₃ darstellt. Ihre Analyse mit Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 4,3–4,2 (t; 2H); 3,7–3,4 (m; 10H); 3,4–3,3 (t; 2H); 2,2–1,9 (s; 3H) und 1,7–0,9 (m; 42H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,2; 71,6–68,1 (6 CH₂); 63,6; 31,9–22,3 (21 CH₂); 21,0.
Ausgehend von der oben erhaltenen Verbindung 13 und nach derselben Vorschrift erhält man die entsprechende siliciumorganische Verbindung 16. Es handelt sich um eine Verbindung der Formel (I), in der X₁, X₂ und X₃ Chloratome darstellen, n gleich 22 ist, m gleich 1 ist, i gleich 1 ist, k gleich 2 ist und B eine Gruppe -COOCH₃ darstellt. Ihre Analyse mit Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 4,1–4,0 (s; 2H); 3,6–3,3 (m; 13H); 1,7–0,9 (m; 42H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,0; 71,6–63,8 (6 CH₂); 51,7; 31,9–22,3 (21 CH₂).
Die nachfolgende Tabelle I fasst die Struktur der in dem vorliegenden Beispiel erhaltenen siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I) kurz zusammen.
TABELLE I
BEISPIEL 2: Synthese von siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I), worin m = 0.
1) Synthese ungesättigter Vorläufer (5).
1-1: Ungesättigte Vorläufer, die eine Gruppe -OCOCH₃ tragen
• Verbindung 17
Der in Beispiel 1 erhaltene ungesättigte Alkohol 5 (0,9 g; 2,7 mmol) wird in einem 100-ml-Zweihalsrundkolben in Dichlormethan (10 ml) und Triethylamin (0,6 ml; 5,4 mmol; 2 Äq.) suspendiert. Das Reaktionsmedium wird auf 0°C abgekühlt und dann wird mit einer Spritze Acetylchlorid (0,5 ml; 4 mmol; 1,5 Äq.) zugetropft. Das Reaktionsmedium wird 15 Minuten bei 0°C und dann 1 h 30 bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Reaktionsmedium hydrolysiert und dann dreimal mit Diethylether extrahiert. Die Etherphasen werden vereinigt und dann mit einer 10%igen Salzsäurelösung, mit Wasser und dann mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung gewaschen. Anschließend wird die Etherphase bis zur Neutralität gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Verbindung 17 wird in Form eines weißen Feststoffs erhalten (0,9 g; Ausbeute 100%). Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3079; 2919; 2850; 1740; 1641.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 5,9–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 4,1–3,9 (t; 2H); 2,2–1,9 (m; 5H) und 1,7–1,0 (m; 36H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,1; 139,3; 114,0; 64,7; 33,6–25,8 (19 CH₂); 21,0.
• Verbindung 18
Nach derselben Vorschrift wie zur Herstellung von Verbindung 17, aber ausgehend von einem ungesättigten Alkohol mit 16 Kohlenstoffatomen, erhält man Verbindung 18, deren Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR wie folgt ist:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3080; 2923; 2853; 1742; 1643.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 5,9–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 4,1–4,0 (t; 2H); 2,1–1,9 (m; 5H) und 1,7–1,1 (m; 24H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,1; 139,3; 114,0; 64,8; 33,6–25,8 (13 CH₂); 21,2.
• Verbindung 19
Nach derselben Vorschrift wie zur Herstellung von Verbindung 17, aber ausgehend von einem ungesättigten Alkohol mit 27 Kohlenstoffatomen, erhält man Verbindung 19, deren Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR wie folgt ist:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3080; 2923; 2853; 1742; 1643.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 5,9–5,7 (m; 1H); 5,1–4,7 (m; 2H); 4,1–4,0 (t; 2H); 2,1–1,9 (m; 5H) und 1,7–1,1 (m; 46H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,1; 139,3; 114,0; 64,8; 33,6–25,8 (24 CH₂); 21,1.
1-2: Bromierte ungesättigte Vorläufer
Ausgehend von ungesättigten bromierten Derivaten der Formel CH₂=CH-(CH₂)_xBr, wobei x zwischen 3 und 23 ist, und nach der in Beispiel 1 angegebenen Vorschrift zur Herstellung von Verbindung 2 werden Organomagnesiumverbindungen der Formel CH₂=CH-(CH₂)_xMgBr erhalten. Ihre Kupplung mit einem dibromierten Derivat Br(CH₂)_yBr (wobei x + y wenigstens 13 und höchstens 33 ist) unter den gleichen Bedingungen wie denen der in Beispiel 1 beschriebenen Kupplung mit einem Bromalkohol zur Herstellung von Verbindung 5 führt zu den ungesättigten bromierten Derivaten der Formeln 20, 21 und 22.
Verbindung 20 wird mit einem ungesättigten bromierten Derivat, in dem x gleich 9 ist, und einem dibromierten Derivat, in dem y gleich 10 ist, erhalten. Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3078; 2922; 2852; 1640.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 5,9–5,7 (m; 1H); 5,1–4,9 (m; 2H); 3,5 (t, 2H); 2,2–1,8 (m; 4H) und 1,6–1,2 (m; 32H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 139,2; 114,1; 33,9–25,7 (19 CH₂).
Verbindung 21 wird mit einem ungesättigten bromierten Derivat, in dem x gleich 14 ist, und einem dibromierten Derivat, in dem y gleich 10 ist, erhalten. Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3080; 2920; 2851; 1642.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 6,0–5,7 (m; 1H); 5,1–4,9 (m; 2H); 3,5 (t, 2H); 2,2–1,8 (m; 4H) und 1,6–1,2 (m; 42H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 138,8; 113,8; 33,9–25,7 (24 CH₂).
Verbindung 22 wird mit einem ungesättigten bromierten Derivat, in dem x gleich 9 ist, und einem dibromierten Derivat, in dem y gleich 5 ist, erhalten. Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3078; 2925; 2854; 1641.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 5,9–5,7 (m; 1H); 5,1–4,9 (m; 2H); 3,5 (t, 2H); 2,2–1,8 (m; 4H) und 1,6–1,2 (m; 22H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 139,2; 114,1; 33,9–25,7 (14 CH₂).
1-3: Ungesättigte Vorläufer, die eine Carbonsäuregruppe -COOH tragen
Der in Beispiel 1 erhaltene ungesättigte Alkohol 5 (13 g; 40 mmol) wird in einem 250-ml-Dreihalsrundkolben in 40 ml Aceton suspendiert. Zu dieser Suspension werden 80 ml Jones-Reagens (2 M) gegeben. Die Suspension wird 2 h zum Rückfluss gebracht. Nach Rückkehr auf Raumtemperatur wird das Aceton abgedampft, der Feststoff filtriert und dann fünfmal mit Wasser und dreimal mit auf 0°C gekühltem Aceton gespült. Anschließend wird der Feststoff durch Umkristallisieren aus einer Mischung aus THF/Aceton (v/v: 9/1) gereinigt, was Verbindung 23 in Form eines weißen Feststoffs liefert (9,9 g; Schmelzpunkt 73–74°C); Ausbeute 94%). Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3370; 3080; 2917; 2849; 1707; 1643.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 11,2 (verbreitertes s; 1H); 6,0–5,7 (m; 1H); 5,1–4,9 (m; 2H); 2,4 (t, 2H); 2,2–2,0 (m; 2H) und 1,9–1,1 (m; 34H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 172,0; 139,3; 113,8; 33,6–25,8 (19 CH₂).
1-4: Ungesättigte Vorläufer, die eine Methylestergruppe -COOCH₃ tragen
Die oben erhaltene Säure 23 (4 g; 11,8 mmol) wird in einem 100-ml-Dreihalsrundkolben in wasserfreiem Toluol (20 ml) unter Inertatmosphäre bei 0°C solubilisiert. Es wird Oxalylchlorid (2 g; 17,6 mmol; 1,5 Äq.) zugetropft und dann wird die Mischung bei Raumtemperatur 2 h gerührt. Anschließend werden überschüssiges Reagens und Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft. Das Acylchlorid wird vorübergehend unter Argon aufbewahrt. Man gibt langsam Methanol (10 ml; 236 mmol, 20 Äq.) zu, das zuvor über Calciumchlorid destilliert worden war. Anschließend wird das Reaktionsmedium 18 h zum Rückfluss gebracht. Nach Rückkehr der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur wird das überschüssige Methanol abgedampft. Dann wird das Reaktionsmedium dreimal mit Diethylether extrahiert. Die Etherphasen werden vereinigt und mit einer 10%igen Salzsäurelösung, mit Wasser und mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung gewaschen. Anschließend wird die Etherphase bis zur Neutralität gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Verbindung 24 wird in Form eines weißen Feststoffs erhalten (4 g; Schmelzpunkt 50–51,5°C; Ausbeute 100%). Ihre Analyse mit Infrarot und Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR ist wie folgt:
IR (Dispersion in KBr) ν (cm^–1): 3080; 2917; 2849; 1743; 1643.
¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 6,0–5,7 (m; 1H); 5,1–4,9 (m; 2H); 3,6 (t, 3H); 2,4–2,3 (t; 2H); 2,2–2,0 (m; 2H) und 1,9–1,1 (m; 34H).
¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 172,3; 139,3; 114,0; 51,5; 33,6–25,8 (19 CH₂).
2) Silylierung der ungesättigten Vorläufer.
Es wird nach der gleichen Vorgehensweise wie in Beispiel 1 angegeben verfahren. Die ausgehend von den ungesättigten Vorläuferverbindungen 17, 18 und 19 erhaltenen Protonen- und Kohlenstoff-13-NMR-Spektren der siliciumorganischen Verbindungen sind wie folgt:

– ausgehend von Vorläuferverbindung 17: ¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)) : 4,1–3,9 (t, 2H); 2,1 (s; 3H); 1,7–0,9 (m; 42H). ¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,2; 64,7; 31,9–22,3 (21 CH₂); 21,0.
– ausgehend von Vorläuferverbindung 18: ¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 4,1–3,9 (t, 2H); 2,1 (s; 3H); 1,7–0,9 (m; 30H). ¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,2; 64,7; 31,9–22,3 (15 CH₂); 21, 0.
– ausgehend von Vorläuferverbindung 19: ¹H-NMR (CDCl₃; δ (ppm)) : 4,1–3,9 (t, 2H); 2,1 (s; 3H); 1,7–0,9 (m; 52H). ¹³C-NMR (CDCl₃; δ (ppm)): 171,2; 64,7; 31,9–22,3 (26 CH₂); 21,0.

Die nachfolgende Tabelle II fasst die Struktur der in dem vorliegenden Beispiel erhaltenen siliciumorganischen Verbindungen der Formel I kurz zusammen.
Tabelle II
BEISPIEL 3: Silanisierung eines festen Trägers mit einer siliciumorganischen Verbindung der Formel (I) und Herstellung einer selbstorganisierten Monoschicht.
1) Silanisierung des festen Trägers.
Als Substrat wird eine oberflächenoxidierte Siliciumscheibe verwendet. Die Scheibe wird nach dem folgenden Verfahren gesäubert, um Verunreinigungen von ihrer Oberfläche zu beseitigen und sie zu hydratisieren:

– Eintauchen in eine frisch hergestellte Chromschwefelsäuremischung (2,5 g K₂Cr₂O₄; 2,5 ml destilliertes Wasser; 50 ml Schwefelsäure) für 10 Minuten.
– Unter einem mit Staubfiltern ausgerüsteten Abzug mit Laminarströmung wird die Scheibe in deionisiertes Wasser getaucht und 20 Minuten einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Dieser Prozess wird zweimal mit 5 bzw. 2 Minuten Beschallung wiederholt.
– Unter einem mit Staubfiltern ausgerüsteten Abzug mit Laminarströmung wird die Scheibe unter inerter und filtrierter Atmosphäre zum Trocknen in den Silanisierungsreaktor gebracht. Der Reaktor wird 45 Minuten bei 100°C in ein Ölbad getaucht und dann aus dem Ölbad genommen und seine Temperatur wieder auf 18°C zurückgeführt.

Die in Beispiel 1 erhaltene und in der gewünschten Menge frisch hergestellte siliciumorganische Verbindung 14 wird unter Inertatmosphäre in einem kleinen Teil einer Mischung aus C₆H₁₂/CCl₄/CHCl₃ (v/v/v: 80/12/8) solubilisiert. Anschließend wird die siliciumorganische Verbindung 14 in Lösung mit einer Spritze entnommen und dann in einen Schlenkkolben gegeben, der den Rest der Lösungsmittelmischung enthält, dessen Gesamtvolumen so berechnet wurde, dass man eine Silanisierungsmischung mit einer geeigneten Verdünnung erhält (zwischen 1 × 10^–5 und 1 × 10^–2 Mol/Liter). Die Lösungsmittel wurden zuvor nach an sich bekannten Methoden getrocknet.
Die Lösung zum Silanisieren wird mit einer Spritze in den Reaktor gegeben und die Siliciumscheibe bleibt 16 h in diese Lösung eingetaucht. Die silanisierte Scheibe wird aus dem Reaktor genommen und nach Waschen mit Chloroform ("HPLC-Reinheit") gegebenenfalls bei einer Temperatur zwischen 50 und 120°C getempert. Anschließend wird sie 2 Minuten unter Ultraschall gereinigt, wobei dieser Prozess zweimal wiederholt wird.
2) Charakterisierung der modifizierten Oberfläche.
Oben wurde ein fester Träger erhalten, dessen Oberfläche mit der Verbindung 14 modifiziert ist. Die Kontrolle des Aufpfropfens der siliciumorganischen Verbindungen erfolgt mittels Infrarotspektroskopie und konfokaler Raman-Spektroskopie.
3) Freisetzung der Oberflächenhydroxylgruppen.
Falls erforderlich, können die Hydroxylgruppen der Oberfläche nach der folgenden Verfahrensvorschrift freigesetzt werden: Die silanisierte Scheibe wird 20 Minuten in eine KOH-Lösung (0,5 M) in einer Mischung aus Wasser/Ethanol (v/v: 1/1) eingetaucht. Anschließend wird die Scheibe 5 Minuten mit Ultraschall in demineralisiertem Wasser gesäubert. Dieser Prozess wird einmal in Wasser und dann zweimal in Chloroform wiederholt.
4) Charakterisierung der Oberfläche nach Freisetzung der Hydroxylgruppen.
6 zeigt Infrarotspektren, die nach drei Versuchen des Aufpfropfens der Verbindung 14 auf den Träger nach der oben erläuterten Silanisierungsvorschrift und nach Verseifen der Ester auf der Oberfläche erhalten wurden. Die Durchlässigkeit ist auf der Ordinate und die Frequenz (cm^–1) auf der Abszisse angegeben. Man stellt fest, dass sich die drei Spektren mit Peaks bei 2917 und 2850 cm^–1, die für ein organisiertes System charakteristisch sind, überlagern. Daraus lässt sich also schließen, dass das Aufpfropfen der siliciumorganischen Verbindung auf den Träger reproduzierbar ist und zur Bildung einer selbstorganisierten Monoschicht führt.
7 zeigt Untersuchungen der oben erhaltenen modifizierten Oberfläche mittels Raman-Spektroskopie. 7a ist für die Dichte der Oberfläche des gepfropften Substrats repräsentativ, wobei die Dimensionen der Oberfläche auf Abszisse und Ordinate angegeben sind (7 mm der Figur entsprechen 1 μm des Substrats) und die Dichteskala von 140 bis 165 eingeteilt ist (willkürliche Einheiten). Diese Figur zeigt die Homogenität der Oberfläche. Die 7b und 7c stellen Raman-Spektren dar, die an zwei verschiedenen Punkten der Oberfläche des Substrats aufgenommen wurden; die Ordinate zeigt die Impulse pro Sekunde und die Frequenz ist auf der Abszisse angegeben.
Die Infrarot- und Raman-Spektren zeigen also eindeutig die Homogenität des auf dem Substrat abgeschiedenen Films sowie die Organisation der Moleküle auf der Oberfläche, die für eine selbstorganisierte Monoschicht charakteristisch ist. Das Infrarotspektrum zeigt ferner, dass das Aufpfropfen des Films vollständig reproduzierbar ist.
BEISPIEL 4: Weiteres Beispiel für die Silanisierung eines festen Trägers mit einer siliciumorganischen Verbindung der Formel (I).
Als Substrat wird ein Mikroskopträger aus Glas verwendet. Der Glasträger wird durch 2 h Eintauchen bei 20°C in eine 2%ige wässrige Hellmanex^®-Lösung (vertrieben von Polylabo unter der Referenz 12240) und anschließendes gründliches Spülen mit deionisiertem Wasser gesäubert. Der Glasträger wird zum Trocknen unter inerter und filtrierter Atmosphäre unter einem mit Staubfiltern ausgerüsteten Abzug mit Laminarströmung in den Pfropfreaktor gebracht. Der Reaktor wird 45 Minuten bei 100°C in ein Ölbad getaucht und dann aus dem Ölbad genommen und seine Temperatur auf 18°C zurückgeführt.
Die mit der siliciumorganischen Verbindung 14 wie in dem vorhergehenden Beispiel angegeben hergestellte Lösung zum Silanisieren wird mit einer Spritze in den Reaktor eingebracht, und der Reaktor und der Glasträger bleiben 16 h in diese Lösung eingetaucht. Das Spülen des silanisierten Substrats erfolgt wie in Beispiel 3 beschrieben.
Die Charakterisierung der Oberfläche durch Infrarot- und Raman-Spektroskopie zeigt hier wiederum die Bildung einer selbstorganisierten Monoschicht auf dem Substrat, wobei auch mit anderen siliciumorganischen Agenzien der Formel (I) als der Verbindung 14 die gleichen Ergebnisse erhalten werden.
BEISPIEL 5: Direkte Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger, der durch eine selbstorganisierte Monoschicht aus siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I) modifiziert ist.
1) Herstellung des durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifizierten festen Trägers.
Der verwendete feste Träger ist ein Substrat aus Siliciumoxid (Si/SiO₂), auf dem gemäß der in Beispiel 3 angegebenen Vorschrift eine selbstorganisierte Monoschicht gebildet wurde, die die siliciumorganische Verbindung 14 umfasst. Man könnte auch irgendeine andere siliciumorganische Verbindung der Formel (I) sowie jede Mischung von siliciumorganischen Verbindungen, die wenigstens eine siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfassen, verwenden.
Die auf den Träger aufgepfropften Enden der siliciumorganischen Verbindungen werden durch Eintauchen des Substrats in eine KOH-Lösung wie in Beispiel 3 angegeben in Hydroxylgruppen überführt. Auf diese Weise erhält man ein Substrat, das Hydroxyfunktionen auf der Oberfläche trägt. Dieses Substrat wird in Acetonitril gesäubert und 1 Minute ultraschallbehandelt, bevor es in die Synthesekammer gegeben wird.
2) Synthese von Nucleinsäuren auf diesem Träger.
Es wird hier die Phosphoramiditchemie verwendet, mit dem Wissen, dass andere dem Fachmann bekannte chemische Methoden wie die H-Phosphonatchemie ebenfalls verwendet werden könnten. Die Nucleotide werden daher in Form von β-Cyanoethylphosphoramiditen eingesetzt, wobei die Amine der verschiedenen Stickstoffbasen geschützt sind, beispielsweise, ohne dass dies einschränkend wäre, durch Benzoyl-, Isobutyryl- oder Tertiobutylphenoxyessigsäuregruppen. Die Nucleotide sind in 5'-Stellung durch eine Dimethoxytritylgruppe geschützt; ebensogut könnten jedoch auch photolabile Gruppen verwendet werden (wie MeNPOC, beschrieben bei PEASE et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022–5026), die durch UV-Bestrahlung abgespalten werden könnten.
Die Synthese von Nucleinsäuren erfolgt bei der eingesetzten Phosphoramiditchemie in 3'→5'-Richtung. Die verschiedenen Pfropfschritte eines Nucleotids sind wie folgt, wobei die Gesamtheit dieser Schritte einen Zyklus darstellt:

1. Detritylierung (25 Sekunden): 3% Trichloressigsäure in Dichlormethan;
2. Waschen: wasserfreies Acetonitril;
3. Kupplung (1 Minute): Einbringen einer Mischung von 0,1 M Amidit und 0,45 M eines Aktivators (Tetrazol);
4. Capping (15 Sekunden): Einbringen einer Mischung aus (i) Essigsäureanhydrid/2,6-Lutidin/Acetonitril (10 ml/10 ml/80 ml) und (ii) 10% 1-Methylimidazol in Dimethylformamid (10 ml/90 ml);
5. Oxidation (15 Sekunden): Einbringen einer Mischung aus Iod/Pyridin/Tetrahydrofuran/Wasser (0,508 mg/1,6 ml/15,2 ml/3,2 ml);
6. Capping (15 Sekunden).

Es versteht sich von selbst, dass die Lösungen zur Detritylierung, zum Waschen, zur Kupplung, zum Capping und zur Oxidation in dem oben angegebenen Zyklus keine Beschränkung darstellen.
Abhängig von der Länge der Nucleinsäure, die man herstellen möchte, können so viele Zyklen wie gewünscht durchgeführt werden. Sobald die endgültige Anzahl von Zyklen erreicht wurde, werden die Stickstoffbasen entschützt und die Nucleinsäure wird durch eine Behandlung mit 30–33%igem Ammoniak über Nacht bei Raumtemperatur entschützt, um die Schutzgruppen, die über das Grundgerüst und die Stickstoffbasen verteilt sind, abzuspalten. Wenn ein ammoniaklabiler Spacer-Arm zwischen einen Teil der Nucleinsäuren und die silanisierte Oberfläche eingebracht wurde, wird diese Fraktion der Nucleinsäuren vom Träger abgespalten.
Abhängig von der Art der verwendeten Schutzgruppen können auch andere Behandlungen zum Entschützen verwendet werden, beispielsweise mit Kaliumcarbonat.
Das Substrat wird mit Wasser und dann mit TRIS-Puffer gewaschen (Lösung von 10 mM TRIS-HCl, die durch Zugabe einer 10-mM-Lösung von TRIS-Base auf pH 7,1 eingestellt wurde, wobei die fertige Lösung eine NaCl-Konzentration von 50 mM aufweist), bevor es zur Hybridisierung verwendet werden kann.
BEISPIEL 6: Hybrisierungsversuche mit Oligonucleotiden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren direkt auf einem festen Träger synthetisiert wurden.
Es wird ein mit einer selbstorganisierten Monoschicht modifizierter fester Träger verwendet, wie er in Beispiel 5 beschrieben ist (Siliciumoxid Si/SiO₂, auf dem eine Monoschicht aus siliciumorganischen Verbindungen 14 gebildet ist, wobei die Oberflächenfunktionen in Hydroxylgruppen überführt wurden). Auf diesen Träger wird vor der Oligonucleotidsynthese ein Spacer-Arm aus 10 Nucleotiden T aufgepfropft.
An vier Punkten dieses Trägers werden, wie in 8a dargestellt, Oligonucleotide mit der Bezeichnung L185 und U226 (Sequenz mit 25 Nucleotiden) synthetisiert. Die 8b und 8c geben auf einer Skala von 0 bis 10 für 8b (die als Skala für die 8d, 8f und 8h dient) und auf einer Skala von 0 bis 1,5 für 8c (die als Skala für die 8e, 8g und 8i dient) die auf dem Träger gefundenen Fluoreszenzintensitäten an.
8d stellt die nachgewiesene Fluoreszenzintensität dar, nachdem der Träger mit einem zu L185 komplementären Oligonucleotid, das Fluoreszenzmarker enthält, in Kontakt gebracht und gewaschen wurde. Die Hybridisierung erfolgt bei 46°C über Nacht in Gegenwart eines TRIS-Puffers, pH 7,1, der 50 mM NaCl enthält. Die Konzentration von Oligonucleotid L185 in TRIS ist 0,01 mg/ml. Jeder zu L185 komplementäre Strang trägt am 5'-Ende eine fluoreszierende Cy3-Gruppe. Man beobachtet deutlich eine Hybridisierung der komplementären Sequenz mit der Sequenz L185. 8e entspricht dem Träger nach Denaturierung: Die komplementäre Sequenz wird nicht mehr nachgewiesen.
8f zeigt die nachgewiesene Fluoreszenzintensität, nachdem der Träger mit einer Lösung eines zu U226 komplementären Oligonucleotids, das Fluoreszenzmarker enthält, in Kontakt gebracht und der Träger unter den gleichen Bedingungen wie oben für Strang L185 angegeben gewaschen wurde. Auch hier wird wieder eine Hybridisierung der komplementären Sequenz mit der Sequenz U226 beobachtet. 8g entspricht dem Träger nach Denaturierung: Die komplementäre Sequenz wird nicht mehr nachgewiesen.
8h zeigt die nachgewiesene Fluoreszenzintensität, nachdem der Träger erneut mit einer Lösung eines zu L185 komplementären Oligonucleotids, das Fluoreszenzmarker enthält, in Kontakt gebracht und der Träger gewaschen wurde. Es erfolgt wieder eine Hybridisierung der komplementären Sequenz mit der Sequenz L185. 8i zeigt das Fehlen der komplementären Sequenz nach Denaturierung.
Diese Versuche zeigen, dass Nucleinsäuren, die direkt auf einem festen, durch eine selbstorganisierte Monoschicht aus siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I) modifizierten Träger synthetisiert wurden, wobei die Synthese nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt, zu selektiven Hybridisierungsreaktionen mit komplementären Sequenzen führen können, wobei der Träger in mehreren aufeinanderfolgende Zyklen von Hybridisierung und Denaturierung wiederverwendet werden kann.
BEISPIEL 7: Immobilisierung von vorsynthetisierten Nucleinsäuren auf einem festen Träger, der durch eine selbstorganisierte Monoschicht aus siliciumorganischen Verbindungen der Formel (I) modifiziert ist.
1) Herstellung des durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifizierten festen Trägers.
Es wird wie in Beispiel 5 vorgegangen, mit dem Unterschied, dass die selbstorganisierte Monoschicht die nach der in Beispiel 1 angegebenen Vorschrift hergestellte siliciumorganische Verbindung der Formel 16 enthält. Es versteht sich von selbst, dass auch jede andere siliciumorganische Verbindung der Formel (I) verwendet werden könnte (oder eine Mischung aus siliciumorganischen Verbindungen, die wenigstens eine siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst), wobei die Verbindung der Formel (I) eine geschützte Carbonsäurefunktion trägt. Die Enden der siliciumorganischen Verbindungen werden durch Hydrolyse der Ester (beispielsweise unter Einwirkung von Triiodmethylsilan oder konzentrierter Salzsäure) in Carbonsäuregruppen überführt.
2) Immobilisierung von Nucleinsäuren auf dem Träger.
Die Carbonsäurefunktionen des Trägers werden durch eine N-Hydroxysuccinimidlösung aktiviert. Der so aktivierte Träger wird mit einer Lösung der zu immobilisierenden Nucleinsäure in Kontakt gebracht (1 μg/μl in einer Mischung aus Acetonitril/Wasser im Volumenverhältnis von 9/1 in Gegenwart von Triethylamin), wobei diese Nucleinsäure einen Spacer-Arm trägt, der mit einer Aminfunktion funktionalisiert ist. Die Umsetzung erfolgt bei Raumtemperatur, gegebenenfalls bis zum Trocknen der Lösung. Anschließend wird der Träger mit einem TRIS-Puffer, pH 7,1, gewaschen. Diese Vorgehensweise ermöglicht die Blockie rung von Säurefunktionen, die bei der Umsetzung mit einem Amin nicht reagiert haben (Capping-Reaktion).

Claims

Verwendung, zur Synthese oder Immobilisierung von Nucleinsäuren, eines festen Trägers, der durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifiziert ist, die wenigstens eine siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst:
wobei n zwischen 15 und 35 liegt, m gleich 0 oder 1 ist, X₁, X₂ und X₃, die gleich oder voneinander verschieden sein können, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus unverzweigten oder verzweigten gesättigten C₁-C₆-Alkylgruppen und hydrolysierbaren Gruppen, wobei wenigstens eines von X₁, X₂ oder X₃ eine hydrolysierbare Gruppe darstellt, A die Gruppe -O-(CH₂-CH₂-O)_k-(CH₂)_i- darstellt, worin k zwischen 0 und 100 liegt und i eine ganze Zahl höher oder gleich 0 ist, falls m = 0, B eine Gruppe -OCOR, -OR, -COOR oder ein Halogenatom darstellt, wobei R ein Wasserstoffatom oder eine unverzweigte oder verzweigte C₁-C₆-Alkylgruppe darstellt, falls m = 1: wenn k = 0 und i = 0, B eine Gruppe R₁ darstellt, wenn k = 1 und i ≥ 1, B eine Gruppe -OR₁, -OCOR₁, -NR₁R₂, -COOR₁, -CONR₁R₂, -SR₁ oder ein Halogenatom darstellt, wenn k ≥ 1 und i = 0, B eine Gruppe -R₁, -COR₁, -COOR₁ oder -CONR₁R₂ darstellt, wenn k ≥ 1 und i ≥ 1, B eine Gruppe -OR₁, -OCOR₁, -NR₁R₂, -COOR₁, -CONR₁R₂, -SR₁ oder ein Halogenatom darstellt, R₁ und R₂, die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom, eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte und unverzweigte oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen oder eine aromatische Gruppe darstellen.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass n zwischen 20 und 25 liegt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass k zwischen 0 und 5 liegt.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glasmaterialien, Keramikmaterialien, Metallen und Metalloiden.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrolysierbare Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Halogenatomen, der Gruppe -N(CH₃)₂ und der Gruppe -OR', wobei R' eine unverzweigte oder verzweigte gesättigte C₁-C₆-Alkylgruppe ist.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass X₁, X₂ und X₃ Chloratome darstellen, n gleich 22 ist, m gleich 1 ist, i gleich 0 ist, k gleich 1 oder 3 ist und B eine Gruppe -COCH₃ darstellt.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass X₁, X₂ und X₃ Chloratome darstellen, n gleich 22 ist, m gleich 1 ist, i gleich 1 ist, k gleich 2 ist und B eine Gruppe -COOCH₃ darstellt.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass X₁, X₂ und X₃ Chloratome darstellen, n gleich 16, 22 oder 27 ist, m gleich 0 ist und B eine Gruppe -OCOCH₃ darstellt.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass X₁, X₂ und X₃ Chloratome darstellen, n gleich 21 ist, m gleich 0 ist und B eine Gruppe -COOCH₃ darstellt.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung von DNA-Chips.
Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifiziert ist, die wenigstens eine siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 definiert ist, und dadurch, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellung eines festen Trägers, der durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifiziert ist, die wenigstens eine siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 definiert ist, wobei die siliciumorganischen Verbindungen an ihrem Ende eine geschützte Hydroxy- oder Aminfunktion aufweisen; b) gegebenenfalls Entschützen der Hydroxy- oder Aminfunktion; c) lokalisierte kovalente Kupplung eines Nucleotids an den in den Schritten a) oder b) erhaltenen modifizierten festen Träger; d) wenigstens einmaliges Wiederholen von Schritt c) mit gleichen oder anderen Nucleotiden.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt a) mit den folgenden Schritten durchgeführt wird: i) Eliminierung der Verunreinigungen von dem festen Träger und Hydratation und/oder Hydroxylierung seiner Oberfläche, j) Einbringen in eine Mischung aus wenigstens zwei Lösungsmitteln, die wenigstens ein unpolares Lösungsmittel auf Kohlenwasserstoffbasis umfassen, unter Inertatmosphäre, einer siliciumorganischen Verbindung der allgemeinen Formel (I), wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 definiert ist, wobei die Verbindung an einem Ende eine geschützte Hydroxy- oder Aminfunktion aufweist, k) Silanisierung des in Schritt i) erhaltenen Trägers durch Eintauchen in die in Schritt j) hergestellte Lösung, l) gegebenenfalls Tempern des in Schritt k) erhaltenen silanisierten Trägers, der die selbstorganisierte Monoschicht trägt, bei einer Temperatur zwischen 50 und 120°C für eine Dauer von 5 Minuten bis zu einer Nacht, und m) Spülen des in Schritt k) oder l) erhaltenen modifizierten Trägers mit einem Lösungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt a) oder b) und vor Schritt c) ein Schritt des Aufpfropfens von Spacer-Armen, die endständige Hydroxy- oder Aminfunktionen tragen, an das Ende der siliciumorganischen Verbindungen durchgeführt wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt c) gekuppelten Nucleotide geschützt sind, und dadurch, dass auf Schritt d) ein Schritt zum Entschützen der synthetisierten Nucleinsäure folgt.
Verfahren zur Immobilisierung von Nucleinsäuren auf einem festen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifiziert ist, die wenigstens eine siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 definiert ist, und dadurch, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellung eines festen Trägers, der durch eine selbstorganisierte Monoschicht modifiziert ist, die wenigstens eine siliciumorganische Verbindung der Formel (I) umfasst, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 definiert ist, wobei die siliciumorganischen Verbindungen an ihrem Ende eine geschützte Carbonsäure- oder Aminfunktion aufweisen; b) gegebenenfalls Entschützen der Carbonsäure- oder Aminfunktion; c) gegebenenfalls, wenn der modifizierte feste Träger endständige Carbonsäurefunktionen trägt, Aktivierung dieser Funktionen; d) In-Kontakt-Bringen des in Schritt a), b) oder c) erhaltenen modifizierten festen Trägers mit ein oder mehreren Lösungen, lokal aufgebracht, der zu immobilisierenden Nucleinsäure(n) in ein oder mehreren polaren Lösungsmitteln, wobei die Nucleinsäuren an einem ihrer Enden einen Spacer-Arm tragen, der entweder mit einer Aminfunktion funktionalisiert ist, wenn der modifizierte feste Träger gegebenenfalls geschützte endständige Carbonsäurefunktionen trägt, oder mit einer aktivierten Carbonsäurefunktion, wenn der modifizierte feste Träger gegebenenfalls geschützte endständige Aminfunktionen trägt; und e) Waschen des festen Trägers, auf dem die Nucleinsäuren immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt a) mit den folgenden Schritten durchgeführt wird: i) Eliminierung der Verunreinigungen von dem festen Träger und Hydratation und/oder Hydroxylierung seiner Oberfläche, j) Einbringen in eine Mischung aus wenigstens zwei Lösungsmitteln, die wenigstens ein unpolares Lösungsmittel auf Kohlenwasserstoffbasis umfassen, unter Inertatmosphäre, einer siliciumorganischen Verbindung der allgemeinen Formel (I), wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 definiert ist, wobei die Verbindung an einem Ende eine geschützte Carbonsäure- oder Aminfunktion aufweist, k) Silanisierung des in Schritt i) erhaltenen Trägers durch Eintauchen in die in Schritt j) hergestellte Lösung, und l) gegebenenfalls Tempern des in Schritt k) erhaltenen silanisierten Trägers, der die selbstorganisierte Monoschicht trägt, bei einer Temperatur zwischen 50 und 120°C für eine Dauer von 5 Minuten bis zu einer Nacht, und m) Spülen des in Schritt k) oder l) erhaltenen modifizierten Trägers mit einem Lösungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt a) oder b) und vor Schritt c) ein Schritt des Aufpfropfens von Spacer-Armen, die endständige Carbonsäure- oder Aminfunktionen tragen, an das Ende der siliciumorganischen Verbindungen durchgeführt wird.
DNA-Chip, dadurch gekennzeichnet, dass er nach dem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17 erhalten wird, wobei die Nucleinsäuren DNAs sind.