JP2003520350A - シラン化固体支持体上で核酸を合成および固定化するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、１ないし数個のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層によって修飾された固体支持体の、核酸を合成または固定化するための、使用に関する。本発明はまた、このようなシラン化固体支持体上で核酸を合成または固定化するための方法、および該方法によって得られるＤＮＡチップに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、１以上のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層（organize
d self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の、核酸を合成または固
定化するための使用、およびまた固体支持体上で核酸を合成または固定化するた
めの方法に関する。

【０００２】 無機表面上で化学合成を行うかまたは分子を固定化するために、第一に、無機
支持体への有機分子の結合を提供するカップリング剤を表面上へグラフトするこ
とが必要である。

【０００３】 オルガノシリコンカップリング剤が、この目的のために、L.A. CHRISEYら（Nu
cleic Acids Research, 1996, 24, 15, 3031-3039）および U. MASKOSら（Nucle
ic Acids Research, 1992, 20, 7; 1679-1684））によって提案されている。し
かし、使用される薬剤、すなわち３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン
および種々のアミノシランは、それらが表面上にランダムにそして非再現的に（
nonreproducibly）堆積するという欠点を有する。それらはその上に厚みが制御
され得ない不均一な膜を形成し、この膜はまた引き続いての化学処理に対して余
り耐久性がなく、膜の不均一性は、実際に、シロキサン結合の乏しい保護を意味
する。従って、これらの分子の再現可能なグラフトを得ることは非常に困難であ
る。支持体上にオリゴヌクレオチドを結合または合成する前に、更なる表面反応
が、表面での立体障害を減少させるため（例えば、L.A. CHRISEYらによって記載
されるように、二官能性ヘテロ環式分子をグラフトすること）、表面をより親水
性にするため（U. MASKOSらは、エチレングリコールまたはペンタ−もしくはヘ
キサエチレングリコールをグラフトすることを記載する）、および／または表面
官能基の乏しい反応性を克服するために必要であり、これらはまたそれら自体で
制御されない更なる操作である。

【０００４】 A. ULMANは、Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554において、官能化アルキルト
リクロロシランタイプのオルガノシリコン化合物を使用する、固体支持体上での
組織化自己集合単層の形成を記載した。生体分子を結合させるためのその使用が
提案され、これは、この文脈で、チオール官能基での生体分子の修飾およびヘテ
ロ二官能分子での表面の修飾を恐らく必要とする方法である。

【０００５】 従って、本発明者らは、先行技術の欠点を克服し、そして緻密で（dense）そ
して組織化された（organized）単層膜で修飾された固体支持体上で、生体分子
（特に核酸）を合成しそして固定化するための方法を提供する目標を設定した。

【０００６】 本発明の主題は、核酸を合成または固定化するための、式（Ｉ）に対応する少
なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized
self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の使用であり：

【０００７】

【化２】

【０００８】 ここで： −ｎは、１５〜３５、好ましくは２０〜２５であり、 −ｍは、０または１に等しく、 −Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃は、互いに同一または異なり得、直鎖または分枝鎖の、Ｃ₁ 〜Ｃ₆の飽和アルキル基または加水分解性基からなる群から選択され、Ｘ₁、Ｘ₂
またはＸ₃の少なくとも１つは加水分解性基を示し、 −Ａは、基−Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ）_k−（ＣＨ₂）_i−を示し、ここで、ｋは
０〜１００、好ましくは０〜５であり、そしてｉは０に等しいかそれより大きい
整数、好ましくは０または１を示し、 −ｍ＝０の場合、Ｂは基−ＯＣＯＲ、−ＯＲまたは−ＣＯＯＲあるいはハロゲン
原子を示し、Ｒは水素原子あるいは直鎖または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₆アルキル基を示
し、 −ｍ＝１の場合： ・ｋ＝０およびｉ＝０の場合、Ｂは基Ｒ₁を示し、 ・ｋ＝０およびｉ≧１の場合、Ｂは基−ＯＲ₁、−ＯＣＯＲ₁、−ＮＲ₁Ｒ₂、−
ＣＯＯＲ₁、−ＣＯＮＲ₁Ｒ₂または−ＳＲ₁あるいはハロゲン原子を示し、 ・ｋ≧１およびｉ＝０の場合、Ｂは基−Ｒ₁、−ＣＯＲ₁、−ＣＯＯＲ₁または
−ＣＯＮＲ₁Ｒ₂を示し、 ・ｋ≧１およびｉ≧１の場合、Ｂは、基−ＯＲ₁、−ＯＣＯＲ₁、−ＮＲ₁Ｒ₂、
−ＣＯＯＲ₁、−ＣＯＮＲ₁Ｒ₂または−ＳＲ₁あるいはハロゲン原子を示し、 ・Ｒ₁およびＲ₂は、同一または異なり得、水素原子、直鎖または分枝鎖の、飽
和または不飽和の、１〜２４の炭素原子を含む、必要に応じて置換された炭化水
素ベース鎖、あるいは芳香族基を示す。

【０００９】 Ｂが、ｉの値とは関係なく、基−ＯＲ₁、−ＯＣＯＲ₁または−ＣＯＯＲ₁を示
す場合、そしてｋ≧１の場合、Ｂは、Protective groups in organic synthesis
(T.W. GREEN et al., 2nd edition, Wiley Interscience) に記載される保護基
（例えば、環式保護基）のような、ヒドロキシルまたはカルボン酸官能基の保護
から得られる任意の基を示し得ることが理解される。

【００１０】 本発明の目的のために、そして引き続いての文章において、用語“核酸”は、
等しく、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは修飾された塩
基の修飾された骨格を有する核酸（例えば、ホスホジエステル結合の変わりにペ
プチド結合を含むペプチド核酸（ＰＮＡ））でさえ意味するように意図される。

【００１１】 用語“芳香族”は、１以上のアリール環（例えば、フェニル環）を有する任意
の基を意味するように意図される。表現“組織化自己集合単層（organized self
-assembled monolayer）”は、分子が組織化される分子の集合（assembly）を意
味するように意図され、この組織化（organization）は、分子の鎖間の相互作用
および強力な結合（cohesion）に起因し、安定でそして秩序化された（ordered
）異方性膜を生じさせる(A. ULMAN, Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554)。

【００１２】 固体支持体上に形成された組織化自己集合単層は、化学的および構造的のどち
らにも十分に規定されたパラメータを有する均一で緻密な（dense）有機表面を
生成することを可能にする。ｎ、ｍ、ｋおよびｉの十分に定義された値について
の式（Ｉ）の化合物の自己集合の特性に起因して得られる、この単層の形成は、
完全に、各オルガノシリコン化合物について再現可能（reproducible）である。
さらに、非常に緻密な、組織化された、自己集合単層の形成は、化学的（酸性ま
たは塩基性）処理からシロキサン結合を保護し、これは、表面上で種々の化学反
応を行うことを可能にする。

【００１３】 本発明において使用される式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物は、有利なこと
に、基Ａの性質および使用され得る末端基Ｂの多様性の点から、非常に様々な官
能性および大きな反応性を有し、これらの基Ｂが、当然ながら、当業者に周知の
有機化学反応に従って望まれるように修飾または官能化されることが可能である
。

【００１４】 本発明に従う使用は、特に有利には、選択される式（Ｉ）のオルガノシリコン
化合物によって、支持体上に形成された組織化自己集合単層の均一性および安定
性の点から、確実に（reliably）そして再現可能に（reproducibly）、支持体上
で核酸を合成または固定化することを可能にする。核酸が、オルガノシリコン化
合物と固体支持体との間に現れるシロキサン結合の分解（degradation）なしに
、強力な共有結合によって修飾化支持体上で合成または固定化される。

【００１５】 好適な固体支持体は、一般的に、水和表面を有するものおよび／またはヒドロ
キシル基を提示する表面を有するものである。好ましくは、該支持体は、ガラス
、セラミックス（例えば、酸化物タイプのもの）、金属（例えば、アルミニウム
または金）およびメタロイド（例えば、シリコン）からなる群から選択される。

【００１６】 本発明の目的のために、用語“加水分解性”は、水性媒体中で酸と反応して化
合物Ｘ₁Ｈ、Ｘ₂ＨまたはＸ₃Ｈを与え得る任意の基を意味すると意図され、Ｘ₁、
Ｘ₂およびＸ₃は式（Ｉ）において定義される通りである。

【００１７】 有利な実施形態によれば、該加水分解性基は、ハロゲン原子、基−Ｎ（ＣＨ₃
）₂および基−ＯＲ’［Ｒ’は直鎖または分枝鎖の、Ｃ₁〜Ｃ₆飽和アルキル基で
ある］からなる群から選択される。

【００１８】 基Ｂおよび加水分解性基に関して、好適なハロゲン原子は、等しく、フッ素お
よび塩素、臭素またはヨウ素である。

【００１９】 別の有利な実施形態によれば、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが２
２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが０に等しく、ｋが１または３に等しく、そし
てＢが基−ＣＯＣＨ₃を示す。

【００２０】 別の有利な実施形態によれば、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが２
２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが１に等しく、ｋが２に等しく、そしてＢが基
−ＣＯＯＣＨ₃を示す。

【００２１】 別の有利な実施形態によれば、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが１
６、２２または２７に等しく、ｍが０に等しく、そしてＢが基−ＯＣＯＣＨ₃を
示す。

【００２２】 別の有利な実施形態によれば、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが２
１に等しく、ｍが０に等しく、そしてＢが基−ＣＯＯＣＨ₃を示す。

【００２３】 本発明に従う修飾化固体支持体の使用は、特にＤＮＡチップ（即ち、公知の一
セットのＤＮＡが非常に正確な順序で共有結合されている支持体）を製造するた
めに有利であり、これらのチップは多数回再使用可能である。このようなＤＮＡ
チップは、支持体上に固定化されたＤＮＡの標的核酸またはオリゴヌクレオチド
とのハイブリダイゼーションによって、これらの標的分子の配列を決定すること
、または遺伝子発現をモニターすることを可能にする。多くの用途がある：新規
の遺伝子および新規の医療品（medical products）を発見すること、診断、毒性
研究を行うことなど。

【００２４】 本発明の主題はまた、固体支持体上で核酸を合成するための方法であって、該
支持体が、上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリ
コン化合物を含む組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）
で修飾されていること、および以下の工程： ａ）上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化
合物を含む組織化自己集合単層で修飾された固体支持体を製造すること［ここで
、該オルガノシリコン化合物は、それらの末端に、保護されたアミンまたはヒド
ロキシル官能基を有する］； ｂ）必要に応じて、該アミンまたはヒドロキシル官能基を脱保護すること； ｃ）局所様式で（in a localized manner）、ヌクレオチドを、工程ａ）または
ｂ）で得られた修飾化固体支持体へ共有結合させること； ｄ）同一または異なるヌクレオチドで少なくとも１回工程ｃ）を繰り返すこと、 を含むことを特徴とする。

【００２５】 工程ａ）は、有利には、以下の工程： ｉ）前記固体支持体から汚染物質（contaminants）を除去し、そしてその表面を
水和および／またはヒドロキシル化すること、 ｊ）上記に定義される一般式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物を、少なくとも１
つの無極性炭化水素ベース溶媒を含む少なくとも２つの溶媒の混合物へ、不活性
雰囲気下で、導入すること［該化合物は、１末端に、保護されたアミンまたはヒ
ドロキシル官能基を有する］、 ｋ）工程ｉ）で得られた支持体を、工程ｊ）で調製された溶液中での浸漬によっ
てシラン化すること、 ｌ）必要に応じて、自己集合単層を有する工程ｋ）で得られたシラン化支持体を
、５０〜１２０℃の温度で、５分間〜一晩、アニールすること（annealing）、
ならびに ｍ）工程ｋ）またはｌ）で得られた修飾化支持体を、溶媒（好ましくは、極性溶
媒）でリンスすること、 によって行われる。

【００２６】 用語、固体支持体の“汚染物質（contaminants）”は、支持体の表面に存在し
、そして支持体自体の化学構造の一部でない、任意の化合物（例えば、脂質、ダ
ストまたは他のもの）を意味するように意図される。

【００２７】 固体支持体の性質に従って、工程ｉ）は、１以上の溶媒および／または酸化剤
および／またはヒドロキシル化剤（例えば、スルホクロニック（sulfochromic）
混合物）、洗剤（例えば、Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標））、オゾンを用いた
光化学処理（photochemical treatment）または任意の他の好適な処理を使用し
て行われ得る。

【００２８】 工程ｊ）において、保護されたアミンまたはヒドロキシル官能基の例として、
基−ＮＲ’Ｒ”および−ＯＣＯＲ’が言及され得、ここでＲ’およびＲ”は、ア
ルキル鎖を示す。アミンまたはヒドロキシル官能基の保護から生じる任意の他の
基がまた、認識され得る。

【００２９】 工程ｊ）は、有利には、少なくとも１つの無極性炭化水素ベース溶媒および少
なくとも１つの極性溶媒の混合液中で行われ得る。この場合、無極性溶媒および
極性溶媒の容積比は、好ましくは、７０／３０〜９５／５である。

【００３０】 例として、そして非制限様式で、工程ｊ）の間、使用され得る無極性炭化水素
ベース溶媒はシクロヘキサンであり、そして使用され得る極性溶媒はクロロホル
ムである。

【００３１】 工程ｊ）において、溶媒の混合物中のオルガノシリコン化合物の濃度は、好ま
しくは、１×１０^-5〜１×１０^-2ｍｏｌ／リットルである。

【００３２】 支持体をシラン化するための工程ｋ）は、使用される溶媒に従って、１分〜３
日の時間の間、そして−１０℃〜１２０℃の温度で、行われ得る。

【００３３】 本発明に従って固体支持体上で核酸を合成するための方法の間、工程ｂ）が、
当業者に公知の任意の技術によって、例えば水酸化カリウムでの処理によって行
われ得る。工程ｃ）およびｄ）は、ホスホルアミダイト（phosphoramidite）化
学によって、または例えばA. ELLINGTON and J.D. POLLARD in Current Protoco
ls in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New Yorkによって記載さ
れる、当業者に公知のヌクレオチドを共有結合的にカップリングするための任意
の他のタイプの化学によって、行われ得る。

【００３４】 本発明に従う合成方法の有利な実施形態によれば、前記オルガノシリコン化合
物の末端へ、末端アミンまたはヒドロキシル官能基を有するスペーサーアームを
グラフトするための工程が、工程ａ）またはｂ）の後および工程ｃ）の前に行わ
れる。

【００３５】 このようなスペーサーアームは、所望の特性に依存して、電荷、長さおよび極
性において可変であり得る。例えば、それらは、帯電した鎖（例えば、脱塩基部
位を有するホスホルアミダイトなど）、非帯電親水性鎖（例えば、ポリエチレン
グリコール）、非帯電疎水性鎖（経てば、アルキル鎖）、または水性アンモニア
不安定性基（aqueous ammonia-labile group）を含む鎖（例えば、基−ＳＯ₂）
を含み得る。

【００３６】 修飾化支持体へヌクレオチドを共有結合的にカップリングするための工程ｃ）
は、局所様式で（in a localized manner）、即ち支持体上の所定の場所で、行
われる。

【００３７】 工程ｃ）の繰り返しは、望まれる回数だけ行われ得；工程ｃ）は、例えば、収
率はこのような数を超えて減少することを知って、約１００回行われ得る。

【００３８】 工程ｃ）およびｄ）においてカップリングされたヌクレオチドは、好ましくは
、固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成に関する文献に記載されるように、
好適に保護されている。工程ｄ）に引き続いて、固体支持体上で合成された核酸
は、任意の好適な化学処理、例えば水性アンモニアによって脱保護され得ること
が明瞭に理解される。この処置は、水性アンモニア不安定性スペーサーアームが
これらの核酸とシラン化表面との間に導入されていなければ、支持体からの核酸
の切断を伴わない。

【００３９】 本発明の主題はまた、固体支持体上で核酸を固定化するための方法であって、
前記支持体が、上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノ
シリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾されていること、および以下の
工程： ａ）上記に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１つのオルガノシリコン化
合物を含む組織化自己集合単層で修飾された固体支持体を製造すること［ここで
、該オルガノシリコン化合物は、それらの末端に、保護されたアミンまたはカル
ボン酸官能基を有する］； ｂ）必要に応じて、該アミンまたはカルボン酸官能基を脱保護すること； ｃ）必要に応じて、該修飾化固体支持体が、末端カルボン酸官能基を有する場合
、これらの官能基を活性化すること； ｄ）工程ａ）、ｂ）またはｃ）で得られた修飾化固体支持体を、局所的に適用さ
れた（applied locally）、固定化される核酸（単数または複数）の１以上の極
性溶媒中の１以上の溶液と接触させること［該核酸は、それらの末端の１つで、
該修飾化固体支持体が必要に応じて保護された末端カルボン酸官能基を有する場
合にはアミン官能基で、または該修飾化固体支持体が必要に応じて保護された末
端アミン官能基を有する場合には活性化カルボン酸官能基で官能化されているス
ペーサーアームを有する］；ならびに ｅ）該核酸が固定されている固体支持体を洗浄すること、 を含むことを特徴とする。

【００４０】 工程ａ）は、有利には、工程ｊ）において、オルガノシリコン化合物が、１末
端で、保護されたアミンまたはカルボン酸官能基を有するという相違を伴って、
固体支持体上で核酸を合成するための方法に関して上記で記載したように行われ
る。

【００４１】 カルボン酸官能基を活性化するための工程ｃ）は、例えば、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドまたはカルボジイミドの溶液、あるいは当業者に公知の任意の他の
好適な活性化試薬を使用して行われ得る。

【００４２】 工程ｄ）の間、核酸を可溶化するために、後者の良好な溶解性および溶液の蒸
発の制御を可能にする任意の溶液が使用され得ることが明らかに理解される；例
として、そして非限定的な様式で、アセトニトリル／水混合物が言及され得る。
固定化される核酸の各溶液は、微細堆積（microdeposition）の好適な手段を使
用して、支持体上の所定の場所に堆積される。

【００４３】 本発明に従う固定化方法の有利な実施形態によれば、前記オルガノシリコン化
合物の末端へ、末端アミンまたはカルボン酸官能基を有するスペーサーアームを
グラフトするための工程が、工程ａ）またはｂ）の後および工程ｃ）の前に行わ
れる。好適なスペーサーアームは、上記に記載の通りである。

【００４４】 本発明の主題はまた、前記核酸がＤＮＡである、本発明に従う核酸を固定化す
るための方法を使用して得られることを特徴とする、ＤＮＡチップである。

【００４５】 本発明に従うＤＮＡチップは、安定であり、そして従って多くのハイブリダイ
ゼーションおよび変性サイクルにおいて再使用され得るという利点を有する。

【００４６】 上記のアレンジメントに加えて、本発明はまた、以下の説明から明らかとなる
であろう他のアレンジメントを含み、これは、本発明の文脈で使用され得るオル
ガノシリコン化合物の合成およびこれらのオルガノシリコン化合物の組織化自己
集合単層で修飾され固体支持体上での核酸の合成または固定化の実施例、ならび
にまた添付の図面を参照する。

【００４７】 しかし、これらの実施例は、本発明の主題の単なる例示のために与えられ、そ
れらは決してその限定を構成しないことが、明らかに理解されるべきである。

【００４８】 実施例１：ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の合成 １）不飽和アルコールの合成（図１） ・マグネシウム化合物２の調製 マグネシウム（１．８ｇ；７０ｍｍｏｌ）を、５００ｍｌの三ツ口丸底フラス
コへ、不活性雰囲気下で導入する。前もって７０ｍｌの無水ＴＨＦ（テトラヒド
ロフラン）に溶解した、不飽和臭素化誘導体１（１６．３ｇ；７０ｍｍｏｌ）を
滴下する。数滴のジブロモエタンが、該マグネシウムを活性化するために必要で
あり得る。反応混合物を、１時間３０分間還流させ、マグネシウム化合物２を得
、これを直ちに使用する。

【００４９】 ・リチウムアルコキシド４の調製 ブロモアルコール３（１７．７ｇ；７０ｍｍｏｌ；１ｅｑ）を、不活性雰囲気
下で、乾燥２５０ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中、７０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解す
る。溶液を−７８℃へ冷却し、次いでメチルリチウム（５０ｍｌ；８０ｍｍｏｌ
；１．１ｅｑ）を滴下する。リチウムアルコキシド４が得られる。

【００５０】 ・不飽和アルコール５の調製 マグネシウム化合物２を−７８℃へ冷却し、次いでヨウ化銅（１．１ｇ；３．
５ｍｍｏｌ；０．０５ｅｑ）を添加した。溶液を２５分間−７８℃で攪拌し、次
いで紫色が得られるまで、周囲温度へ再加熱する。次いで、溶液を、直ちに−７
８℃へ冷却し、そしてアルゴン雰囲気下で中空針（hollow needle）を使用して
リチウムアルコキシド４を導入する。溶液を１時間−７８℃で、次いで１８時間
周囲温度で攪拌する。過剰メチルリチウムを、エタノールの添加し、続いて１０
％塩酸水溶液の添加による酸性媒体中での加水分解によって破壊する。有機相を
ジエチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液
、水、そして最終的に飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄する。次いで、有機相を中
性へ洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、次いで真空下で濃縮する。生成物をアセトン
からの再沈殿で精製する。化合物５を白色固体の形態で得る（１９．８ｇ；融点
６１．７−６２．８°Ｃ；収率８７％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン
−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。

【００５１】

【数１】

【００５２】 ２）エチレングリコールの導入（図２） ・不飽和塩素化誘導体６の合成 上記で得られたアルコール５（１５ｇ；４６ｍｍｏｌ；１ｅｑ）およびピリジ
ン（４０．３６ｍｌ；６ｍｍｏｌ；０．１ｅｑ）を、マグネチックスターラーを
備えそして垂直還流冷却器を載せた２５０ｍｌの二ツ口丸底フラスコへ導入する
。次いで、塩化チオニル（６ｍｌ；７０ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を滴下する。反
応媒体を１時間攪拌し、次いでＯＨバンドが完全に消失するまで還流させる（赤
外分光法によってモニターされる）。続いて反応媒体を、加水分解し、次いでジ
エチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、１０％塩酸溶液、水、次
いで飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、
ＭｇＳＯ₄で乾燥し、そして真空下で濃縮する。化合物６を黄色固体の形態で得
、次いでシリカクロマトグラフィー（溶出液：石油エーテル／エーテル、７０／
３０ ｖ／ｖ）によって精製し；白色固体を得る（１４ｇ；融点３４．１〜３４
．９℃；収率７５％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによ
るその分析は、以下の通りである。

【００５３】

【数２】

【００５４】 ・不飽和ヨウ素化誘導体７の合成 不飽和塩素化化合物６（１０．６ｇ；３２ｍｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム
（２２ｇ；１４０ｍｍｏｌ；４ｅｑ）を、２５０ｍｌ丸底フラスコ中のアセトン
（４０ｍｌ）に可溶化させる（solubilized）。次いで、溶液を１８時間還流さ
せる。次いで、反応媒体をジエチルエーテルで抽出し、エーテル相を合わせ、次
いで水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、そして真空下で濃縮する。生成物をアセ
トンからの沈殿操作によって精製する。化合物７を、黄色固体の形態で得る（１
１ｇ；融点４１．１〜４２．０℃；収率８１％）。赤外ならびにプロトンおよび
カーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。

【００５５】

【数３】

【００５６】 ・不飽和アルコール８の合成 ２０ｍｌの無水ＴＨＦ中のエチレングリコール（１１．５ｇ；１８０ｍｍｏｌ
；１０ｅｑ）および予め粉末にされた水酸化ナトリウム（３．７ｇ；９０ｍｍｏ
ｌ；５ｅｑ）の溶液を、３０分間還流させる。ヨウ素化化合物７（８ｇ；１８ｍ
ｍｏｌ；１ｅｑ）および硫酸水素テトラブチルアンモニウム（０．６２ｇ；１．
８ｍｍｏｌ；０．１ｅｑ）を添加する。次いで、反応媒体を７２時間還流する。
周囲温度へ戻した後、塩酸水溶液（１０％、５０ｍｌ）を導入する。次いで、反
応媒体をジエチルエーテルで３回抽出し；エーテル相を合わせ、そして１０％塩
酸溶液で２回、水、次いで飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で洗浄する。次いで、エーテル
相を中性へ洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、そして真空下で濃縮する。得られた固
体をジクロロメタンから再沈殿させ、次いでシリカクロマトグラフィーによって
精製する（溶出液：ジクロロメタン／酢酸エチル；ｖ／ｖ：３０／７０）。化合
物８を、白色固体の形態で得る（１．４ｇ、融点６１．２〜６２．４℃；収率２
１％）。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、
以下の通りである。

【００５７】

【数４】

【００５８】 ・エステル形態で保護された不飽和アルコール９の合成 不飽和アルコール８（０．９ｇ；２．７ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌの二ツ口丸
底フラスコ中、ジクロロメタン（１０ｍｌ）およびトリエチルアミン（０．６ｍ
ｌ；５．４ｍｍｏｌ；２ｅｑ）に懸濁させる。反応媒体を０℃へ冷却し、次いで
塩化アセチル（０．５ｍｌ；４ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を、シリンジを使用して
滴下する。反応媒体を１５分間０℃で、次いで１時間３０分間周囲温度で攪拌す
る。続いて、それを加水分解し、次いでジエチルエーテルで３回抽出する。エー
テル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水、次いで飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で洗
浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、そして真
空下で濃縮する。化合物９を白色固体の形態で得る（０．９ｇ；収率１００％）
。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の
通りである。

【００５９】

【数５】

【００６０】 ３）３つのエチレングリコール単位の導入（図２） 上記で得られた不飽和ヨウ素化誘導体７およびトリエチレングリコールから出
発して、不飽和アルコール１０を得、次いでエステル化して生成物１１を得る。
これは、上述と同一のプロトコルに従って行われる。

【００６１】 赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによる生成物１０の分析は
、以下の通りである。

【００６２】

【数６】

【００６３】 赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによる生成物１１の分析は
、以下の通りである。

【００６４】

【数７】

【００６５】 ４）不飽和エステルの調製（図３） 上記で得られた不飽和アルコール１０から出発して、対応の酸および対応のエ
ステルを以下のように調製した。

【００６６】 ・酸１２の調製 不飽和アルコール１０（３ｇ；６．６ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの三ツ口丸底フ
ラスコ中の１０ｍｌのアセトンに懸濁させる。８０ｍｌの２Ｍジョーンズ試薬（
BOWDEN et al., J. Chem. Soc., 1946, 39）をこの懸濁液に添加する。懸濁液を
２時間還流させる。周囲温度へ戻した後、アセトンを蒸発させ、そして固体を濾
別し、次いで水で５回および０℃に冷却したアセトンで３回リンスする。次いで
、固体をＴＨＦ／アセトン混合物（ｖ／ｖ：９／１）からの再結晶によって精製
し、化合物１２を白色固体の形態で得る（２．９ｇ；収率９４％）。赤外ならび
にプロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。

【００６７】

【数８】

【００６８】 ・エステル１３の調製 酸１２（２．９ｇ；６．４ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中
、０℃、不活性雰囲気下で、無水トルエン（７ｍｌ）に可溶化させる。塩化オキ
サリル（１．２２ｇ；９．６ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を滴下し、次いで混合物を
周囲温度で２時間攪拌する。次いで、過剰の試薬および溶媒を、真空下で蒸発さ
せる。塩化アシルをアルゴン下で一時的に保存する。予め塩化カルシウム上で蒸
留させたメタノール（６ｍｌ；１２８ｍｍｏｌ；２０ｅｑ）を、徐々に添加する
。次いで、反応媒体を１８時間還流し、その後周囲温度へ戻し、次いで過剰メタ
ノールを蒸発させる。次いで、反応媒体を３回ジエチルエーテルで抽出する。エ
ーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水、および飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で
洗浄する。次いで、エーテル相を中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、そして
真空下で濃縮する。化合物１３を白色固体の形態で得、次いでシリカクロマトグ
ラフィー（溶出液：石油エーテル／エーテル、容積で５０／５０）によって精製
する。３００ｍｇの白色固体を得る（収率１０％）。赤外ならびにプロトンおよ
びカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。

【００６９】

【数９】

【００７０】 単一エチレングリコール単位を含むアルコール８を使用することによって、対
応の酸およびエステルがまた、アルコール１０から出発してここで記載したのと
同一のプロトコルに従って得られ得る。

【００７１】 ５）不飽和前駆体のシリル化（図４） エステル９（１５０ｍｇ；０．３３ｍｍｏｌ）を、不活性雰囲気下、乾燥Ｓｃ
ｈｌｅｎｋチューブへ導入する。新たに蒸留したトリクロロシラン（０．３ｍｌ
；２．２ｍｍｏｌ；６ｅｑ）、無水トルエン（０．３ｍｌ）およびＡＢＣＲによ
って販売される（リファレンス６８４７８−９２−２）Ｋａｒｓｔｅｄ触媒（Ｐ
ＣＯ ７２）の１滴を添加する。次いで、反応媒体を２時間４０℃にする。周囲
温度へ戻した後、トルエンおよび過剰なトリクロロシランを、ベーンポンブ（va
ne pump）（圧力は０．５ｍｍＨｇである）を使用して、減圧下で、蒸発させる
。化合物１４を白色固体の形態で得、そしてアルゴン下で保存する（収率９９％
）。それは、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１
に等しく、ｉが０に等しく、ｋが１に等しく、そしてＢが基−ＣＯＣＨ₃を示す
、上記に定義される式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物である。

【００７２】 プロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによる化合物１４の分析は、以下の通り
である。

【００７３】

【数１０】

【００７４】 化合物１１から出発することによってそして同一のプロトコルを使用すること
によって、対応のオルガノシリコン化合物１５が得られる。それは、Ｘ₁、Ｘ₂お
よびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく、ｉが０に等し
く、ｋが３に等しく、そしてＢが基−ＣＯＣＨ₃を示す、式（Ｉ）のオルガノシ
リコン化合物である。プロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、
以下の通りである。

【００７５】

【数１１】

【００７６】 上記で得られた化合物１３から出発することによってそして同一のプロトコル
を使用することによって、対応のオルガノシリコン化合物１６が得られる。それ
は、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、ｍが１に等しく
、ｉが１に等しく、ｋが２に等しく、そしてＢが基−ＣＯＯＣＨ₃を示す、式（
Ｉ）の化合物である。プロトンおよびカーボン−１３ＮＭＲによるその分析は、
以下の通りである。

【００７７】

【数１２】

【００７８】 表Ｉは、本実施例において得られた式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の構造
を概括する。

【００７９】

【表１】

【００８０】 実施例２：ｍ＝０である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の合成 １）不飽和前駆体の合成（図５） １−１：基−ＯＣＯＣＨ₃を有する不飽和前駆体 ・化合物１７ 実施例１で得られた不飽和アルコール５（０．９ｇ；２．７ｍｍｏｌ）を、１
００−ｍｌの２ツ口丸底フラスコ中、ジクロロメタン（１０ｍｌ）およびトリエ
チルアミン（０．６ｍｌ；５．４ｍｍｏｌ；２ｅｑ）に懸濁させる。反応媒体を
、０℃へ冷却し、次いで塩化アセチル（０．５ｍｌ；４ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）
をシリンジを使用して滴下する。反応媒体を、１５分間０℃で、次いで１時間３
０分間周囲温度で、攪拌する。続いて、反応媒体を、加水分解させ、次いで３回
ジエチルエーテルで抽出する。エーテル相を合わせ、そして１０％塩酸溶液、水
、および次いで飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性ま
で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、そして真空下で濃縮する。化合物１７を、白色
固体形態で得る（０．９ｇ；収率１００％）。赤外ならびにプロトンおよびカー
ボン−１３ ＮＭＲによる分析は、以下の通りである。

【００８１】

【数１３】

【００８２】 ・化合物１８ 化合物１７の製造と同一のプロトコルを使用することによって、しかし１６炭
素原子を有する不飽和アルコールから出発して、化合物１８を得、赤外ならびに
プロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるこの分析は、以下の通りである。

【００８３】

【数１４】

【００８４】 ・化合物１９ 化合物１７の製造と同一のプロトコルを使用することによって、しかし２７炭
素原子を有する不飽和アルコールから出発して、化合物１９を得、赤外ならびに
プロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるこの分析は、以下の通りである。

【００８５】

【数１５】

【００８６】 １−２：臭素化不飽和前駆体 式ＣＨ₂＝ＣＨ−（ＣＨ₂）_xＢｒ［ｘは、３〜２３である］の不飽和臭素化誘
導体から出発して、実施例１に記載の化合物２の製造のためのプロトコルに従っ
て、式ＣＨ₂＝ＣＨ−（ＣＨ₂）_xＭｇＢｒのオルガノマグネシウム化合物を得る
。化合物５の生成のための実施例１に従うブロモアルコールとのカップリングに
ついてのものと同一の条件下での、二臭素化誘導体Ｂｒ（ＣＨ₂）_yＢｒ（ｘ＋ｙ
は、最小１３そして最大３３に等しい）とのそのカップリングは、式２０、２１ および２２の不飽和臭素化誘導体を生成する。

【００８７】 化合物２０は、ｘが９に等しい不飽和臭素化誘導体およびｙが１０に等しい二
臭素化誘導体を使用して得られる。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３
ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。

【００８８】

【数１６】

【００８９】 化合物２１は、ｘが１４である不飽和臭素化誘導体およびｙが１０に等しい二
臭素化誘導体を使用して得られる。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３
ＮＭＲによるその分析は、以下の通りである。

【００９０】

【数１７】

【００９１】 化合物２２は、ｘが９である不飽和臭素化誘導体およびｙが５に等しい二臭素
化誘導体を使用して得られる。赤外ならびにプロトンおよびカーボン−１３ Ｎ
ＭＲによるその分析は、以下の通りである。

【００９２】

【数１８】

【００９３】 １−３：カルボン酸基−ＣＯＯＨを有する不飽和前駆体 実施例１で得られる不飽和アルコール５（１３ｇ；４０ｍｍｏｌ）を、２５０
−ｍｌの三ツ口丸底フラスコ中、４０ｍｌのアセトンに懸濁させる。８０ｍｌの
ジョーンズ試薬（２Ｍ）を、この懸濁液に添加する。この懸濁液を、２時間還流
させる。周囲温度に戻した後、アセトンを蒸発させ、固体を濾過し、次いで水で
５回、そして０℃に冷却したアセトンで３回リンスする。次いで、固体をＴＨＦ
／アセトン混合物（ｖ／ｖ：９／１）からの再結晶によって精製し、化合物２３ を白色固体形態で得る（９．９ｇ；融点７３−７４°Ｃ；収率９４％）。赤外な
らびにプロトンおよびカーボン−１３ ＮＭＲによるその分析は、以下の通りで
ある。

【００９４】

【数１９】

【００９５】 １−４：メチルエステル基−ＣＯＯＣＨ₃を有する不飽和前駆体 上記で得られた酸２３（４ｇ；１１．８ｍｍｏｌ）を、１００−ｍｌの三ツ口
丸底フラスコ中、０℃、不活性雰囲気下で、無水トルエン（２０ｍｌ）に可溶化
させる。塩化オキサリル（２ｇ；１７．６ｍｍｏｌ；１．５ｅｑ）を滴下して導
入し、次いで混合物を周囲温度で２時間攪拌する。次いで、過剰な試薬および溶
媒を真空下で蒸発させる。塩化アシルをアルゴン下で一時的に保存する。予め塩
化カルシウム上で蒸留された、メタノール（１０ｍｌ；２３６ｍｍｏｌ；２０ｅ
ｑ）を徐々に添加する。次いで、反応媒体を、１８時間還流させる。反応混合物
が周囲温度に戻った後、過剰のメタノールを蒸発させる。次いで、反応媒体を、
ジエチルエーテルで３回抽出する。エーテル相を合わせ、１０％塩酸溶液、水、
および飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で洗浄する。次いで、エーテル相を中性へ洗浄し、
ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、真空下で濃縮する。化合物２４を白色固体の形態で得る
（４ｇ；融点５０−５１．５°Ｃ；収率１００％）。赤外ならびにプロトンおよ
びカーボン−１３ ＮＭＲによる分析は、以下の通りである。

【００９６】

【数２０】

【００９７】 ２）不飽和前駆体のシリル化 実施例１に示されるものと同一のプロトコルを行う。不飽和前駆体１７、１８ および１９から出発して得られたオルガノシリコン化合物のプロトンおよびカー
ボン−１３ ＮＭＲスペクトルは、以下の通りである。

【００９８】

【数２１】

【００９９】 以下の表IIは、本実施例において得られた式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物
の構造を概括する。

【０１００】

【表２】

【０１０１】 実施例３：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物を使用しての固体支持体のシラ
ン化、および組織化自己集合単層の製造 １）固体支持体のシラン化 表面酸化シリコンディスク（surcace-oxidized silicon disk）を、支持体と
して使用する。ディスクを、その表面から汚染物質（contaminants）を除去しそ
してそれを水和させるために、以下の手順にした従って清浄にする： −新たに調製したクロム（ＶＩ）／硫酸混合物（２．５ｇのＫ₂Ｃｒ₂Ｏ₄；２．
５ｍｌの蒸留水；５０ｍｌの硫酸）中で１０分間の浸漬、 −ダストフィルターを備えた層流フード（laminar flow hood）下で、ディスク
を脱イオン水に浸漬し、そして２０分間超音波へ供する。このプロセスを、それ
ぞれ５および２分間の超音波処理（sonication）の持続を２回繰り返す、 −ダストフィルターを備えた層流フード下で、ディスクを、不活性でそしてフィ
ルターされた（filtered）雰囲気下で、乾燥させるためにシラン化リアクターへ
導入する。リアクターを、１００℃のオイルバス中に４５分間浸漬し、次いでオ
イルバスから取り出し、そしてその温度を１８℃へ戻す。

【０１０２】 不活性雰囲気下で、所望の量で新たに調製した、実施例１で得られるオルガノ
シリコン化合物１４を、Ｃ₆Ｈ₁₂／ＣＣｌ₄／ＣＨＣｌ₃（ｖ／ｖ／ｖ：８０／１
２／８）混合物のフラクションに溶解する。続いて、溶液中のオルガノシリコン
化合物１４を、シリンジで回収し、次いで、溶媒混合物の残余を含むＳｃｈｌｅ
ｎｃｋチューブへ導入し、この全容積は、好適な希釈（１×１０^-5〜１×１０^-2 ｍｏｌ／リットル）のシラン化溶液を作製するように算出されている。溶媒を、
それ自体が公知の手順に従って予め乾燥させた。

【０１０３】 シラン化溶液をシリンジでリアクターへ導入し、そしてシリコンディスクを、
この溶液中に１６時間浸漬させたままにする。シラン化されたディスクをリアク
ターから回収し、次いで、クロロホルム（ＨＰＬＣグレード）で洗浄した後、必
要に応じて５０〜１２０℃の温度でアニールする。次いで、それを、そして超音
波で２分間清浄にし、このプロセスを２回繰り返す。

【０１０４】 ２）修飾化表面のキャラクタライゼーション 表面が化合物１４で修飾されている、固体支持体が、上記で得られた。オルガ
ノシリコン化合物のグラフト化を、共焦点ラマン分析法および赤外分光法を使用
することによってモニターする。

【０１０５】 ３）表面ヒドロキシルの放出 必要であれば、表面ヒドロキシルを、以下のプロトコルを使用して放出させ得
る：シラン化ディスクを、水／エタノール（ｖ／ｖ：１／１）混合物中のＫＯＨ
（０．５Ｍ）の溶液に２０分間浸漬させる。次いで、ディスクを超音波で５分間
脱塩水中で清浄にする。このプロセスを水中で１回、次いでクロロホルム中で２
回繰り返す。

【０１０６】 ４）ヒドロキシルの放出後の表面のキャラクタライゼーション 図６は、上記で説明されたシラン化プロトコルに従って、そして表面エステル
の鹸化後、支持体へ化合物１４をグラフト化する３つの実験後に得られる赤外ス
ペクトルを示す。透過率（transmission）はｙ軸上に現れ、そして周波数（freq
uency）（ｃｍ^-1）はｘ軸上に現れる。３つのスペクトルは、２９１７および２
８５０ｃｍ^-1で組織化系（organized system）の特徴的なピークで、重ね合わせ
られていることに注意する。従って、それから、支持体上へのオルガノシリコン
化合物のグラフトは、再現性があり、そして組織化自己集合単層の形成を生じさ
せることが結論され得る。

【０１０７】 図７は、上記で得られた修飾化表面のラマン分光分析研究を示す。図７ａは、
グラフト化支持体の表面の密度を表し、表面の寸法は、ｘ軸およびｙ軸上に現れ
（図における７ｍｍは、支持体における１μｍに対応する）、そして密度のスケ
ールは、１３０〜１６５（任意の単位）に目盛りをつけられる（graduated）。
この図は、表面の均一性を実証する。図７ｂおよび図７ｃは、支持体の表面の２
つの異なるポイントで測定されたラマンスペクトルを示す；ｙ軸は１秒当たりの
カウントを示し、そして周波数はｘ軸に現れる。

【０１０８】 従って、赤外およびラマンスペクトルは、明白に、組織化自己集合単層の特徴
である、支持体に堆積された膜の均一性および表面上の分子の組織化を示す。赤
外スペクトルはまた、膜のグラフト化が完全に再現性であることを示す。

【０１０９】 実施例４：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物を使用しての固体支持体上にお
けるシラン化の他の例 ガラス顕微鏡スライド（glass microscope slide）を、支持体として使用する
。ガラススライドを、２％水性Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標）溶液（Ｐｏｌｙ
ｌａｂｏによってリファレンス１２２４０で販売）中、２時間、２０℃での浸漬
、次いで多量の脱イオン水でのリンスによって、清浄にする。ダストフィルター
を備えた層流フード下で、ガラススライドを、不活性でそしてフィルターされた
（filtered）雰囲気下で、乾燥させるためにグラフト化リアクターへ導入する。
リアクターを、１００℃のオイルバス中に４５分間浸漬し、次いで、オイルバス
から取り出し、そしてその温度を１８℃へ戻す。

【０１１０】 前記実施例に示されるようにオルガノシリコン化合物１４を使用して調製され
たシラン化溶液を、シリンジで、リアクターへ導入し、そしてガラススライドを
この溶液に１６時間浸漬させたままにする。シラン化支持体を、実施例３に記載
されるようにリンスする。

【０１１１】 赤外およびラマン分光分析による表面のキャラクタライゼーションは、ここで
また、支持体上における組織化自己集合単層の生成を実証し、同一の結果がまた
、化合物１４以外の式（Ｉ）のオルガノシリコン剤で得られる。

【０１１２】 実施例５：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で修飾さ
れた固体支持体上での核酸の直接合成 １）組織化自己集合単層で修飾された固体支持体の製造 使用される固体支持体は、実施例３に記載されるプロトコルに従って、オルガ
ノシリコン化合物１４を含む組織化自己集合単層がその上に形成された、酸化シ
リコン（oxidized silicon）支持体Ｓｉ／ＳｉＯ₂である。式（Ｉ）の任意の他
のオルガノシリコン化合物も、式（Ｉ）の少なくとも一つのオルガノシリコン化
合物を含むオルガノシリコン化合物の任意の混合物として使用され得る。

【０１１３】 支持体上へグラフトされたオルガノシリコン化合物の末端を、実施例３に記載
されるように、ＫＯＨの溶液中での支持体の浸漬によってヒドロキシル基へ変換
させる。このようにして、表面ヒドロキシル官能基を含む支持体を得る。支持体
を、アセトニトリルで清浄にし、そして超音波に１分間供し、その後、合成チャ
ンバに配置する。

【０１１４】 ２）この支持体上での核酸の合成 ホスホルアミダイト化学を、当業者に周知の他のタイプの化学（例えば、Ｈ−
ホスホネート化学）が使用され得る認識のもとに、ここで使用する。従って、ヌ
クレオチドを、β−シアノエチルホスホルアミダイトの形態で使用し、種々の窒
素含有塩基のアミンは、例えばそして非限定様式で、ベンゾイル、イソブチリル
またはｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチック基で保護されている。ヌクレオチ
ドは、５’位でジメトキシトリチル基で保護されており；しかし、ＵＶイルミネ
ーションによって除去され得る光不安定性（photolabile）基もまた使用され得
る（例えば、Peaseらによって、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-
5026で記載されるＭｅＮＰＯＣ）。

【０１１５】 核酸合成は、使用されるホスホルアミダイト化学で、３’→５’方向に行われ
る。ヌクレオチドをグラフトするための種々の工程は、以下の通りであり、これ
らの工程の全ては以下のサイクルを構成する： １．脱トリチル化（detritylation）（２５秒）：ジクロロメタン中３％トリ
クロロ酢酸； ２．洗浄：無水アセトニトリル； ３．カップリング（１分）：０．１Ｍアミダイトおよび０．４５Ｍのアクチベ
ータ（テトラゾール）の混合液の導入； ４．キャッピング（capping）（１５秒）：（ｉ）無水酢酸／２，６−ルチジ
ン／アセトニトリル（１０ｍｌ／１０ｍｌ／８０ｍｌ）および（ｉｉ）ジメチル
ホルムアミド中１０％の１−メチルイミダゾール（１０ｍｌ／９０ｍｌ）の混合
液の導入； ５．酸化（１５秒）：ヨウ素／ピリジン／テトラヒドロフラン／水（０．５０
８ｍｇ／１．６ｍｌ／１５．２ｍｌ／３．２ｍｌ）混合物の導入； ６．キャッピング（１５秒）。

【０１１６】 上記に与えられるサイクルにおいて、脱トリチル化、洗浄、カップリング、キ
ャッピングおよび酸化溶液は、限定的様式で与えられていないことが、明らかに
理解される。

【０１１７】 望まれるのと同じくらい多くのサイクルが、生成されるように意図される核酸
の長さに依存して、行われ得る。一旦サイクルの最終番号に到達すると、窒素含
有塩基は脱保護されて、核酸は周囲温度で一晩３０〜３３％の水性アンモニアで
の処理によって脱保護され、その結果、骨格および窒素含有塩基に分布される保
護基が切断される。必要に応じて、水性アンモニア不安定性スペーサーアームが
、シラン化表面と核酸の一部との間に導入されている場合、核酸のこのフラクシ
ョンが、支持体から切断されるだろう。

【０１１８】 使用される保護基の性質に依存して、例えば炭酸カリウムを使用する、他の脱
保護処理を使用することが可能であり得る。

【０１１９】 支持体を、水、次いでＴＲＩＳ緩衝液（１０ｍＭ ＴＲＩＳ塩基溶液を添加す
ることによってｐＨ７．１へ調整された１０ｍＭ ＴＲＩＳ ＨＣｌの溶液、最終
溶液は５０ｍＭのＮａＣｌ濃度を有する）で洗浄し、その後、それをハイブリダ
イゼーションのために使用し得る。

【０１２０】 実施例６：本発明に従う方法に続いて固体支持体上に直接合成されたオリゴヌ
クレオチドで行われるハイブリダイゼーション実験 実施例５に記載の組織化自己集合単層で修飾された固体支持体（オルガノシリ
コン化合物１４の単層が形成されている、酸化シリコン（oxidized silicon）Ｓ
ｉ／ＳｉＯ₂、表面官能基はヒドロキシル基に変換されている）を使用する。１
０ヌクレオチドＴのスペーサーアームを、オリゴヌクレオチド合成の前に、この
修飾化支持体上へグラフトする。

【０１２１】 Ｌ１８５およびＵ２２６と名付けられたオリゴヌクレオチド（２５ヌクレオチ
ドの配列）を、図８ａに例示されるように、この支持体の４点で合成する。図８
ｂおよび８ｃは、図８ｂについて０〜１０のスケール（図８ｄ、８ｆおよび８ｈ
についてのスケールとして役立つ）において、そして図８ｃについて０〜１．５
のスケール（８ｅ、８ｇおよび８ｉについてのスケールとして役立つ）において
、支持体上に描かれた蛍光強度を示す。

【０１２２】 図８ｄは、蛍光ラベルを含むＬ１８５に相補的なオリゴヌクレオチドの溶液と
支持体とを接触させた後、支持体を洗浄した後に、検出された蛍光強度を示す。
ハイブリダイゼーションを、５０ｍＭのＮａＣｌを含むＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７
．１）の存在下、一晩、４６℃で行う。ＴＲＩＳ中のオリゴヌクレオチドＬ１８
５の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌである。Ｌ１８５に相補的な各ストランド（st
rand）は、５’末端に蛍光基Ｃｙ３を有する。配列Ｌ１８５との相補配列のハイ
ブリダイゼーションが、明らかに観察される。図８ｅは、変性後の支持体に対応
する：相補配列は、もはや検出されない。

【０１２３】 図８ｆは、Ｌ１８５ストランドに関して上記で示されたのと同一の条件下で、
蛍光ラベルを含むＵ２２６に相補的なオリゴヌクレオチドの溶液と支持体とを接
触させた後に支持体を洗浄後、検出された蛍光強度を示す。ここでまた、配列Ｕ
２２６との相補配列のハイブリダイゼーションが、観察される。図８ｇは、変性
後の支持体に対応する：相補配列は、もはや検出されない。

【０１２４】 図８ｈは、蛍光ラベルを含むＬ１８５に相補的なオリゴヌクレオチドの溶液と
支持体とをもう一度接触させた後、支持体を洗浄した後に検出された蛍光強度を
示す。配列Ｌ１８５との相補配列のハイブリダイゼーションがまた生じる。図８
ｉは、変性後の相補配列の非存在を示す。

【０１２５】 これらの実験は、式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で
修飾された固体支持体上に直接合成された核酸は［この合成は、本発明の方法に
従って行われる］、相補配列との選択的なハイブリダイゼーション反応を生じ得
、支持体は、ハイブリダイゼーションおよび変性の数回の連続サイクルにおいて
、再使用可能であることを示す。

【０１２６】 実施例７：式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の組織化自己集合単層で修飾さ
れた固体支持体上でのプレ合成された核酸の固定化 １）組織化自己集合単層で修飾された固体支持体の製造 組織化自己集合単層が実施例１に示されるプロトコルに従って調製された式１ ６ のオルガノシリコン化合物を含むという相違を伴って、実施例５のように、手
順を行った。式（Ｉ）の任意の他のオルガノシリコン化合物（または、式（Ｉ）
の少なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含むオルガノシリコン化合物の混
合物）が使用され得ることが、明らかに理解され、該式（Ｉ）の化合物は、保護
されたカルボン酸官能基を有する。オルガノシリコン化合物の末端は、エステル
の加水分解によって（例えば、トリヨードメチルシランまたは濃塩酸の作用下で
）、カルボン酸基へ変換される。

【０１２７】 ２）この支持体上での核酸の固定化 支持体のカルボン酸官能基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液で活性化
する。このように活性化された支持体を、固定化される核酸の溶液と接触させ（
トリエチルアミンの存在下、容積で９／１のアセトニトリル／水混合物中１μｇ
／μｌ）、この核酸は、アミン官能基で官能化されたスペーサーアームを有する
。反応を、周囲温度で、必要に応じて溶液の乾燥まで行う。次いで、支持体をＴ
ＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．１）で洗浄する。この操作は、アミンとの反応によって
反応していない酸官能基をブロックすることを可能にする（キャッピング（capp
ing）反応）。

【０１２８】 上記から明らかなように、本発明は、決して、今より明確に記載された、実行
、調製および適用に限定されず；逆に、それは、本発明の文脈および範囲から逸
脱することなく、当業者に思いつかれ得る全てのその改変を含む。

【０１２９】 特に、核酸を合成および固定化するための方法のみが記載されたが、本発明に
従う方法がまた他の生体分子（特にタンパク質）に適用され得ることが明らかに
理解される；この場合、本発明に従う合成方法は、これらの生体分子の基本単位
（basic units）を支持体上へグラフトするための連続工程を含み得、それにも
関わらず、行われる工程は、核酸に関してより詳細に記載したものと同一である
。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１、２および３は、ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽
和前駆体の合成を例示する。

【図２】 図１、２および３は、ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽
和前駆体の合成を例示する。

【図３】 図１、２および３は、ｍ＝１である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽
和前駆体の合成を例示する。

【図４】 図４は、これらの不飽和前駆体のシリル化を例示する。

【図５】 図５は、ｍ＝０である式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の不飽和前駆体を示
す。

【図６】 図６は、Ａｕ／Ｓｉ／ＳｉＯ₂支持体のシリカ表面上へオルガノシリコン化合
物１４をグラフトすることからなる３つの実験後に作製された赤外スペクトルを
示す。

【図７】 図７ａは、オルガノシリコン化合物１４がグラフトされているＡｕ／Ｓｉ／Ｓ
ｉＯ₂支持体の表面のラマン分光分析によって分析された密度を示す；図７ｂお
よび７ｃは、この表面の２つの異なるポイントで測定されたラマンスペクトルを
示す。

【図８】 図８は、オリゴヌクレオチドＬ１８５およびＵ２２６が合成されている（図８
ａ）、式（Ｉ）のオルガノシリコン化合物の単層で修飾されたＡｕ／Ｓｉ／Ｓｉ
Ｏ₂支持体を使用しての、ハイブリダイゼーション（図８ｄ、８ｆおよび８ｈ）
および変性（図８ｅ、８ｇおよび８ｉ）からなる連続実験を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/543 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベネット ベルナルド フランス国 エフ−33400 タランス リ ュ ポルテ−ボンホール 45 (72)発明者 ボスバ ジャマール フランス国 エフ−33400 タランス シ ュマン デ スゾン 251 (72)発明者 ショパン フランク フランス国 エフ−72320 ヴァレンス レ ロジス (72)発明者 ステイランド エリアーヌ フランス国 エフ−69130 エカリー シ ュマン デュ ムーラン カロン 18 (72)発明者 マーティン ジャン−レネ フランス国 エフ−69380 ロザンヌ リ ュ デ ベルヴュー 66 (72)発明者 クロアレック ジャン−ピエール フランス国 エフ−69005 リヨン リュ ムルゲ 11 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA09 EA04 HA19

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸を合成または固定化するための、式（Ｉ）に対応する少
   なくとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized
   self-assembled monolayer）で修飾された固体支持体の使用： 【化１】 ここで： −ｎは、１５〜３５であり、 −ｍは、０または１に等しく、 −Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃は、互いに同一または異なり得、直鎖または分枝鎖の、Ｃ₁ 〜Ｃ₆の飽和アルキル基または加水分解性基からなる群から選択され、Ｘ₁、Ｘ₂
   またはＸ₃の少なくとも１つは加水分解性基を示し、 −Ａは、基−Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ）_k−（ＣＨ₂）_i−を示し、ここで、ｋは
   ０〜１００であり、そしてｉは０に等しいかそれより大きい整数を示し、 −ｍ＝０の場合、Ｂは基−ＯＣＯＲ、−ＯＲまたは−ＣＯＯＲあるいはハロゲン
   原子を示し、Ｒは水素原子あるいは直鎖または分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₆アルキル基を示
   し、 −ｍ＝１の場合： ・ｋ＝０およびｉ＝０の場合、Ｂは基Ｒ₁を示し、 ・ｋ＝０およびｉ≧１の場合、Ｂは基−ＯＲ₁、−ＯＣＯＲ₁、−ＮＲ₁Ｒ₂、−
   ＣＯＯＲ₁、−ＣＯＮＲ₁Ｒ₂または−ＳＲ₁あるいはハロゲン原子を示し、 ・ｋ≧１およびｉ＝０の場合、Ｂは基−Ｒ₁、−ＣＯＲ₁、−ＣＯＯＲ₁または
   −ＣＯＮＲ₁Ｒ₂を示し、 ・ｋ≧１およびｉ≧１の場合、Ｂは、基−ＯＲ₁、−ＯＣＯＲ₁、−ＮＲ₁Ｒ₂、
   −ＣＯＯＲ₁、−ＣＯＮＲ₁Ｒ₂または−ＳＲ₁あるいはハロゲン原子を示し、 ・Ｒ₁およびＲ₂は、同一または異なり得、水素原子；直鎖または分枝鎖の、飽
   和または不飽和の、１〜２４の炭素原子を含む、必要に応じて置換された炭化水
   素ベース鎖；あるいは芳香族基を示す。
2. 【請求項２】 ｎが２０〜２５であることを特徴とする、請求項１に記載の
   使用。
3. 【請求項３】 ｋが０〜５であることを特徴とする、請求項１または請求項
   ２に記載の使用。
4. 【請求項４】 前記固体支持体が、ガラス、セラミックス、金属およびメタ
   ロイドからなる群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項
   に記載の使用。
5. 【請求項５】 前記加水分解性基が、ハロゲン原子、基−Ｎ（ＣＨ₃）₂およ
   び基−ＯＲ’［Ｒ’は直鎖または分枝鎖の、Ｃ₁〜Ｃ₆飽和アルキル基である］か
   らなる群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の
   使用。
6. 【請求項６】 Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、
   ｍが１に等しく、ｉが０に等しく、ｋが１または３に等しく、そしてＢが基−Ｃ
   ＯＣＨ₃を示すことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。
7. 【請求項７】 Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが２２に等しく、
   ｍが１に等しく、ｉが１に等しく、ｋが２に等しく、そしてＢが基−ＣＯＯＣＨ ₃ を示すことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
8. 【請求項８】 Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが１６、２２また
   は２７に等しく、ｍが０に等しく、そしてＢが基−ＯＣＯＣＨ₃を示すことを特
   徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
9. 【請求項９】 Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃が塩素原子を示し、ｎが２１に等しく、
   ｍが０に等しく、そしてＢが基−ＣＯＯＣＨ₃を示すことを特徴とする、請求項
   １〜５のいずれか１項に記載の使用。
10. 【請求項１０】 ＤＮＡチップを製造するための、前記請求項のいずれか１
    項に記載の使用。
11. 【請求項１１】 固体支持体上で核酸を合成するための方法であって、該支
    持体が、請求項１〜９のいずれか１項に定義される式（Ｉ）に対応する少なくと
    も１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層（organized self-a
    ssembled monolayer）で修飾されていること、および以下の工程： ａ）請求項１〜９のいずれか１項に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１
    つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾された固体支持体
    を製造すること［ここで、該オルガノシリコン化合物は、それらの末端に、保護
    されたアミンまたはヒドロキシル官能基を有する］； ｂ）必要に応じて、該アミンまたはヒドロキシル官能基を脱保護すること； ｃ）局所様式で（in a localized manner）、ヌクレオチドを、工程ａ）または
    ｂ）で得られた修飾化固体支持体へ共有結合させること； ｄ）同一または異なるヌクレオチドで少なくとも１回工程ｃ）を繰り返すこと、
    を含むことを特徴とする、方法。
12. 【請求項１２】 前記工程ａ）が以下の工程： ｉ）前記固体支持体から汚染物質を除去し、そしてその表面を水和および／また
    はヒドロキシル化すること、 ｊ）請求項１〜９のいずれか１項に定義される一般式（Ｉ）のオルガノシリコン
    化合物を、少なくとも１つの無極性炭化水素ベース溶媒を含む少なくとも２つの
    溶媒の混合物へ、不活性化雰囲気下で、導入すること［該化合物は、１末端に、
    保護されたアミンまたはヒドロキシル官能基を有する］、 ｋ）工程ｉ）で得られた支持体を、工程ｊ）で調製された溶液中での浸漬によっ
    てシラン化すること、 ｌ）必要に応じて、自己集合単層を有する工程ｋ）で得られたシラン化支持体を
    、５０〜１２０℃の温度で、５分間〜一晩、アニールすること、ならびに ｍ）工程ｋ）またはｌ）で得られた修飾化支持体を、溶媒でリンスすること、 によって行われることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記オルガノシリコン化合物の末端へ、末端アミンまたは
    ヒドロキシル官能基を有するスペーサーアームをグラフトするための工程が、工
    程ａ）またはｂ）の後および工程ｃ）の前に行われることを特徴とする、請求項
    １１または請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 工程ｃ）でカップリングされたヌクレオチドが保護されて
    いること、および工程ｄ）に合成された核酸の脱保護の工程が続くことを特徴と
    する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 【請求項１５】 固体支持体上で核酸を固定化するための方法であって、前
    記支持体が、請求項１〜９のいずれか１項に定義される式（Ｉ）に対応する少な
    くとも１つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾されてい
    ること、および以下の工程： ａ）請求項１〜９のいずれか１項に定義される式（Ｉ）に対応する少なくとも１
    つのオルガノシリコン化合物を含む組織化自己集合単層で修飾された固体支持体
    を製造すること［ここで、該オルガノシリコン化合物は、それらの末端に、保護
    されたアミンまたはカルボン酸官能基を有する］； ｂ）必要に応じて、該アミンまたはカルボン酸官能基を脱保護すること； ｃ）必要に応じて、該修飾化固体支持体が、末端カルボン酸官能基を有する場合
    、これらの官能基を活性化すること； ｄ）工程ａ）、ｂ）またはｃ）で得られた修飾化固体支持体を、局所的に適用さ
    れた（applied locally）、固定化される核酸（単数または複数）の１以上の極
    性溶媒中の１以上の溶液と接触させること［該核酸は、それらの末端の１つで、
    該修飾化固体支持体が必要に応じて保護された末端カルボン酸官能基を有する場
    合にはアミン官能基で、または該修飾化固体支持体が必要に応じて保護された末
    端アミン官能基を有する場合には活性化カルボン酸官能基で官能化されているス
    ペーサーアームを有する］；ならびに ｅ）該核酸が固定されている固体支持体を洗浄すること、 を含むことを特徴とする、方法。
16. 【請求項１６】 工程ａ）が以下の工程： ｉ）前記固体支持体から汚染物質を除去し、そしてその表面を水和および／また
    はヒドロキシル化すること、 ｊ）請求項１〜９のいずれか１項に定義される一般式（Ｉ）のオルガノシリコン
    化合物を、少なくとも１つの無極性炭化水素ベース溶媒を含む少なくとも２つの
    溶媒の混合物へ、不活性化雰囲気下で、導入すること［該化合物は、１末端に、
    保護されたアミンまたはカルボン酸官能基を有する］、 ｋ）工程ｉ）で得られた支持体を、工程ｊ）で調製された溶液中での浸漬によっ
    てシラン化すること、ならびに ｌ）必要に応じて、自己集合単層を有する工程ｋ）で得られたシラン化支持体を
    、５０〜１２０℃の温度で、５分間〜一晩、アニールすること、ならびに ｍ）工程ｋ）またはｌ）で得られた修飾化支持体を、溶媒でリンスすること、 によって行われることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記オルガノシリコン化合物の末端へ、末端アミンまたは
    カルボン酸官能基を有するスペーサーアームをグラフトするための工程が、工程
    ａ）またはｂ）の後および工程ｃ）の前に行われることを特徴とする、請求項１
    ５または請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記核酸がＤＮＡである、請求項１５〜１７のいずれか１
    項に記載の方法を使用して得られることを特徴とする、ＤＮＡチップ。