JP2008505630A - 新規のマイクロ流体システム及び細胞捕獲方法 - Google Patents
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Abstract
Description
−nは、15と35の間、好ましくは20と25の間であり、
−mは、0または1に等しく、
−X1、X2及びX3は互いに同じでも異なってもよく、飽和の、直鎖または分岐C1〜C6アルキル基及び加水分解化可能な基からなる群から選択され、X1、X2またはX3の少なくとも一つは加水分解化可能な基を表し、
−Aは、−O−(CH2−CH2−O)k−(CH2)i−基を表し、ここでkは0と100の間、好ましくは0と5の間の整数を表し、そしてiは0以上、好ましくは0または1と等しい整数を表し、
−Bは、−OCOR、−OR、−COOR、−R−、−COR、−NR1R2、−CONR1R2、COOR、−SRまたはハロゲン原子から選択される基を表し、
−R、R1及びR2は:水素原子、飽和または不飽和ならびに直鎖または分岐炭化水素鎖(これは1以上のハロゲン原子で任意に置換され、そして、1〜24炭素原子、好ましくは1〜6炭素原子を含む)、あるいは、1以上のハロゲン原子で任意に置換された芳香族基から選択される)
に対応する少なくとも一つの有機ケイ素化合物を含有する組織化自己集合単層により修飾される。
a)上述の式(I)に対応する少なくとも一つの有機ケイ素化合物を含む組織化自己集合単層により修飾された固体支持体の製造(ここで前記有機ケイ素化合物は、それらの末端で、保護されたカルボン酸、ヒドロキシルまたはアミン官能基を示す);
b)カルボン酸、ヒドロキシルまたはアミン官能基の必要に応じた脱保護;
c)修飾された該固体支持体へのカップリング剤の必要に応じたグラフト;
d)タンパク質エンティティのグラフト。
i)該固体支持体からの汚染物質の除去、ならびにその表面の水和及び/または水酸化、
j)不活化雰囲気下での、少なくとも一つの非極性炭化水素溶媒を含有する少なくとも2つの溶媒混合物への、上述の式(I)の有機ケイ素化合物(該化合物は、一端が、保護されたカルボン酸、ヒドロキシルまたはアミン官能基を示す)の導入、
k)工程j)で調製した溶液に浸漬することによる、工程i)で得られた支持体のシラン化、
l)自己組織化単層を保有する、50と120℃の間の温度で、5分から一晩の期間の、工程k)で得られたシラン化支持体の必要に応じたアニーリング、及び
m)溶媒、好ましくは極性溶媒の酸による、工程k)またはl)で得られた修飾された支持体のリンス。
(i)−NH2末端を有する鎖の場合:
ホモ二官能性またはヘテロ二官能性のカップリング剤が選択され得る。タンパク質と反応することを目的とされる官能基は、スルホスクシンイミジル(BS3)の有するカルボニル基か、またはスルホ−NHSエステル(スルホ−SMCC)のいずれか一方である。以下が含まれ得る:
−BS3:ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(Staros JV (1982). N-hydroxysulfosuccinimide active esters: Bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linker. Biochemistry, 21, 3950)。これはスキーム1に従い実施される:
ヘテロ二官能性カップリング剤は:
−PMPI:N−(p−マレイミドフェニル)イソシアナート(Annunziato ME at al. (1993). p-Maleimidophenyl isocyanate: a novel heterobifunctional linker for hydroxyl to thiol coupling. Bioconjug. Chem., 4, 212)。これはスキーム4で説明されるように使用される:
ヘテロ二官能性カップリング剤は:
−KMUH:κ−マレイミドウンデカン酸N−ヒドラジド(Trail PA et al. (1993). Science, 261, 212)。これはスキーム5で説明されるように使用される:
捕獲することが望ましいサブ集団の細胞の性質は、このタンパク質エンティティの選択を決定している。後者は、標的のサブ集団に特異的な親和性を示す必要がある。
A.NH2基とSATAの反応(工程I)
a)細胞間接着分子Ep−CAMの過剰発現
上皮組織由来の乳房の固形腫瘍は、Ep−CAM、細胞間接着分子を過剰発現する(Gastl G, Spizzo G, Obrist P et al. (2000). Ep-CAM overexpression in breast cancer as a predictor of survival. The Lancet, 356, 1981)。Ep−CAMはまた、名前:17−1A、ESA、EGP40でも表される。これは、GA733−2遺伝子によりコードされる40kDa膜貫通上皮糖蛋白である(Linnenbach AJ, Woicierowski J, Wu S et al. (1989). Sequence investigation for the major gastrointestinal tumor-associated antigen family, GA733. Proc. Natl. Acad. USA, 86, 27; Gottlinger HG, Funke I, Johnson JP et al. (1986). The epithelial cell surface antigen, a target for antibody-mediated tumor therapy: its biochemical nature, tissue distribution and recognition by different monoclonal antibodies. Int. J. Cancer, 38, 47)。これは、癌腫の大部分で過剰発現する腫瘍抗原として認識され、また転移プロセスに関与する(Litvinov SV, Velders MP, Bakker HA et al. (1994). Ep-CAM: a human antigen is a homophilic cell-cell adhesion molecule. J. Cell Biol., 125, 437)。Ep−CAMは特に免疫療法において治療標的として提案されている。様々なモノクローナル抗体、17−1A、MOC31、Ber−EP4及びHA−125が、この分子の様々なエピトープに対して指向性を有する。モノクローナル抗体Ber−EP4は、Ep−CAMの2つの34及び39kDaのエピトープを認識する(Latza U, Niedobitek G, Schawarting R et al. (1990). Ber-EP4: a new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelia. J. Clin. Pathol., 43, 213)。
b)HER−2の過剰発現
ヒト増殖因子2レセプター(HER−2)/neu(c−erbB−2)の遺伝子は、17qクロモソーム上に局在し、そして上皮増殖因子レセプター(EGFRs)のファミリーまたはHERsのファミリーのチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通タンパク質レセプターをコードする。HER−2/neu遺伝子の増幅またはHER−2(p185HER2)タンパク質の過剰発現は、乳ガン及び様々な癌腫の予後診断因子である(Slamon DJ, Clark GM, Wong SG et al. (1987). Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the Her-2/neu oncogene. Science, 235, 177)。抗−HER−2抗体(トラスツズマブ(Trastuzumab))が抗腫瘍治療に使用される。
c)MUC1の過剰発現
ムチンは、呼吸器系の空気/水界面のようなラフな環境状況(rough environmental context)、胃の酸性環境、肝臓、膵臓、胆嚢、腎臓、唾液腺、涙腺及び眼のような分化した器官の分泌性上皮表面と腸との複合環境にある様々なタイプの正常上皮細胞により発現される。ムチンのファミリーは少なくとも17の分泌または非分泌分子を含み、またホメオスタシスを維持する主要な役割を果たす(Hollingsworth MA and Swanson JB (2004). Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Reviews Cancer, 4, 45)。
1−デバイス
層流チャンバーによる細胞捕獲を図2に説明する。
保護されたヒドロキシル末端、保護されたアミン末端または保護された酸末端を含むクロロシラン官能基によりグラフトされた固体支持体は、キャビティ(2)を閉鎖するために上述のようにキャビティ(2)に固定化される。該デバイスの他の機械的な構成要素は図2のように配置される。末端の官能基を脱保護するための試薬は、レセプタクル(14)のうちの一つからキャビティ(2)に注入され、そしてカップリング剤がキャビティ(2)に注入され、そして最終的には認識生物分子である。これは、図2に記載の機械的デバイスから、好適な順序での試薬の注入によりクロロシランによってグラフト化された壁(固体支持体)を官能化することを可能にし、これがリンス工程を中間工程として提供することを可能にするためである。
2−CTCsの分離のためのプロトコール
乳ガンの拡散を被った患者からの及び/またはガンでないコントロールからの3〜5ml量の末梢血を5mMのEDTA(エチレンジアミン四酢酸)を含有するHanks’ medium (In VitroGen)に慣用的に引き抜く。次いで、予め好適に与えられたチューブ(Leucosep)中のFicoll(Amersham)を含有するグラディエント上で、赤血球及び血小板から有核細胞(白血球及び腫瘍細胞)を分離する。次いで、層流チャンバーを使用して細胞を分離する前に、白血球及びCTCsを含有する細胞画分を、mlあたり1×106cellsの割合で0.1%HSA(ヒト血清アルブミン)を含有するHanks’ medium中に希釈する。蠕動ポンプのスループットは、剪断速度15s−1と剪断応力0.15dync/cm2に対応して、約50μl/分に調整される。
3−腫瘍表現型の分子的特徴付け
分離されたCTCsの特徴付けのための様々なプロセスが適用され得る。
a)CTCsの形態学的、免疫細胞学的及び遺伝学的特徴付け
−免疫組織化学(IHC)による:抗体によるマーキングの検出:抗ケラチン(CK19、CK20、CK22)、白血球特異的抗−CD45
−腫瘍マーカー(IHC及びRT−PCR):HER−2/neu、テロメラーゼ、MUC−1の過剰発現
b)細胞遺伝学的特徴
−CGH(比較 in situ ハイブリダイゼーション)
−FISH(蛍光 in situ ハイブリダイゼーション)
4−他の適用
a−出生前診断
本プロセスはまた、母体血液中の胎児細胞の初期の遺伝子分析のための出生前診断において産科学においてに使用され得る(Bianchi D. (1999). Fetal cells in the maternal circulation: feasibility for prenatal diagnosis. Br. J. Maematol., 105, 574; Fisk N. (1998). Maternal-fetal medicine and prenatal diagnosis. Curr. Opin. Obstet. Gynecol., 10, 81)。我々のプロセスにおいて標的となる胎児細胞集団は、上皮タイプの栄養細胞を含むものであり、そして妊娠の最初3ヶ月のあいだの短い期間のものである(Shulman LP. (2003). Fetal cells in maternal blood. Current Women’s Health Reports 3, 47)。この細胞集団の密度は非常に低い:106母細胞あたり〜1胎児栄養芽細胞。細胞捕獲は、上皮膜抗原に指向性を有する抗体、または、ヒト胎盤ラクトゲンに指向性を有する抗体を使用して実施され得る(Latham SE, Suskin HA, Petropoulos A et al. (1996). A monoclonal antibody to human placental lactogen hormone facilitates isolation of fetal cells from maternal blood in a model system. Prenat. Diagn., 16, 813)。
本プロセスの他の適用は骨髄及び末梢血におけるCTCsの検出に関する(章15:Tumor Cell Contamination (2001). Autologous Blood and Marrow Transplantation X: Proceedings of the Tenth International Symposium, edited by Karel A. Dicke and A. Keating)。
Claims (27)
- 細胞集団に特異的な認識生物分子の層で固定されたシランの組織化自己集合層によりその内壁(5)がグラフトされている、流体の循環のためのチャンバー(1)を備えた細胞集団を捕獲するためのマイクロ流体デバイスであって、シランの組織化自己集合層が、式(I):
−nは、15と35の間、好ましくは20と25の間であり、
−mは、0または1に等しく、
−X1、X2及びX3は互いに同じでも異なってもよく、飽和の、直鎖または分岐のC1〜C6アルキル基及び加水分解化可能な基からなる群から選択され、X1、X2またはX3の少なくとも一つは加水分解化可能な基を表し、
−Aは、−O−(CH2−CH2−O)k−(CH2)i−基を表し(ここでkは0と100の間、好ましくは0と5の間の整数を表し)、そしてiは0以上、好ましくは0または1と等しい整数を表し、
−Bは、−OCOR、−OR、−COOR、−R−、−COR、−NR1R2、−CONR1R2、COOR、−SRまたはハロゲン原子から選択される基を表し、
−R、R1及びR2は:水素原子、飽和または不飽和ならびに直鎖または分岐炭化水素鎖(これは1以上のハロゲン原子で任意に置換され、そして、1〜24炭素原子を含む)、あるいは、1以上のハロゲン原子で任意に置換された芳香族基から選択される(R=HまたはR=アルカリのとき、B≠−Rと理解される))
に対応する少なくとも一つの有機ケイ素化合物を含むことを特徴とする、マイクロ流体デバイス。 - 生物分子層が、カップリング剤層を介してシランの組織化自己集合層と結合することを特徴とする、請求項1に記載のデバイス。
- 特異的なグラフトを備えた流体の循環のためのチャンバー(1)の内壁(5)が、ガラスまたはシリコンスライド、あるいは表面に−OH官能基を備えた任意の固体金属表面であり得る固体支持体(5)から構成されることを特徴とする、請求項1または2に記載のデバイス。
- 流体の循環のためのチャンバー(1)の寸法が、それが層流チャンバーであるように選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のデバイス。
- 流体の循環のためのチャンバー(1)が、キャビティの二つの端に配置される2つのオリフィス(3、4)を備えた平行六面体(parallelepipedal)タイプのキャビティ(2)を備え、流体が第一オリフィス(3)を介して注入され、そして第二オリフィス(4)を介して収集されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
- 流体の循環のためのチャンバー(1)が、30μl以下、さらに好ましくはまた12μl以下の容量を有するキャビティ(2)を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
- 流体の循環のためのチャンバー(1)に試料流体を注入することを可能にするポンプ(10)を備えることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
- 特異的なグラフトを備えた壁(5)が、流体の循環のためのチャンバー(1)を通過する流れと平行であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
- 加水分解可能な基が:ハロゲン原子、−N(R’)2基及び−OR’基から選択され、R’が飽和、直鎖または分岐C1〜C6アルキル基であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一つに記載のデバイス。
- X1、X2及びX3が塩素原子を表すことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一つに記載のデバイス。
- nが22以上であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一つに記載のデバイス。
- 該カップリング剤が:
−ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート;
−スルホスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)−1−シクロへキサンカルボキシレート
−プロテインA
−プロテインG
−N−(p−マレイミドフェニル)イソシアナート
−κ−マレイミドウンデカン酸N−ヒドラジド
から選択されることを特徴とする、請求項2に記載のデバイス。 - 該認識生物分子がタンパク質であり、そのリシンの側鎖NH2官能基がチオール(SH)基に変換されていることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
- 該認識生物分子が:
− モノクローナル抗体17−1A、MOC31、Ber−EP4及びHA−125(これらは細胞間接着分子Ep−CAMを認識する)
− 抗−HER−2(抗−ヒトErB2)抗体
− 抗−MUC1(CT2 Mab)抗体
から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。 - キャビティ(2)ならびに細胞及び流体の循環のためのインレット(3)とアウトレット(4)オリフィスを備えた層流チャンバー(1)、化学的に官能化され且つ該キャビティ(2)に固定されたチャンバーの床を構成する除去可能なガラスまたは結晶性Siスライド(5)、該開口部(3、4)を介する流体の導入及び排出を制御する蠕動ポンプ(10)、生物試料(11)が配置される少なくとも一つのレセプタクル(12)、レセプタクル(12)を該開口部(3)に接続する少なくとも一つの循環チューブ(13)、ならびに該開口部(4)に接続された少なくとも一つのアウトレットチューブ(18)を備えることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
- レセプタクル(12)が、層流チャンバー(1)に導入するためのチューブ(17)を介して開口部(3)に接続されていることを特徴とする、請求項15に記載のデバイス。
- 試薬(14a、14b)を備える少なくとも一つのレセプタクル(14)、チューブ(17)を介してレセプタクル(14)を開口部(3)に接続する循環チューブ(15)、該チューブ(15)及び(13)及び(17)間の接続を調節するための該循環チューブ(15)、(13)及び(17)の交差部分のバルブ(16)を備えることを特徴とする、請求項16に記載のデバイス。
- キャビティ(2)と接続した排出チューブ(20)及び再循環チューブ(21)ならびに該チューブ(18)、(20)及び(21)間の流体を方向付けるためのバルブ(19)を備えることを特徴とする、請求項15に記載のデバイス。
- 請求項1〜19のいずれか一つに記載のデバイスの流体の循環のためのチャンバー(1)に生物試料を通過させる工程を含むことを特徴とする、生物試料中の細胞捕獲プロセス。
- 流体の循環のためのチャンバー(1)に生物試料を通過させる少なくとも2工程を含むことを特徴とする、請求項19に記載のプロセス。
- さらに、細胞を脱着する工程を含むことを特徴とする、請求項19または請求項20に記載のプロセス。
- 生物試料中の細胞集団の捕獲における、請求項1〜18のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
- 10pN〜1nN、有利には20pN〜500pN、好ましくは30〜300pN、さらに好ましくは50〜150pNの範囲の強さで、細胞がその受容体と相互作用を有する特異的表面マーカーの、生物試料中の細胞集団の捕獲における、請求項22に記載の使用。
- 血液試料からの循環している腫瘍細胞の精製及び特徴付けにおける、請求項1〜18のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
- 乳ガン、前立腺ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、肝臓ガン、結腸ガンまたは肺ガンから選択される病状の進行の診断及びモニタリングにおける、請求項24に記載の使用。
- 母体由来の血液試料からの胎児細胞の精製及び特徴付けにおける、請求項1〜18のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
- 骨髄中の循環している腫瘍細胞の検出における、請求項1〜18のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
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