CA2573044A1 - Nouveau systeme microfluidique et procede de capture de cellules - Google Patents

Abstract

Dispositif microfluidique et ses applications pour la capture de sous-population de cellules au sein d'un fluide biologique. Le dit dispositif comporte une chambre (1) de circulation des fluides dont une paroi interne (5) est dotée d'un greffage par une couche de silane autoassemblée organisée, à
laquelle est fixée une couche de biomolécules de reconnaissance spécifiques de la population de cellules.

Description

NOUVEAU SYSTEME MICROFLUIDIQUE ET PROCEDE DE CAPTURE DE
CELLULES
L'invention,a pour objet un nouveau dispositif microfluidique et son utilisation pour la capture de sous populations de cellules au sein d'un fluide biologique.
Plus particulièrement l'invention concerne un dispositif comportant une chambre de circulation des fluides dont une paroi est dotée d'un greffage permettant la capture d'une sous population de cellules au sein d'un échantillon biologique mis en circulation dans cette chambre. Ce dispositif permet la capture de cellules présentes en très petite quantité dans cet échantillon biologique. L'invention a également pour objet un procédé de capture de cellules au sein d'un échantillon biologique, ce procédé
étant caractérisé en ce qu'il comporte une étape de passage de l'échantillon biologique dans un tel dispositif.
Le dispositif de l'invention peut être utilisé pour la purification et la caractérisation des cellules tumorales circulantes à partir d'un échantillon de sang du patient ou pour la purification et la caractérisation de cellules feetales à
partir d'un échantillon sanguin prélevé chez la mère.
Le cancer du sein est la tumeur maligne la plus fréquente chez la femme en Europe et aux Etats-Unis. Le contrôle de la dissémination métastatique est un facteur important dans le pronostic de la pathologie. La purification et la caractérisation moléculaire des cellules tumorales circulantes (CTC) représentent un enjeu primordial dans le suivi de patientes, à la fois comme paramètre d'appréciation de la maladie micrométastatique à un stade précoce, et comine outil phénotypique et génotypique à un stade tardif.
La possibilité de purifier et de caractériser des cellules tumorales circulantes présente un intérêt majeur dans le diagnostic et le suivi de l'évolution du cancer du sein mais également d'autres types de cancer comme le cancer de la prostate, du rein, de la vessie, du foie, du côlon, du poumon.
Les procédures actuelles de purification de CTC utilisent le CELLection kit qui fonctionne suivant le principe de séparation des cellules par capture par des billes magnétiques sur lesquelles l'anticorps anti-épithélial spécifique est greffé
(Dynal(M RAM
IgGI CELLectionTM Kit). Cette méthode combine plusieurs étapes de centrifugation très lourdes. Elle demande pratiquement un jour et demi de manipulation. Les rendements sont très faibles. Il y a beaucoup de pertes de CTC principalement dues à leur accrochage aux billes magnétiques. C'est pour cette raison que cette technique est difficilement utilisable en application clinique de routine.
On connaît dans l'art antérieur des dispositifs comprenant une chambre à
flux laminaire et permettant la capture de cellules.

2 Le document WO 03/091730 décrit un dispositif destiné à contrôler la migration des leucocytes, ce dispositif comportant deux chambres reliées entre elles par un canal. L'objectif est d'étudier les mécanismes de liaison des leucocytes aux parois des vaisseaux sanguins. Des composés médiateurs de la migration des leucocytes composés de cellules endothéliales peuvent être placés dans le canal. Des composés à
tester peuvent également être placés dans ce dispositif.
Le document US-2003/0044766 décrit un procédé et un dispositif pour détecter une interaction entre deux types de cellules, l'une étant fixée dans un passage soumis à un flux laininaire d'une dispersion comprenant le second type de cellule.
Ce dispositif est destiné à étudier les interactions entre des populations de leucocytes et des cellules endothéliales.
Le document A. Pierres et al., Faraday Discuss., 1998, 111, 321-330 décrit l'utilisation d'une chambre à flux laminaire pour étudier la formation de liaisons entre des sphères recouvertes de streptavidine et les parois de la chambre greffées par de la biotine.
Le document M.R. Wattenberger et al., Biophys. J., vol. 57, April 1990, 765-777 étudie de façon détaillée les paramètres qui régissent l'interaction entre une surface recouverte par un ligand et des cellules porteuses d'un récepteur. Des récepteurs incorporés dans des liposomes ont servi de modèle de cellule. Les essais ont été faits dans une chambre à flux laminaire.
La force de cisaillement, la force de la liaison ligand-récepteur, la densité
de récepteurs sur la surface sont des paramètres importants.
Le document WO 00/23802 décrit une méthode de diagnostic permettant de détenniner la capacité de liaison de cellules dans un échantillon biologique consistant à
faire passer cet échantillon sur une surface couverte d'un substrat se liant à
ces cellules.
Ce document est plus particulièrement orienté vers le diagnostic des anomalies plaquettaires et des thromboses. Les conditions de cisaillement qui sont appliquées sont destinées à imiter les conditions que connaissent ces cellules in vivo dans les vaisseaux sanguins.
Toutefois, les documents de l'art antérieur concernent essentiellement des dispositifs et des procédés destinés à étudier des interactions entre deux populations cellulaires : les leucocytes et les cellules endothéliales, à étudier l'adhérence plaquettaire ou des modèles cellulaires (sphères liposomes) porteurs de récepteurs.
Aucun de ces documents ne concerne la capture et l'étude de cellules tumorales circulantes ou de cellules foztales.
Les documents de l'art antérieur concernent l'étude du comportement de populations de cellules qui sont présentes en grande concentration dans les échantillons

3 traités et qui sont couvertes de récepteurs présents à leur surface avec une densité très élevée.
Les cellules auxquelles s'intéresse plus particulièrement la présente invention ont la particularité d'être présentes en très faible concentration dans les échantillons biologiques étudiés, au milieu d'autres populations de cellules fortement majoritaires. Les récepteurs spécifiques de ces cellules sont exprimés en faible densité à
leur surface. Ce sont ces deux particularités qui rendent leur capture et leur identification au sein d'un échantillon biologique particulièrement difficiles.
L'utilisation d'un dispositif à flux laminaire de l'art antérieur dont une paroi serait greffée de façon classique par un ligand des CTC ne permet pas de capturer de CTC au sein d'un échantillon sanguin car celles-ci sont présentes en trop faible quantité et l'interaction antigène-anticorps concernée par cette capture est de l'ordre de 50 à 150 piconewtons, ce qui est extrêmement faible par comparaison avec les interactions des molécules d'adhérence entre deux populations de cellules. L'invention concerne plus particulièrement la capture d'une population de cellules dont les marqueurs spécifiques de surface ont une interaction avec leurs récepteurs d'une intensité allant de lOpN à 1nN, avantageusement de 20pN à 500pN, préférentiellement de 30 à 300pN, plus spécifiquement de 50 à 150pN.
Les problèmes que vise à résoudre la présente invention sont la capture d'une population cellulaire minoritaire du type CTC au sein d'un échantillon biologique, en utilisant une quantité réduite d'échantillon biologique, et en ayant un rendement de capture aussi élevé que possible.
Ce problème a pu être résolu grâce à un dispositif comprenant une chambre de circulation des fluides dont une paroi interne est dotée d'un greffage particulier.
Le greffage dont est doté le dispositif de l'invention possède la particularité de présenter une surface régulière homogène sur laquelle peut être greffée une population de ligands spécifiques de la sous population de cellules que l'on cherche à
capturer. L'homogénéité de surface favorise des interactions ligand-récepteur ou antigène-anticorps de faible intensité qui dans d'autres conditions matérielles ne permettraient pas d'effectuer cette capture.
Une chambre de circulation des fluides comporte une cavité, de préférence une cavité de type parallélépipédique, comportant deux orifices placés à deux extrémités de la cavité, le fluide étant injecté par un premier orifice et collecté par un second orifice.
Les dimensions de la chambre de circulation des fluides sont avantageusement choisies de façon à ce qu'elle soit une chambre à flux laminaire. Il peut également s'agir d'une cavité d'un dispositif microfluidique comme celui décrit dans le

4 PCT/FR2005/001753 document US-6,408,878. Avantageusement, la cavité interne de la chainbre de circulation des fluides a un volume inférieur ou égal à 30 l, encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 12 l, ce qui permet de traiter des échantillons biologiques de volume réduit.
Avantageusement le dispositif est muni d'une pompe permettant d'injecter le fluide échantillon dans la chambre de circulation des fluides.
Avantageusement encore le dispositif comporte un circuit de circulation du fluide en boucle relié à une pompe, de telle sorte que l'échantillon à traiter passe plus d'une fois dans la chambre de circulation des fluides avant d'être collecté.
Selon la présente invention au moins une paroi de la chambre de circulation des fluides est dotée d'un greffage particulier. De préférence il s'agit d'une paroi parallèle au flux qui traverse la chambre de circulation des fluides. De préférence la chambre de circulation des fluides est un parallélépipède et l'une de ses faces internes comporte un greffage particulier.
La paroi de la chambre de circulation des fluides dotée d'un greffage particulier est constituée d'un support solide, qui peut être une lame de verre ou de silicium ou de toute surface solide métallique comportant des fonctions -OH en surface, qui est placée dans la chambre de circulation des fluides.
La surface de support solide, lame de verre, de Si ou autre est fonctionnalisée par une couche homogène, monomoléculaire auto-assemblée de chaînes chlorosilanes.
Une entité protéique de reconnaissance de la population de cellules cibles, notamment de cellules tumorales circulantes (anticorps ou ligand protéique) est greffée directement ou par l'intermédiaire d'un agent de couplage adéquat sur la couche de chlorosilanes. La sélectivité de la biomolécule de reconnaissance est déterminante pour la capture de la population de cellules cibles. Le support solide (lame) préparé
est ensuite monté dans le dispositif de circulation des fluides.
La fonctionnalisation du support solide pour la capture cellulaire comprend 3 étapes : le greffage de cholorosilanes sur la lame de verre, le greffage d'un agent de couplage (qui peut être un agent de couplage chimique ou un agent de type protéine A ou G) et en final le greffage d'une entité protéique de reconnaissance (anticorps, ou le ligand d'un récepteur membranaire d'une cellule). La Figure 1 illustre une laine de verre de ce type greffée par un anticorps : le support solide est greffé par une couche de silane autoassemblée organisée, à laquelle est fixée par une liaison covalente une couche d'agent de couplage (linker). Une couche de biomolécules de reconnaissance spécifique de la population cellulaire cible est fixée de façon covalente ou non à l'agent de couplage. La présence de la couche d'agent de couplage est facultative : selon une variante de l'invention, on peut prévoir que les biomolécules de reconnaissance soient directement fixées sur la couche de silane autoassemblée organisée.

Pour effectuer l'immobilisation de façon covalente de molécules organiques sur une surface minérale, il est tout d'abord nécessaire de greffer sur celle-ci des molécules de couplage qui vont assurer la fixation des molécules organiques sur le substrat minéral.

5 Des molécules de couplage organosiliciées ont été proposées dans ce but par L.A. Chrisey et al. (Nucléic Acids Research, 1996, 24, 15, 3031-3039) et U. Maskos et al. (Nucléic Acids Reseai-ch, 1992, 20, 7, 1679-1684). Les molécules utilisées, à savoir le 3-glycidoxypropyltriméthoxysilane et différents aminosilanes, présentent toutefois l'inconvénient de se déposer de façon aléatoire et non reproductible sur la surface. Ils y forment un film inhomogène dont l'épaisseur ne peut être contrôlée, film qui est en outre peu robuste vis-à-vis de traitements chimiques ultérieurs, l'inhomogénéité du film indiquant en effet une mauvaise protection des liaisons siloxaniques. Il est donc très difficile d'obtenir un greffage reproductible de ces molécules. Avant de fixer ou de synthétiser des oligonucléotides sur le substrat, des réactions de surface supplémentaires sont nécessaires pour diminuer la gène stérique à la surface (par exemple greffage de molécules hétérocycliques bifonctionnelles, comme décrit par L.A. Chrisey et al.), rendre la surface plus hydrophile (U. Maskos et al. décrivent le greffage d'éthylène glycol, de penta- ou d'hexa-éthylèneglycol) et/ou pallier la faible réactivité des fonctions de surface, opérations supplémentaires qui, elles aussi, ne sont pas maîtrisées.
A. Ulman a décrit, dans Chefu. Rev., 1996, 96, 1533-1554, la formation de monocouches autoassemblées organisées sur des supports solides à l'aide de composés organosiliciés de type alkyltrichlorosilanes fonctionnalisés. Leur utilisation pour la fixation de biomolécules est proposée, méthode qui nécessite vraisemblablement, dans ce contexte, une modification de la biomolécule par une fonction thiol et une modification de la surface par des molécules hétérobifonctionnelles.
Pour pallier ces inconvénients des composés organosiliciés ont été décrits dans le document WO 01/53303. Ces composés peuvent être utilisés comme molécules de couplage pour déposer à la surface d'un support solide, une monocouche autoassemblée organisée. De telles molécules ont été utilisées notamment pour l'imm.obilisation de biomolécules telles que des acides nucléiques.
Contrairement aux méthodes de greffage de biomolécules de l'art antérieur, la méthode décrite dans WO 01/53303 permet d'obtenir un support solide greffé
par des biomolécules immobilisées sur une monocouche autoassemblée organisée.
Cette caractéristique se traduit par la présentation d'une surface homogène de biomolécules qui favorise la capture d'une population minoritaire de cellules, dotées d'une faible densité de capteurs spécifiques dans un échantillon biologique circulant sur cette surface.

6 En effet les greffages de l'art antérieur ne permettaient pas d'obtenir une homogénéité de surface satisfaisante et ce défaut a pour conséquence un faible taux de capture de cellules cibles minoritaires au sein d'un échantillon biologique.
Dans le dispositif de l'invention, le support solide est modifié par une monocouche autoassemblée organisée comprenant au moins un composé
organosilicié
répondant à la formule (I) :

X, X2\Si-(CH2)n-(A)m-B

X3 (I) dans laquelle :
- n est compris entre 15 et 35, de préférence entre 20 et 25, -mestégalà0ouà1, - Xl, X2 et X3, qui peuvent être identiques ou différents entre eux, sont sélectionnés dans le groupe constitué par des groupes alkyles saturés en CI à
C6, linéaires ou ramifiés, et les groupement hydrolysables, au moins l'un de Xi, X2 ou X3 représentant un groupement hydrolysable, - A représente un groupement -O-(CH2-CH2-O)k-(CH2);- dans lequel k représente un nombre entier compris entre 0 et 100, de préférence entre 0 et 5, et i représente un nombre entier supérieur ou égal à 0, de préférence égal à 0 ou à
1, - B représente un groupement choisi parmi -OCOR, -OR, -COOR, -R, -COR, -NR1R2, -CONR1R2, COOR, -SR, un atome d'halogène, - R, Rl, R2 étant choisis parmi : un atome d'hydrogène, une chaîne hydrocarbonée éventuellement substituée par un ou plusieurs atomes d'halogène, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, comprenant 1 à 24 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 6 atomes de carbone, ou un groupement aromatique éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène.
On entend par aromatique tout groupement qui possède un ou plusieurs noyaux aryles, par exemple un noyau phényle.
On entend par monocouche autoassemblée organisée un assemblage de molécules dans lequel les molécules sont organisées, organisation due à des interactions et à une forte cohésion entre les chaînes des molécules, donnant lieu à un film anisotrope stable et ordonné (A. Ulinan, Cheni. Rev., 1996, 96, 1533-1554).
Une monocouche autoassemblée organisée formée sur un support solide permet l'obtention d'une surface organique dense, homogène et de paramètres bien définis à la fois chimiquement et structurellement. La formation de cette monocouche, obtenue

7 grâce aux propriétés d'autoassemblage des composés de formule (I) pour des valeurs de n, m, k et i bien définies, est parfaitement reproductible pour chaque composé
organosilicié.
En outre, la formation d'une monocouche autoassemblée organisée, très dense, protège les liaisons siloxaniques vis-à-vis des traitements chimiques (acides ou basiques), ce qui permet de réaliser des réactions chimiques variées sur cette surface.
Les composés organosiliciés de 'formule (I) utilisés dans la présente invention présentent avantageusement des fonctionnalités très variées et une grande réactivité, eu égard à la nature du groupe A et à la diversité des groupements B terminaux utilisables, ces groupement B pouvant bien entendu être modifiés et fonctionnalisés à
volonté selon les réactions de chimie organique bien connues de l'homme du métier.
Les composés décrits ci-dessus permettent, de façon particulièrement avantageuse et de par les composés organosiliciés de formule (I) sélectionnés, d'immobiliser des biomolécules sur un support de façon fiable et reproductible, eu égard à
l'homogénéité et à la stabilité de la monocouche autoassemblée organisée formée sur le support. Les biomolécules sont immobilisées sur le support modifié par des liaisons covalentes fortes, sans dégradation des liaisons siloxaniques développées entre les composés organosiliciés et le support solide.
Des supports solides convenables sont, de manière générale, ceux dont la surface est hydratée et/ou ceux dont la surface présente des groupements hydroxyles. De préférence, ledit support est sélectionné dans le groupe constitué par les verres, les céramiques (par exemple de type oxyde), les métaux (par exemple l'aluminium ou l'or) et les métalloïdes (tel que le silicium).
Au sens de la présente invention, on entend par hydrolysable tout groupe capable de réagir avec un acide en milieu aqueux de façon à donner les composés X1H, X2H ou X3H, XI, X2 et X3 étant tels que définis dans la formule (I).
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux, ledit groupement hydrolysable est sélectionné dans le groupe constitué par les atomes d'halogène, le groupement N(R)2 et les groupements -OR', R' étant un groupe alkyle saturé en CI à C6, linéaire ou ramifié.
En ce qui concerne les groupements B et les groupements hydrolysables, des atomes d'halogène convenables sont aussi bien le fluor que le chlore, le brome ou l'iode.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux, XI, X2 et X3 représentent des atomes de chlore.
Avantageusement, n est supérieur ou égal à 22.
L'utilisation de supports solides modifiés selon la présente invention est particulièrement avantageuse pour la préparation de supports sur lesquels sont fixés, de façon covalente, des entités protéiques (anticorps, ligand d'un récepteur cellulaire,

8 protéine...) susceptibles de fixer de façon sélective des cellules représentant une sous population au sein d'un échantillon biologique.
La préparation du support solide greffé selon la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) préparation d'un support solide modifié par une monocouche autoassemblée organisée comprenant au moins un composé organosilicié répondant à la formule (I) telle que définie précédemment, dans lequel lesdits composés organosiliciés présentent à leur extrémité une fonction acide carboxylique hydroxyle ou amine protégée ;
b) éventuellement, déprotection de la fonction acide carboxylique hydroxyle ou amine ;
c) éventuellement, greffage d'un agent de couplage sur le support solide modifié ;
d) greffage de l'entité protéique.
L'étape a) est avantageusement réalisée par les étapes suivantes i) élimination des contaminants du support solide et hydratation et/ou hydroxylation de sa surface, j) introduction dans un mélange d'au moins deux solvants comprenant au moins un solvant hydrocarboné non polaire, sous atmosphère inerte, d'un composé
organisilicié de formule (I) telle que définie ci-dessus, ledit composé
présentant à une extrémité une fonction acide carboxylique hydroxyle ou amine protégée, k) silanisation du support obtenu à l'étape i) par immersion dans la solution préparée à l'étape j), 1) éventuellement, recuit du support silanisé obtenu à l'étape k), portant la monocouche autoassemblée, à une température comprise entre 50 et 120 C, pour une durée de 5 minutes à une nuit, et m) rinçage du support modifié obtenu à l'étape k) ou 1) à l'acide d'un solvant, de préférence polaire.
La préparation de supports solides fonctionnalisés par une couche de silanes est illustrée de façon détaillée dans le document WO01/53303.
Par contaminants du support solide, on entend tout composé tel que de la graisse, des poussières ou autres, présent à la surface du support et qui ne fait pas partie de la structure chimique du support lui-même.
Selon la nature du support solide, l'étape i) peut être effectuée à l'aide d'un ou plusieurs solvants et/ou oxydants et/ou hydroxylants (par exemple un mélange sulfochromique), d'une solution de détergent (par exemple Hellmanex(D), d'un traitement photochimique à l'ozone ou tout autre traitement approprié.
L'étape j) peut avantageusement être réalisée dans un mélange d'au moins un solvant hydrocarboné non polaire et d'au moins un solvant polaire.
Dans ce cas,

9 les proportions volumiques de solvant non polaire et de solvant polaire sont de préférence comprises entre 70/30 et 95/5.
A titre d'exemple et de façon non limitative, au cours de l'étape j), un solvant hydrocarboné non polaire utilisable est le cyclohexane et un solvant polaire utilisable est le chloroforme.
Lors de l'étape j), la concentration du composé organosilicié dans le mélange de solvants est de préférence comprise entre 1.10-5 et 1.10-2 mole/litre.
L'étape k) de silanisation du support peut être effectuée pendant un temps compris entre 1 minute et 3 jours et à une température comprise entre -

10 C et 120 C selon les solvants utilisés.
L'étape c) de greffage d'un agent de couplage peut être mise en oeuvre de façon différente en fonction de la nature de la fonction terminale du groupe de formule (I).
(i) Dans le cas des chaînes à terminaison -NH2 :
Un agent de couplage homo-bifonctionnel ou hétéro-bifonctionnel peut être choisi. Le groupement fonctionnel destiné à réagir avec la protéine est soit le carbonyle en a du sulfosuccinimidyl (BS3) soit l'ester de sulfo NHS (Sulfo-SMCC). Il peut s'agir de :
- BS3 : subérate de bis(sulfosuccinimidyle) (Staros JV. (1982) N-Hydroxysulfosuccinimide active esters: Bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linker.
Biochemistry 21:3950.), que l'on met en oeuvre suivant le schéma 1 S 3Na ~-NH2 Na035 p O 1303Ne ~---O
~N~"O-G-CMa-'CH7-Gti-CFL~CFtz"CHz-C--0-N ~
~O O

- Sulfo-SMCC : Carboxylate de 1-cyclohexane-4-(N-maléimidométhyle) sulfosuccinimidyle (Samoszuk MK et al. (1989) Antibody, Immunocojugates.
Radiopharm 2:37), que l'on met en oeuvre suivant le schéma 2:

NH2 NH---~
0 o sOo 5 O-N Na+O' 2 ~
N _~\-~0 O
~

10 - A la place d'un agent de couplage chimique, la protéine A (PA) ou la protéine G (PG) peuvent jouer le rôle d'agent de couplage (Eliasson M, Olsson A, Palmcrantz E et al. (1988) Chimeric-binding receptors engineered from Staphylococcal protein A and Streptococcal protein G. J Biol Chem 263:4323). Dans ce cas, PA
ou PG
peut être couplé directement à la chaîne chlorosilane terminée en NH2 en présence de EDC
[Chlorydrate de 1-éthyle-3-(3-Diméthylaminopropyle)carbodiimide] (Grabarek Z
and Gergely J (1990) Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal Biochem 185:131). Cette variante est illustrée par le schéma 3 [~-NH2 + NH2 ~~ - NH2 Protéine A ou G

(ii) Dans le cas des chaînes terminées en OH :
Un agent de couplage hétéro-bifonctionnel est :
- PMPI : Isocyanate de N-(p-maléimidophényle) (Annunziato ME et al.
(1993) p-maleimidophenyl isocyanate : a novel heterobifunctionnal linker for hydroxyl to thiol coupling. Bioconjug Chem 4:212) dont la mise en oeuvre se fait comme illustré par le schéma 4:

11 ~- p H 0---N O
O
-=.,~ ~ / o N

(iii) Dans le cas des chaînes terminées en COOH
L' agent de couplage hétéro-bifonctionnel est :
- KMUH : N-hydrazide de l'acide k-maléimidoundécanoique (Trail PA, et al (1993) Science 261:212) dont la mise en oeuvre se fait comme illustré
par le schéma 5:

/ H
LcooH N ",NH-çQ-~

H
/N N
0 NHz - Dans le cas des chaînes à terminaison en -COOH, il est également possible d'utiliser la protéine A ou la protéine G comme décrit ci-dessus.
A l'étape d) on choisit l'entité protéique en fonction de l'utilisation que l'on souhaite faire du dispositif :
La nature de la sous-population de cellules que l'on cherche à capturer est déterminante pour le choix de cette entité protéique. Cette dernière doit présenter une affinité spécifique pour la sous-population ciblée.
La stratégie de la capture des CTC est fondée sur les propriétés de reconnaissance des molécules de la surface cellulaire. Ces molécules sont des molécules d'adhérence cellulaire, ou des récepteurs membranaires. La capture cellulaire est médiée par l'interaction de ligands spécifiques avec ses récepteurs ou d'anticorps dirigés contre un épitope d'une molécule d'adhérence ou d'un récepteur.
Quelle que soit l'entité protéique utilisée pour la capture cellulaire (ligand ou anticorps), il est nécessaire de modifier les fonctions NH2 latérales des lysines de la protéine de reconnaissance et de les transformer en groupement hydrosulfure (SH).

12 Dans le cas d'un anticorps, pour une reconnaissance antigène-anticorps, la modification du NH2 latéral de la lysine située sur la portion Fc a une grande importance car elle permet de laisser les sites de liaison libres sur les fragments Fab, ces sites étant nécessaires à la reconnaissance des antigènes cellulaires.
La stratégie de fixation de l'entité protéique de reconnaissance peut consister dans l'utilisation du réactif SATA Acétate de (N-Succinimidyl-S-acétyle) par un procédé comprenant deux étapes (Duncan RJS, Weston PD et al. (1983) A new reagent which may be used to introduce sulfhydryl groups into proteins, and its use in the preparation of conjugates for immunoassays. Anal Biochem 132:68) comme illustré sur les schémas 6 et 7, ou du réactif de TRAUT (2-iminothiolane=HCl), comme illustré
sur le schéma 8, (Ghosh SS, Kao PM, McCue AW et al. (1990) Use of maleimide thiol coupling chemistry for efficient suntheses of oligonucleotide-enzyine conjugate hybridization probes. Bioconjug Chem 1:71) :

A. Réaction des NH2 avec SATA (étape I) NH2 N~0 J~ S~CH3 H$~CH3 +
H,OH

B. Déprotection des SH par l'hydroxylamine (étape II) 5 CH3 + NHzOH=HCt $x H H
II

H

C. Modification des NHZ par le réactif de TRAUT

13 s NH2C( NH2CI
NH2 + ~ -- ~ sH
N

Quelques exemples d'anticorps reconnaissant des molécules de surface et destinés à être greffés dans le dispositif de l'invention :
a) Sur-expression de la molécule d'adhérence intercellulaire Ep-CAM
Les tumeurs solides du sein dérivant des tissus épithéliaux sur-expriment Ep-CAM, une molécule d'adhérence intercellulaire (Gastl G, Spizzo G, Obrist P et al.
(2000) Ep-CAM
overexpression in breast cancer as a predictor of survival. The Lancet 356:198 1). Ep-CAM
est également désigné sous les noms : 17-1A, ESA, EGP40. C'est une glycoprotéine épithéliale transmembranaire de 40 kDa codée par le gène GA733-2 (Linnenbach AJ, Woicierowski J, Wu S et al. (1989) Sequence investigation for the major gastrointestinal tumor-associated antigene family, GA733. Proc natl Acad USA 86:27; Gdttlinger HG, Funke I, Johnson JP et al. (1986) The epithelial cell surface antigen, a target for antibody-mediated tumor therapy: its biochemical nature, tissue distribution and recognition by different monoclonal antibodies. Int J Cancer 38:47). Elle est reconnue comme un antigène tumoral sur-exprimé dans la plupart des carcinomes, et est impliquée dans le processus métastatique (Litvinov SV, Velders MP, Bakker HA et al. (1994) Ep-CAM : a human antigen is a homophilic cell-cell adhesion molecule. J Cell Biol 125:437). Ep-CAM est suggéré comme cible thérapeutique, particulièrement en immunothérapie. Divers anticorps monoclonaux, 17-1A, MOC31, Ber-EP4, et HA-125 sont dirigés contre divers épitopes de cette molécule. L'anticorps monoclonal Ber-EP4 reconnaît deux épitopes de 34 et 39 kDa de Ep-CAM (Latza U, Niedobitek G, Schawarting R et al. (1990) Ber-EP4: a new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelia. J Clin Patho143:213).
Ber-EP4, ou MOC31 ou HA-125 peuvent être liés soit directement sur la protéine A ou la protéine G, soit à la chaîne chlorosilane à terminaison NH2, OH ou COOH, par l'intermédiaire d'un agent de couplage adéquat.
b) Sur-expression de HER-2 Le gène du récepteur du facteur de croissance humain 2(HER-2)lraeu (c-erbB-2) est localisé sur le chromosome 17q et code pour un récepteur protéique transmembranaire avec une activité tyrosine kinase, de la famille des récepteurs des facteurs de croissance épidermique (EGFR) ou la famille des HER.
L'amplification du gène HER-2/neu ou la sur-expression de la protéine HER-2 (p185HEI) sont des facteurs pronostiques dans le cancer du sein et de divers carcinomes (Slamon DJ, Clark GM, Wong

14 SG et al. (1987) Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the Her-2-/neu oncogene. Science 235:177). L'anticorps anti-(trastuzumab) est utilisé en thérapie anti-tumorale.
L'anticorps anti-HER-2 (anti-humain ErB2) est utilisé comme marqueur spécifique pour capturer les CTC du cancer du sein. Associé à la détection par l'anticorps Ber-EP4, il jouera le rôle d'un marqueur potentiel des CTC.
Le greffage de l'anticorps anti-Her-2 peut être fait comme celui de l'anticorps Ber-EP4.
c) Sur-expression.de MUC1 Les mucines sont exprimées par divers types de cellules épithéliales normales dans un cadre environnemental rugueux comme l'interface air/eau du système respiratoire, l'environnement acide de l'estomac, l'environnement complexe du tractus intestinal et les surfaces épithéliales sécrétrices des organes spécialisés comme le foie, le pancréas, la vésicule biliaire, les reins, les glandes salivaires, les glandes lacrymales et l'oeil. La famille des mucines comprend au moins 17 molécules sécrétées ou non et joue un rôle central dans le maintien de l'homéostase (Hollingsworth MA and Swanson BJ. (2004) Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat Reviews Cancer 4:45).
Les mucines sont des glycoprotéines de haut poids moléculaire avec des répétitions en tandem de séquences riches en sérine, thréonine et prolines attachées à des oligosaccharides par des liaisons 0-glycosidiques. MUCI est une protéine de membrane intégrale. Dans les tumeurs du sein, MUC1 est sur-exprimée et glycosylée de façon aberrante (Rahn JJ, Dabbagh L, Pasdar M et al. (2001) The importance of MUCl cellular localization in patients with breast carcinoma: an immunohistologic study of 71 patients and review of the literature. Cancer 91:1973).
L'anticorps anti-MUC1 (CT2 Mab) est utilisé comme marqueur spécifique pour capturer les CTC du cancer du sein. Associé à la détection par l'anticorps Ber-EP4, il jouera le rôle d'un marqueur potentiel des CTC.
Le greffage de l'anticorps anti-MUCI peut être fait comme celui de l'anticorps Ber-EP4.
Les antigènes de membrane choisis comprenant une glycoprotéine de membrane Ep-CAM, la glycoprotéine MUC1, et un récepteur du facteur de croissance HER-2/neu sont des marqueurs tumoraux sur-exprimés dans les CTC. De ce fait, les cellules tumorales peuvent révéler une densité de molécules de surface cellulaire optimisée, favorisant ainsi la capture cellulaire spécifique. Il est à noter que la densité de CTC dans le sang périphérique est un paramètre totalement inconnu. Ce paramètre peut varier selon le degré de la pathologie et tourne autour de 1 CTC pour 103 à
2x104 leukocytes.

Les anticorps dirigés contre ces molécules sont spécifiques et suffisamment sélectifs pour perinettre une capture de CTC dans les meilleures conditions possibles en termes de conservation, de morphologie cellulaire et de viabilité.
La stratégie d'utilisation des longues chaînes organosiliciées (n = 22) 5 pour le greffage des surfaces, l'addition d'un agent de couplage, et le greffage de la portion Fc de l'anticorps sont des atouts pour optimiser la capture cellulaire.
En effet, la longueur de l'ensemble X3-Si-(CH2)22-agent de couplage-anticorps varie entre 40 à 50 ~ produisant ainsi une grande flexibilité dans une présentation favorable de l'anticorps à l'antigène cellulaire.
10 En effet, en admettant une densité de récepteurs HER-2 sur-exprimés sur la surface totale de la cellule tumorale de 106, une évaluation rapide donne 8 récepteurs dans une surface carrée de 10 A de côté. Selon l'évaluation par la microscopie de force atomique (AFM), la densité de greffage de chaînes organosiliciées étant de 3 à 5 molécules par nm2, cette configuration est très favorable à l'obtention d'un bon greffage d'agent de liaison et

15 d'anticorps.
EXEMPLE
1- Dispositif La figure 2 illustre la capture cellulaire au moyen d'une chambre à flux laminaire.
Le présent procédé de capture cellulaire utilise une chambre à flux laminaire (1), fabriquée en Plexiglas , comprenant une cavité (2) de dimension 20 x 6 x 0,2 mm3 (L x 1 x h), et reliée à l'extérieur par des ouvertures d'entrée (3) et de sortie (4) pour la circulation des cellules et des fluides.
La paroi (5) constituant le plancher de la chambre est une lame de verre ou de Si cristallin amovible et fonctionnalisée chimiquement. Cette lame est appliquée dans une encoche (6) contre la cavité (2) de la chambre (1) au moyen d'un joint torique (7) destiné à en assurer l'étanchéité. On peut prévoir que les extrémités de la cavité (2) soient arrondies de façon à favoriser le positionnement du joint torique (7). Elle est vissée (8) sur la base en Plexiglas(P par une plaque métallique (9). Un joint en Téflon (9a) sépare la lame de verre de la plaque métallique. Tout autre moyen connu de l'homme du métier et permettant la fixation du support solide dans la cavité peut être utilisé.
Dans le cas illustré
sur la figure 2, et selon une variante préférée de l'invention, la plaque métallique (9) comporte dans sa partie centrale une zone transparente (non hachurée) qui permet d'observer l'intérieur de la cavité (2) à l'aide d'un microscope (non représenté). De même pour le joint en Téflon (9a) comporte une zone centrale transparente (non hachurée). La proportion des zones opaques et transparentes peut varier.

16 Les arrivées et les évacuations des fluides par les ouvertures (3, 4) sont placées sous le contrôle d'une pompe péristaltique (10) imposant le débit et la vitesse d'écoulement.
La pompe péristaltique (10) prélève l'échantillon biologique (11) dans un réceptacle (12), prévu à cet effet, fermé de façon à être maintenu stérile, et l'injecte dans le tube de circulation (13). Elle peut prélever des réactifs (14a, 14b) dans les réceptacles (14), également fermés de façon à assurer la bonne conservation des produits qu'ils contiennent, et les injecter dans les tubes de circulation (15). Une vanne (16) à
l'intersection des tubes de circulation (15), (13) et (17) permet de réguler la connexion entre les tubes de circulation (15) et (13) et le tube (17) d'introduction dans la chambre à flux laminaire (1).
Les fluides traversent la chambre à flux laminaire (1) sous contrôle de la pompe péristaltique (l0) et en sortent par le tube de sortie (18). Une vanne (19) permet d'orienter le fluide du tube de sortie (18) soit vers un tube d'évacuation (20) soit vers un tube de recyclage (21) relié à la cavité (2), qui permet de faire passer à nouveau le fluide dans la chambre à flux laminaire (1). Sur la figure 2 le tube de recyclage (21) est relié à la cavité
(2) par l'intermédiaire du réceptacle (12), mais il est possible de prévoir une connexion directe entre le tube de recyclage (21) et la cavité (2). Le recyclage de l'échantillon biologique par ce circuit permet un meilleur rendement de capture des cellules cibles. Le sens de la circulation des fluides dans le dispositif est indiqué par des flèches.
Le dispositif décrit ci-dessus constitue un exemple de mise en eeuvre de l'invention. D'autres variantes sont incluses dans la portée de l'invention.
La caractéristique essentielle réside dans la mise en circulation de l'échantillon biologique dans une chambre de circulation des fluides permettant un écoulement en flux laminaire dont une paroi interne est dotée d'un greffage particulier décrit ci-dessus.
Le circuit de circulation des fluides en dehors de la chambre de circulation des fluides peut être aménagé
en fonction des réactifs que l'on souhaite ou non utiliser. Selon une variante de l'invention, le dispositif peut comporter plusieurs chambres de circulation des fluides placées en série ou en parallèle. Cette chambre de circulation des fluides peut être incluse dans tout dispositif microfluidique de configuration appropriée à la capture de cellules, comme par exemple un dispositif microfluidique tel que celui décrit dans le document US-6,408,878.
Lorsque l'échantillon biologique est passé à travers la chambre de circulation des fluides une ou plusieurs fois, en fonction du protocole expérimental choisi, il est possible de récupérer les cellules qui se sont fixées sur la paroi greffée selon l'invention en injectant dans la chambre de circulation des fluides un réactif permettant le décrochage de ces cellules. Elles sont ensuite récupérées en vue de leur analyse et de leur comptage.
Selon une variante de l'invention, le dispositif de la figure 2 peut être construit de la façon suivante : t

17 Un support solide greffé par des fonctions chlorosilane à terminaison hydroxyle, amine ou acide protégées est fixé dans la cavité (2) comme décrit ci-dessus, de façon à fermer la cavité (2). Les autres éléments mécaniques du dispositif sont placés comme sur la figure 2. Un réactif de déprotection des fonctions terminales est injecté dans la cavité (2) à partir de l'un des réceptacles (14), puis un agent de couplage est injecté dans la cavité (2) et enfin la biomolécule de reconnaissance. On peut en effet à
partir du dispositif mécanique décrit sur la figure 2, fonctionnaliser la paroi (support solide) greffée par les chlorosilanes par une séquence appropriée d'injections de réactifs, des étapes de rinçage pouvant être prévues de façon intermédiaire.
2- Protocole d'isolement des CTC
Un volume de 3 à 5 ml de sang périphérique de patients développant un cancer du sein et/ou de témoins sans cancer est prélevé d'une façon classique dans un milieu de Hanks (In VitroGen) contenant 5mM d'EDTA (acide éthylène diamine tétra acétique). Les cellules nuclées (leukocytes et cellules tumorales) sont ensuite séparées des globules rouges et des plaquettes sur un gradient contenant du ficoll (Amersham) dans des tubes pré-adaptés (Leucosep). Les fractions de cellules contenant les leukocytes et les CTC
sont ensuite diluées dans du milieu de Hanks contenant 0,1 % de HSA (albumine de sérum humain) à raison de 1 x 106 cellules par ml avant de les souinettre à
l'isolement au moyen de la chambre à flux laminaire. Le débit de la pompe péristaltique est réglé
autour de 50 jil/min correspondant à une vitesse de cisaillement de 15 s 1 et une contrainte de cisaillement de 0,15 dyne/cm2.
La récupération des CTC isolées peut être effectuée par dissociation de la liaison antigène-anticorps par diverses méthodes : par compétition en utilisant un inhibiteur peptidique; soit en augmentant la vitesse de flux d'un facteur de 10 à 100, soit par une dissociation des ponts S=S des fragments des anticorps pour le relargage des cellules capturées.
D'autres essais ont été faits sur des dispositifs microfluidiques et des chambres à flux laminaires dont les dimensions sont données dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous :
L x 1 x h mm3 Volume ( 1 20x6x0,10 12 20x6x0,15 18 20 x 6 x 0,20 24 20x6x0,25 30 Tableau 1 : dimensions de la chambre à flux laminaire

18 L x 1 x h( m3) Volume (nl) 100 x 50 x 200 1 100 x 100 x 200 2 150 x 100 x 200 3 150 x 150 x 200 4,5 Tableau 2: dimensions du dispositif microfluidique 3- Caractérisation moléculaire du phénotype tumoral Divers procédés pour la caractérisation des CTC isolées peuvent être appliqués.
a) Caractérisation morphologique, immuno-c ologique et génétique des CTC
- par imtnuno-histochifnie (IHC) : détection de marquage par des anticorps : antikératine (CK19, CK20, CK22), anti-CD45 spécifique des leukocytes - Marqueurs tunzof-aux (IHC et RT-PCR) : sur-expression de HER-2/neu, téloinérase, MUC-1 b) Caractérisation cyto genétique - CGH (hybridation in situ comparative) - FISH (fluorescenee in situ lzybridation) 4- Autres applications a) Le dia n~ ostic prénatal Le présent procédé peut également être utilisé en obstétrique dans le diagnostic prénatal pour des analyses génétiques précoces de cellules foetales dans le sang maternel (Bianchi D. (1999) Fetal cells in the maternal circulation:
feasibility for prenatal diagnosis. Br J Maematol 105:574; Fisk N. (1998) Maternal-fetal medicine and prenatal diagnosis. Curr Opin Obstet Gynecol 10:81). La population de cellules faetales visées dans notre procédé est constituée par des cellules trophoblastiques, de type épithélial, et de courte vie pendant le premier trimestre de gestation (Shulman LP. (2003) Fetal cells in maternal blood. Current Women's Health Reports 3:47). La densité de cette population de cellules est très basse :- 1 trophoblaste feetal pour 106 cellules maternelles. La capture cellulaire peut se faire à l'aide d'anticorps dirigés contre des antigènes épithéliaux membranaires, ou un anticorps dirigé contre le lactogène placentaire humain (Latham SE, Suskin HA, Petropoulos A et al. (1996) A monoclonal antibody to human placental lactogen hormone facilitates isolation of fetal cells from maternal blood in a model system.
Prenat Diagn 16:813).

19 Le présent procédé présente un avantage certain par rapport aux méthodes existantes comme la cytométrie de flux ou les billes magnétiques.
Les cellules fertales isolées sont soumises à une caractérisation moléculaire génétique pour la détection d'anomalies génétiques (PCR, FISH).
b. Détection de CTC dans le sang périphérique et la moelle osseuse Une autre application du présent procédé concerne la détection de CTC
dans la moelle osseuse et le sang périphérique (Chapter 15 : Tumor Cell Contamination (2001) Autologous blood and Marrow TransplantationX: Proceedings of the Tenth International Symposium, ed by Karel A. Dicke and A. Keating).
Dans le premier cas, la présence de CTC métastatique dans la moelle osseuse permet d'évaluer le pronostic afin de cibler les thérapies.
Dans le deuxième cas, le présent procédé concerne une évaluation en deux étapes sur une même patiente : 1) sur la présence et le pourcentage de CTC dans le sang périphérique avant une chimiothérapie ablative de la moelle, et 2) l'absence de CTC
sur le prélèvement sanguin traité et purgé pour obtenir une population de cellules souches hématopoïétiques pour une transplantation autologue.

Claims (26)

1. Dispositif micro fluidique pour la capture d'une population de cellules comportant une chambre (1) de circulation des fluides dont les dimensions sont choisies de telle sorte qu'elle soit une chambre à flux laminaire et dont une paroi interne (5) est dotée d'un greffage par une couche de silane autoassemblée organisée, à laquelle est fixée une couche de biomolécules de reconnaissance spécifiques de la population de cellules, caractérisé en ce que la couche de silane autoassemblée organisée comprend au moins un composé organosilicié répondant à la formule (I) :

dans laquelle :
- n est compris entre 15 et 35, de préférence entre 20 et 25, -m est égal à 0 ou à 1, - X1, X2 et X3, qui peuvent être identiques ou différents entre eux, sont sélectionnés dans le groupe constitué par des groupes alkyles saturés en C1 à
C6, linéaires ou ramifiés, et les groupement hydrolysables, au moins l'un de X1, X2 ou X3 représentant un groupement hydrolysable, - A représente un groupement -O-(CH2-CH2-O)k-(CH2)i dans lequel k représente un nombre entier compris entre 0 et 100, de préférence entre 0 et 5, et i représente un nombre entier supérieur ou égal à 0, de préférence égal à 0 ou à
1, - B représente un groupement choisi parmi -OCOR, -OR, -COOR, -R, -COR, -NR1R2, -CONR1R2, COOR, -SR, un atome d'halogène, - R, R1, R2 étant choisis parmi : un atome d'hydrogène, une chaîne hydrocarbonée éventuellement substituée par un ou plusieurs atomes d'halogène, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, comprenant 1 à 24 atomes de carbone, ou un groupement aromatique éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, étant entendu que lorsque R=H ou R=alkyle, alors B~R

2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la couche de biomolécules est liée à la couche de silane autoassemblée organisée par l'intermédiaire d'une couche d'agent de couplage.

3. Dispositif selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la paroi interne (5) de la chambre (1) de circulation des fluides dotée d'un greffage particulier est constituée d'un support solide (5), qui peut être une lame de verre, de silicium ou de toute surface solide métallique comportant des fonctions -OH en surface.

4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la chambre (1) de circulation des fluides comporte une cavité (2) de type parallélépipédique, comportant deux orifices (3,4) placés à deux extrémités de la cavité, le fluide étant injecté par un premier orifice (3) et collecté par un second orifice (4).

5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la chambre (1) de circulation des fluides comporte une cavité (2) d'un volume inférieur ou égal à 30 µl, encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 12 µl.

6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est muni d'une pompe (10) permettant d'injecter le fluide échantillon dans la chambre (1) de circulation des fluides.

7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la paroi (5) dotée d'un greffage particulier est parallèle au flux qui traverse la chambre (1) de circulation des fluides.

8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé
en ce que le groupe hydrolysable est sélectionné parmi : les atomes d'halogène, le groupement -N(R')2 et les groupements -OR', R' étant un groupe alkyle saturé
en C1 à C6, linéaire ou ramifié.

9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé
en ce que X1, X2 et X3 représentent des atomes de chlore.

10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que n est supérieur ou égal à 22.

11. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'agent de couplage est sélectionné parmi :
- le Subérate de bis(sulfosuccinimidyle);
- le carboxylate de 1-cyclohexane-4-(N-maléimidométhyle) sulfosuccinimidyle - la protéine A
- la protéine G
- l'isocyate de N-(p-maléimido phényle) - le N-hydrazide de l'acide k-maléimidoundécanoïque.

12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la biomolécule de reconnaissance est une protéine dont les fonctions NH2 latérales des lysines ont été transformées en groupement hydrosulfure (SH).

13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la biomolécule de reconnaissance est sélectionnée parmi :

- les anticorps monoclonaux 17-1A, MOC31, Ber-EP4, et HA-125 qui reconnaissent la molécule d'adhérence intercellulaire Ep-CAM, - l'anticorps anti-HER-2 (anti-humain ErB2) - l'anticorps anti-MUC1 (CT2 Mab)

14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une chambre à flux laminaire (1), comprenant une cavité
(2) et des ouvertures d'entrée (3) et de sortie (4) pour la circulation des cellules et des fluides, une lame (5) de verre ou de Si cristallin amovible et fonctionnalisée chimiquement constituant le plancher de la chambre (1) fixée à la cavité (2), une pompe péristaltique (10) contrôlant l'arrivée et les évacuations des fluides par les ouvertures (3, 4), au moins un réceptacle (12) dans lequel est placé l'échantillon biologique (11), au moins un tube de circulation (13) reliant le réceptacle (12) à l'ouverture (3) et au moins un tube de sortie (18) relié à l'ouverture (4).

15. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que le réceptacle (12) est relié à l'ouverture (3) par l'intermédiaire d'un tube (17) d'introduction dans la chambre à flux laminaire (1),

16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réceptacle (14) comprenant un réactif (14a, 14b), un tube de circulation (15) reliant le réceptacle (14) à l'ouverture (3) par l'intermédiaire du tube (17), une vanne (16) à
l'intersection des tubes de circulation (15), (13) et (17) pour réguler la connexion entre les tubes (15) et (13) et (17).

17. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend un tube d'évacuation (20) et un tube de recyclage (21) relié à la cavité (2) et une vanne (19) d'orientation du fluide entre les tubes (18), (20) et (21).

18. Procédé de capture de cellules au sein d'un échantillon biologique, ce procédé étant caractérisé en ce qu'i1 comporte une étape de passage de l'échantillon biologique dans la chambre (1) de circulation des fluides d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.

19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comporte au moins deux étapes de passage de l'échantillon biologique dans la chambre (1) de circulation des fluides.

20. Procédé selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisé
en ce qu'il comporte en outre une étape de décrochage des cellules.

21. Utilisation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour la capture d'une population de cellules dans un échantillon biologique.

22. Utilisation selon la revendication 21 pour la capture dans un échantillon biologique d'une population de cellules dont les marqueurs spécifiques de surface ont une interaction avec leurs récepteurs d'une intensité allant de 10pN à 1nN, avantageusement de 20pN à 500pN, préférentiellement de 30 à 300pN, plus spécifiquement de 50 à 150pN.

23. Utilisation du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour la purification et la caractérisation des cellules tumorales circulantes à partir d'un échantillon de sang.

24. Utilisation selon la revendication 23 pour le diagnostic et le suivi de l'évolution d'une pathologie sélectionnée parmi le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer du rein, le cancer de la vessie, le cancer du foie, le cancer du côlon, le cancer du poumon.

25. Utilisation du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour la purification et la caractérisation de cellules foetales à partir d'un échantillon sanguin de la mère.

26. Utilisation du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour la détection de cellules tumorales circulantes dans la moelle osseuse.