CN115254208A - 用于捕获循环肿瘤细胞的仿生微流体装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于捕获循环肿瘤细胞的仿生微流体装置。本发明提供了从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌细胞(CSC)的方法，所述方法包括在条件下将样品引入基于流动的多通道装置内，所述基于流动的多通道装置具有细胞捕获表面和流动修饰表面，所述条件允许CTC与设置在细胞捕获表面上的细胞滚动诱导试剂和捕获试剂结合。本发明还提供了基于流动的多通道装置，以从样品中捕获CTC和CSC。

Description

用于捕获循环肿瘤细胞的仿生微流体装置
本申请是申请日为2015年3月9日的中国专利申请201580022705.6 “用于捕获循环肿瘤细胞的仿生微流体装置”的分案申请。
政府支持陈述
本发明在由美国国家科学基金会(National Science Foundation)(NSF) 授予的CBET-0931472下由政府支持进行。政府在本发明中拥有一定权利。
与相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2014年3月7日提交的美国临时专利申请号 61/949,472的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容以引用的方式全 文并入本文。
技术领域
本发明涉及从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌症干细胞(CSC) 的方法，以及用于执行该方法的多通道微流体装置。
背景技术
癌症仍是世界上最具破坏性的疾病之一，每年具有超过1千万新病例。 尽管治疗原发性肿瘤的诊断和治疗方法中的近期进展已导致过去两年癌症 死亡率的减少，但癌症转移仍构成极大挑战，因为患者经常复发。散播和循 环肿瘤细胞(分别为DTC和CTC)已知诱导在距离原发性肿瘤的遥远部位 处的继发性肿瘤形成，称为转移。描述癌症转移的两种主要理论，种子和土 壤假说以及机械截留理论，是可用的，并且关于各自的外渗过程是相似的， 由三个序贯步骤组成。转移机制已知通过细胞滚动起始—所述细胞滚动是用 于将白细胞召募至炎症部位的天然存在的过程。在第二步中，细胞紧密附着 至内皮细胞。在第三步中，细胞通过内皮迁移(血细胞渗出)，导致继发性 肿瘤形成。
关于转移性癌症的诊断和预后的研究努力已集中于骨髓(BM)中的DTC 和血液中的CTC的检测。DTC的检测要求BM的抽吸-这是一个侵入性、 耗时且通常对于患者疼痛的过程，排除了对于预后研究连同治疗性处理必要 的重复取样。因而，癌症患者的外周血中的CTC的有效检测拥有作为替代 方案的希望，由于它的最低限度侵入性和容易取样(即抽血)。然而，CTC 的临床使用仍未实现用于常规临床实践。事实上，患者血液中的CTC的临 床意义不如BM中的DTC明确。与使用基于Ficoll的测定或OncoQuick方 法以及其他免疫磁性富集程序相对容易富集的BM中的DTC不同，CTC是 非常罕见的(估计在106-109个正常血细胞的背景下一个肿瘤细胞的范围内)， 呈现CTC的有效临床显著检测的巨大挑战。
肿瘤已知包含肿瘤起始细胞或循环癌症干细胞。循环癌症干细胞能够自 我更新且生成分化后代，以与正常干细胞相似的方式组构分层细胞系统。这 些细胞显示出在使用免疫缺陷小鼠的异种移植物移植中显著的致瘤活性，其 指示了细胞在癌症发展中的重要作用。另外，存在CSC可在治疗后的复发 和转移中起关键作用的越来越多的证据(Trumpp和Wiestler，Nat.Clin.Pract. Oncol.5：337-47，2008)。
因此，存在有效分离循环肿瘤细胞和循环干细胞的装置和方法的需要， 所述装置和方法具有增强的灵敏度和特异性以帮助癌症的诊断和预后。
发明内容
本发明的仿生平台可容纳在一个平台上的多重通道，所述多重通道可靶 向循环肿瘤细胞(CTC)和癌症干细胞(CSC)。第一通道(图1中的区域‘i′)可 基于与CTC标记物的特异性结合，从癌症患者血液中捕获CTC，所述CTC 标记物例如上皮细胞粘附分子(EpCAM)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)、 表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、 CD24和叶酸结合受体(FAR)。捕获的CTC可使用胰蛋白酶或其他基于 EDTA的脱离溶液从区域‘i’处脱离。在捕获的CTC中，更多的干细胞样CTC， 潜在的CSC则可使用对于CSC特异性的其他通道(图1中的区域‘ii’)进行 区分。对于细胞区分，干细胞标记物例如CD44、CXCR1、N-钙粘蛋白和 CD133可在第二通道上利用。这种CTC和CSC的原位捕获和区分概念可扩 展至多重通道系统。关于多重通道系统的例子之一，三通道装置，显示于图 1B中。另外，这种三通道流动室可用于其他目的：例如来自不同癌症患者 的三个血液样本的同时CTC捕获，以用于CTC和CSC的高流通量筛选和捕 获。关于两通道和三通道流动室的示例性尺寸在图2中指示。为了使CTC 检测效率达到最大，关于表面官能化的参数，即E-选择素和抗体的宽度以及 抗体条的角度可如图3中所示加以改变。
本发明的装置改善CTC和CSC分离的灵敏度和特异性。首先，细胞滚 动诱导试剂例如E-选择素的固定改善CTC和CSC与红血细胞和血浆的分 离。重要的是，天然存在的细胞滚动现象是将快速流动细胞召募至捕获表面 的最有效方式之一，消除经常导致堵塞和非特异性捕获问题的流动波动的需 要。第二，肿瘤细胞特异性和/或干细胞特异性捕获试剂例如抗体通过树状聚 合物纳米接头的固定实现强多价结合，以增强捕获效率。第三，本发明的装 置的模块性质允许使用任何标记物作为捕获试剂，所述捕获试剂理想地适合 于具有高度异质表型的CTC和CSC的有效检测。另外，本发明的最佳化多 通道装置实现以高流通量的CTC以及CSC的高度有效捕获。例如，在关于 单通道设计的0.4dyn/cm2或50μL/分钟的相同流速时，三通道设计将实现在 7分钟而不是20分钟内1mL血液的分析。
本发明提供了从样品中捕获CTC和CSC的方法，所述方法包括将所述 样品引入基于流动的装置内的步骤，其中所述装置包括至少两个室，第一室 包含固定的细胞滚动诱导试剂和固定的CTC特异性捕获试剂，并且第二室 包含固定的细胞滚动诱导试剂和固定的CSC特异性捕获试剂，并且在允许 CTC和CSC与细胞滚动诱导试剂和捕获试剂结合的条件下，将所述样品 引入装置内。
样品是包含CTC和/或CSC的任何流体，例如血液、淋巴液或脑脊髓液。
在本发明的方法中，用于捕获CTC和/或CSC的捕获试剂是与CTC或 CSC特异性结合的任何试剂，例如抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转 铁蛋白、肽和适体。
在本发明的方法的任一种中，CTC特异性捕获试剂特异性结合在CTC 表面上的部分，例如抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽和 适体。例如，捕获试剂与例如上皮细胞粘附分子(EpCAM)、人表皮生长因 子受体-2(HER-2)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、前列腺 特异性抗原(PSA)、CD24或叶酸结合受体(FAR)结合。另外，CTC特异性捕获试剂是肽，例如RGD肽。
在本发明的方法的任一种中，CSC特异性捕获试剂特异性结合在CSC 表面上的部分，例如抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽或 适体。例如，CSC特异性捕获试剂与例如CD44、CXCR1、N-钙粘蛋白、 CD10、CD127或CD133结合。
在本发明的方法的任一种中，用于捕获CTC和/或CSC的捕获试剂经由 与装置的表面附着而固定，或试剂经由与接头的附着而固定，所述接头附着 至装置的表面。
在本发明的方法中使用的将捕获试剂附着至装置表面的接头是聚合物 纳米接头，例如与聚乙二醇共价附着的经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。 在一个方面，经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物选自第3代、第4代、第5 代、第6代、第7代、第8代和第9代经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。 在另一个方面，聚合物纳米接头包含与聚乙二醇共价附着的聚酯-n-羧酸酯 -1-炔烃树枝状物，其中n是8、16、32、64或128。
本发明提供了本发明的方法中的任一种，所述方法还包括对引入装置 内的样品施加.05至10dyn/cm2的剪切应力的步骤。在方法的另一个方面， 剪切应力为0.1dyn/cm2至2dyn/cm2。在方法的另外一个方面，剪切应力 为约0.16dyn/cm2。
在本发明的方法的任一种中，细胞滚动诱导试剂是选择素或者选择素的 CTC或CSC结合片段。例如，选择素选自E-选择素、P-选择素和L-选择 素。
在方法的另一个方面，固定的细胞滚动诱导试剂和固定的捕获试剂以 基本上均匀的方式排列。
在方法的另外一个方面，固定的细胞滚动诱导试剂和固定的捕获试剂 以一定模式排列。
在本发明的方法的任一种中，细胞滚动诱导试剂共价附着至装置的表 面。例如，细胞滚动诱导试剂经由选自环氧基、羧基、硫醇基、炔基、叠 氮基、马来酰亚胺基、羟基、胺基、醛基及其组合的化学部分共价附着至 表面。
在本发明的方法的任一种的另外一个方面，细胞滚动诱导试剂经由接头 固定至装置的表面。例如，接头选自树状聚合物、树枝状物、右旋糖、聚 乙二醇、聚(L-赖氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚(乳酸)、 聚(乙醇酸)及其组合。
本文还提供的是用于从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌症干 细胞(CSC)的基于流动的多通道装置，所述基于流动的多通道装置包括：(a) 包含细胞捕获表面和流动动员表面的第一通道，其中CTC特异性捕获试 剂和细胞滚动诱导试剂固定至所述细胞捕获表面，和(b)包含细胞捕获表面 和流动修饰表面的第二通道，其中CSC捕获试剂和细胞滚动诱导试剂固定 至所述细胞捕获表面。术语“多通道”指两个或更多个通道。本发明的装置可具有2个通道、3个通道、4个通道、5个通道、6个通道、7个通道、 8个通道、9个通道或者10个或更多个通道。
在装置的一个方面，在装置内的多重通道是连接的，并且样品将在通道 之间流动。在另一个方面，装置具有多个入口和多个出口，例如每个通道具 有其自身的入口和出口，并且通道不是连接的，或每个通道具有其自身入口， 并且通道由单个或多个出口连接。
在本发明的装置的任一种中，细胞滚动诱导试剂是选择素或者选择素 的CTC或CSC结合片段。在装置的另一个方面，选择素是E-选择素、P- 选择素或L-选择素。
在本发明的装置的任一种中，CTC特异性捕获试剂特异性结合在CTC 表面上的部分，例如抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽和 适体。例如，捕获试剂与上皮细胞粘附分子(EpCAM)、人表皮生长因子受 体-2(HER-2)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异 性抗原(PSA)、CD24或叶酸结合受体(FAR)结合。另外，CTC特异性捕获试剂是肽，例如RGD肽。
在本发明的装置的任一种中，CSC捕获试剂特异性结合在CSC表面上 的部分，例如抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽和适体。 例如，捕获试剂与CD44、CXCR1、N-钙粘蛋白、CD10、CD127或CD133 结合。
在本发明的装置的任一种中，用于捕获CTC和/或CSC的捕获试剂经由 与装置的表面附着而固定，或试剂经由与接头的附着而固定，所述接头附着 至装置的表面。
将捕获试剂附着至本发明装置的任一种的表面的接头是聚合物纳米接 头，例如与聚乙二醇共价附着的经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。在一个 方面，经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物选自第3代、第4代、第5代、第 6代、第7代、第8代或第9代经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。在另一 个方面，聚合物纳米接头包含与聚乙二醇共价附着的聚酯-n-羧酸酯-1-炔烃 树枝状物，其中n是8、16、32、64或128。
在本发明的装置的任一种的另一个方面，细胞滚动诱导试剂和捕获试 剂以基本上均匀的方式排列。
在本发明的装置的任一种的另一个方面，细胞捕获表面包括第一区和 第二区的模式，所述第一区包含细胞滚动诱导试剂，并且所述第二区包含 捕获试剂。在一个方面，第一区还包含捕获试剂。
在本发明的装置的任一种的另一个方面，第一区和第二区以交替模式 排列。
在本发明的装置的任一种中，细胞滚动诱导试剂共价附着至细胞捕获 表面。例如，共价附着是通过化学基团例如环氧基、羧基、硫醇基、炔基、 叠氮基、马来酰亚胺基、羟基、胺基、醛基或其组合。
在本发明的装置的任一种中，细胞滚动诱导试剂经由接头固定至微流 体装置的表面。例如，接头是右旋糖、树状聚合物、聚乙二醇、聚(L-赖氨 酸)、聚(L-谷氨酸)、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)及其组 合。
本公开内容的其他特征和优点根据下述详述将变得显而易见。然而，应 当理解详述和具体例子虽然指示本公开内容的优选实施例，但仅作为举例说 明而给出，因为在本公开内容的精神和范围内的各种变化和修饰根据该详述 对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1提供了用于CTC和CSC捕获和区分的仿生平台模型。在小图A中： 在区域‘i’上从癌症患者的血液中捕获的CTC中，干细胞样癌细胞可使用区 域‘ii’连续区分且分离。这种CTC和CSC原位捕获和区分概念还可作为如小 图B中所示的三通道装置应用。三通道装置可用于如小图C中所示的多重 血液样本的高流通量筛选。
图2提供了用于本发明的多通道基于流动的装置的流动室的原型。例如， 两个或更多个通道流动室可如所示尺寸进行制造。
图3提供了本发明的多通道基于流动的装置的示意图。为了获得最高的 CTC检测灵敏度和特异性，可修饰用于表面官能化的参数，例如E-选择素 模式的宽度(a)、抗体模式的宽度(b)和抗体模式的角度。
图4显示了在相同条件下，与b)线性聚合物固定表面相比较，在a)树状 聚合物涂布的表面上实质上增强的肿瘤细胞捕获。
图5证实了通过在流动下的多价结合和细胞滚动的组合增强的细胞捕获 和效率。小图a)显示了树状聚合物涂布的表面连同E-选择素显示了捕获效率 的～7倍增加。小图b)显示了当MDA-MB-231细胞(10-1,000)掺料到107HL-60 细胞内时，树状聚合物表面实现＞75％肿瘤细胞捕获。误差条：标准误(n＝3)。 *指示p＜0.05。
图6显示了使用单通道基于流动的装置与aEGFR，来自健康和转基因小 鼠的CTC检测。小图a)显示了使用健康FVB/N小鼠和CEO转基因小鼠的 实验的图示。小图b)显示了在健康和转基因小鼠之间捕获的CTC数目/100 μL血液的比较。小图c)提供了捕获的细胞的免疫染色方案，并且小图d)显 示了在DAPI、细胞角蛋白和CD45染色后的捕获的CTC的实际荧光图像。
图7提供了使用单通道基于流动的装置获得的临床数据。小图a)提供了 在CellSearchTM*和基于流动的装置上捕获的CTC数目/7.5mL患者血液的比 较。小图b)证实了与不含E-选择素的相同表面相比较，对于细胞滚动使用基 于流动的装置与E-选择素在捕获的细胞中～25倍的急剧增加的CTC纯度。* 值得自文献。
图8提供了使用多重抗体和树状聚合物的表面官能化的示意图。
图9证实了使用各种树状聚合物-抗体缀合物的EMT后细胞的有效捕 获。a)通过TGF-β处理，在EMT后三种BCA细胞的受体表达变化。b)在 EMT前和EMT后，使用树状聚合物涂布的表面，MDA-MB-231细胞的表面 捕获的增强倍数。误差条：标准误(n＝3)。*指示p＜0.05。
图10显示了装配成流动室的多功能表面的制备的示意性图解：a)施加多 通道PDMS模版且灌注抗体用于表面固定；b)去除模版且回填E-选择素；和 c)与流动室装配。
图11显示了具有各种通道的定制流动室。小图a)提供了双通道流动室 装置。小图b)显示了与在荧光显微镜上固定的官能化捕获表面装配的多通道 基于流动的装置。小图c)提供了具有三个通道的基于流动的装置的另外设 计。
具体实施方式
必须指出如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种” 和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。
在一个方面，用于从样品中捕获CTC和CSC的装置包括至少两个通道， 其中每个通道包括细胞捕获表面和流动修饰表面。例如，在一个通道中，细 胞捕获表面包括细胞滚动诱导试剂和CTC特异性捕获试剂，并且在另一个 通道中，细胞捕获表面包括细胞滚动诱导试剂和CSC特异性捕获试剂。在 一个方面，用于从样品中捕获CTC和CSC的方法包括在允许CTC和CSC 与细胞滚动诱导试剂和捕获试剂结合的条件下，将样品引入装置内。
任选地，流动修饰表面包括排列为诱导流动通过通道的样品中的旋转流 的一个或多个结构。流动修饰表面诱导样品中的旋转流，其可允许细胞与细 胞捕获表面的增强接触，并且因此允许更有效的CTC和CSC捕获。
本发明的方法提供了在约200至500μL/分钟的流速的生理学范围内生 物样品的高流通量分离。在一些实施例中，将0.05dyn/cm2至10dyn/cm2的 剪切应力施加于引入微流体装置10内的样品。在一些实施例中，将0.1 dyn/cm2至2dyn/cm2的剪切应力施加于引入微流体装置10内的样品。在一 些实施例中，剪切应力为约0.05、约0.10、约0.15、约0.20、约0.25、约0.30、 约0.35、约0.40、约0.45、约0.50、约0.55、约0.60、约0.65、约0.70、约 0.75、约0.80、约0.85、约0.90、约0.95、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、 约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约 2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、约3.0、约3.1、约3.2、 约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、 约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约 6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、 约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约 8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9、 约9.0、约9.1、约9.2、约9.3、约9.4、约9.5、约9.6、约9.7、约9.8、约 9.9、约10.0dyn/cm2。在一些实施例中，剪切应力为约0.16dyn/cm2。
I.微流体装置
本发明的装置包括具有细胞捕获表面和流动修饰表面的至少两个通道。 细胞捕获表面可相对流动修饰表面设置。例如，细胞捕获表面可设置在通道 的底表面上，并且流动修饰表面可设置在通道的顶表面上，相对细胞捕获表 面。可替代地，流动修饰可设置与细胞捕获表面邻近。在另外一个实施例中， 细胞捕获表面和流动修饰表面可掺入单个表面内。通道可为例如具有四个壁 的封闭通道。细胞捕获表面和/或流动修饰表面可设置在通道的多个壁上。
在装置内的多重通道可为连接的，并且样品将在通道之间流动。在另一 个方面，装置可具有多个入口和多个出口，例如每个通道具有其自身的入口 和出口，并且通道不是连接的，或每个通道具有其自身入口，并且通道由单 个或多个出口连接。多个通道可具有均匀的形状和/或大小。可替代地，多个 通道可具有在单个装置内的不同形状和大小。
通道可具有任何合适的横截面形状。例如，通道可为矩形、三角形、圆 形或椭圆形。微流体装置的尺寸可使用下式进行最佳化，以使流体旋转达到 最大，同时使流体阻力降到最低：
Figure BDA0003522909680000091
其中μ是运动粘度，L是通道长度，w是通道宽度，并且h是通道高度。
例如，通道可具有约50μm至约600μm、约100μm至约500μm、约 200μm至约400μm的高度。其他合适的高度包括例如约50、100、150、200、 250、300、350、400、450、500、550或600μm。通道可具有约200μm至 约2000μm、约400μm至约1500μm、约500μm至约1000μm、或约600μm至约800μm的宽度。其他合适的宽度包括例如约200、300、400、500、600、 700、800、900、1000、1100、1200、1500、1600、1700、1800、1900或2000 μm。通道可具有约200μm至约5000μm、约400μm至约4000μm、约600 μm至约2000μm、或约800μm至约1000μm的长度。其他合适的长度包括 例如约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、 3000、3500、4000、4500或5000μm。
细胞捕获表面包括附着至基质的细胞滚动诱导试剂和CTC和/或CSC特 异性捕获试剂。基质可为例如玻璃、塑料(或聚合物涂布的)、水凝胶、基 质胶、或胞外基质(ECM)涂布的基质。细胞滚动诱导试剂和捕获试剂可直 接地或使用例如接头间接地固定在基质上。细胞滚动诱导试剂和捕获试剂可 跨越细胞捕获表面均匀地排列。例如，细胞捕获表面可包括具有细胞滚动诱 导试剂和捕获试剂的交替区域。交替区域可具有基本上相同的宽度，或宽度 可在区域之间不同。包括细胞滚动诱导试剂和捕获试剂的区域可例如排列为 平行的或以相对于通过通道的流动方向的角度排列。例如，区域可与通过通 道的流动方向切向排列。
流动修饰表面是本领域众所周知的。可使用任何已知的流动修饰表面。 例如，流动修饰表面可任选包括从表面延伸到通道内的一个或多个嵴。嵴具 有一定的形状、大小和定向，以便诱导在流动通过通道的样品中的旋转流。 例如通过用细胞滚动诱导试剂和捕获试剂涂布流动修饰表面，细胞捕获表面 和流动修饰表面可包括在装置的单个表面上。例如，嵴可用细胞滚动诱导试 剂和捕获试剂进行涂布。嵴的全部或一部分可为涂布的。例如，嵴的侧壁可 用细胞滚动诱导试剂和捕获试剂进行涂布。样品中的旋转流的诱导可增强细胞捕获效率。具有低扩散率的细胞具有保留在它们进入其的通道区域内的趋 势。例如，血液细胞由于其大直径具有固有的低扩散率。当细胞进入远离细 胞捕获表面的通道时，这有害地影响细胞捕获过程。例如，如果血细胞进入 接近顶部的微流体通道，则当它沿微通道行进几厘米时，它可能保持接近顶 部，从而限制细胞与位于通道底部处的生物官能化基质的相互作用。在样品 中的旋转流的引入迫使细胞朝向细胞捕获表面，由此增强细胞和细胞捕获表 面之间的接触。
嵴可具有任何合适的横截面形状，例如矩形、圆形、椭圆形或三角形。 嵴可具有约10μm至约300μm、约50μm至约300μm、约100μm至约250 μm、或约150μm至约200μm的厚度。其他合适的厚度t包括约10、15、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275或300μm。嵴可具有约50μm至约 300μm、约100μm至约250μm、或约150μm至约200μm的宽度。其他合 适的宽度包括约50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300 μm。邻近嵴之间的距离可为约50μm至约500μm、约100μm至约400μm、 或约200μm至约300μm。其他合适的距离包括约50、100、150、200、250、 300、350、400、450或500μm。邻近嵴之间的距离跨越流动修饰表面可为 基本上均匀的或可不同。
嵴可为基本上线性的，例如在与流动垂直的方向上延伸。嵴可具有人字 结构。嵴可相对于流动方向成角度。例如，嵴可相对于流动方向垂直或倾斜 地成角度。在一个实施例中，嵴在相对于流动方向F的45°角上。其他合适 的角度包括约45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°、100°、 110°、120°、130°、140°、150°、160°和170°。一个或多个嵴可均匀地成角 度。可替代地，嵴的角度可跨越通道改变，以对流动通过通道的样品诱导不 同的旋转特性。
一个或多个嵴可以模式排列。例如，流动修饰表面可包括具有一个或多 个嵴的第一区和缺乏嵴的第二区。可替代地，第二区可包括这样的嵴：所述 嵴的定向、大小和/或形状不同于第一区的嵴。流动修饰表面还可包括完全缺 乏嵴的第三区。具有不同大小、定向和/或形状的嵴的任何合适数目的区域可 包括在流动修饰表面上。第一区和第二区可例如跨越流动修饰表面均匀地交 替。
微流体装置可通过制备含有具有细胞滚动诱导试剂的区域和具有捕获 试剂的区域的细胞捕获表面进行制造。具有流动修饰表面的微流体通道随后 可附着至细胞捕获表面。
细胞捕获表面可通过使细胞滚动诱导试剂和捕获试剂在基质例如玻璃 载玻片上形成图案来形成。形成细胞滚动诱导试剂和捕获试剂的区域的任何 已知方法均可用于形成细胞捕获表面。细胞滚动诱导试剂和捕获试剂可例如 使用聚合物模版例如PDMS模版形成图案。模版可如本领域已知的例如使用 光刻法形成。光致抗蚀剂可涂布在晶片上，并且使用光掩模选择性暴露。光 致抗蚀剂随后显影，从而导致光致抗蚀剂的未暴露部分被去除，由此形成模 版的阴模。聚合物例如PDMS随后可倾倒在阴模上且固化，由此导致模版。模版包括从第一表面突出的一个或多个结构。突出结构的大小、定向和形状 与细胞滚动诱导试剂和捕获试剂的所需区域的大小、定向和形状基本上相 同。当置于基质上时，突出结构作用于掩蔽基质的一部分。细胞滚动诱导试 剂或捕获试剂可附着至基质的未掩蔽部分。模版随后可被去除，并且基质的 暴露部分可填充有细胞滚动诱导试剂或捕获试剂，由此形成细胞捕获表面。
细胞滚动诱导试剂和捕获试剂可使用例如物理吸附或等离子体消融附 着至基质。例如，试剂可使用微流体吸附进行附着，其中所需试剂置于可溶 性介质中，并且通过置于基质上的微流体通道进行注射。允许溶液经过几个 小时吸附至表面。当所需试剂对热敏感或被热损害时，这种技术是有利的。
用于制备具有不同密度和模式的合适基团的表面用于共价结合的方法 是本领域众所周知的(例如，参见Rusmini等人，Biomacromolecules8： 1775-89(June 2007)和Leckband等人，Biotechnology and Bioengineering 37： 227-237(1991)，所述两个参考文献的完整内容以引用的方式并入本文)。在 一些实施例中，捕获试剂和/或细胞滚动诱导试剂的密度范围为约10ng/cm2至约600ng/cm2。在一些实施例中，捕获试剂和/或细胞滚动诱导试剂的密度 大于约30ng/cm2。例如，在一些实施例中，捕获试剂和/或细胞滚动诱导试剂的密度范围为约30ng/cm2至约360ng/cm2。在一些实施例中，捕获试剂 和/或细胞滚动诱导试剂的密度范围为约50ng/cm2至约300ng/cm2。在一些 实施例中，捕获试剂和/或细胞滚动诱导试剂的密度范围为约100ng/cm2至约 200ng/cm2。
通道和流动修饰表面可如本领域已知的形成。参见Stroock等人，Science 295：647-51，所述参考文献的内容以引用的方式全文并入本文。流动修饰表 面可使用软光刻法形成。例如，流动修饰表面可使用光致抗蚀剂例如双重高 度SU-8光致抗蚀剂模具形成。模具通过首先使微流体通道旋转且形成图案 进行制备。在发展通道模式之前，将第二光致抗蚀剂层旋转到模具上，以生 成关于流动修饰表面的嵴的模式。加入比对标记物，以有利于第二光致抗蚀 剂层的正确定向。模具随后暴露、硬烘烤且显影，由此导致含有具有结构的通道的模具，所述结构浇铸流动修饰表面的嵴。所得到的模具随后用聚合物 例如PDMS进行涂布，以形成通道和流动修饰表面。
II.细胞滚动
本发明的微流体装置的室包含固定的细胞滚动诱导试剂。瞬时配体受体 相互作用的形成通常在血液和血管内皮中流动的细胞之间发生；这种生理过 程被称为细胞滚动。细胞滚动已知在生物学重要的过程中起关键作用，所述 过程例如白细胞召募至炎症部位、在静脉内注射后造血祖细胞的归巢和CTC 诱导的转移。这种行为通常通过在血管内皮细胞表面上的选择素(例如E-、 P-、L-选择素)和膜蛋白包括P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)之间的动态相 互作用介导。本领域技术人员将认识到能够诱导CTC或CSC经历细胞滚动 的任何分子可用于实践所公开的方法且制备所公开的装置。
在本公开内容的一些实施例中，细胞滚动诱导试剂是选择素。在另一个 实施例中，选择素是内皮(E)-选择素。在另外一个实施例中，选择素是P-选 择素。在另一个实施例中，选择素是L-选择素。此外，保留结合CTC的能 力的选择素的片段特别设想在本公开内容的范围内。
由于其在活化内皮和骨皮肤微血管衬里上的表达，并且因其在细胞滚 动、细胞信号传导和趋化现象中的作用，E-选择素(CD62E)在疾病中是特别 值得注意的。许多研究指向通过涉及各种类型的癌细胞(例如前列腺、乳腺 和结肠癌细胞)的粘附和归巢中的E-选择素发挥的关键作用。E-选择素通过 内皮细胞响应炎性细胞因子例如白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)而从头合成。因此，利用基于细胞滚动行为的细胞分离，因为它模 仿生理过程，且消除其他免疫标记检测方法必需的标记和标记去除步骤。然 而，考虑到大的细胞类别，包括白细胞、血小板、嗜中性粒细胞、间充质干 细胞和造血干细胞、以及转移性癌细胞，显示出在选择素上的滚动，关于来 自细胞混合物或全血的特异性细胞类型的基于滚动的检测具有实现足够特 异性的局限性，其已阻碍技术对临床意义装置的转变。通过使细胞滚动诱导 试剂与固定的捕获试剂偶联，本公开内容的方法和装置克服这种局限性。不 预期受任何特定理论束缚，认为细胞滚动诱导试剂促使循环肿瘤细胞(CTC) 显示出在微流体装置的表面上的“滚动”行为(上文描述)。滚动CTC随 后接触固定的捕获试剂，并且由此被装置捕获(即固定)。
任何共价化学均可用于将细胞滚动诱导试剂固定至微流体装置的表面。 在一些实施例中，细胞滚动诱导试剂通过一种或多种化学部分而附着至表 面。一般而言，化学部分和表面之间的键是共价的。无限制地，在一些实施 例中，化学部分包含环氧基、羧基、硫醇基、炔基、叠氮基、马来酰亚胺 基、乙烯基、羟基、胺基、醛基及其组合。
在一些实施例中，细胞滚动诱导试剂经由接头固定至微流体装置的表 面。在一些实施例中，接头选自树状聚合物、树枝状物、右旋糖、聚乙二 醇、聚(L-赖氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、聚(乳酸)、聚 (乙醇酸)及其组合。
本发明的装置和方法中使用的用于捕获CTC的滚动效应在PCT公开号 WO2010/124227和美国专利公开号20120077246中详细描述，所述公开以引 用的方式全文并入本文。
III.细胞捕获
A.捕获试剂
本发明的微流体装置的通道包含固定的捕获试剂。本领域技术人员应了 解能够与循环肿瘤细胞选择性结合的任何分子均可用作捕获试剂。显示出与 循环肿瘤细胞的选择性结合的此类分子的具体例子包括抗体(或抗体片段)、 叶酸、转铁蛋白、某些肽和适体。抗体的例子包括但不限于曲妥珠单抗(赫 赛汀)、贝伐珠单抗(阿瓦斯汀)、抗CD33抗体(麦罗塔)、抗CD20抗 体(泽娃灵和百克沙)及其片段和工程化形式(例如双抗体、avimer等)。肽的例子包括但不限于RGD和NGR。
上皮细胞粘附分子(EpCAM)通过例如肺、结肠直肠、乳腺、前列腺、头 与颈和肝起源的各种癌频繁过表达，但不存在血液细胞中。因此，为了允许 CTC的特异性结合(即“捕获”)，同时避免非CTC细胞的结合，在一些 实施例中，捕获试剂是抗EpCAM抗体。抗EpCAM抗体由几个源包括例如 R&D Systems、Abcam和Millipore商购可得。可替代地，可用于实践本公开 内容的方法或生成本公开内容的装置的抗EpCAM抗体可通过本领域已知的 任何方法生成。
如本文使用的，术语“抗体”和“免疫球蛋白”理解为意指(i)完整抗体 (例如单克隆抗体或多克隆抗体)，(ii)其抗原结合部分，包括例如Fab片段、 Fab′片段、(Fab′)2片段、Fv片段、单链抗体结合位点、sFv，(iii)双特异性抗 体及其抗原结合部分，和(iv)多特异性抗体及其抗原结合部分。
如本文使用的，术语“特异性结合(bind specifically)”、“特异性结合(specifically bind)”和“特异性结合(specific binding)”理解为意指抗体对于 特定抗原具有至少约106M-1、更优选至少约107M-1、更优选至少约108M-1、 且最优选至少约1010M-1的选择性结合亲和力。适当对照可用于区分“特异 性”和“非特异性”结合。
如本文使用的，术语“CTC特异性捕获试剂”理解为意指与CTC特异 性结合的试剂，例如与CTC的表面上的部分特异性结合的试剂。另外，术 语“CSC特异性捕获试剂”理解为意指与CSC特异性结合的试剂，例如与 CSC的表面上的部分特异性结合的试剂。
在一些实施例中，捕获试剂是转铁蛋白。转铁蛋白是铁结合转运蛋白， 与阴离子例如碳酸氢盐结合相关，所述铁结合转运蛋白可结合铁离子的两个 原子。转铁蛋白负责铁从吸附和血红素降解部位转运到贮存和利用部位。转 铁蛋白受体(TfR)已知在广泛范围的癌症中过表达，使得转铁蛋白可用作捕获 试剂。
在一些实施例中，捕获试剂是RGD肽、cRGD肽、RGD模拟物、含有 RGD序列的肽或蛋白质、其结构或功能等价物、或其组合。本文描述的RGD 或RGD模拟物包括起因于环状Arg-Gly-Asp肽的修饰的任何肽或肽模拟物。 修饰可在肽的侧基和/或主链上。肽合成包括肽模拟物的合成充分得到记录， 并且可经由例如组合化学容易地实现。
在一些实施例中，捕获试剂是叶酸。叶酸已知与肿瘤相关抗原称为叶酸 盐受体(FR)结合，使得叶酸可用作捕获试剂。
B.多价效应
多价相互作用-多价配体与生物系统中的多重受体的同时结合事件- 已得到广泛研究，以促进特异性细胞类型的靶向。这些活性对于许多病理过 程也是关键的，所述病理过程包括病毒、寄生虫、支原体和细菌病原体的附 着。使用生物多价抑制剂的研究已获得结合亲合力的定量测量，具有1至9 个数量级的增加。
在本公开内容的一些方面，多价效应通过经由与接头附着将捕获试剂固 定在细胞捕获表面的基质上来完成，所述接头直接附着至细胞捕获表面的基 质。在一些实施例中，接头是聚合物纳米接头。在一些实施例中，聚合物纳 米接头是经修饰的聚(酰胺-胺)(PAMAM)树状聚合物。
纳米接头可为树枝状聚合物。可使用已知树枝状体系结构中的任一种， 包括例如树状聚合物、结构树状聚合物(tecto-dendrimer)、规则树枝状物、树 状接枝聚合物和超支化聚合物。还可使用具有从核发出的多条臂的树枝状星 形支化聚合物。相应地，如本文使用的，树枝状聚合物是具有致密分支结构 的聚合物，具有大量终末反应基团。树枝状聚合物包括几层或几代重复单位， 通常被称为分支单元，其全部含有一个或多个分支点。树枝状聚合物包括树 状聚合物和超支化聚合物通过具有两个或更多个反应基团的单体单元的反 应，或单体单元的组合进行制备，其中单体单元中的至少一个具有至少三个 反应基团。可使用的树状聚合物包括由从共同核发出的多个树枝状物组成的 那些，所述共同核可为单个原子或一组原子。每个树枝状物一般由终末表面 基团、具有大于或等于二的分支功能性的内部分支连接、以及共价连接附近 分支连接的二价连接子组成。
制备且表征树状聚合物、树枝状物、超支化聚合物、星形支化聚合物、 致密星形支化聚合物和超梳状支化聚合物的方法均为本领域众所周知的，并 且在文献中充分描述。树枝状物是规则支化聚合物分子，并且其结构可在分 子水平上得到精确控制，并且它们具有独特特性。它们是楔形的且包含分支 源于其的焦点。不同树枝状物可具有由每个分支延伸的不同数目的分支和不 同数目的层。在本公开内容的一些实施例中，聚合物纳米接头包含与聚乙二 醇共价附着的聚酯-n-羧酸酯-1-炔烃树枝状物，其中n是8、16、32、64 或128。
可使用的树枝状聚合物的具体例子包括聚(酰胺-胺)(PAMAM)树状聚合 物、树状接枝聚合物和超支化聚合物；聚(苄基醚)树状聚合物、树状接枝聚 合物和超支化聚合物；聚酯树状聚合物和超支化聚合物；聚(丙烯亚胺)(PPI) 树状聚合物、树状接枝聚合物和超支化聚合物；含有机硅的树状聚合物、树 状接枝聚合物和超支化聚合物、聚苯乙烯树木状聚合物。
PAMAM树状聚合物据报道是有利于多价效应的极佳介质，因为与如果 将配体缀合至相似分子量的线性聚合物而获得的那种相比较，树状聚合物的 几何学将配体预组构成小空间区域。因此，已“预支付”定位配体的熵惩罚。 其次，树状聚合物结构允许所有配体寻址细胞表面。这不一定是相似分子量 超支化聚合物的情况，其中纠结链或交联链可阻止所需的配体定向。PAMAM 树状聚合物是相当柔性的，且容易由各向同性介质中采用的球形变形为在与 表面相互作用后的盘状结构。这种预组构、聚合物主链拓扑学和容易变形性 的组合使得PAMAM树状聚合物成为用于实现与细胞表面的多价结合的有 效材料。此外，多价效应可显著增加靶蛋白或细胞的检测特异性和灵敏度。 通过固定与癌细胞特异性标记物例如抗EpCAM缀合的PAMAM树状聚合 物，表面的特异性和灵敏度通过多价效应基本上增加。
在一些实施例中，PAMAM树状聚合物共价附着至聚乙二醇。
在一些实施例中，PAMAM树状聚合物选自第3代PAMAM树状聚合 物、第4代PAMAM树状聚合物、第5代PAMAM树状聚合物、第6代 PAMAM树状聚合物、第7代PAMAM树状聚合物、第8代PAMAM树 状聚合物和第9代PAMAM树状聚合物。
在本发明的装置和方法中使用的树状聚合物的多价效应在PCT公开号 WO2010/124227和美国专利公开号20120077246中详细描述，所述公开以引 用的方式全文并入本文。
本发明还涉及以下实施方案：
1.一种从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌症干细胞(CSC)的 方法，所述方法包括将所述样品引入基于流动的装置内的步骤，其中所述 装置包括至少两个室，所述第一室包含固定的细胞滚动试剂和固定的CTC 特异性捕获试剂，并且所述第二室包含固定的细胞滚动试剂和固定的CSC 特异性捕获试剂，并且在允许CTC和CSC与所述细胞滚动试剂和所述捕 获试剂结合的条件下，将所述样品引入所述装置内。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述捕获试剂是抗体、抗体片段、 工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽和适体。
3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述对于CTC特异性的捕 获试剂特异性结合在CTC表面上的部分。
4.根据实施方案3所述的方法，其中所述捕获试剂与上皮细胞粘附分 子(EpCAM)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)、表皮生长因子受体(EGFR)、 癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CD24和叶酸结合受体(FAR) 结合。
5.根据实施方案3所述的方法，其中所述捕获试剂是RGD肽。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述对于CSC特异 性的捕获试剂特异性结合在CSC表面上的部分。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述捕获试剂与CD44、CXCR1、 N-钙粘蛋白、CD10、CD127和CD133结合。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂经由与 所述装置的表面的附着而固定。
9.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂经由与 接头的附着而固定，所述接头与所述装置的表面附着。
10.根据实施方案9所述的方法，其中所述接头是聚合物纳米接头。
11.根据实施方案10所述的方法，其中所述聚合物纳米接头包含与聚 乙二醇共价附着的经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。
12.根据实施方案11所述的方法，其中所述经修饰的聚(酰胺-胺)树状 聚合物选自第3代、第4代、第5代、第6代、第7代、第8代和第9代 经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。
13.根据实施方案11所述的方法，其中所述聚合物纳米接头包含与聚 乙二醇共价附着的聚酯-n-羧酸酯-1-炔烃树枝状物，其中n是8、16、32、 64或128。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，所述方法还包括对引入 所述装置内的所述样品施加.05至10dyn/cm2的剪切应力。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞滚动诱导 试剂是选择素或选择素的CTC结合片段。
16.根据实施方案15所述的方法，其中所述选择素选自E-选择素、 P-选择素和L-选择素。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞滚动诱导 试剂与所述微流体装置的表面共价附着。
18.根据实施方案17所述的方法，其中所述细胞滚动诱导试剂经由选 自环氧基、羧基、硫醇基、炔基、叠氮基、马来酰亚胺基、羟基、胺基、 醛基及其组合的化学部分与所述表面共价附着。
19.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞滚动诱导 试剂经由接头固定至所述微流体装置的表面。
20.根据实施方案19所述的方法，其中所述接头选自树状聚合物、树 枝状物、右旋糖、聚乙二醇、聚(L-赖氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚乙烯醇、聚 乙烯亚胺、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)及其组合。
21.一种用于从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌症干细胞 (CSC)的微流体装置，所述微流体装置包括：
(a)包括细胞捕获表面和流动动员表面的第一通道，其中CTC特异性 捕获试剂和细胞滚动诱导试剂固定至所述细胞捕获表面，
(b)包括细胞捕获表面和流动修饰表面的第二通道，其中CSC特异性 捕获试剂和细胞滚动诱导试剂固定至所述细胞捕获表面。
22.根据实施方案21所述的装置，其中所述第一通道和第二通道是连 接的。
23.根据实施方案21所述的装置，其中每个通道具有入口和出口。
24.根据实施方案21-23中任一项所述的装置，其中所述细胞滚动诱 导试剂是选择素或选择素的CTC结合片段。
25.根据实施方案21-24中任一项所述的装置，其中所述选择素选自 E-选择素、P-选择素和L-选择素。
26.根据实施方案21-25中任一项所述的装置，其中所述捕获试剂是 抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽和适体。
27.根据实施方案21-26中任一项所述的装置，其中所述对于CTC特 异性的捕获试剂特异性结合在CTC表面上的部分。
28.根据实施方案27所述的装置，其中所述捕获试剂与上皮细胞粘附 分子(EpCAM)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)、表皮生长因子受体 (EGFR)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CD24和叶酸结合受 体(FAR)结合。
29.根据实施方案27所述的装置，其中所述捕获试剂是RGD肽。
30.根据实施方案21-29中任一项所述的装置，其中所述对于CSC特 异性的捕获试剂特异性结合在CSC表面上的部分。
31.根据实施方案30所述的装置，其中所述捕获试剂与CD44、CXCR1、N-钙粘蛋白、CD10、CD127和CD133结合。
32.根据实施方案21-31中任一项所述的装置，其中所述捕获试剂通 过与所述细胞捕获表面的直接附着而固定至所述细胞捕获表面。
33.根据实施方案21-32中任一项所述的装置，其中所述捕获试剂通 过附着至与所述表面直接附着的接头而固定在细胞捕获表面上。
34.根据实施方案33所述的装置，其中所述接头是聚合物纳米接头。
35.根据实施方案34所述的装置，其中所述聚合物纳米接头包含与聚 乙二醇共价附着的经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。
36.根据实施方案34所述的装置，其中所述经修饰的聚(酰胺-胺)树状 聚合物选自第3代、第4代、第5代、第6代、第7代、第8代和第9代 经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。
37.根据实施方案34所述的方法，其中所述聚合物纳米接头包含与聚 乙二醇共价附着的聚酯-n-羧酸酯-1-炔烃树枝状物，其中n是8、16、32、 64或128。
38.根据实施方案21-37中任一项所述的装置，其中所述细胞滚动诱 导试剂和所述捕获试剂以基本上均匀的方式排列。
39.根据实施方案38所述的装置，其中所述细胞捕获表面包括第一区 和第二区的模式，所述第一区包含所述细胞滚动诱导试剂，并且所述第二 区包含所述捕获试剂。
40.根据实施方案39所述的装置，其中所述第一区还包含所述捕获试 剂。
41.根据实施方案39或40所述的装置，其中所述第一区和第二区以 交替模式排列。
42.根据实施方案21-41中任一项所述的装置，其中所述细胞滚动诱 导试剂与所述细胞捕获表面共价附着。
43.根据实施方案42所述的装置，其中所述共价附着是通过选自环氧 基、羧基、硫醇基、炔基、叠氮基、马来酰亚胺基、羟基、胺基、醛基及 其组合的化学部分。
44.根据实施方案21-43中任一项所述的装置，其中所述细胞滚动诱 导试剂经由接头固定至所述微流体装置的表面。
45.根据实施方案44所述的装置，其中所述接头选自右旋糖、树状聚 合物、聚乙二醇、聚(L-赖氨酸)、聚(L-谷氨酸)、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺、 聚(乳酸)、聚(乙醇酸)及其组合。
实例
提供下述实例用于举例说明并且不以任何方式限制本发明的范围。
实例1：仿生表面有利于细胞捕获
用固定的选择素和aEpCAM制备新型生物功能表面，以诱导肿瘤细胞 滚动和在这些表面上的静态结合，如以引用的方式全文并入本文的Myung 等人，Langmuir 26(11)：8589-96，2010中所述。细胞滚动的诱导改善捕获效 率，其转变为这种CTC装置的更高灵敏度，如Myung等人，Langmuir 26(11)： 8589-96，2010中所述。这种装置的另一种独特特征是纳米技术对细胞捕获的 应用。通过树状聚合物介导的多价效应在癌细胞靶向中增强的结合亲合力 (Hong等人J.Chem Biol.14(1)：107-15，2006)可显著改善罕见CTC的检测。 为了利用多价效应制备高度灵敏的表面，第7代(G7)聚(酰胺-胺)(PAMAM) 树状聚合物和aEpCAM如图4中所示使用。由于其足够的大小(直径8-10 nm)和表面官能团数目(理论上512个)以容纳多重aEpCAM(Fc区的直 径约5.5nm)/树状聚合物，选择G7 PAMAM树状聚合物，由此允许多价 结合。使用BIAcore X的表面等离子体共振(SPR)测定揭示与～5个aEpCAM 分子缀合的树状聚合物显示比游离aEpCAM急剧降低超过一百万倍的KD值 (更强的结合)。
经由树状聚合物的强多价结合的效应随后在肿瘤细胞捕获表面上进行 测试，采用多重癌细胞系例如MDA-MB-361、MCF-7和MDA-MB-231细胞， 如Myung等人，Agnew ChemInt EdEng 50(49)：11769-72，2011中所述。如图 5a中所示，对于所有三种细胞系，树状聚合物固定表面捕获比线性聚合物(聚 (乙二醇)(PEG))涂布的表面基本上多～7倍的细胞。作为初步研究，我们还 将三种癌细胞系掺料到PBS缓冲溶液内，所述PBS缓冲溶液含有以10-1,000 个肿瘤细胞/107HL-60细胞的HL-60细胞，以模拟体内刺激。树状聚合物- aEpCAM涂布表面连同E-选择素的捕获效率在测试的混合物比率自始至终 维持在超过75％，而PEG化的表面使捕获效率下降至低于25％(图5b)。 注意到通过用补充EGTA的PBS缓冲液的3分钟洗涤，除捕获的细胞外的 滚动细胞(HL-60)从表面容易地脱离且去除，如我们较早证实的(Myung等 人Analytical Chem.86(12)：6088-94，2014)。
实例2：仿生表面改善灵敏度和CTC的检测
来自非小细胞肺癌(NSCLC)的转基因小鼠模型的血样用于研究仿生表 面的灵敏度。NSCLC的细胞周期蛋白E-过表达(CEO)鼠转基因模型进行改 造，用于过表达细胞周期调节物CEO，如Ma等人，Proc.Natl.Acad.Sci. 104(10):4089-96,2013中所述。这种小鼠模型显示了在NSCLC患者中发现的 显著特征，例如染色体不稳定性、肺发育不良和增生、hedgehog途径活化、 单一和多发性腺癌、以及重要的转移。在用aEGFR官能化的表面上捕获来 自健康和转基因小鼠的CTC数目，如图6b中所示，其中根据CTC数目， 转基因小鼠(75.3±14.9CTC/100μL，n＝7)显示与健康对照(4.4±1.2 CTC/100μL，n＝6，p＝0.0011)的显著差异(平均值±S.D.，**p<0.005)。 注意到使用标准免疫染色法(图6c和6d)鉴定了CTC，如Nagrath等人， Nature 450:1235-9,2007中所述。在捕获的细胞中，与细胞角蛋白(CK)抗体结合(CK+)、通过DAPI染色(DAPI+)且仍对CD45阴性(CD45-)的细胞鉴定为 CTC。不计数通过CK-/CD45+/DAPI+限定的白细胞和不含核的自体荧光细 胞。
仿生表面还就其监控由于治疗干预的CTC数目变化的能力进行测试。 CEO小鼠不进行处理(对照)，用非特异性锁核酸(M47)和抗miR-31锁核 酸(M53)(其已知有效杀死NSCLC细胞)进行处理。与M47组(40.5±29.7 CTCs,n＝6)和无处理的对照CEO小鼠(25.4±26.9CTCs,n＝6)相比较，组M53 (11.3±9.2CTCs,n＝7,p＝0.039)显示显著更少的CTC数目。此外，图6b中所 示的数据指示在体外肿瘤细胞系(ED-1和ED1-SC)和体内CTC(对照M47和M53)之间存在显著的大小差异，证实仅基于大小的CTC检测方法可能 不是充分有效的。另外，捕获的“活的”体内CTC可进行培养扩增，如图 6c中所示。
实例3：仿生表面的临床验证
使用从20个癌症患者收集的血液样本进行临床研究。在肝素处理的管 (BDVacutainerTM)中收集的抽取血液保持在室温下。在抽血后24小时内，使 用单通道基于流动的装置(图7中所示)执行CTC捕获。根据厂商的方案， 使用Ficoll-Paque Plus，首先分开且回收血液中的单核细胞包括CTC。含有 回收的单核细胞的血沉棕黄层重悬浮于完全DMEM培养基中，并且在 Myung等人，Analytical Chem.86(12)：6088-94，2014中所述的条件下，注射 到具有aEpCAM、aEGFR和aHER2固定在表面上用于CTC捕获的单室装置 内。使用上文描述的相同方法鉴定CTC。
如图7中所示，仿生表面证实针对来自所有患者的临床CTC的极大灵 敏度。虽然CellSearchTM据报道仅捕获来自H&N癌症患者的0-46个CTC， 但单室装置平均起来捕获2,048个CTC/相同体积的血液(7.5mL)(图7a)。 另外，与不含E-选择素的相同表面相比较，具有E-选择素的捕获表面显示 出在捕获细胞中～25倍的显著增强的CTC纯度，从而指示细胞滚动在我们的 装置中决定捕获纯度和特异性的重要性(图7b)。总之，体内和临床研究指示仿生表面具有发展为高度灵敏、特异性和成本效益CTC检测系统的极大 潜力，所述CTC检测系统有效捕获具有培养扩增潜力的“活的”临床CTC。
实例4：多通道装置的制备和表征
在这项研究中，多室装置采用以模式固定在多室装置的捕获表面上的对 CTC特异性的多重抗体和多重cCSC特异性抗体。模式含有用于滚动的E- 选择素以及G7 PAMAM树状聚合物，所述G7 PAMAM树状聚合物具有抗 上皮细胞粘附分子(aEpCAM)和抗人上皮生长因子受体2(aHER2)，连同 aCD44、aCD10、aCD271，用于多价捕获。此外，为了从捕获CTC中有效分离出CSC，对于CSC标记物例如CD44、CD10和CD27特异性的固定的 细胞也固定在捕获表面上。
通过逐层方法制备多功能表面。如图8中所示，环氧官能化表面通过软 光刻法用各种抗体形成显微图案，其中使用由聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)制 成的多通道模版。多图案化表面随后用E-选择素进行处理，以回填空的间隙 以随后诱导各种细胞的滚动。aEpCAM、aHER2和aEGFR的固定以图案化 模式在G7 PAMAM树状聚合物涂布的表面的顶部上执行，与E-选择素一起 加入，并且装配成流动室，导致仿生表面，其中使用与Myung等人AnalyticalChem.86(12)：6088-94，2014中所述的相似固定方案。蛋白质固定使用荧光抗 体例如E-选择素抗体/FITC缀合物和加上荧光标记的抗体加以证实。为了确 保蛋白质是共价固定的，表面在使用具有高离子强度的缓冲液的充分清洗步 骤后进行再成像，如Hong等人，Langmuir 23(24)12261p-8，2007中所述。另 外，X射线光电子光谱法用于分析表面的元素组成。
为了证实仿生表面有效捕获具有高度异质表型的肿瘤细胞，诱导5种细 胞系经历EMT，且灌注到装置内。简言之，头与颈癌细胞用TGF-β以10和 20ng/mL的浓度处理72小时。EMT通过蛋白质印迹以及通过观察增强的细 胞骨架活性加以证实，其中使用皮至纳米规模AFM力测量和细胞水平伤口 愈合测定两者，如Lee等人，117(31)：9233-40，2013中所述。使用Myung等 人，Agnew Chem Iht Ed Eng 50(49)：11769-72，2011中所述的相似方法，EMT后细胞的捕获效率和表面行为与EMT前配对物相比较(参见图9)。
执行使用5种细胞系的体外流动室测试，以最佳化图案尺寸。蛋白质图 案的长度和角度进行最佳化，以稳定诱导滚动且使肿瘤细胞特异性捕获达到 最大。E-选择素和树状聚合物-抗体结构域的长度分别最佳化至这样的条件： 在所述条件中在0.5-4.0dyn/cm2的各种剪切应力下，两个结构域诱导细胞的 稳定滚动(1-10μm/s)，并且使捕获的细胞数目/表面积达到最大。相同最佳化 过程还使用掺料到得自健康供体的人血内之后的细胞执行。
解离常数(KD)的定量测量对于表面固定的树状聚合物-抗体缀合物与细 胞模仿微球体的相互作用获得，其中使用如Myung等人Analytical Chem. 83(3)：1078-83，2011中所述的SPR。例如，EpCAM片段使用生物素化试剂盒 进行生物素化，随后为与微珠-链霉抗生物素蛋白缀合物的缀合。基于动力 学参数，测定最佳数目的表面固定抗体/树状聚合物。最佳化装置在其捕获一 系列CTC的效率中加以验证和检查。
实例6：用于高流通量和有效捕获的多通道装置的制造
上文描述的最佳化图案化表面转变成多通道装置。制造具有2-3个通道 的一系列定制流动室，其具有更长的通道长度，这增加捕获效率、流通量以 及CTC和CSC的差异检测。与商购可得的单通道流动室(Glycotech)相比较， 多通道流动室(一些通道设计和具有显微镜的设置显示于图11中)提供了 表面图案化中更多的灵活性和增强的灵敏度，而无与实验室中目前使用的系 统的重大构型变化。
原型设计使用掺料到来自健康供体的人血内的各种肿瘤细胞在其捕获 效率方面进行比较。比较试验在浓度(掺料到1mL人血内的20-2,000个肿 瘤细胞)和相同捕获时间(10分钟)下执行。

Claims (13)

1.一种从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌症干细胞(CSC)的方法，所述方法包括将所述样品引入基于流动的装置内的步骤，其中所述装置包括至少两个室，第一室包含固定的细胞滚动诱导试剂、固定的CTC特异性或CSC特异性捕获试剂，和第二室包含固定的细胞滚动诱导试剂和固定的CTC或CSC特异性捕获试剂，其中所述捕获试剂经由与共价附着到所述装置的表面的经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物的附着而固定，并且在允许CTC和CSC与所述细胞滚动诱导试剂和所述捕获试剂结合的条件下，将所述样品引入所述装置内，其中所述细胞滚动诱导试剂是E选择素或E选择素的CTC结合片段。
2.一种用于从样品中捕获循环肿瘤细胞(CTC)和循环癌症干细胞(CSC)的微流体装置，所述微流体装置包括：
(a)包括细胞捕获表面和流动动员表面的第一通道，其中CTC特异性或CSC特异性捕获试剂和细胞滚动诱导试剂固定至所述细胞捕获表面，其中所述捕获试剂经由与共价附着到所述装置的表面的经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物的附着而固定，
(b)包括细胞捕获表面和流动修饰表面的第二通道，其中CTC特异性或CSC特异性捕获试剂和细胞滚动诱导试剂固定至所述细胞捕获表面，且其中所述细胞滚动诱导试剂是E选择素或E选择素的CTC结合片段。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述第一通道和第二通道是连接的，或者每个通道具有入口和出口。
4.根据权利要求1所述的方法或权利要求2或3所述的装置，其中所述捕获试剂是抗体、抗体片段、工程抗体、叶酸、转铁蛋白、肽和适体。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法或装置，其中所述对于CTC特异性的捕获试剂特异性结合在CTC表面上的部分或者所述对于CSC特异性的捕获试剂特异性结合在CSC表面上的部分。
6.根据权利要求5所述的方法或装置，其中所述捕获试剂与上皮细胞粘附分子(EpCAM)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CD24和叶酸结合受体(FAR)结合，所述捕获试剂是RGD肽或者与CD44、CXCR1、N-钙粘蛋白、CD10、CD127和CD133结合。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法或装置，其中所述捕获试剂经由与接头的附着而固定，所述接头与所述装置的表面附着。
8.根据权利要求7所述的方法或装置，其中所述接头是聚合物纳米接头，其包含(i)与聚乙二醇共价附着的经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物、(ii)与聚乙二醇共价附着的聚酯-n-羧酸酯-1-炔烃树枝状物，其中n是8、16、32、64或128。
9.根据权利要求8所述的方法或装置，其中所述经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物选自第3代、第4代、第5代、第6代、第7代、第8代和第9代经修饰的聚(酰胺-胺)树状聚合物。
10.根据权利要求9所述的方法或装置，其中所述细胞滚动诱导试剂经由接头固定到所述微流体装置的表面或者经由与选自环氧基、羧基、硫醇基、炔基、叠氮基、马来酰亚胺基、羟基、胺基、醛基及其组合的化学部分与所述表面共价附着。
11.根据权利要求2-10中任一项描述的装置，其中所述细胞滚动诱导试剂和所述捕获试剂以基本上均匀的方式排列。
12.根据权利要求11描述的装置，其中所述细胞捕获表面包括第一区和第二区的模式，所述第一区包含所述细胞滚动诱导试剂，并且所述第二区包含所述捕获试剂。
13.根据权利要求2-12中任一项描述的装置，其中所述第一区和第二区以交替模式排列。
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