JP2018513684A - マイクロ流体細胞培養 - Google Patents

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Abstract

細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを強化するように構成された栄養素及びガス成分の提供を含む、マイクロ流体デバイスにおいて１つ又は複数の生体細胞を培養するシステム、方法、及びキットが記載される。幾つかの実施形態では、単一の細胞の培養は、マイクロ流体デバイスにおいてクローン集団を生成し得る。

Description

発明の背景
生物科学及び関連分野では、１つ又は複数の細胞の培養が有用であり得る。本発明の幾つかの実施形態は、マイクロ流体デバイスにおいて細胞又は細胞群を培養する装置及びプロセスを含む。
発明の概要
一態様では、１つ又は複数の生体細胞を培養するマイクロ流体デバイスが提供され、このデバイスは、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの成長室とを含み、分離領域は、接続領域に流体接続され、及び接続領域は、フロー領域への基端開口部を含み、少なくとも１つの成長室は、マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を更に含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体の分離領域は、第２の流体培地を含むように構成され得、フロー領域及び少なくとも１つの成長室に第１及び第２の流体培地がそれぞれ実質的に充填される場合、第２の流体培地の成分は、第１の流体培地に拡散し得、及び／又は第１の流体培地の成分は、第２の流体培地に拡散し得、及び第１の培地は、分離領域に実質的に流入しないことができる。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、フロー領域の少なくとも部分を有するマイクロ流体チャネルを更に含み得、少なくとも１つの成長室の接続領域は、マイクロ流体チャネル内に直接開口し得る。
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、マイクロ流体デバイス内での細胞可搬性を支持する１つ又は複数の作用剤を用いて調整され得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを用いて調整され得る。他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、サッカリド部分を含むポリマーを用いて調整され得る。幾つかの実施形態では、サッカリド部分を含むポリマーは、デキストランを含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アミノ酸部分を含むポリマーを用いて調整され得る。幾つかの実施形態では、ポリマーは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はDNase1であり得る。更に他の実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、カルボン酸部分、スルホン酸部分、核酸部分、又はホスホン酸部分を含むポリマーを用いて調整され得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、カルボン酸部分、スルホン酸部分、核酸部分、又はホスホン酸部分を含むポリマーを用いて調整され得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、マイクロ流体デバイスの表面に共有結合された結合基を含み、及び結合基は、マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、シロキシ結合基であり得る。他の実施形態では、結合基は、ホスホン酸エステル結合基であり得る。様々な実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキル又はフルオロアルキル部分を含み得る。幾つかの実施形態では、フルオロアルキル部分は、ペルフルオロアルキル部分であり得る。幾つかの実施形態では、アルキル又はフルオロアルキル部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有し得る。アルキル又はフルオロアルキル部分は、線状構造を有し得る。マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも調整された表面の結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に直接結合され得る。他の実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分にリンカーを介して間接的に結合され得る。幾つかの実施形態では、リンカーは、トリアゾリレン部分を含み得る。他の実施形態では、リンカーは、１つ又は複数のアリーレン部分を含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、サッカリド部分を含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキレンエーテル部分を含み得る。更に他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アミノ酸部分を含み得る。代替的に、少なくとも１つの調整された表面は、双性イオンを含み得る。更なる実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、ホスホン酸部分又はカルボン酸部分を含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アミノ部分又はグアニジン部分を含む。幾つかの他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキル若しくはフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸若しくはポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、アクチンフィラメントの形成を妨げ、インテグリン受容体をブロックし、又はＤＮＡファウリング表面への細胞の結合を低減し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、ＲＧＤ含有ペプチドであり得る。他の実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、サイトカラシンＢ、インテグリンへの抗体、小分子タンパク質、又はDNase1タンパク質を含み得るフィブロネクチンの阻害剤であり得る。他の実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、２種類以上の細胞接着ブロック分子の組合せを含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、開裂可能部分を含み得る。幾つかの実施形態では、開裂可能部分は、調整された表面の分裂を可能にするように構成され、それにより、培養後に１つ又は複数の生体細胞の可搬性を促進し得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を含み得る。哺乳類血清の１つ又は複数の成分は、Ｂ２７（登録商標）サプリメント、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を有する基板を更に含み得る。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ構成を有する基板は、１つ若しくは複数の生体細胞を成長室内に導入するか、又は１つ若しくは複数の生体細胞を成長室外に移動させるように構成され得る。ＤＥＰ構成は、光学的に作動され得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、少なくとも約３０℃の温度で安定であるように構成され得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの成長室の分離領域は、約１００個の範囲の細胞への細胞増殖を支持するのに十分な寸法を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの成長室に、１×１０２以下の生体細胞が維持され得、及び少なくとも１つの成長室の容積は、約２×１０６立方μｍ以下であり得る。他の実施形態では、１×１０２以下の生体細胞が少なくとも１つの成長室に維持され得、及び少なくとも１つの成長室の容積は、約１×１０７立方μｍ以下であり得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、デバイスは、第１又は第２の流体培地をフロー領域に入れるように構成された少なくとも１つの流入口と、第１の培地がフロー領域から出る際、第１の培地を受け取るように構成された少なくとも１つの流出口とを更に含み得る。マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの成長室又はその分離領域の上に変形可能蓋領域を更に含み得、それにより、変形可能蓋領域を押すことで生体細胞を分離領域からフロー領域に搬出するのに十分な力が及ぼされる。マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、蓋を含み得、蓋の少なくとも部分は、ガス透過可能であり得、それにより、マイクロ流体デバイス内に配置された流体培地へのガス分子源を提供する。蓋のガス透過性部分は、少なくとも１つの成長室の上に配置され得る。他の実施形態では、蓋のガス透過性部分は、フロー領域の上に配置され得る。更に他の実施形態では、少なくとも１つの成長室は、複数の成長室を含み得る。
様々な実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、複数の生体細胞を含み得る。マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの成長室は、哺乳類細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの成長室は、免疫細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含み得る。更に他の実施形態では、免疫細胞は、リンパ球又は白血球であり得る。幾つかの他の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、又は樹状細胞であり得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの成長室は、接着細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの成長室は、ハイブリドーマ細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの成長室は、単一の細胞及び生体細胞の対応するクローンコロニーの細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含み得る。
別の態様では、１つ又は複数の生体細胞をマイクロ流体デバイスで培養するシステムが提供され、本システムは、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、少なくとも１つの成長室とを有するマイクロ流体デバイスを含み、成長室は、マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を有する。少なくとも１つの成長室は、分離領域及び接続領域を含み得、分離領域は、接続領域に流体接続され、及び接続領域は、フロー領域への基端開口部を有する。幾つかの実施形態では、マイクロ流体の分離領域は、第２の流体培地を含むように構成され得、フロー領域及び少なくとも１つの成長室に第１及び第２の流体培地がそれぞれ実質的に充填される場合、第２の流体培地の成分は、第１の流体培地に拡散し得、及び／又は第１の流体培地の成分は、第２の流体培地に拡散し得、及び第１の培地は、分離領域に実質的に流入しないことができる。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、フロー領域の少なくとも部分を含むマイクロ流体チャネルを更に含み得、少なくとも１つの成長室の接続領域は、マイクロ流体チャネル内に直接開口し得る。マイクロ流体デバイスは、任意の要素を任意の組合せで有する、本明細書に記載されるような任意のマイクロ流体デバイスであり得る。
本システムの様々な実施形態では、本システムは、少なくとも第１の流体培地をかん流させるように構成されたフローコントローラを更に含み得る。コントローラは、少なくとも第１の流体培地を非連続的にかん流させるように構成される。
本システムの様々な実施形態では、本システムのマイクロ流体デバイスは、１つ若しくは複数の生体細胞を成長室内に導入するか、又は１つ若しくは複数の生体細胞を成長室外に移動させるように構成された誘電泳動（ＤＥＰ）構成を有する基板を更に含み得る。ＤＥＰ構成は、光学的に作動され得る。
本システムの様々な実施形態では、本システムは、第１の流体培地を含むように構成されたリザーバを更に含み得、リザーバは、マイクロ流体デバイスに流体接続される。リザーバは、溶解ガス分子で第１の流体培地を飽和させることが可能なガス環境によって接触されるように構成され得る。
本システムの様々な実施形態では、本システムは、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流入口に接続されたセンサを更に含み得、センサは、第１の流体培地のｐＨを検出するように構成され得る。本システムの様々な実施形態では、本システムは、少なくとも１つの流出口に接続されたセンサを更に含み得、センサは、第１の流体培地がマイクロ流体デバイスを出る際、第１の流体培地のｐＨを検出するように構成される。幾つかの実施形態では、センサは、光学センサであり得る。
本システムの様々な実施形態では、本システムは、少なくとも１つの成長室及び成長室に含まれる任意の生体細胞の画像を捕捉するように構成された検出器を更に含み得る。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、１つ又は複数の哺乳類細胞を含み得る。他の実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、１つ又は複数のハイブリドーマ細胞を含み得る。更に他の実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、１つ又は複数のリンパ球又は白血球細胞を含み得る。代替的に、１つ又は複数の生体細胞は、１つ又は複数の接着細胞を含み得る。
本システムの様々な実施形態では、成長室内の１つ又は複数の生体細胞は、単一の細胞であり得、及びコロニーは、生体細胞のクローンコロニーであり得る。
別の態様では、誘電泳動（ＤＥＰ）構成及び表面を有する基板と、基板の表面の酸化物部分に共有結合された調整された表面とを含む組成物が提供される。本組成物は、化学式１又は化学式２の構造を有し得、本明細書に定義されるように、化学式１又は化学式２の任意の値の要素を有し得る。
本組成物の幾つかの実施形態では、調整された表面は、表面の酸化物部分に共有結合された結合基を含み得、及び結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、シロキシ結合基であり得る。他の実施形態では、結合基は、ホスホン酸基であり得る。幾つかの実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に直接結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、リンカーへの接続を介して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、リンカーの第１の端部への接続を介して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。リンカーは、線状部を更に含み得、線状部の骨格は、ケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、トリアゾリレン部分を更に含み得る。幾つかの実施形態では、トリアゾリレン部分は、リンカーの線状部に割り込み得るか、又はリンカーの線状部の第２の端部に接続され得る。他の実施形態では、線状部の骨格は、アリーレン部分を含み得る。
様々な実施形態では、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分は、アルキル部分、フルオロアルキル部分、モノ若しくはポリサッカリド、アルコール部分、ポリアルコール部分、アルキレンエーテル部分、高分子電解質部分、アミノ基部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸アニオン部分、カルボキシベタイン部分、スルホベタイン部分、スルファミン酸部分、又はアミノ酸部分を含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アミノ酸、アルキル部分、ペルフルオロアルキル部分、デキストラン部分、及び／又はアルキレンエーテル部分を含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキル又はペルフルオロアルキル部分を含み得る。幾つかの実施形態では、アルキル又はペルフルオロアルキル部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有する。様々な実施形態では、調整された表面は、１つ又は複数の開裂可能部分を更に含み得る。開裂可能部分は、調整された表面の分裂を可能にし、それにより、培養後に１つ又は複数の生体細胞の可搬性を促進するように構成され得る。
別の態様では、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、少なくとも１つの成長室とを有するマイクロ流体デバイスにおいて少なくとも１つの生体細胞を培養する方法が提供され、本方法は、少なくとも１つの生体細胞を少なくとも１つの成長室に導入するステップであって、少なくとも１つの成長室は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を有するように構成される、ステップと、少なくとも、生体細胞のコロニーを生成するように少なくとも１つの生体細胞を増殖させるのに十分に長い時間期間にわたり、少なくとも１つの生体細胞を培養するステップとを含む。少なくとも１つの成長室は、分離領域及び接続領域を含み得、分離領域は、接続領域に流体的に結合され、及び接続領域は、フロー領域への基端開口部を有する。幾つかの実施形態では、マイクロ流体の分離領域は、第２の流体培地を含むように構成され得、フロー領域及び少なくとも１つの成長室に第１及び第２の流体培地がそれぞれ実質的に充填される場合、第２の流体培地の成分は、第１の流体培地に拡散し得、及び／又は第１の流体培地の成分は、第２の流体培地に拡散し得、及び第１の培地は、分離領域に実質的に流入しないことができる。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、フロー領域の少なくとも部分を有するマイクロ流体チャネルを更に含み得、少なくとも１つの成長室の接続領域は、マイクロ流体チャネル内に直接開口し得る。マイクロ流体デバイスは、任意の要素を任意の組合せで有する、本明細書に記載されるような任意のマイクロ流体デバイスであり得る。
本方法の幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、表面に共有結合された結合基を含み得、更に、結合基は、マイクロ流体デバイス内での１つ又は複数の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合される。幾つかの他の実施形態では、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分は、アルキル若しくはフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸若しくはポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキル又はペルフルオロアルキル部分を含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキレンエーテル部分又はデキストラン部分を含み得る。
本方法の幾つかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの成長室の少なくとも表面を調整するステップを含み得る。幾つかの実施形態では、調整することは、ポリマーを含む調整試剤を用いて少なくとも１つの成長室の少なくとも表面を処理することを含み得る。他の実施形態では、調整することは、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を用いて少なくとも１つの成長室の少なくとも表面を処理することを含み得る。更に他の実施形態では、調整することは、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を用いて少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を処理することを含み得る。
本方法の幾つかの実施形態では、少なくとも１つの生体細胞を少なくとも１つの成長室に導入することは、少なくとも１つの生体細胞を移動させるのに十分な強度を有する誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用することを含み得る。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用することは、ＤＥＰ力を光学的に作動させることを含み得る。
本方法の幾つかの実施形態では、本方法は、培養するステップ中に第１の流体培地をかん流させるステップを更に含み得、第１の流体培地は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流入口を介して導入され、且つマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流出口を介して搬出され、第１の流体培地は、搬出されると、任意選択的に第２の流体培地からの成分を含む。
本方法の幾つかの実施形態では、本方法は、培養するステップ後に、調整された表面の１つ又は複数の開裂可能部分を開裂させ、それにより、成長室又はその分離領域から且つフロー領域への１つ又は複数の生体細胞の搬出を促進するステップを更に含み得る。
本方法の幾つかの実施形態では、本方法は、１つ又は複数の生体細胞を成長室又はその分離領域からフロー領域に搬出するステップを更に含み得る。
本方法の幾つかの実施形態では、少なくとも１つの生体細胞は、哺乳類細胞を含み得る。本方法の他の実施形態では、少なくとも１つの生体細胞は、少なくとも１つの免疫細胞を含み得る。本方法の更に他の実施形態では、少なくとも１つの免疫細胞は、リンパ球又は白血球を含み得る。本方法の幾つかの他の実施形態では、少なくとも１つの免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、又は樹状細胞を含み得る。更に他の実施形態では、少なくとも１つの生体細胞は、接着細胞を含み得る。代替的に、少なくとも１つの生体細胞は、ハイブリドーマ細胞を含み得る。
本方法の幾つかの実施形態では、少なくとも１つの生体細胞を少なくとも１つの成長室に導入するステップは、単一の細胞を成長室に導入することを含み得、及び培養するステップによって生成された生体細胞のコロニーは、クローンコロニーであり得る。
別の態様では、マイクロ流体デバイスを含む、生体細胞を培養するキットが提供され、マイクロ流体デバイスは、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含む少なくとも１つの成長室とを有する。少なくとも１つの成長室は、分離領域及び接続領域を含み得、分離領域は、接続領域に流体接続され、及び接続領域は、フロー領域への基端開口部を有する。マイクロ流体デバイスは、要素の任意の組合せを有する、本明細書に記載されるような任意のマイクロ流体デバイスであり得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、アルキル部分、フルオロアルキル部分、モノ若しくはポリサッカリド部分、アルコール部分、ポリアルコール部分、アルキレンエーテル部分、高分子電解質部分、アミノ基部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸塩部分、カルボキシベタイン部分、スルホベタイン部分、スルファミン酸部分、又はアミノ酸部分を含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、サッカリド部分、アルキレンエーテル部分、アルキル部分、フルオロアルキル部分、又はアミノ酸部分の少なくとも１つを含む。幾つかの実施形態では、アルキル又はフルオロアルキル部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有する。
本キットの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、マイクロ流体デバイスの表面に共有結合された結合基を含み得、及び結合基は、マイクロ流体デバイス内での１つ又は複数の生体細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、シロキシ結合基であり得る。他の実施形態では、結合基は、ホスホン酸結合基であり得る。幾つかの実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に直接結合され得る。他の実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分にリンカーを介して間接的に結合され得る。結合基は、リンカーの第１の端部への接続を介して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。様々な実施形態では、リンカーは、線状部を更に含み得、線状部の骨格は、ケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、トリアゾリレン部分を含み得る。
本キットの様々な実施形態では、本キットは、表面調整試剤を更に含み得る。幾つかの実施形態では、表面調整試剤は、アルキレンエーテル部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、ホスホン酸部分、アミノ酸部分、核酸部分、又はサッカリド部分の少なくとも１つを含むポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、表面調整試剤は、アルキレンエーテル部分、アミノ酸部分、及び／又はサッカリド部分の少なくとも１つを含むポリマーを含み得る。
他の実施形態では、表面調整試剤は、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、アクチンフィラメントの形成を妨げ、インテグリン受容体をブロックし、又はＤＮＡファウリング表面への細胞の結合を低減し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、サイトカラシンＢ、ＲＧＤ含有ペプチド、フィブロネクチンの阻害剤、インテグリンへの抗体、又はDNase1タンパク質であり得る。幾つかの実施形態では、表面調整試剤は、２つ以上の細胞接着ブロック分子の組合せを含み得る。
更に他の実施形態では、表面調整試剤は、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を含み得る。幾つかの実施形態では、哺乳類血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）であり得る。
本キットの様々な実施形態では、本キットは、成長室の少なくとも１つの表面の調整を補充するように構成された試剤を含む培養培地添加剤を更に含み得る。培養培地添加剤は、Pluronic（登録商標）ポリマーを含み得る。
本キットの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、開裂可能部分を含み得る。幾つかの実施形態では、本キットは、調整された表面の開裂可能部分を開裂させるように構成された試剤を更に含み得る。
本キットの様々な実施形態では、本キットは、生体細胞の状態を検出する少なくとも１つの試剤を更に含み得る。
本発明の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器と併用されるシステムの例を示す。 本発明の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。 本発明の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。 本発明の幾つかの実施形態による成長室を示す。 本発明の幾つかの実施形態による成長室を示す。 本発明の幾つかの実施形態による詳細な成長室を示す。 本発明の実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。 本発明の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器と併用されるシステムの特定の例を示す。 本発明の幾つかの実施形態による撮像デバイスを示す。 内部で使用される成長室の更なる例を含むマイクロ流体デバイスの別の実施形態を示す。 内部で使用される成長室の更なる例を含むマイクロ流体デバイスの別の実施形態を示す。 内部で使用される成長室の更なる例を含むマイクロ流体デバイスの別の実施形態を示す。 調整培地をマイクロ流体デバイスに提供して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持することが可能なシステム構成要素の実施形態をそれぞれ表す。 調整培地をマイクロ流体デバイスに提供して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持することが可能なシステム構成要素の実施形態をそれぞれ表す。 調整培地をマイクロ流体デバイスに提供して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持することが可能なシステム構成要素の実施形態をそれぞれ表す。 調整培地をマイクロ流体デバイスに提供して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持することが可能なシステム構成要素の実施形態をそれぞれ表す。 調整培地をマイクロ流体デバイスに提供して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持することが可能なシステム構成要素の実施形態をそれぞれ表す。 マイクロ流体デバイスに入る培地及び／又はマイクロ流体デバイスから出る培地のｐＨを検出することが可能な１つ又は複数のセンサを有するマイクロ流体デバイスの表現である。 マイクロ流体デバイスにおいて流体培地をかん流させるプロセスの一実施形態の例である。 マイクロ流体デバイスにおいて流体培地をかん流させるプロセスの別の実施形態の例である。 細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せの強化した支持を提供する調整された表面の概略表現である。 本明細書に記載される方法による培養実験の一実施形態の写真表現である。 本明細書に記載される方法による培養実験の一実施形態の写真表現である。 本明細書に記載される方法による培養実験の一実施形態の写真表現である。 本明細書に記載される方法による培養実験の一実施形態の写真表現である。 本明細書に記載される方法による培養実験の一実施形態の写真表現である。 細胞がデバイスの成長室に配置される前のマイクロ流体デバイスを示す、本明細書に記載される方法による培養実験の別の実施形態の写真表現である。 １つの細胞がマイクロ流体デバイスの１つの成長室に配置される後の時点での図１１Ａの培養実験の実施形態の写真表現である。 図１１Ｂの細胞の培養中の細胞増殖を示す、後の時点での図１１Ａ及び図１１Ｂの培養実験の実施形態の写真表現である。 図１１Ｂの細胞の培養中の細胞増殖を示す、後の時点での図１１Ａ及び図１１Ｂの培養実験の実施形態の写真表現である。 図１１Ｂの細胞の培養中の細胞増殖を示す、後の時点での図１１Ａ及び図１１Ｂの培養実験の実施形態の写真表現である。 培養期間の終了後の増殖した細胞の取り出しを示す、後の時点での図１１Ａ及び図１１Ｂ並びに図１２Ａ〜図１２Ｃの培養実験の実施形態の写真表現である。 培養期間の終了後の増殖した細胞の取り出しを示す、後の時点での図１１Ａ及び図１１Ｂ並びに図１２Ａ〜図１２Ｃの培養実験の実施形態の写真表現である。 培養期間の終了後の増殖した細胞の取り出しを示す、後の時点での図１１Ａ及び図１１Ｂ並びに図１２Ａ〜図１２Ｃの培養実験の実施形態の写真表現である。 少なくとも１つの調整された表面を有するマイクロ流体デバイスでの別の培養実験の実施形態の写真表現である。 少なくとも１つの調整された表面を有するマイクロ流体デバイスでの別の培養実験の実施形態の写真表現である。
発明の詳細な説明
マイクロ流体環境は、栄養素及び／又は溶融可能な細胞の成長シグナリング種を細胞又は細胞群に時間依存様式及び場所依存濃度で提供する局所環境を細胞又は細胞群に提供する機会を提供する。これらの状況は、生体内での状態により近い成長状態を表し得るか、又は代替的にそのような典型的な状態への摂動を可能にして、非標準状態の研究及び非標準状態下での成長を可能にし得る。これらの要件は、標準化されたマクロスケール細胞培養方法を使用して満たすことができない。しかし、ａ）細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せの支持に貢献可能なマイクロ流体環境に細胞を配置し、ｂ）良好に細胞を維持し及び／又は細胞の集団を増殖させ、且つ／又はｃ）良好な成長及び／又は維持につながる状態を定義するように、１つ又は複数の細胞をより簡易に操作するための改善が必要とされる。本明細書に記載されるシステム及び方法は、マイクロ流体細胞培養のより精密な細胞処理、環境制御、及び細胞分離技法を可能にし、例えば、クローン細胞集団の生成に使用され得る。
本明細書は、本発明の例示的な実施形態及び適用を記載する。しかし、本発明は、これらの例示的な実施形態及び適用又は例示的な実施形態及び適用が動作する様式又は本明細書で記載される様式に限定されない。更に、図は簡易図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、明確にするために、誇張又は他の方法で一定の縮尺ではないことがある。更に、「上」、「付着される」、又は「結合される」という用語が本明細書で使用される場合、ある要素（例えば、材料、層、基板等）は、直接他の要素上にあるか、付着されるか、若しくは結合されるか、それともある要素と他の要素との間に１つ又は複数の介在要素があるかに関係なく、他の要素「上」にあり、それに「付着され」、又はそれに「結合される」ことができる。また、方向（例えば、上方、下方、頂部、底部、横、アップ、ダウン、下、上、上部、下部、水平、垂直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」等）は、提供される場合、相対的なものであり、限定としてではなく単なる例として、且つ説明及び考察を容易にするためにのみ提供される。更に、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が参照される場合、そのような参照は、それ自体により列挙される要素の任意の１つ、列挙された要素の全て未満の任意の組合せ、及び／又は列挙された要素の全ての組合せを含むことが意図される。本明細書でのセクション分割は、検討を容易にするためのみのものであり、考察される要素のいかなる組合せも限定しない。
本明細書で使用される場合、「実質的に」は、意図される目的で十分に機能することを意味する。したがって、「実質的に」という用語は、当業者により予期されるが、全体性能にそれほど影響しない等の絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果等からの小さくわずかな変動を可能にする。数値又は数値として表現することができるパラメータ若しくは特徴に関して使用される場合、「実質的に」は、１０％以内を意味する。
「１つ（ones）」という用語は２つ以上を意味する。本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを上回ることができる。
本明細書で使用される場合、「空気」とは、地球の大気中で支配的なガスの組成物を指す。４つの最も豊富なガスは、窒素（通常、約７８容量％の濃度、例えば、約７０〜８０％の範囲内で存在する）、酸素（通常、海面位で約２０．９５容量％、例えば、約１０％〜約２５％の範囲内で存在する）、アルゴン（通常、約１．０容量％、例えば、約０．１％〜約３％の範囲内で存在する）、及び二酸化炭素（通常、約０．０４％、例えば、約０．０１％〜約０．０７％の範囲で存在する）である。空気は、メタン、亜酸化窒素、又はオゾン等の他の微量ガス、花粉、ディーゼル粒子等の微量汚染物及び有機材料を有し得る。空気は、水蒸気（通常、約０．２５％で存在するか、又は約１０ｐｐｍ〜約５容量％の範囲で存在し得る）を含み得る。空気は、濾過され制御された組成物として培養実験での使用に提供され得、本明細書に記載のように調整され得る。
本明細書で使用される場合、「配置される」という用語は、その意味内に「置かれる」を包含する。
本明細書で使用される場合、「マイクロ流体デバイス」又は「マイクロ流体装置」は、流体を保持するように構成された１つ又は複数の離散マイクロ流体回路を含むデバイスであり、各マイクロ流体回路は、領域、流路、チャネル、室、及び／又はペンを含むが、これらに限定されない流体的に相互接続された回路要素と、流体（及び任意選択的に流体に懸濁した微小物体）をマイクロ流体デバイス内及び／又は外に流すように構成された少なくとも２つのポートとから構成される。通常、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、少なくとも１つのマイクロ流体チャネル及び少なくとも１つの室を含み、約１ｍＬ未満の容量の流体、例えば、約７５０μＬ未満、約５００μＬ未満、約２５０μＬ未満、約２００μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約２５μＬ未満、約２０μＬ未満、約１５μＬ未満、約１０μＬ未満、約９μＬ未満、約８μＬ未満、約７μＬ未満、約６μＬ未満、約５μＬ未満、約４μＬ未満、約３μＬ未満、又は約２μＬ未満の流体を保持する。特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約１μＬ〜２μＬ、約１μＬ〜３μＬ、約１μＬ〜４μＬ、約１μＬ〜５μＬ、約２μＬ〜５μＬ、約２μＬ〜８μＬ、約２μＬ〜１０μＬ、約２μＬ〜１２μＬ、約２μＬ〜１５μＬ、約２μＬ〜２０μＬ、約５μＬ〜２０μＬ、約５μＬ〜３０μＬ、約５μＬ〜４０μＬ、約５μＬ〜５０μＬ、約１０μＬ〜５０μＬ、約１０μＬ〜７５μＬ、約１０μＬ〜１００μＬ、約２０μＬ〜１００μＬ、約２０μＬ〜１５０μＬ、約２０μＬ〜２００μＬ、約５０μＬ〜２００μＬ、約５０μＬ〜２５０μＬ、又は約５０μＬ〜３００μＬを保持する。
本明細書で使用される場合、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」は、約１μＬ未満の容量の流体、例えば、約７５０ｎＬ、約５００ｎＬ、約２５０ｎＬ、約２００ｎＬ、約１５０ｎＬ、約１００ｎＬ、約７５ｎＬ、約５０ｎＬ、約２５ｎＬ、約２０ｎＬ、約１５ｎＬ、約１０ｎＬ、約９ｎＬ、約８ｎＬ、約７ｎＬ、約６ｎＬ、約５ｎＬ、約４ｎＬ、約３ｎＬ、約２ｎＬ、約１ｎＬ、又はそれ未満の流体を保持するように構成された少なくとも１つの回路要素を含むマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスである。通常、ナノ流体デバイスは、複数の回路要素（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、３０００個、３５００個、４０００個、４５００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１０，０００個、又はこれを超える）を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ又は複数（例えば、全て）は、約１００ｐＬ〜１ｎＬ、約１００ｐＬ〜２ｎＬ、約１００ｐＬ〜５ｎＬ、約２５０ｐＬ〜２ｎＬ、約２５０ｐＬ〜５ｎＬ、約２５０ｐＬ〜１０ｎＬ、約５００ｐＬ〜５ｎＬ、約５００ｐＬ〜１０ｎＬ、約５００ｐＬ〜１５ｎＬ、約７５０ｐＬ〜１０ｎＬ、約７５０ｐＬ〜１５ｎＬ、約７５０ｐＬ〜２０ｎＬ、約１ｎＬ〜１０ｎＬ、約１ｎＬ〜１５ｎＬ、約１ｎＬ〜２０ｎＬ、約１ｎＬ〜２５ｎＬ、又は約１ｎＬ〜５０ｎＬの容量の流体を保持するように構成される。他の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ又は複数（例えば、全て）は、約１００ｎＬ〜２００ｎＬ、約１００ｎＬ〜３００ｎＬ、約１００ｖ〜４００ｎＬ、約１００ｎＬ〜５００ｎＬ、約２００ｎＬ〜３００ｎＬ、約２００ｎＬ〜４００ｎＬ、約２００ｎＬ〜５００ｎＬ、約２００ｎＬ〜６００ｎＬ、約２００ｎＬ〜７００ｎＬ、約２５０ｎＬ〜４００ｎＬ、約２５０ｎＬ〜５００ｎＬ、約２５０ｎＬ〜６００ｎＬ、又は約２５０ｎＬ〜７５０ｎＬの容量の流体を保持するように構成される。
「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」は、本明細書では、水平寸法及び垂直寸法の両方よりもはるかに長い長さを有するマイクロ流体デバイスのフロー領域を指す。例えば、フローチャネルは、水平寸法又は垂直寸法のいずれか一方の長さの少なくとも５倍、例えば、長さの少なくとも１０倍、長さの少なくとも２５倍、長さの少なくとも１００倍、長さの少なくとも２００倍、長さの少なくとも３００倍、長さの少なくとも４００倍、長さの少なくとも５００倍、又はそれを超える長さであり得る。幾つかの実施形態では、フローチャネルの長さは、その間の任意の範囲を含む約２０，０００μｍ〜約１００，０００μｍの範囲である。幾つかの実施形態では、水平寸法は約１００μｍ〜約１０００μｍ（例えば、約１５０μｍ〜約５００μｍ）の範囲であり、垂直寸法は約２５μｍ〜約２００μｍの範囲、例えば、約４０μｍ〜約１５０μｍの範囲である。なお、フローチャネルは、マイクロ流体デバイスにおいて様々な異なる空間構成を有し得、したがって、完全に線形の要素に限定されない。例えば、フローチャネルは、以下の構成を有する１つ又は複数のセクションであり得るか、又はそれを含み得る：曲線、湾曲、螺旋、傾斜、下降、フォーク形（例えば、複数の異なる流路）、及びそれらの任意の組合せ。加えて、フローチャネルは、経路に沿って異なる断面積を有し、広がり及び収縮して所望の流体フローを内部に提供し得る。
本明細書で使用される場合、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイス内の２つの異なる領域又は回路要素間の標的微小物体の移動を部分的に（完全にではなく）妨げるのに十分に大きいバンプ又は同様のタイプの構造物を指す。２つの異なる領域／回路要素は、例えば、マイクロ流体培養室及びマイクロ流体チャネル又はマイクロ流体培養室の接続領域及び分離領域であり得る。
本明細書で使用される場合、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスでの回路要素（又は２つの回路要素間の界面）の幅の狭まりを指す。狭窄は、例えば、マイクロ流体培養室とマイクロ流体チャネルとの間の界面又はマイクロ流体培養室の分離領域と接続領域との間の界面に配置することができる。
本明細書で使用される場合、「透明」という用語は、可視光が透過する際、可視光を実質的に変更せずに透過させる材料を指す。
本明細書で使用される場合、「微小物体」という用語は、一般に、本発明により分離し収集し得る任意の顕微鏡的物体を指す。微小物体の非限定的な例としては、微粒子；微小ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex（商標）ビーズ等）；磁性ビーズ；微小ロッド；微小ワイヤ；量子ドット等の無生物微小物体、細胞（例えば、胚、卵母細胞、精子細胞、組織から解離された細胞、真核細胞、原生細胞、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞等を含むが、これらに限定されない免疫細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞株からの細胞、循環腫瘍細胞を含むが、これに限定されないがん細胞、感染細胞、ＣＨＯ細胞を含むが、これに限定されないトランスフェクト細胞及び／又は形質転換細胞、レポーター細胞、原核細胞等）；生物学的細胞小器官（例えば、核）；ベシクル又は複合体；合成ベシクル；リポソーム（例えば、合成又は膜標本由来）；脂質ナノクラフト（Ritchie et al. (2009)“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs”, Methods Enzymol., 464:211-231に記載のように）等の生物学的微小物体、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ（例えば、細胞に付着した微小ビーズ、リポソームコーティング微小ビーズ、リポソームコーティング磁性ビーズ等）が挙げられる。ビーズは、蛍光標識、タンパク質、小分子シグナリング部分、抗原、又はアッセイで使用可能な化学／生物種等の共有結合又は非共有結合された他の部分／分子を更に有し得る。
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は生体細胞を指し、生体細胞は、植物細胞、動物細胞（例えば、哺乳類細胞）、バクテリア細胞、真菌細胞等であり得る。哺乳類細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長類等からの細胞であり得る。
生体細胞のコロニーは、生殖可能なコロニー内の生細胞の全ては、単一の親細胞由来の娘細胞である場合、「コロニー」である。「クローン細胞」という用語は、同じクローンコロニーの細胞を指す。
本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」は、２つ以上の細胞（例えば、２〜２０個、４〜４０個、６〜６０個、８〜８０個、１０〜１００個、２０〜２００個、４０〜４００個、６０〜６００個、８０〜８００個、１００〜１０００個、又は１０００個を超える細胞）を指す。
本明細書で使用される場合、「細胞を維持する」という用語は、細胞を生存した状態に保ち、及び／又は増殖させるのに必要な状況を提供する流体成分及びガス成分の両方を含む環境を提供することを指す。
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞を指す場合、細胞数の増大を指す。
本明細書で参照される場合、「ガス透過可能」は、材料又は構造が酸素、二酸化炭素、又は窒素の少なくとも１つを透過可能なことを意味する。幾つかの実施形態では、ガス透過可能材料又は構造は、酸素、二酸化炭素、及び窒素の２つ以上を透過可能であり、これら３つのガス全てを更に透過可能であり得る。
流体培地の「成分」は、溶媒分子、イオン、小分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝産物等を含め、培地に存在する任意の化学的又は生物学的分子である。
流体培地を参照して本明細書で使用される場合、「拡散する」及び「拡散」は、濃度勾配の低い方への流体培地の成分の熱力学的運動を指す。
「培地のフロー」という語句は、拡散以外の任意の機構に主に起因した流体培地のバルク移動を意味する。例えば、培地のフローは、ある箇所から別の箇所への、箇所間の圧力差に起因した流体培地の移動を含むことができる。そのようなフローは、液体の連続、パルス、周期的、ランダム、断続的、若しくは往復フロー、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。ある流体培地が別の流体培地に流れる場合、培地の乱流又は混合が生じ得る。
「実質的にフローがない」という語句は、時間にわたり平均された場合、流体培地内への又は流体培地内での材料（例えば、関心のある分析物）の成分の拡散率未満である流体培地の流量を指す。そのような材料の成分の拡散率は、例えば、温度、成分のサイズ、及び成分と流体培地との相互作用の強さに依存し得る。
マイクロ流体デバイス内の異なる領域を参照して本明細書で使用される場合、「流体接続される」という語句は、異なる領域が流体培地等の流体で実質的に充填される場合、各領域内の流体が連通して単一の流体を形成することを意味する。これは、異なる領域内の流体（又は流体培地）が必ずしも組成物内で同一であることを意味しない。むしろ、マイクロ流体デバイスの異なる流体接続領域内の流体は、流束内にある異なる組成物（例えば、タンパク質、炭水化物、鉄、又は他の分子等の異なる濃度の溶質）を有することができ、その理由は、溶質が各濃度勾配を下がって移動し、及び／又は流体がデバイスを通って流れるためである。
マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスは、「掃引」領域及び「非掃引」領域を含むことができる。本明細書で使用される場合、「掃引」領域は、マイクロ流体回路の流体相互接続された１つ又は複数の回路要素で構成され、各回路要素は、流体がマイクロ流体回路を通って流れているとき、培地のフローを経験する。掃引領域の回路要素は、例えば、領域、チャネル、及び室の全て又は部分を含むことができる。本明細書で使用される場合、「非掃引」領域は、マイクロ流体回路の流体的に相互接続された１つ又は複数の回路要素で構成され、各回路要素は、流体がマイクロ流体回路を通って流れているとき、流束を実質的に経験しない。非掃引領域は、流体接続が、拡散を可能にするが、掃引領域と非掃引領域との間で実質的に培地が流れないように構造化される場合、掃引領域に流体接続することができる。したがって、マイクロ流体デバイスは、実質的に掃引領域と非掃引領域との間での拡散連通のみを可能にしながら、非掃引領域を掃引領域での培地のフローから実質的に分離するように構造化することができる。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルは掃引領域の例であり、一方、マイクロ流体デバイスの分離領域（更に詳細に後述する）は非掃引領域の例である。
本明細書で使用される場合、流体培地フローの「非掃引」率は、成長室の分離領域内の第２の流体培地の成分をフロー領域内の第１の流体培地に拡散させ、及び／又は第１の流体培地の成分を分離領域内の第２の流体培地に拡散させるのに十分な流量であって、更に第１の媒質が分離領域に実質的に流入しない流量を意味する。
本明細書で使用される場合、「流路」は、培地のフローの軌道を画定し、培地のフローの軌道の対象である流体接続された１つ又は複数の回路要素（例えば、チャネル、領域、室等）を指す。したがって、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路要素（例えば、非掃引領域）は、流路内の培地のフローの対象とならずに、流路を含む回路要素に流体接続され得る。
「アリーレン」は、本明細書で使用される場合、炭素環式（例えば、フェニル、フルオレニル、及びナフチル）であるΠ共役電子系を有する少なくとも１つのリングを有し、分子の他の部分への１つ又は２つの付着点を有する、６〜１０個の環原子（例えば、Ｃ６〜Ｃ１０芳香族又はＣ６〜Ｃ１０アリール）を有する芳香族ラジカルを指す。「６〜１０」等の数値範囲は、本明細書に現れる場合には常に所与の範囲内の各整数を指す。例えば、「６〜１０個の環原子」は、アリール基が６個の環原子、７個の環原子など、１０個以上を含む環原子からなり得ることを意味する。この用語は、単環式基又は縮合環多環式基（すなわち、環原子の隣接ペアを共有するリング）を含む。アリーレンの例としては、フェニレン、ナフチレン等が挙げられるが、これらに限定されない。アリーレン部分は、更に置換されてもよく、又は分子の他の部分への１つ又は２つの付着点以外の置換を有さなくてもよい。
「ヘテロアリーレン」は、本明細書で使用される場合、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１つ又は複数の環ヘテロ原子を含み、単環式、二環式、三環式、又は四環式系を含み得る、環員数５〜１８の芳香族ラジカル（例えば、Ｃ５〜Ｃ１３ヘテロアリール）を指し、−ｅｎｅ接尾語は、ヘテロアリール還系が分子の他の部分への１つ又は２つの付着点を有することを示す。「５〜１８」等の数値範囲は、本明細書で現れる場合には常に所与の範囲内の各整数を指す。例えば、「５〜１８個の環原子」は、ヘテロアリール基が５個の環原子、６個の環原子など、１８個以上の環原子からなり得ることを意味する。Ｎ含有「ヘテロ芳香族」又は「ヘテロアリール」部分は、リングの骨格原子の少なくとも１つが窒素原子である芳香族基を指す。多環ヘテロアリール基は溶解されてもよく、又は溶解されなくてもよい。ヘテロアリールラジカル内のヘテロ原子は、任意選択的に酸化され得る。１つ又は複数の窒素原子は、存在する場合、任意選択的に四級化され得る。ヘテロアリールは、リングの任意の原子を通して残りの分子に付着する。ヘテロアリーレンの例としては、ベンゾイミダゾリレン、ベンゾインドリレン、イソオキサゾリレン、チアゾリレン、トリアゾリレン、テトラゾリレン、及びチオフェニレン（すなわち、チエニレン）が挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリーレン部分は、更に置換されてもよく、又は分子の他の部分への１つ又は複数の付着点以外の他の置換を有さなくてもよい。
「ヘテロ環」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ、２つ、若しくは３つのヘテロ原子、好ましくは酸素、窒素、及び硫黄から独立して選択される１つ若しくは２つのヘテロ原子を含む置換若しくは非置換の環員数３、４、５、６、若しくは７の飽和若しくは部分非飽和リング；又は酸素、窒素、及び硫黄から独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む最高で１０個までの原子を含み、ヘテロ原子を含むリングが飽和する二重環系を指す。ヘテロ環の例としては、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、４−ピラニル、テトラヒドロピラニル、チオラニル（thiolanyl）、モルホリニルピペラジニル、ジオキソラニル、ジオキサニル、及び５−メチル−６−クロマニルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロ環基は、分子の他の部分への１つ又は２つの付着点を有し得、更に置換されてもよく、又は更に置換されなくてもよい。
システム
マイクロ流体デバイスを含む、マイクロ流体デバイスにおいて１つ又は複数の生体細胞を培養するシステムが提供され、マイクロ流体デバイスは、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、少なくとも１つの成長室とを含み、成長室は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を有する。
マイクロ流体デバイス及びそのようなデバイスを動作させ観測するシステム
図１は、本発明の実施に使用することができるマイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の例を示す。カバー１１０を一部切り欠き、マイクロ流体デバイス１００内の部分図を提供するマイクロ流体デバイス１００の斜視図を示す。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流路１０６を通って流体培地１８０が流れることができ、任意選択的に１つ又は複数の微小物体（図示せず）をマイクロ流体回路１２０内及び／又はマイクロ流体回路１２０を通して搬送する。１つのマイクロ流体回路１２０が図１に示されているが、適するマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２又は３個）のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それに関係なく、マイクロ流体デバイス１００はナノ流体デバイスであるように構成され得る。図１に示される実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体成長室１２４、１２６、１２８、及び１３０を含み、各成長室は、流路１０６に流体接続する１つ又は複数の開口部を有する。更に以下で考察するように、マイクロ流体成長室は、培地１８０が流路１０６を通って流れているときであっても、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前に、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の概説を提供する。
図１に概して示されるように、マイクロ流体回路１２０はエンクロージャ１０２により画定される。エンクロージャ１０２は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図１に示される例では、エンクロージャ１０２は、支持構造体１０４（例えば、基部）、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０を含むものとして示されている。支持構造体１０４、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造体１０４の内面１０９に配置することができ、カバー１１０は、マイクロ流体回路構造１０８を覆って配置することができる。支持構造体１０４及びカバー１１０と一緒に、マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の要素を画定することができる。
図１に示されるように、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の下部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の上部にあり得る。代替的に、支持構造体１０４及びカバー１１０は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の上部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれがエンクロージャ１０２内又は外への通路を含む１つ又は複数のポート１０７があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート１０７は、マイクロ流体回路構造１０８のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート１０７は、カバー１１０等のエンクロージャ１０２の他の構成要素に配置することができる。１つのみのポート１０７が図１に示されているが、マイクロ流体回路１２０は２つ以上のポート１０７を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路１２０に入るための流入口として機能する第１のポート１０７があり得、流体がマイクロ流体回路１２０を出るための流出口として機能する第２のポート１０７があり得る。ポート１０７が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路１０６を通って流れる方向に依存し得る。
支持構造体１０４は、１つ又は複数の電極（図示せず）と、基板又は複数の相互接続された基板を含むことができる。例えば、支持構造体１０４は、１つ又は複数の半導体基板を含むことができ、各半導体基板は電極に電気的に接続される（例えば、半導体基板の全て又はサブセットは、１つの電極に電気的に接続することができる）。支持構造体１０４は、プリント回路基板組立体（「ＰＣＢＡ」）を更に含むことができる。例えば、半導体基板はＰＣＢＡ上に搭載することができる。
マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定することができる。そのような回路要素は、マイクロ流体回路１２０に流体が充填される場合、流体的に相互接続することができる、フローチャネル、室、ペン、トラップ等の空間又は領域を含むことができる。図１に示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路１０８は、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。枠１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的又は完全に囲むことができる。枠１１４は、例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に囲む比較的剛性の構造であり得る。例えば、枠１１４は金属材料を含むことができる。
マイクロ流体回路材料１１６には、キャビティ等をパターニングして、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互接続を画定することができる。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過可能であり得る可撓性ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等）等の可撓性材料を含むことができる。マイクロ流体回路材料１１６を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、シリコーン（フォトパターニング可能シリコーン又は「ＰＰＳ」）等のエッチング可能材料、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）等が挙げられる。幾つかの実施形態では、そのような材料 − したがって、マイクロ流体回路材料１１６ − は、剛性及び／又はガスを実質的に不透過であり得る。それに関係なく、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造体１０４上及び枠１１４内部に配置することができる。
カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であり得る。代替的に、カバー１１０は、図１に示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体１０４は、示されるように枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造であってもよく、又は枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であってもよい。同様に、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１に示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。
幾つかの実施形態では、カバー１１０は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、ＰＤＭＳ等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー１１０の１つ又は複数の部分（例えば、成長室１２４、１２６、１２８、１３０上に位置する１つ又は複数の部分）は、カバー１１０の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー１１０は１つ又は複数の電極を更に含むことができる。１つ又は複数の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム−錫−酸化物（ＩＴＯ）等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、１つ又は複数の電極は、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスタ、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Chiouら）に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、細胞の接着、生存、及び／又は成長を支持するように変更することができる（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより）。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造体１０４は、光を透過することができる。カバー１１０は、ガス透過可能な少なくとも１つの材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を含むこともできる。
図１は、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、示されるように、電源１９２、撮像デバイス１９４、及び傾斜デバイス１９０を含む。
電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス１９４は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイス１９４は、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器を更に含む。撮像デバイス１９４は、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図３に関して考察するように、撮像デバイス１９４は顕微鏡（又は光学縦列）を更に含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
システム１５０は、１つ又は複数の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を回転させるように構成された傾斜デバイス１９０を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、マイクロ流体デバイス１００（したがって、マイクロ流体回路１２０）を水平向き（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に相対して０°）、垂直向き（すなわち、ｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°）、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも１つの軸の周りでマイクロ流体回路１２０を含むエンクロージャ１０２を支持及び／又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス１９０は、ｘ軸に相対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス１００を傾斜させることができる。水平向き（したがって、ｘ軸及びｙ軸）は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸若しくはｙ軸に相対して１８０°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、流路１０６又はマイクロ流体回路１２０の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾斜させる。
幾つかの場合、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が１つ又は複数の成長室の上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の成長室よりも高く位置する（すなわち、流路１０６の上方の成長室内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。「下方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の成長室よりも下に位置する（すなわち、流路１０６の下方の成長室内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。
幾つかの場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が、成長室の真上又は真下に配置されずに、１つ又は複数の成長室の上方又は下方に配置されるように、９０°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。
システム１５０は培地源１７８を更に含むことができる。培地源１７８（例えば、容器、リザーバ等）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源１７８は、図１に示されるように、マイクロ流体デバイス１００の外部にある、マイクロ流体デバイス１００とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源１７８は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス１００のエンクロージャ１０２内部に配置することができる。例えば、培地源１７８は、マイクロ流体デバイス１００の部分であるリザーバを含むことができる。
図１は、システム１５０の一部を構成し、マイクロ流体デバイス１００と併せて利用することができる制御及び監視機器１５２の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器１５２の例は、培地源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する原動モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像デバイス１９４（例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾斜デバイス１９０を制御する傾斜モジュール１６６とを含むマスタコントローラ１５４を含む。制御機器１５２は、マイクロ流体デバイス１００に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール１６８を含むこともできる。示されるように、機器１５２は、表示デバイス１７０及び入／出力デバイス１７２を更に含むことができる。
マスタコントローラ１５４は、制御モジュール１５６及びデジタルメモリ１５８を含むことができる。制御モジュール１５６は、例えば、メモリ１５８内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等）に従って動作するように構成されたデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール１５６は、ハードワイヤードデジタル回路及び／又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス１００又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されたマスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８の任意の１つ又は複数により実行され得る。同様に、マスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。
培地モジュール１６０は培地源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、培地源１７８を制御して、選択された流体培地１８０をエンクロージャ１０２に入れる（例えば、流入口１０７を介して）ことができる。培地モジュール１６０は、エンクロージャ１０２からの培地の取り出し（例えば、流出口（図示せず）を通して）を制御することもできる。したがって、１つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路１２０に入れ、マイクロ流体回路１２０から搬出することができる。培地モジュール１６０は、マイクロ流体回路１２０内部の流路１０６での流体培地１８０のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール１６０は、傾斜モジュール１６６が傾斜デバイス１９０に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる前に、流路１０６内及びエンクロージャ１０２を通る培地１８０のフローを停止させる。
原動モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図２Ａ及び図２Ｂに関して後述するように、エンクロージャ１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成、及び／又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成（図１に示されず）を含むことができ、原動モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）のアクティブ化を制御して、流路１０６及び／又は成長室１２４、１２６、１２８、１３０で微小物体（図示せず）及び／又は培地の液滴（図示せず）を選択し移動させることができる。
撮像モジュール１６４は撮像デバイス１９４を制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像デバイス１９４から画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイス１９４からの画像データは、撮像デバイス１９４により捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の標識の蓄積の有無等）。撮像デバイス１９４により捕捉された情報を使用して、撮像モジュール１６４は、物体（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はマイクロ流体デバイス１００内のそのような物体の移動速度を更に計算することができる。
傾斜モジュール１６６は、傾斜デバイス１９０の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール１６６は、重力を介して１つ又は複数の成長室への微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路１２０での微小物体及び／又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール１６６は、マイクロ流体回路１２０の傾斜を調整して、マイクロ流体回路１２０内で微小物体及び／又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール１６６は、このデータを使用して、マイクロ流体回路１２０内での微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。
図１に示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２及び成長室１２４、１２６、１２８、１３０を含むものとして示されている。各室は、チャネル１２２への開口部を含むが、室が室内部の微小物体を流体培地１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６又は他の室内の微小物体から実質的に分離することができるように、その他では閉じられている。幾つかの場合、室１２４、１２６、１２８、１３０は、１つ又は複数の微小物体をマイクロ流体回路１２０内部に物理的に入れるように構成される。本発明による成長室は、以下に詳細に考察され示されるように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、及び／又は重力との併用に最適化される様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。
マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体成長室を含み得る。５つの成長室が示されるが、マイクロ流体回路１２０は、より少数又はより多数の成長室を有し得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体成長室を含み、成長室の２つ以上は異なる構造及び／又は特徴を含む。
図１に示される実施形態では、１つのチャネル１２２及び流路１０６が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むように構成された複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０は、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通する流入弁又はポート１０７を更に含み、それにより、流体培地１８０は、流入口１０７を介してチャネル１２２にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路１０６は１つの経路を含む。幾つかの場合、１つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路１０６は、交互になった方向で２回以上にわたってマイクロ流体デバイス１００にわたり移動する。
幾つかの場合、マイクロ流体回路１２０は、複数の平行チャネル１２２及び流路１０６を含み、各流路１０６内の流体培地１８０は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路１０６内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の成長室は、標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される（例えば、チャネル１２２に相対して）。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、１つ又は複数の微小物体トラップ１３２を更に含む。トラップ１３２は、一般に、チャネル１２２の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体成長室１２４、１２６、１２８、１３０の１つ又は複数の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から１つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。
トラップ１３２は、標的微小物体のトラップ１３２へのフローを支援するように構成された開口部を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ１３２は、トラップ１３２内への標的微小物体の保持を支援するように構成された他の特徴を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、微小流体成長室の開口部と位置合わせされ、微小流体成長室の開口部に関してチャネル１２２の逆側に配置され、それにより、チャネル１２２に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を成長室の開口部に落とす軌道でトラップ１３２を出る。幾つかの場合、トラップ１３２は、標的微小物体よりも小さく、トラップ１３２を通るフローを促進し、それにより、トラップ１３２内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路１３４を含む。
幾つかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）力は、１つ又は複数の電極（図示せず）を介して流体培地１８０にわたり適用されて（例えば、流路及び／又は成長室において）、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、マイクロ流体回路１２０の１つ又は複数の部分に適用されて、１つの微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体成長室に輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、成長室（例えば、成長室１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の微小物体が成長室から変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、本発明の教示により前に収集された微小物体を成長室から選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。
他の実施形態では、光電子ウェッティング（ＯＥＷ）力が、１つ又は複数の電極（図示せず）を介してマイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）での１つ又は複数の位置（例えば、流路及び／又は成長室の画定に役立つ位置）に適用されて、マイクロ流体回路１２０に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力は支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置に適用されて、１つの液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体成長室に輸送する。幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、成長室（例えば、成長室１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の液滴が成長室から変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、本発明の教示により前に収集された液滴を成長室から選択的に取り出す。
幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、フロー及び／又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ１０２は傾斜して（例えば、傾斜デバイス１９０により）、流路１０６及び流路１０６内に配置された微小物体をマイクロ流体成長室の上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び／又は液滴を室内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の後に適用することができる。更に他の場合、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。
図２Ａ〜図２Ｆは、本発明の実施に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図２Ａは、マイクロ流体デバイス２００が光学作動動電学的デバイスとして構成された実施形態を示す。光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するＯＥＴ構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される：米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）。ＯＥＷ構成の例は、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Chiouら）に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に援用される。光学作動動電的デバイスの更に別の例は、ＯＥＴ／ＯＥＷ結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Khandrosら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Khandrosら）並びにそれらの対応するＰＣＴ公報である国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
原動マイクロ流体デバイス構成
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより、個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより、個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。
ＤＥＰ構成を含むマイクロ流体デバイス２００の一例を図２Ａ及び図２Ｂに示す。簡潔にするために、図２Ａ及び図２Ｂは、開放領域／室２０２を有するマイクロ流体デバイス２００のエンクロージャ１０２の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域／室２０２が、成長室、成長室、フロー領域、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。更に、マイクロ流体デバイス２００は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス２００は、マイクロ流体デバイス１００に関して本明細書に記載される等の複数の成長室、或いは成長室及び／又は１つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。ＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイス２００の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス２００内に組みこまれ得、及び／又はマイクロ流体デバイス２００と組み合わせて使用し得ることを更に理解されたい。例えば、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び他のモジュール１６８の１つ又は複数を含む上述した制御及び監視機器１５２を含むシステム１５０は、マイクロ流体デバイス２００と併用し得る。
図２Ａにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス２００は、下部電極２０４及び下部電極２０４に重なる電極活性化基板２０６を有する支持構造体１０４と、上部電極２１０を有するカバー１１０とを含み、上部電極２１０は下部電極２０４から離間される。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／室２０２の両面を画定する。したがって、領域／室２０２に含まれる培地１８０は、上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続を提供する。下部電極２０４と上部電極２１０との間に接続され、領域／室２０２でのＤＥＰ力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成された電源２１２も示されている。電源２１２は、例えば、交流（ＡＣ）電源であり得る。
特定の実施形態では、図２Ａ及び図２Ｂに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２２０からの光２２２の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図２Ｂに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターン２２２は、正方形等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち、下部電極２０４から、フロー領域１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／室２０２において培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／室２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。
電源２１２が活性化されている場合、上記ＤＥＰ構成は、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗ＤＥＰ電極領域２１４との間に流体培地１８０内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地１８０内の付近の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥する局所ＤＥＰ力を生成する。したがって、流体培地１８０内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光源２２０からマイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２２２を変更することにより、領域／室２０２の内面２０８での多くの異なるそのようなＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源２１２の周波数並びに培地１８０及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性等のパラメータに依存し得る。
図２Ｂに示される照明ＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２４は単なる例である。デバイス２００に投射される光パターン２２２により、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照明する（それにより、活性化する）ことができ、照明／活性化されるＤＥＰ電極領域２１４のパターンは、光パターン２２２を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
幾つかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板２０６の内面２０８は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の数／水素及びケイ素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域２１４は、光パターン２２２により、電極活性化基板２０８の内面２０８上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン２２２に対応することができる。上述したような光伝導層を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層（又は領域）、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応する。代替的に、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができ、そのような各電極はＤＥＰ電極領域２１４に対応する。電極活性化基板２０６は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板２０６の内面２０８におけるＤＥＰ電極領域２１４と下部電極２１０との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続（すなわち、フォトトランジスタ又は電極）は、光パターン２２２により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板２０６を通る（すなわち、下部電極２０４から、領域／室２０２内の培地１８０と界面を接する電極活性化電極２０６の内面２０８まで）相対インピーダンスが、対応するＤＥＰ電極領域２１４における培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン２２２内の光により活性化される場合、電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４での培地１８０を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化する。したがって、培地１８０内の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光パターン２２２により決まるように、領域／室２０２での電極活性化基板２０６の内面２０８での多くの異なるＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。
フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）に記載されており（例えば、図２１及び図２２に示されるデバイス３００並びにその説明を参照されたい）、この内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）に記載されており（例えば、図面全体を通して示されるデバイス２００、４００、５００、６００、及び９００並びにその説明を参照されたい）、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極２１０はエンクロージャ１０２の第１の壁（又はカバー１１０）の一部であり、電極活性化基板２０６及び下部電極２０４は、エンクロージャ１０２の第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部である。領域／室２０２は、第１の壁と第２の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極２１０は第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部であり、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方は、第１の壁（又はカバー１１０）の一部である。更に、光源２２０は代替的に、下からエンクロージャ１０２を照明するのに使用することができる。
ＤＥＰ構成を有する図２Ａ及び図２Ｂのマイクロ流体デバイス２００を用いて、原動モジュール１６２は、光パターン２２２をデバイス２００に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２４）で電極活性化基板２０６の内面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａでの第１の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、領域／室２０２での培地１８０内の微小物体（図示せず）を選択することができる。次に、原動モジュール１６２は、光パターン２２２をデバイス２００に相対して移動させて、ＤＥＰ電極領域２１４での第２の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、デバイス２００を光パターン２２２に相対して移動させることができる。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、電極活性化基板２０６の内面２０８でのＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構成を有することができる。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉して、ＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたＤＥＰ電極の近傍での領域／室２０２内の微小物体（図示せず）に対する正味ＤＥＰ力を生成する。電源２１２の周波数及び培地（図示せず）及び／又は領域／室２０２内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、ＤＥＰ力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。ＤＥＰ電極の組（例えば、正方形パターン２２４を形成するＤＥＰ電極領域２１４の組における）を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域／室２０２における１つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域／室２０２内で移動させることができる。図１の原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御し、したがって、ＤＥＰ電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域／室２０２の周囲の特定の微小物体（図示せず）を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，２９４，０６３号（Beckerら）及び同第６，９４２，７７６号（Medoro）に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
更なる別例として、マイクロ流体デバイス２００は電子ウェッティング（ＥＷ）構成を有することができ、ＥＷ構成は、ＤＥＰ構成の代わりであってもよく、又はＤＥＰ構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス２００の部分に配置されてもよい。ＥＷ構成は、光電子ウェッティング構成又は誘電体上の電子ウェッティング（ＥＷＯＤ）構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのＥＷ構成では、支持構造体１０４は、誘電層（図示せず）と下部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び／又は疎水性材料でコーティングすることができる。ＥＷ構成を有するマイクロ流体デバイス２００の場合、支持構造体１０４の内面２０８は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。
誘電層（図示せず）は、１つ又は複数の酸化物層を含むことができ、厚さ約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ〜約１７５ｎｍ）を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム）等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約１０ｋオーム〜約５０ｋオームのインピーダンスを有することができる。
幾つかの実施形態では、領域／室２０２に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、TEFLON（登録商標）又はポリ（２，３−ジフルオロメチレニル−ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、CYTOP（商標））などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する）であり得る。代替的に、フッ素化（又はパーフルオロ化）炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５ｎｍ〜３．０ｎｍ）を有する。
幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス２００のカバー１１０も同様に疎水性材料（図示せず）でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体１０４の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体１０４の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。更に、カバー１１０は、支持構造体１０４の様式で、誘電層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含むことができる。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電層は、電極活性化基板２０６及び支持構造体１０４の誘電層と同じ組成及び／又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス２００は２つの電子ウェッティング表面を有することができる。
幾つかの実施形態では、電子活性化基板２０６は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の総数及びケイ素原子の総数／水素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。代替的に、電子活性化基板２０６は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び／又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）には、ａ−Ｓｉ：Ｈ等の光伝導性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記引用した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）には、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
したがって、マイクロ流体デバイス２００は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン２２２を使用して、電極活性化基板２０６での光応答性ＥＷ領域又は光応答性ＥＷ電極を活性化することができる。電極活性化基板２０６のそのような活性化されたＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング）において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板２０６に入射する光パターン２２２を変更する（又は光源２２０に相対してマイクロ流体デバイス２００を移動させる）ことにより、支持構造体１０４の内面２０８に接触する液滴（例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む）は、領域／室２０２内に存在する不混和流体（例えば、油媒体）を通って移動することができる。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、ＥＷＯＤ構成を有することができ、電極活性化基板２０６は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板２０６は、パターンになったそのような電子ウェッティング（ＥＷ）電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等の行列に配置された略正方形のＥＷ電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のＥＷ電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、ＥＷ電極は、電気スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）により選択的に活性化（又は非活性化）することができる。電極活性化基板２０６でのＥＷ電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面２０８又はその疎水性コーティングに接触する液滴（図示せず）は、領域／室２０２内で移動することができる。図１の原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のＥＷ電極を活性化及び非活性化して、領域／室２０２の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するＥＷＯＤ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６８５，３４４号（Sundarsanら）に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
マイクロ流体デバイス２００の構成に関係なく、電源２１２を使用して、マイクロ流体デバイス２００の電気回路に給電する電位（例えば、ＡＣ電源電位）を提供することができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じ又は電源１９２の構成要素であり得る。電源２１２は、上部電極２１０及び下部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を提供するように構成され得る。ＡＣ電圧の場合、電源２１２は、上述したように、領域／室２０２内の個々の微小物体（図示せず）を捕捉して移動させ、及び／又はこれらも上述したように、領域／室２０２内の支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、誘電層及び／又は誘電層上の疎水性コーティング）のウェッティング特性を変更するのに十分に強い正味ＤＥＰ力（又は電子ウェッティング力）を生成するのに十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力（例えば、電圧又は電流）を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Khandrosら）、及び同第２０１５／０３０６５９９号（Khandrosら）を参照されたい。
成長室
一般的な成長室２４４、２４６、及び２４８の非限定的な例は、図２Ｃ及び図２Ｄに示されるマイクロ流体デバイス２４０内に示されている。各成長室２４４、２４６、及び２４８は、分離領域２５８と、分離領域２５８をチャネル１２２に流体接続する接続領域２５４とを画定する分離構造体２５０を含むことができる。接続領域２５４は、チャネル１２２への基端開口部２５２及び分離領域２５８への先端開口部２５６を含むことができる。接続領域２５４は、チャネル１２２から成長室２４４、２４６、２４８内に流れる流体培地（図示せず）のフローの最大侵入深さが分離領域２５８内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域２５４に起因して、成長室２４４、２４６、２４８の分離領域２５８内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、チャネル１２２内の培地１８０のフローから分離され、チャネル１２２内の培地１８０のフローにより実質的に影響されないことができる。
したがって、チャネル１２２は掃引領域の例であり得、成長室２４４、２４６、２４８の分離領域２５８は非掃引領域の例であり得る。述べたように、チャネル１２２及び成長室２４４、２４６、２４８は、１つ又は複数の流体培地１８０を含むように構成され得る。図２Ｃ及び図２Ｄに示される例では、ポート２４２はチャネル１２２に接続され、流体培地１８０がマイクロ流体デバイス２４０内に導入又は外に取り出せるようにすることができる。流体培地１８０を導入する前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングし得る。マイクロ流体デバイス２４０が流体培地１８０を含むと、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２６０は選択的に生成及び停止させることができる。例えば、示されるように、ポート２４２はチャネル１２２の異なる位置（例えば、両端部）に配置することができ、流入口として機能するあるポート２４２から流出口として機能する別のポート２４２への培地のフロー２６０を生成することができる。
図２Ｅは、本発明による成長室２４４の例の詳細図を示す。微小物体２７０の例も示されている。
既知のように、成長室２４４の基端開口部２５２を越えたマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２６０は、成長室２４４内及び／又は外への培地１８０の２次フロー２６２を生じさせることができる。成長室２４４の分離領域２５８内の微小物体２７０を２次フロー２６２から分離するために、成長室２４４の接続領域２５４の長さＬｃｏｎ（すなわち、基端開口部２５２から先端開口部２５６まで）は、接続領域２５４への２次フロー２６２の侵入深さＤｐよりも大きい値であるはずである。２次フロー２６２の侵入深さＤｐは、チャネル１２２内を流れる流体培地１８０の速度並びにチャネル１２２及びチャネル１２２への接続領域２５４の基端開口部２５２の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、チャネル１２２及び開口部２５２の構成は固定され、一方、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２６０の速度は可変である。したがって、成長室２４４毎に、２次フロー２６２の侵入深さＤｐが接続領域２５４の長さＬｃｏｎを超えないことを保証するチャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２６０の最高速度Ｖｍａｘを識別することができる。チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２６０の流量が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、結果として生成される、チャネル１２２及び接続領域２５４への２次フロー２６２を制限することができ、分離領域２５８に入らないようにすることができる。したがって、チャネル１２２内の培地１８０のフロー２６０は、微小物体２７０を分離領域２５８外に引き込まない。むしろ、分離領域２５８内に配置された微小物体２７０は、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２６０に関係なく、分離領域２５８内に留まる。
更に、チャネル１２２内の培地１８０のフロー２６０の流量がＶｍａｘを超えない限り、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２６０は、様々な粒子（例えば、微粒子及び／又はナノ粒子）をチャネル１２２から成長室２４４の分離領域２５８内に移動させない。したがって、接続領域２５４の長さＬｃｏｎを２次フロー２６２の最大侵入深さＤｐよりも大きくすることで、ある成長室２４４の、チャネル１２２又は別の成長室（例えば、図２Ｄの成長室２４６、２４８）からの様々な粒子による汚染を回避することができる。
チャネル１２２及び成長室２４４、２４６、２４８の接続領域２５４は、チャネル１２２内の培地１８０のフロー２６０により影響を及ぼすことができるため、チャネル１２２及び接続領域２５４は、マイクロ流体デバイス２４０の掃引（又はフロー）領域と見なすことができる。他方、成長室２４４、２４６、２４８の分離領域２５８は、非掃引（又は非フロー）領域と見なすことができる。例えば、チャネル１２２内の第１の流体培地１８０中の成分（図示せず）は、実質的に、チャネル１２２から接続領域２５４を通り分離領域２５８内の第２の流体培地２８０への第１の培地１８０の成分の拡散によってのみ、分離領域２５８内の第２の流体培地２８０と混合することができる。同様に、分離領域２５８内の第２の培地２８０の成分（図示せず）は、実質的に、分離領域２５８から接続領域２５４を通り、チャネル１２２内の第１の培地１８０への第２の培地２８０の成分の拡散によってのみ、チャネル１２２内の第１の培地１８０と混合することができる。第１の培地１８０は、第２の培地２８０と同じ培地であってもよく、又は異なる培地であってもよい。更に、第１の培地１８０及び第２の培地２８０は、同じ培地として開始され、異なるようになることができる（例えば、分離領域２５８内の１つ又は複数の細胞により又はチャネル１２２を通って流れる培地１８０を変更することにより、第２の培地２８０を調整することを通して）。
チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２６０により生じる２次フロー２６２の最大侵入深さＤｐは、上述したように、幾つかのパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例としては、チャネル１２２の形状（例えば、チャネルは、培地を接続領域２５４に向けることができ、接続領域２５４から培地を逸らすことができ、又はチャネル１２２への接続領域２５４の基端開口部２５２に実質的に直交する方向に培地を向けることができる）、基端開口部２５２でのチャネル１２２の幅Ｗｃｈ（又は断面積）及び基端開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２６０の速度Ｖ、第１の培地１８０及び／又は第２の培地２８０の粘度等が挙げられる。
幾つかの実施形態では、チャネル１２２及び成長室２４４、２４６、２４８の寸法は、チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２６０のベクトルに対して以下のように向けることができる：チャネル幅Ｗｃｈ（又はチャネル１２２の断面積）は、培地１８０のフロー２６０に略直交することができ、開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）は、チャネル１２２内の培地１８０のフロー２６０に略平行であり得、及び／又は接続領域の長さＬｃｏｎは、チャネル１２２内の培地１８０のフロー２６０に略直交することができる。上記は単なる例であり、チャネル１２２及び成長室２４４、２４６、２４８の相対位置は、互いに対して他の向きであり得る。
図２Ｅに示されるように、接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２５２から先端開口部２５６まで均一であり得る。したがって、先端開口部２５６での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内にあり得る。代替的に、先端開口部２５６での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎよりも大きい値であり得る。
図２Ｅに示されるように、先端開口部２５６での分離領域２５８の幅は、基端開口部２５２での基端領域２５４の幅Ｗｃｏｎと略同じであり得る。したがって、先端開口部２５６での分離領域２５８の幅は、基端開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内であり得る。代替的に、先端開口部２５６での分離領域２５８の幅は、基端開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎよりも大きくてもよく、又は小さくてもよい。更に、先端開口部２５６は基端開口部２５２よりも小さくてよく、接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２５２と先端開口部２５６との間で狭め得る。例えば、接続領域２５４は、様々な異なるジオメトリ（例えば、接続領域を面取りする、接続領域に勾配を付ける）を使用して基端開口部と先端開口部との間で狭め得る。更に、接続領域２５４の任意の部分又はサブ部分を狭め得る（例えば、基端開口部２５２に隣接する接続領域の部分）。
図４Ａ〜図４Ｃは、図１の各マイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及びチャネル１３４の変形であるマイクロ流体回路４３２及びフローチャネル４３４を含むマイクロ流体デバイス４００の別の例示的な実施形態を示す。マイクロ流体デバイス４００は、上述した成長室１２４、１２６、１２８、１３０、２４４、２４６、又は２４８の追加の変形である複数の成長室４３６も有する。特に、図４Ａ〜図４Ｃに示されるデバイス４００の成長室４３６をデバイス１００、２００、２４０、及び２９０での上述した成長室１２４、１２６、１２８、１３０、２４４、２４６、又は２４８のいずれかで置換可能なことを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス４００は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形であり、上述したマイクロ流体デバイス１００、２００、２４０、２９０と同じ又は異なるＤＥＰ構成及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素を有することもできる。
図４Ａ〜図４Ｃのマイクロ流体デバイス４００は、支持構造体（図４Ａ〜図４Ｃでは見えないが、図１に示されるデバイス１００の支持構造体１０４と同じ又は概して同様であり得る）、マイクロ流体回路構造４１２、及びカバー（図４Ａ〜図４Ｃでは見えないが、図１に示されるデバイス１００のカバー１２２と同じ又は概して同様であり得る）を含む。マイクロ流体回路構造４１２は枠４１４及びマイクロ流体回路材料４１６を含み、これらは図１に示されるデバイス１００の枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は概して同様であり得る。図４Ａに示されるように、マイクロ流体回路材料４１６により画定されるマイクロ流体回路４３２は複数のチャネル４３４（２つが示されるが、より多くのチャネルがあり得る）を含むことができ、チャネル４３４に複数の成長室４３６が流体接続される。
各調整室４３６は、分離構造４４６、分離構造４４６内の分離領域４４４、及び接続領域４４２を含むことができる。チャネル４３４の基端開口部４７２から分離構造４３６での先端開口部４７４まで、接続領域４４２はチャネル４３４を分離領域４４４に流体接続する。一般に、図２Ｄ及び図２Ｅの上記考察によれば、チャネル４３４内の第１の流体培地４０２のフロー４８２は、チャネル４３４から成長室４３６の各接続領域４４２内及び／又は外への第１の培地４０２の２次フロー４８４をもたらすことができる。
図４Ｂに示されるように、各成長室４３６の接続領域４４２は、一般に、チャネル４３４の基端開口部４７２と分離構造４４６の先端開口部４７４との間に延びるエリアを含む。接続領域４４２の長さＬｃｏｎは、２次フロー４８４の最大侵入深さＤｐよりも大きい値であり得、その場合、２次フロー４８４は、分離領域４４４に向かってリダイレクトされずに接続領域４４２内に延びる（図４Ａに示されるように）。代替的に、図４Ｃに示されるように、接続領域４４２は、最大侵入深さＤｐよりも小さい長さＬｃｏｎを有することができ、その場合、２次フロー４８４は、接続領域４４２を通って延び、分離領域４４４に向かってリダイレクトされる。この後者の状況では、接続領域４４２の長さＬｃ１及びＬｃ２との和は最大侵入深さＤｐよりも大きく、したがって、２次フロー４８４は分離領域４４４内に延びない。接続領域４４２の長さＬｃｏｎが侵入深さＤｐよりも大きいか否か又は接続領域４４２の長さＬｃ１及びＬｃ２の和が侵入深さＤｐよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Ｖｍａｘを超えないチャネル４３４内の第１の培地４０２のフロー４８２は、侵入深さＤｐを有する２次フローをもたらし、成長室４３６の分離領域４４４内の微小物体（示されていないが、図２Ｅに示される微小物体２７０と同じ又は概して同様であり得る）は、チャネル４３４内の第１の培地４０２のフロー４８２により分離領域４４４外に引き出されない。チャネル４３４内のフロー４８２は、様々な材料（図示せず）もチャネル４３４から成長室４３６の分離領域４４４内に引き込まない。したがって、チャネル４３４内の第１の培地４０２内の成分をチャネル４３４から成長室４３６の分離領域４４４内の第２の培地４０４内に移動させることができる唯一の機構は、拡散である。同様に、成長室４３６の分離領域４４４内の第２の培地４０４内の成分を分離領域４４４からチャネル４３４内の第１の培地４０２内に移動させることができる唯一の機構も拡散である。第１の培地４０２は第２の培地４０４と同じ培地であり得、又は第１の培地４０２は第２の培地４０４と異なる培地であり得る。代替的に、第１の培地４０２及び第２の培地４０４は、同じ培地から始まり、例えば、分離領域４４４内の１つ又は複数の細胞により又はチャネル４３４を通って流れる培地を変更することにより、第２の培地を調整することを通して異なるようになることができる。
図４Ｂに示されるように、チャネル４３４内のチャネル４３４の幅Ｗｃｈ（すなわち、図４Ａにおいて矢印４８２で示されるチャネルを通る流体培地フローの方向を横断してとられる）は、基端開口部４７２の幅Ｗｃｏｎ１に略直交することができ、したがって、先端開口部４７４の幅Ｗｃｏｎ２に略平行であり得る。しかし、基端開口部４７２の幅ｃｏｎ１及び先端開口部４７４の幅Ｗｃｏｎ２は、互いと略直交する必要はない。例えば、基端開口部４７２の幅Ｗｃｏｎ１が向けられる軸（図示せず）と、先端開口部４７４の幅Ｗｃｏｎ２が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって、９０°以外であり得る。代替的に向けられる角度の例としては、以下の任意の範囲内の角度を含む：約３０°〜約９０°、約４５°〜約９０°、約６０°〜約９０°等。
成長室の様々な実施形態（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２４４、２４６、２４８、又は４３６）では、分離領域（例えば、２５８又は４４４）は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、１つのみ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は同様の相対的に少数の微小物体を含むように構成され得る。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも３×１０３立方μｍ、少なくとも６×１０３立方μｍ、少なくとも９×１０３立方μｍ、少なくとも１×１０４立方μｍ、少なくとも２×１０４立方μｍ、少なくとも４×１０４立方μｍ、少なくとも８×１０４立方μｍ、少なくとも１×１０５立方μｍ、少なくとも２×１０５立方μｍ、少なくとも４×１０５立方μｍ、少なくとも８×１０５立方μｍ、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、少なくとも１×１０７立方μｍ、少なくとも２×１０７立方μｍ、少なくとも４×１０７立方μｍ、少なくとも６×１０７立方μｍ、少なくとも１×１０８立方μｍ、又はこれを超える大きさであり得る。
成長室の様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２５２、４７２）でのチャネル１２２、４３４の幅Ｗｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：５０〜１０００μｍ、５０〜５００μｍ、５０〜４００μｍ、５０〜３００μｍ、５０〜２５０μｍ、５０〜２００μｍ、５０〜１５０μｍ、５０〜１００μｍ、７０〜５００μｍ、７０〜４００μｍ、７０〜３００μｍ、７０〜２５０μｍ、７０〜２００μｍ、７０〜１５０μｍ、９０〜４００μｍ、９０〜３００μｍ、９０〜２５０μｍ、９０〜２００μｍ、９０〜１５０μｍ、１００〜３００μｍ、１００〜２５０μｍ、１００〜２００μｍ、１００〜１５０μｍ、及び１００〜１２０μｍ。上記は単なる例であり、チャネル１２２、４３４の幅Ｗｃｈは他の範囲（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）内であることもできる。更に、チャネル１２２、４３４の幅Ｗｃｈは、成長室の基端開口部以外のチャネルの領域で、これらの任意の範囲内であるように選択することができる。
幾つかの実施形態では、成長室は約３０μｍ〜約２００μｍ又は約５０μｍ〜約１５０μｍの断面高さを有する。幾つかの実施形態では、成長室は、約１００，０００〜約２，５００，０００平方μｍ又は約２００，０００〜約２，０００，０００平方μｍの断面積を有する。幾つかの実施形態では、接続領域は、対応する成長室の断面高さに一致する断面高さを有する。幾つかの実施形態では、接続領域は、約５０〜約５００μｍ又は約１００〜約３００μｍの断面幅を有する。
成長室の様々な実施形態では、基端開口部２５２、４７２でのチャネル１２２、４３４の高さＨｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：２０〜１００μｍ、２０〜９０μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜７０μｍ、２０〜６０μｍ、２０〜５０μｍ、３０〜１００μｍ、３０〜９０μｍ、３０〜８０μｍ、３０〜７０μｍ、３０〜６０μｍ、３０〜５０μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜９０μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜７０μｍ、４０〜６０μｍ、又は４０〜５０μｍ。上記は単なる例であり、チャネル１２２、４３４の高さＨｃｈは他の範囲（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）内であることもできる。チャネル１２２、４３４の高さＨｃｈは、成長室の基端開口部以外のチャネルの領域で、これらの任意の範囲内であるように選択することができる。
成長室の様々な実施形態では、基端開口部２５２、４７２でのチャネル１２２、４３４の断面積は、以下の任意の範囲内であり得る：５００〜５０，０００平方μｍ、５００〜４０，０００平方μｍ、５００〜３０，０００平方μｍ、５００〜２５，０００平方μｍ、５００〜２０，０００平方μｍ、５００〜１５，０００平方μｍ、５００〜１０，０００平方μｍ、５００〜７，５００平方μｍ、５００〜５，０００平方μｍ、１，０００〜２５，０００平方μｍ、１，０００〜２０，０００平方μｍ、１，０００〜１５，０００平方μｍ、１，０００〜１０，０００平方μｍ、１，０００〜７，５００平方μｍ、１，０００〜５，０００平方μｍ、２，０００〜２０，０００平方μｍ、２，０００〜１５，０００平方μｍ、２，０００〜１０，０００平方μｍ、２，０００〜７，５００平方μｍ、２，０００〜６，０００平方μｍ、３，０００〜２０，０００平方μｍ、３，０００〜１５，０００平方μｍ、３，０００〜１０，０００平方μｍ、３，０００〜７，５００平方μｍ、又は３，０００〜６，０００平方μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部２５２、４７２でのチャネル１２２の断面積は他の範囲（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）内であることもできる。
成長室の様々な実施形態では、接続領域２５４、４４２の長さＬｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：１〜２００μｍ、５〜１５０μｍ、１０〜１００μｍ、１５〜８０μｍ、２０〜６０μｍ、２０〜５００μｍ、４０〜４００μｍ、６０〜３００μｍ、８０〜２００μｍ、及び１００〜１５０μｍ。上記は単なる例であり、接続領域２５４、４４２の長さＬｃｏｎは、上記例と異なる範囲（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）内であることもできる。
成長室の様々な実施形態では、基端開口部２５２での接続領域２５４、４４２の幅Ｗｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：２０〜５００μｍ、２０〜４００μｍ、２０〜３００μｍ、２０〜２００μｍ、２０〜１５０μｍ、２０〜１００μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜６０μｍ、３０〜４００μｍ、３０〜３００μｍ、３０〜２００μｍ、３０〜１５０μｍ、３０〜１００μｍ、３０〜８０μｍ、３０〜６０μｍ、４０〜３００μｍ、４０〜２００μｍ、４０〜１５０μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜６０μｍ、５０〜２５０μｍ、５０〜２００μｍ、５０〜１５０μｍ、５０〜１００μｍ、５０〜８０μｍ、６０〜２００μｍ、６０〜１５０μｍ、６０〜１００μｍ、６０〜８０μｍ、７０〜１５０μｍ、７０〜１００μｍ、及び８０〜１００μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部２５２の接続領域２５４、４４２の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なることができる（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）。
成長室の様々な実施形態では、基端開口部２５２、４７２での接続領域２５４、４４２の幅Ｗｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：２〜３５μｍ、２〜２５μｍ、２〜２０μｍ、２〜１５μｍ、２〜１０μｍ、２〜７μｍ、２〜５μｍ、２〜３μｍ、３〜２５μｍ、３〜２０μｍ、３〜１５μｍ、３〜１０μｍ、３〜７μｍ、３〜５μｍ、３〜４μｍ、４〜２０μｍ、４〜１５μｍ、４〜１０μｍ、４〜７μｍ、４〜５μｍ、５〜１５μｍ、５〜１０μｍ、５〜７μｍ、６〜１５μｍ、６〜１０μｍ、６〜７μｍ、７〜１５μｍ、７〜１０μｍ、８〜１５μｍ、及び８〜１０μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部２５２、４７２の接続領域２５４、４４２の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なることができる（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）。
成長室の様々な実施形態では、接続領域２５４、４４２の長さＬｃｏｎと基端開口部２５２、４７２での接続領域２５４、４４２の幅Ｗｃｏｎとの比率は、以下の任意の比率以上であり得る：０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、又はこれを超える値。上記は単なる例であり、接続領域２５４の長さＬｃｏｎと基端開口部２５２、４７２での接続領域２５４、４４２の幅Ｗｃｏｎとの比率は、上記例と異なることができる。
マイクロ流体デバイス１００、２００、２４０、２９０、４００の様々な実施形態では、Ｖｍａｘは、約０．２μＬ／秒、約０．３μＬ／秒、約０．４μＬ／秒、約０．５μＬ／秒、約０．６μＬ／秒、約０．７μＬ／秒、約０．８μＬ／秒、約０．９μＬ／秒、約１．０μＬ／秒、約１．１μＬ／秒、約１．２μＬ／秒、約１．３μＬ／秒、約１．４μＬ／秒、又は約１．５μＬ／秒に設定することができる。幾つかの他の実施形態では、代替的に、Ｖｍａｘは、約０．２μＬ／秒、約０．３μＬ／秒、約０．４μＬ／秒、約０．５μＬ／秒、約０．６μＬ／秒、約０．７μＬ／秒、約０．８μＬ／秒、約０．９μＬ／秒、約１．０μＬ／秒、約１．１μＬ／秒、約１．２μＬ／秒、約１．３μＬ／秒、約１．４μＬ／秒、約１．５μＬ／秒、約１．６μＬ／秒、約１．７μＬ／秒、約１．８μＬ／秒、約１．９μＬ／秒、約２．０μＬ／秒、約２．１μＬ／秒、約２．２μＬ／秒、約２．３μＬ／秒、約２．４μＬ／秒、又は約２．５μＬ／秒に設定することができる。更に他の実施形態では、Ｖｍａｘは、約２．０μＬ／秒、約２．２μＬ／秒、約２．４μＬ／秒、約２．６μＬ／秒、約２．８μＬ／秒、約３．０μＬ／秒、約３．２μＬ／秒、約３．４μＬ／秒、約３．６μＬ／秒、約３．８μＬ／秒、約４．０μＬ／秒、約４．２μＬ／秒、約４．４μＬ／秒、約４．６μＬ／秒、約４．８μＬ／秒、約５．０μＬ／秒、約６．０μＬ／秒、約７．０μＬ／秒、８．０若しくはこれらの前後の値、又は約９．０μＬ／秒に設定することができる。
成長室を有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、成長室の分離領域２５８、４４４の容積は、例えば、少なくとも３×１０３立方μｍ、６×１０３立方μｍ、９×１０３立方μｍ、１×１０４立方μｍ、２×１０４立方μｍ、４×１０４立方μｍ、８×１０４立方μｍ、１×１０５立方μｍ、２×１０５立方μｍ、４×１０５立方μｍ、８×１０５立方μｍ、１×１０６立方μｍ、２×１０６立方μｍ、４×１０６立方μｍ、６×１０６立方μｍ、又はこれを超える値であり得る。成長室を有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、成長室の分離領域の容積は、約５×１０３立方μｍ、約７×１０３立方μｍ、約１×１０４立方μｍ、約３×１０４立方μｍ、約５×１０４立方μｍ、約８×１０４立方μｍ、約１×１０５立方μｍ、約２×１０５立方μｍ、約４×１０５立方μｍ、約６×１０５立方μｍ、約８×１０５立方μｍ、約１×１０６立方μｍ、約２×１０６立方μｍ、約４×１０６立方μｍ、約８×１０６立方μｍ、約１×１０７立方μｍ、約３×１０７立方μｍ、約５×１０７立方μｍ、又は約８×１０７立方μｍ、又はこれを超える値であり得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、成長室であって、１×１０２以下の生体細胞を維持し得、成長室の容積が２×１０６立方μｍ以下であり得る、成長室を有する。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、成長室であって、１×１０２以下の生体細胞を維持し得、成長室の容積が４×１０５立方μｍ以下であり得る、成長室を有する。更に他の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、成長室であって、５０以下の生体細胞を維持し得、成長室の容積が４×１０５立方μｍ以下であり得る、成長室を有する。
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスが約１００〜約５００個の成長室、約２００〜約１０００個の成長室、約５００〜約１５００個の成長室、約１０００〜約２０００個の成長室、又は約１０００個〜約３５００個の成長室を有する、本明細書で考察される任意の実施形態でのように構成された成長室を有する。
幾つかの他の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスが約１５００〜約３０００個の成長室、約２０００〜約３５００個の成長室、約２５００〜約４０００個の成長室、約３０００〜約４５００個の成長室、約３５００個〜約５０００個の成長室、約４０００〜約５５００個の成長室、約４５００〜約６０００個の成長室、約５０００〜約６５００個の成長室、約５５００〜約７０００個の成長室、約６０００〜約７５００個の成長室、約６５００〜約８０００個の成長室、約７０００〜約８５００個の成長室、約７５００〜約９０００個の成長室、約８０００〜約９５００個の成長室、約８５００〜約１０，０００個の成長室、約９０００〜約１０，５００個の成長室、約９５００〜約１１，０００個の成長室、約１０，０００〜約１１，５００個の成長室、約１０，５００〜約１２，０００個の成長室、約１１，０００〜約１２，５００個の成長室、約１１，５００〜約１３，０００個の成長室、約１２，０００〜約１３，５００個の成長室、約１２，５００〜約１４，０００個の成長室、約１３，０００〜約１４，５００個の成長室、約１３，５００〜約１５，０００個の成長室、約１４，０００〜約１５，５００個の成長室、約１４，５００〜約１６，０００個の成長室、約１５，０００〜約１６，５００個の成長室、約１５，５００〜約１７，０００個の成長室、約１６，０００〜約１７，５００個の成長室、約１６，５００〜約１８，０００個の成長室、約１７，０００〜約１８，５００個の成長室、約１７，５００〜約１９，０００個の成長室、約１８，０００〜約１９，５００個の成長室、約１８，５００〜約２０，０００個の成長室、約１９，０００〜約２０，５００個の成長室、約１９，５００〜約２１，０００個の成長室、又は約２０，０００〜約２１，５００個の成長室を有する、本明細書で考察される任意の実施形態でのように構成された成長室を有する。
図２Ｆは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス２９０を示す。マイクロ流体デバイス２９０は図２Ｆに示され、マイクロ流体デバイス１００の定型化された図である。実際には、マイクロ流体デバイス２９０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び成長室１２８）は本明細書で考察された寸法を有する。図２Ｆに示されるマイクロ流体回路１２０は、２つのポート、４つの別個のチャネル１２２、及び４つの別個の流路１０６を有する。マイクロ流体デバイス２９０は、各チャネル１２２に通じる複数の成長室を更に含む。図２Ｆに示されるマイクロ流体デバイスでは、成長室は、図２Ｅに示されるペンと同様のジオメトリを有し、したがって、接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、掃引領域（例えば、チャネル１２２及び２次フロー２６２の最大侵入深さＤｐ内の接続領域２５４の部分）及び非掃引領域（例えば、分離領域２５８及び２次フロー２６２の最大侵入深さＤｐ内にない接続領域２５４の部分）の両方を含む。
図３Ａ及び図３Ｂは、本発明によるマイクロ流体デバイス（例えば、１００、２００、２４０、２９０）を動作させるため及び観測のために使用することができるシステム１５０の様々な実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体デバイス１００（図示せず）又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造体（「ネスト」）３００を含むことができる。ネスト３００は、マイクロ流体デバイス３６０（例えば、光学的に作動される動電学的デバイス１００）と界面を接することができ、電源１９２からマイクロ流体デバイス３６０への電気接続を提供することができるソケット３０２を含むことができる。ネスト３００は、一体型電気信号生成サブシステム３０４を更に含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、マイクロ流体デバイス３６０がソケット３０２により保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス３６０内の電極の対にわたり印加されるように、バイアス電圧をソケット３０２に供給するように構成され得る。したがって、電気信号生成サブシステム３０４は電源１９２の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス３６０に印加する能力は、マイクロ流体デバイス３６０がソケット３０２により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス３６０内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
図３Ａに示されるように、ネスト３００は、プリント回路基板組立体（ＰＣＢＡ）３２０を含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２０に搭載され、ＰＣＢＡ３２０に電気的に集積することができる。例示的なネスト３００は、同様にＰＣＢＡ３２０に搭載されるソケット３０２も含む。
通常、電気信号生成サブシステム３０４は波形生成器（図示せず）を含む。電気信号生成サブシステム３０４は、波形生成器から受信される波形を増幅するように構成されたオシロスコープ（図示せず）及び／又は波形増幅回路（図示せず）を更に含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット３０２により保持されるマイクロ流体デバイス３６０に供給される波形を測定するように構成され得る。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス３６０の基端位置（及び波形生成器の先端位置）において波形を測定し、それにより、デバイスに実際に印加されている波形を測定するに当たりより大きい精度を保証する。オシロスコープ測定から得られるデータは、例えば、フィードバックとして波形生成器に提供され得、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成され得る。適する結合された波形生成器及びオシロスコープの例は、Red Pitaya（商標）である。
特定の実施形態では、ネスト３００は、電気信号生成サブシステム３０４の検知及び／又は制御に使用される、マイクロプロセッサ等のコントローラ３０８を更に含む。適するマイクロプロセッサの例としては、Arduino Nano（商標）等のArduino（商標）マイクロプロセッサが挙げられる。コントローラ３０８を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ１５４（図１に示される）と通信して機能及び分析を実行し得る。図３Ａに示される実施形態では、コントローラ３０８は、インタフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を通してマスタコントローラ１５４と通信する。
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、Red Pitaya（商標）波形生成器／オシロスコープユニット（「Red Pitayaユニット」）を含む電気信号生成サブシステム３０４と、Red Pitayaユニットにより生成された波形を増幅し、増幅電圧をマイクロ流体デバイス１００に渡す波形増幅回路とを含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス３６０での増幅電圧を測定し、次に、マイクロ流体デバイス３６０での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力電圧を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２０に搭載されるＤＣ−ＤＣコンバータの対により生成される＋６．５Ｖ〜−６．５Ｖ電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス１００において１３Ｖｐｐまでの信号が生成される。
図３Ａに示されるように、ネスト３００は、熱制御サブシステム３０６を更に含むことができる。熱制御サブシステム３０６は、ネスト３００により保持されるマイクロ流体デバイス３６０の温度を調整するように構成され得る。例えば、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイス（図示せず）及び冷却ユニット（図示せず）を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス３６０の少なくとも１つの表面と界面を接するように構成された第１の表面を有することができる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック（図示せず）であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第２の表面（例えば、第１の表面とは逆の表面）は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路３３０に接続することができる。図３Ａに示される実施形態では、ネスト３００は、流入口３３２及び流出口３３４を含む、外部リザーバ（図示せず）から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路３３０に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び／又は流体路３３０は、ネスト３００のケース３４０に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス３６０の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu（商標）熱電電源（Pololu Robotics and Electronics Corp.）等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム３０６は、アナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗（例えば、抵抗１ｋオーム＋／−０．１％、温度係数＋／−０．０２ｐｐｍ／Ｃ０）及びＮＴＣサーミスタ（例えば、公称抵抗１ｋオーム＋／−０．０１％を有する）を含むアナログ分圧回路（図示せず）であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム３０６を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に、計算された温度値をオンボードＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu（商標）モーター駆動デバイス（図示せず）上の方向信号及びパルス幅変調信号ピンの両方を駆動して熱電電源を作動させることができ、それにより、ペルチェ熱電デバイスを制御する。
ネスト３００はシリアルポート３５０を含むことができ、シリアルポート３５０により、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、インタフェース３１０を介して外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。加えて、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６と通信することができる（例えば、Plinkツール（図示せず）を介して）。したがって、コントローラ３０８、インタフェース３１０、及びシリアルポート３５０の組合せを介して、電気信号生成サブシステム３０８及び熱制御サブシステム３０６は、外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ１５４は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム３０８を支援することができる。外部マスタコントローラ１５４に結合された表示デバイス１７０を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）（図示せず）は、熱制御サブシステム３０６及び電気信号生成サブシステム３０８からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、ＧＵＩは、コントローラ３０８、熱制御サブシステム３０６、及び電気信号生成サブシステム３０４への更新を可能にすることができる。
上述したように、システム１５０は撮像デバイス１９４を含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイス１９４は光変調サブシステム４２２を含む。光変調サブシステム４２２は、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイシステム（ＭＳＡ）を含むことができ、これらのいずれかは、光源４２０から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡４５０の光学縦列に送るように構成され得る。代替的に、光変調サブシステム４２２は、有機発行ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス（ＦＬＣＯＳ）、又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のそれ自体の光を生成する（したがって、光源４２０の必要性をなくす）デバイスを含むことができる。光変調サブシステム４２２は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム４２２は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。適する光変調サブシステム４２２の一例は、Andor Technologies（商標）のMosaic（商標）システムである。特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は原動モジュール１６２は、光変調サブシステム４２２を制御することができる。
特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は顕微鏡４５０を更に含む。そのような実施形態では、ネスト３００及び光変調サブシステム４２２は、顕微鏡４５０に搭載されるように個々に構成され得る。顕微鏡４５０は、例えば、標準の研究等級の光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であるように構成され得る。したがって、ネスト３００は、顕微鏡４５０のステージ４２６に搭載するように構成され得、及び／又は光変調サブシステム４２２は、顕微鏡４５０のポートに搭載されるように構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光変調サブシステム４２２は、顕微鏡４５０の一体構成要素であり得る。
特定の実施形態では、顕微鏡４５０は１つ又は複数の検出器４４０を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器４４０は撮像モジュール１６４により制御される。検出器４４０は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも２つの検出器４４０が存在する場合、１つの検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得、一方、他の検出器は高感度カメラであり得る。更に、顕微鏡４５０は、マイクロ流体デバイス３６０から反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を１つ又は複数の検出器４４０に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なることができるように、異なる検出器で異なるチューブレンズ（図示せず）を含むこともできる。
特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は、少なくとも２つの光源を使用するように構成される。例えば、第１の光源４２０は構造化光の生成（例えば、光変調サブシステム４２２を介した）に使用することができ、第２の光源４３０は非構造化光の提供に使用することができる。第１の光源４２０は、光学的に作動される動電学的及び／又は蛍光励起のために構造化光を生成することができ、第２の光源４３０は、明視野照明の提供に使用することができる。これらの実施形態では、原動モジュール１６４を使用して第１の光源４２０を制御することができ、撮像モジュール１６４を使用して第２の光源４３０を制御することができる。顕微鏡４５０の光学縦列は、（１）デバイスがネスト３００により保持されているとき、構造化光を光変調サブシステム４２２から受け取り、構造化光を光学作動式動電学的デバイス等のマイクロ流体デバイス内の少なくとも第１の領域で結像し、（２）マイクロ流体デバイスから反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、そのような反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を検出器４４０上に結像するように構成され得る。光学縦列は、デバイスがネスト３００により保持されているとき、非構造化光を第２の光源から受け取り、非構造化光をマイクロ流体デバイスの少なくとも第２の領域で結像するように更に構成され得る。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１及び第２の領域は重複領域であり得る。例えば、第１の領域は第２の領域のサブセットであり得る。
図３Ｂでは、光を光変調サブシステム４２２に供給している第１の光源４２０が示されており、光変調サブシステム４２２は構造化光をシステム４５０の顕微鏡４５０の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ４２４を介して非構造化光を光学縦列に提供している第２の光源４３０が示される。光変調サブシステム４２２からの構造化光及びに示されるように、第２の光源４３０からの非構造化光は、ビームスプリッタ４２４から光学縦列を通って一緒に移動して、第２のビームスプリッタ４２４（又は光変調サブシステム４２２により提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ４４８）に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ４５４を通して試料面４２８まで下がる。次に、試料面４２８からの反射光及び／又は放射光は再び対物レンズ４５４を通って移動し、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ４４８を通り、ダイクロイックフィルタ４５２に到達する。ダイクロイックフィルタ４５２に達する光の一部のみが透過され、検出器４４０に到達する。
幾つかの実施形態では、第２の光源４３０は青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ４５２を用いて、試料面４２８から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ４５２を透過し、検出器４４０に到達することが可能である。これとは対照的に、光変調サブシステム４２２から来る構造化光は、試料面４２８で反射されるが、ダイクロイックフィルタ４５２を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ４５２は、４９５ｎｍよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム４２２からの光のそのような濾波は、光変調サブシステムから発せられる光が４９５ｎｍよりも短いいかなる波長も含まない場合にのみ完了する（示されるように）。実際には、光変調サブシステム４２２から来る光が４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかがフィルタ４５２を透過して検出器４４０に到達する。そのような実施形態では、フィルタ４５２は、第１の光源４２０から検出器４４０に到達する光の量と第２の光源４３０から検出器４４０に到達する光の量とのバランスを変更する役割を果たす。これは、第１の光源４２０が第２の光源４３０よりもはるかに強力な場合、有益であり得る。他の実施形態では、第２の光源４３０は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ４５２は、赤色光以外の可視光（例えば、６５０ｎｍよりも短い波長を有する可視光）を濾波して除外することができる。
マイクロ流体デバイスの成長室内の細胞生存を維持するための追加のシステム構成要素
細胞増殖の成長及び／又は拡大を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能細胞の維持に貢献する環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養、細胞の成長シグナリング種、ｐＨ変調、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。
マイクロ流体デバイスの調整された表面
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整される。幾つかの実施形態では、略全ての内面が調整される。調整された表面は、マイクロ流体デバイス内の細胞培養の成功を促進する要素の１つであり得る。適切な調整された表面を識別するには、幾つかの光学要件のバランスを取る必要があり得る。第１に、調整された表面は、このクラスのマイクロ流体デバイスの製造で使用し得る種々の材料から細胞をシールドするように動作する接触表面を提供し得る。理論により制限されずに、調整された表面は、細胞との金属接触層ではなく、水性を提供する水和水で囲み得る。第２に、調整された表面は、培養の完了後、成長室から細胞を取り出す能力を実質的に妨げずに、培養中に少なくとも１つの生体細胞を適宜支持し得る接触表面を提供し得る。例えば、多くの細胞は、生存及び／又は成長するのに十分に付着するために、ある程度の親水性を有することを接触表面に対して求める。代替的に、細胞によっては、成長し、所望のレベルの生存性を提示するために、ある程度の疎水性を有する接触表面を必要とするものがある。更に、細胞によっては、生存性／成長応答を開始するために、接触表面内に選択されたタンパク質又はペプチドモチーフが存在していることを必要とするものがある。第３に、少なくとも１つの表面の調整により、マイクロ流体デバイスで使用される原動力を実質的に通常機能能力範囲内で機能できるようにし得る。例えば、光作動原動力が利用される場合、調整された表面は、調整された表面を光が透過することを実質的に可能にし得、それにより、光作動原動力は実質的に阻害されない。
少なくとも１つの調整された表面は、成長室の表面、フロー領域の表面、又はそれらの組合せを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の成長室のそれぞれは、少なくとも１つの調整された表面を有する。他の実施形態では、複数のフロー領域のそれぞれは、少なくとも１つの調整された表面を有する。幾つかの実施形態では、複数の成長室のそれぞれ及び複数のフロー領域のそれぞれの少なくとも１つの表面は、調整された表面である。
ポリマーを含む調整された表面
少なくとも１つの調整された表面はポリマーを含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合され得る。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、スターポリマー（スターコポリマー）、及びグラフト又は櫛形ポリマー（グラフトコポリマー）を含め、様々な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書での使用に適し得る。
ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。広範囲のアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスでの使用に適し得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定的で例示的な一クラスは、ポリマー鎖内で異なる比率及び異なる場所にあるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニット及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞と接触する場合の使用に適することが当技術分野で既知である。ポリマーは、平均分子質量ＭＷで、約２０００Ｄａ〜約２０ＫＤａの範囲である。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０よりも大きい（例えば、１２〜１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる。調整された表面をもたらすのに有用な特定のPluronic（登録商標）ポリマーは、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）を含む。別のクラスのアルキレンエーテル含有ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ＭＷ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、ＭＷ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００ＤａのＭＷを有し得る。
他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、カルボン酸部分を含むポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリ乳酸（ＰＬＡ）である。
幾つかの他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、ポリウレタン等であるが、これに限定されないウレタン部分を含むポリマーを含み得る。
他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、スルホン酸部分を含むポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例は、ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトール硫酸である。これらの後者の例示的なポリマーは、高分子電解質であり、付着を支援／阻止するように表面の特性を変更し得る。
更に他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、ポリマー骨格の末端又はポリマーの骨格からのペンダントのいずれかにおいてリン酸塩部分を含むポリマーを含み得る。
更に他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、サッカリド部分を含むポリマーを含み得る。非限定的な例では、キサンタンガム又はデキストラン等の藻類又は菌類ポリサッカリドに由来するもの等のポリサッカリドは、細胞の付着を支援又は阻止し得るポリマーの調整された表面の形成に適し得る。例えば、約３Ｋｄａのサイズを有するデキストランポリマーを使用して、マイクロ流体デバイス内に調整された表面を提供し得る。
更に他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し得る、ヌクレオチド部分、すなわち、核酸を含むポリマーを含み得る。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含んでもよく、又は限定ではなく、７−デアザアデニン、ペントース、メチルホスホン酸、又はホスホロチオエート部分等の核酸塩基、リボース、リン酸塩部分類似物を含む非天然ヌクレオチド部分を含んでもよい。核酸含有ポリマーは、付着を支援又は阻止し得る高分子電解質を含み得る。
更に他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、アミノ酸部分を含むポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含むポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得、これらのいずれかはペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。非限定的な一例では、タンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり得る。幾つかの実施形態では、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質を調整された表面内に提供して、細胞の成長を促進するように細胞付着を最適化し得る。調整された表面に含み得る細胞基質タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えば、フィブロネクチン）、又はラミニンを含むことができるが、これらに限定されない。更に他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面内に提供し得る。
更なる実施形態では、ポリマーの調整された表面は、アミノ部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、及びプトレシンが挙げられる。
幾つかの実施形態では、ポリマーの調整された表面は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分の２つ以上を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、調整された表面に独立して又は同時に組み込み得る、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、及び／又はアミノ酸部分をそれぞれ有する２つ以上のポリマーの混合物を含み得る。
共有結合された調整された表面
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、マイクロ流体デバイス内での１つ又は複数の生体細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された共有結合部分を含む。共有結合部分は結合基を含むことができ、結合基はマイクロ流体デバイスの表面に共有結合される。結合基は、マイクロ流体デバイス内での１つ又は複数の生体細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分にも結合される。結合基が結合された表面は、マイクロ流体デバイスの基板の表面を含み得、マイクロ流体デバイスがＤＥＰ構成を含む実施形態では、基板の表面はケイ素及び／又は二酸化ケイ素を含むことができる。幾つかの実施形態では、共有結合された調整された表面は、マイクロ流体デバイスの全内面を含む。
調整された表面を有するマイクロ流体デバイスの概略表現を図９に示す。図９に見られるように、マイクロ流体デバイス９００は、少なくとも１つの成長室及び／又はフロー領域を含み得るマイクロ流体デバイスの閉鎖領域９０２に面する第１のＤＥＰ基板９０４及び第２のＤＥＰ基板９０６を有する。デバイス９００は、他の点では、マイクロ流体デバイス１００、２００、２４０、２９０、４００、５００Ａ〜Ｅ、又は６００のいずれかのように構成され得る。閉鎖領域９０２は、生体細胞が維持されるか、又は生体細胞が搬入若しくは搬出される領域であり得る。内面９１０（第２のＤＥＰ基板９０６の）及び９１２（第１のＤＥＰ基板９０４の）は、調整された表面９１６で修飾され、調整された表面９１６は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する任意の部分であり得る。調整された表面は、この実施形態では、シロキシ結合基９１４を介して内面のオキシド官能基に共有結合される。
幾つかの実施形態では、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された共有結合部分は、アルキル若しくはフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸若しくはポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。
マイクロ流体デバイス内での１つ又は複数の生体細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された共有結合部分は、本明細書に記載される任意のポリマーであり得、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、サッカリド部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、アミノ酸部分、核酸部分、又はアミノ部分を含む１つ又は複数のポリマーを含み得る。
他の実施形態では、１つ又は複数の生体細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された共有結合部分は、アルキル部分、フルオロアルキル部分（ペルフルオロアルキルを含むが、これに限定されない）、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸、又はサッカリド部分等の非ポリマー部分を含み得る。
幾つかの実施形態では、共有結合部分はアルキル基であり得る。アルキル基は、線状鎖（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１４、１６、１８、２０、２２、若しくはそれを超える個数の炭素の線状鎖）を形成する炭素原子を含むことができる。したがって、アルキル基は直鎖アルキルであり得る。幾つかの実施形態では、アルキル基は置換アルキル基を含み得る（例えば、アルキル基の炭素の幾つかはフッ素化又はパーフルオロ化することができる）。アルキル基は、非置換炭素の線状鎖に結合された置換（例えば、フッ素化又はパーフルオロ化）炭素の線状鎖を含み得る。例えば、アルキル基は、非置換アルキル基を含み得る第２のセグメントに結合される、ペルフルオロアルキル基を含み得る第１のセグメントを含み得る。第１及び第２のセグメントは、直接又は間接的（例えば、エーテル結合により）に結合され得る。アルキル基の第１のセグメントは、結合基の先端部に配置し得、アルキル基の第２のセグメントは、結合基の基端部に配置し得る。他の実施形態では、アルキル基は、分岐アルキル基を含み得、アルキル基のアルキル骨格を中断する１つ又は複数のアリーレン基を更に有し得る。幾つかの実施形態では、アルキル又はフッ化アルキル基の分岐部又はアリーレン中断部は、表面への共有結合の先端にある箇所に配置される。
他の実施形態では、共有結合部分は、２つ以上のアミノ酸を含み得る少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。共有結合部分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は、双性イオン性表面を提供して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持し得るアミノ酸を含み得る。
共有結合部分は１つ又は複数のサッカリドを含み得る。共有結合サッカリドはモノ、ジ、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、直鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。
共有結合部分は１つ又は複数のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有ヘテロ環部分又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス及び任意選択的に成長室内の環境のｐＨ変調を可能にする構造を有し得る。
共有結合部分は、１つ又は複数のカルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルファミン酸部分、又はスルホン酸部分を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は１つ又は複数の核酸部分を含み得、核酸部分は、マイクロ流体デバイス内の生体細胞から核酸を捕捉するように設計された個々のヌクレオチドの配列を有し得る。捕捉核酸は、生体細胞からの核酸に対して相補的なヌクレオチド配列を有し得、混成により核酸を捕捉し得る。
調整された表面は、１種のみの部分で構成されてもよく、又は２つ以上の異なる種類の部分を含んでもよい。例えば、フルオロアルキルの調整された表面（ペルフルオロアルキルを含む）は、全て同じである、例えば、表面への同じ共有結合を有し、成長及び／又は生存及び／又は可搬性を支持するフルオロルキル部分を含む同数のフルオロメチレンユニットを有する複数の共有結合部分を有し得る。代替的に、調整された表面は、表面に付着する２種類以上の部分を有し得る。例えば、調整された表面は、指定された数のメチレン又はフルオロメチレンユニットを有するアルキル基又はフルオロアルキル基を含み得、より多数のメチレン又はフルオロメチレンユニットを有するアルキル鎖又はフルオロアルキル鎖に付着する帯電部分を有する表面に付着する更なる組の基を更に含み得る。幾つかの実施形態では、２つ以上の種類の部分が付着した調整された表面は、より多数の骨格原子を有し、したがって表面への共有結合からより長い長さを有する第１の組の付着リガンドが、調整された表面により嵩張った部分を提示する能力を提供し得、一方、より少数の骨格原子を有しながら、異なる、立体的要求がより緩い末端を有する第２の組の付着リガンドが、シリコン基板又はアルミナ基板自体への望ましくない接着又は接触を回避するように基板表面全体を機能化するのを促進することができるように設計し得る。別の例では、表面に付着した部分は、表面上でランダムに変化する電荷を提示する双性イオン性表面を提供し得る。
調整された表面の特性
幾つかの実施形態では、共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、ＤＥＰ構成の基板表面）に共有結合される場合、単層を形成し得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分により形成される調整された表面は、１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５〜３．０ｎｍ）の厚さを有し得る。他の実施形態では、共有結合部分により形成される調整された表面は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有し得る。幾つかの実施形態では、調整された表面は、ＤＥＰ構成内で動作に向けて適宜機能するために、完全に形成された単層である必要はない。
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの調整された表面は、望ましい電気特性を提供し得る。理論による制限を意図せずに、調整された表面のロバスト性に影響する一要因は、本質的な電荷トラップである。異なる表面調整材料は電子を捕捉し得、電子は材料の分解につながる恐れがある。調整された表面の欠陥は、電荷トラップにつながり、調整された表面の更なる分解につながり得る。
調整された表面の組成以外で、疎水性材料の物理的厚さ等の他の要因がＤＥＰ力に影響し得る。調整された表面が基板に形成される様式（例えば、蒸着、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、及び静電コーティング）等の様々な要因が調整された表面の物理的厚さを変更し得る。調整された表面の物理的厚さ及び均一性は、エリプソメータを使用して測定することができる。
調整された表面は、その電気特性に加えて、生体分子との併用に有利な特性を有することもできる。例えば、フッ化（又はパーフルオロ化）炭素鎖を含む調整された表面は、表面ファウリング量を低減するに当たり、アルキル末端鎖と比較して利点を提供し得る。表面ファウリングは、本明細書で使用される場合、タンパク質及びその老廃物、核酸及び各老廃物等のバイオ材料の永久的又は半永久的な堆積を含み得る、マイクロ流体デバイスの表面への無差別材料堆積量を指す。
ＤＥＰ構成で使用し得る調整された表面の様々な特性を以下の表に含む。見て取ることができるように、全て本明細書に記載されるような共有結合された調整された表面であるエントリ１〜７では、エリプソメータにより測定される厚さは、非共有スピンコーティングにより形成されたCYTOP表面であるエントリ８よりも一貫して薄かった（Ｎ／Ａは、表全体を通して入手不可能であったデータを表す）。フッ化表面は、通常、アルキル（炭化水素）の調整された表面よりもファウリング性が低いため、ファウリングは、形成モードよりも表面の化学的性質に依存することがわかった。
表面への結合基
調整された表面を形成する共有結合部分は、結合基を介して表面に付着する。結合基は、ケイ素又は酸化アルミニウムから形成し得る基板表面の酸化物とのシロキサン含有試剤の反応により形成されるシロキシ結合基であり得る。幾つかの他の実施形態では、結合基は、ケイ素又はアルミニウム基板表面の酸化物とのホスホン酸含有試剤の反応により形成されるホスホン酸エステルであり得る。
複数パートの調整された表面
共有結合された調整された表面は、後述するように、調整された表面を提供する部分を既に含むように構成された表面調整試剤（例えば、ペルフルオロアルキルシロキサン試剤を含み得るアルキルシロキサン試剤又はフルオロ置換アルキルシロキサン試剤）の反応により形成し得る。代替的に、調整された表面は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する部分を、それ自体が表面に共有結合された表面修飾リガンドに結合することにより形成し得る。
調整された表面の構造及び準備方法
幾つかの実施形態では、誘電泳動基板の表面の酸化物に共有結合された調整された表面は、化学式１の構造を有する。
調整された表面は、誘電泳動基板の表面の酸化物に共有結合され得る。誘電泳動基板はケイ素又はアルミナであり得、酸化物は、基板の固有の化学構造の一部として存在するか、又は後述するように導入し得る。調整された表面は、結合基ＬＧを介して酸化物に付着し得、結合基ＬＧは、酸化物とのシロキサン基又はホスホン酸基との反応から形成されるシロキシ基又はホスホン酸エステル基であり得る。
細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分は、アルキル若しくはフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含むが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸若しくはポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。アルキル又はフルオロアルキル部分は、１０炭素以上の骨格鎖長を有し得る。幾つかの実施形態では、アルキル又はフルオロアルキル部分は、約１０、１２、１４、１６、１８、２０、又は２２個の炭素の骨格鎖長を有し得る。
結合基ＬＧは、マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せの支持を提供する部分に直接又は間接的に接続し得る。結合基ＬＧが部分に直接接続される場合、任意選択的なリンカーＬは存在せず、ｎは０である。結合基ＬＧが部分に間接的に接続される場合、リンカーＬが存在し、ｎは１である。リンカーＬは、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を含み得る線状部を有し得る。幾つかの非限定的な例では、それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はリン酸基からなる群から選択される１つ又は複数の部分の任意の組合せで中断され得る。更に、リンカーＬは、リンカーの骨格を中断する１つ又は複数のアリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基を有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬの骨格は１０〜２０個の炭素を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬの骨格は約５原子〜約２００原子、約１０原子〜約８０原子、約１０原子〜約５０原子、又は約１０原子〜約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。他の実施形態では、骨格原子は全て炭素であるわけではなく、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の可能な組合せを含み得る。
表面調整試剤
細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持し、それにより調整された表面を提供するように構成された部分が１ステッププロセスで基板の表面に追加される場合、化学式６の表面調整試剤を使用して、調整された表面を導入し得る。
表面調整試剤は、化学式６の構造を有し得る。
化学式６の表面調整試剤では、表面調整試剤は結合基ＬＧを含み得、結合基ＬＧはシロキサン基又はホスホン酸基であり得る。結合基ＬＧは、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された分に直接又は間接的に結合され得る。ＬＧは、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に直接（ｎ＝０）、又はリンカーＬの第１の端部への接続を介して間接的に（ｎ＝１）結合され得る。リンカーＬは、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を有し得る線状部を更に含み得る。線状部の骨格は、１つ又は複数のアリーレン部分を更に含み得る。細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分（「部分」）は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含むが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分は、アルキル又はペルフルオロアルキル部分を含み得る。アルキル又はペルフルオロ部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有し得る。細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された表面調整試剤の部分は、サッカリド部分を含み得、デキストランであり得る。他の実施形態では、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された表面調整試剤の部分は、アルキレンエーテル部分を含み得る。アルキレンエーテル部分はポリエチレングリコールであり得る。表面調整試剤は開裂可能部分を更に含み得、開裂可能部分は、リンカーＬ内に配置されてもよく、又は細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された表面調整試剤の部分の一部であってもよい。開裂可能部分は、調整された表面の分裂を可能にし、それにより、１つ又は複数の生体細胞の可搬性を促進するように構成され得る。
幾つかの実施形態では、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する部分は、複数ステッププロセスで基板の表面に追加し得る。部分がステップ毎に表面に結合される場合、リンカーＬは、化学式２に示されるような結合基ＣＧを更に含み得る。
幾つかの実施形態では、結合基ＣＧは、反応部分Ｒｘの反応から生じる部分及び反応ペア部分Ｒｐｘと反応するように構成された部分を表す。例えば、１つの典型的なＣＧはカルボキサミジル基を含み得、これは、活性化エステル、酸塩化物等のカルボン酸の誘導体とアミノ基との反応の結果である。ＣＧは、トリアゾリレン基、カルボキサミジル基、チオアミジル基、オキシム基、メルカプチル基、ジスルフィド基、エーテル基、アルケニル基、又は反応部分と各反応ペア部分との反応時に形成し得る任意の他の適する基を含み得る。結合基ＣＧは、部分が付着するリンカーＬの第２の端部に配置し得る。幾つかの他の実施形態では、結合基ＣＧは、リンカーＬの骨格を中断し得る。幾つかの実施形態では、結合基ＣＧはトリアゾリレンであり、これは、アルキン基とアジド基との反応の結果であり、アルキン基及びアジド基のいずれかは、当技術分野で既知のように、クリック結合反応で使用される反応部分又は反応ペア部分であり得る。トリアゾリレン基は更に置換することもできる。例えば、ジベンゾシルコオクテニル溶融トリアゾリレン部分が、ジベンゾシクロオクテニル反応ペア部分Ｒｐｘを有する調整修飾試剤と、表面修飾リガンドのアジド反応部分Ｒｘとの反応から生じ得、これについては以下の段落でより詳細に説明する。様々なジベンゾシクロオクテニル修飾分子が当技術分野で既知であり、又は細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分を組みこむように合成し得る。
調整された表面が複数ステッププロセスで形成される場合、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する部分は、調整修飾試剤（化学式５）と、化学式３の構造を有する、それに共有結合された表面修飾リガンドを有する基板との反応により導入し得る。
化学式３の中間修飾表面には表面修飾リガンドが付着し、表面修飾リガンドは、化学式−ＬＧ−（Ｌ’’）ｊ−Ｒｘを有し、基板の酸化物に結合され、化学式１の調整された表面に関して上述したのと同様に形成される。ＤＥＰ基板の表面は、上述したようなものであり、基板に固有であるか、又は基板に導入される酸化物を含む。結合基ＬＧは上述したようなものである。リンカーＬ’’は存在してもよく（ｊ＝１）、又はしなくてもよい（ｊ＝０）。リンカーＬ’’は、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜１００個の非水素原子を含み得る線状部を有し得る。幾つかの非限定的な例では、それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はリン酸基の任意の組合せで中断され得る。更に、リンカーＬ’’は、リンカーの骨格を中断する１つ又は複数のアリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基を有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬ’’の骨格は１０〜２０個の炭素原子を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬ’’の骨格は、約５原子〜約１００原子、約１０原子〜約８０原子、約１０原子〜約５０原子、又は約１０原子〜約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。他の実施形態では、骨格原子は全て炭素であるわけではなく、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の可能な組合せを含み得る。
反応部分Ｒｘは、表面と表面修飾リガンドとの共有結合の先端部にある表面修飾リガンドの末端に存在する。反応部分Ｒｘは、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する部分を導入する結合反応に有用な任意の適する反応部分である。幾つかの実施形態では、反応部分Ｒｘは、アジド部分、アミノ部分、ブロモ部分、チオール部分、活性化エステル部分、サクシニミジル部分、又はアルキニル部分であり得る。
調整修飾試剤
調整修飾試剤（化学式５）は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する部分を供給するように構成される。
細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された調整修飾試剤の部分は、反応部分Ｒｘと反応ペア部分Ｒｐｘとの反応により表面修飾リガンドに結合される。反応ペア部分Ｒｐｘは、各反応部分Ｒｘと反応するように構成された任意の適する反応基である。非限定的な一例では、１つの適する反応ペア部分Ｒｐｘはアルキンであり得、反応部分Ｒｘはアジドであり得る。反応ペア部分Ｒｐｘは、代替的に、アジド部分であり得、各反応部分Ｒｘはアルキンであり得る。他の実施形態では、反応ペア部分Ｒｐｘは活性エステル官能基であり得、反応部分Ｒｘはアミノ基であり得る。他の実施形態では、反応ペア部分Ｒｐｘはアルデヒドであり得、反応部分Ｒｘはアミノであり得る。他の反応部分−反応ペア部分組合せも可能であり、これらの例は決して限定ではない。
細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するよう構成された化学式５の調整修飾試剤の部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含むが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。
細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せの強化を提供する化学式５の調整修飾試剤の部分は、反応ペア部分Ｒｐｘに直接（Ｌ’、ｍ＝０）又は間接的に接続し得る。反応ペア部分Ｒｐｘが、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せの強化を提供する部分に間接的に接続される場合、反応ペア部分ＲｐｘはリンカーＬ’（ｍ＝１）に接続し得る。反応ペア部分Ｒｐｘは、リンカーＬ’の第１の端部に接続し得、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せの強化を提供する部分は、リンカーＬ’の第２の端部に接続し得る。リンカーＬ’はリンカー部を有し得、リンカー部の骨格は、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜１００個の非水素原子を含む。幾つかの非限定的な例では、それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はリン酸基の任意の組合せで中断され得る。更に、リンカーＬ’は、リンカーＬ’の骨格を中断する１つ又は複数のアリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基を有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬ’の骨格は１０〜２０個の原子を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬ’の骨格は、約５原子〜約１００原子、約１０原子〜約８０原子、約１０原子〜約５０原子、又は約１０原子〜約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。他の実施形態では、骨格原子は全て炭素であるわけではなく、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の可能な組合せを含み得る。
調整修飾試剤（化学式５）が、表面修飾リガンド（化学式３）を有する表面と反応する場合、化学式２の調整された表面を有する基板が形成される。次に、リンカーＬ’及びリンカーＬ’’は、正式にリンカーＬの部分であり、反応部分Ｒｘとの反応ペア部分Ｒｐｘの反応は、化学式２の結合基ＣＧをもたらす。
表面修飾試剤
表面修飾試剤は、構造ＬＧ−（Ｌ’’）ｊ−Ｒｘ（化学式４）を有する化合物である。結合基ＬＧは、誘電泳動基板の表面の酸化物に共有結合される。誘電泳動基板はケイ素又はアルミナであり得、酸化物は、基板の固有の化学構造の一部として存在するか、又は本明細書で考察するように導入し得る。結合基ＬＧは、シロキサン基又はホスホン酸基と基板の表面上の酸化物との反応から形成されるシロキシ基又はホスホン酸エステル基であり得る。反応部分Ｒｘについては上述した。反応部分Ｒｘは、結合基ＬＧに直接接続されてもよく（Ｌ’’、ｊ＝０）、又はリンカーＬ’’（ｊ＝１）を介して間接的に接続されてもよい。結合基ＬＧはリンカーＬ’’の第１の端部に付着し得、反応部分Ｒｘは、表面修飾リガンドが化学式３でのように表面に付着すると、基板の表面の先端であるリンカーＬ’’の第２の端部に接続し得る。
リンカーＬ’’は、線状部の骨格がケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜１００個の非水素原子を含む線状部を有し得る。幾つかの非限定的な例では、それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はリン酸基の任意の組合せで中断され得る。更に、リンカーＬ’’は、リンカーＬ’’の骨格を中断する１つ又は複数のアリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基を有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬ’’の骨格は１０〜２０個の原子を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬ’’の骨格は、約５原子〜約１００原子、約１０原子〜約８０原子、約１０原子〜約５０原子、又は約１０原子〜約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。他の実施形態では、骨格原子は全て炭素であるわけではなく、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の可能な組合せを含み得る。
開裂可能部分
様々な実施形態では、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する部分、リンカーＬ、リンカーＬ’、リンカーＬ’’、又は結合基ＣＧのいずれかは、後述するように、開裂可能部分を更に含み得る。開裂可能部分は、１つ又は複数の生体細胞の可搬性を促進するマイクロ流体デバイスの調整された表面の分裂を可能にするように構成され得る。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の生体細胞の可搬性は、ある時間期間にわたり細胞を培養した後に細胞を移動可能にするため、特に、細胞をマイクロ流体デバイスから搬出可能にするために望ましい。
基板の組成物
したがって、誘電泳動（ＤＥＰ）構成及び表面を有する基板と、基板の表面の酸化物部分に共有結合された調整された表面とを含む組成物が提供される。基板の調整された表面は化学式１又は化学式２の構造を有し得る。
式中、ＬＧは結合基であり、Ｌは、存在してもよく（ｎ＝１）又は不在であってもよい（ｎ＝０）リンカーであり、部分は、マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する部分であり、ＣＧは、本明細書に定義されるような結合基である。
調整された表面は、表面の酸化物部分に共有結合された結合基ＬＧを含み得る。結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に更に結合され得る。結合基は、シロキシ結合基であり得る。他の実施形態では、結合基は、ホスホン酸エステルであり得る。結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に直接又は間接的に結合され得る。結合基は、リンカーの第１の端部への接続を介して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。リンカーは、線状部を更に含み得、線状部の骨格は、上述したように、ケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子を含む群の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を有し得る。線状部の骨格は１つ又は複数のアリーレン部分を更に含み得る。
リンカーは、上で定義された結合基ＣＧを有し得る。結合基ＣＧはトリアゾリレン部分を含み得る。トリアゾリレン部分は、リンカーの線状部を中断してもよく、又はリンカーの線状部への第２の端部に接続してもよい。リンカーの第２の端部は、基板の表面の先端部であり得る。細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分は、１つ又は複数のアルキル若しくはフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含むが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸若しくはポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。幾つかの実施形態では、双性イオン性の調整された表面を提供するアニオン官能基とカチオン官能基との混合物等であるが、これらに限定されない異なる部分の混合物が調整された表面に組み込まれる。調整された表面は、アルキル又はペルフルオロアルキル部分を含み得る。アルキル又はペルフルオロアルキル部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有し得る。調整された表面は、サッカリド部分を含み得、デキストランであり得る。他の実施形態では、調整された表面はアルキレンエーテル部分を含み得る。アルキレンエーテル部分はポリエチレングリコールであり得る。調整された表面は、開裂可能部分を更に含み得る。開裂可能部分は、調整された表面の分裂を可能にし、それにより、１つ又は複数の生体細胞の可搬性を促進するように構成され得る。
誘電泳動（ＤＥＰ）構成及び表面を含む基板と、基板の表面の酸化物部分に共有結合された表面修飾リガンドとを含む別の組成物が提供される。表面修飾リガンドを有する基板は、化学式３の構造を有し得る。
式中、ＬＧは結合基であり、Ｌ’’は、任意選択的なリンカーであり、ｊは０又は１である。リンカーＬ’’は、ｊ＝１の場合、存在し、ｊ＝０の場合、不在であり、Ｒｘは本明細書に記載される反応部分である。
表面修飾リガンドの反応部分は、アジド部分、アミノ部分、ブロモ部分、チオール部分、活性化エステル部分、サクシニミジル部分、又はアルキニル部分であり得る。表面修飾リガンドは、結合基を介して酸化物部分に共有結合され得る。結合基は、シロキシ部分であり得る。他の実施形態では、結合基は、ホスホン酸エステルであり得る。結合基は、表面修飾リガンドの反応部分へのリンカーを介して間接的に接続し得る。結合基はリンカーの第１の端部に付着し得、反応部分はリンカーの第２の端部に付着し得る。リンカーＬ’’は線状部を含み得、線状部の骨格は、ケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜１００個の非水素原子を含む。リンカーＬ’’の骨格は１０〜２０個の原子を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬ’’の骨格は、約５原子〜約５０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬ’’の骨格は全て炭素原子を含み得る。線状部の骨格は１つ又は複数のアリーレン部分を含み得る。リンカーＬ’’はトリアゾリレン部分を含み得る。トリアゾリレン部分は、リンカーＬ’’の末端で中断するか又は付着し得る。表面修飾リガンドは開裂可能部分を含み得る。開裂可能部分は、マイクロ流体デバイスの調整された表面の分裂を可能にし、それにより、１つ又は複数の生体細胞の可搬性を促進するように構成され得る。
準備方法
幾つかの実施形態では、調整された表面又は表面修飾リガンドは、化学蒸着を使用してマイクロ流体デバイスの内面に堆積する。分子の蒸着を通して、調整された表面／表面修飾リガンドは、調整された表面／表面修飾リガンドを構成する分子がマイクロ流体デバイス（１００、２００、２４０、２９０、４００、５００Ａ〜Ｅ、６００）のいずれかの内面の分子に共有結合された密に詰め込まれた単層を達成することができる。望ましい詰め込み密度を達成するために、例えば、アルキル末端シロキサンを構成する分子を少なくとも１１０℃（例えば、少なくとも１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃等）の温度で少なくとも１５時間（例えば、少なくとも２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、又はそれよりも長い時間）の期間にわたり蒸着させることができる。そのような蒸着は、通常、真空下且つ水和した硫酸塩（例えば、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）等の水源の存在下で実行される。通常、蒸着の温度及び持続時間を増大させると、調整された表面／表面修飾リガンドの特性は改善する。幾つかの実施形態では、調整された表面又は表面修飾リガンドは、液相での反応により導入し得る。
マイクロ流体表面を準備するために、酸素プラズマ処理でカバー、マイクロ流体回路材料、及び電極活性化基板を処理し得、酸素プラズマ処理は様々な不純物を除去することができ、それと同時に酸化表面（例えば、本明細書に記載のように共有修飾し得る表面の酸化物）を導入することができる。酸素プラズマクリーナーを例えば真空状況下において１００Ｗで６０秒間にわたり動作させることができる。代替的に、表面を酸化する過酸化水素等の酸化剤を含む液相処理を使用し得る。例えば、塩酸と過酸化水素との混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物（例えば、約３：１〜約７：１の範囲内の硫酸：過酸化水素比を有し得るピラニア溶液）である。
蒸着プロセスは、例えば、カバー、マイクロ流体回路材料、及び電極活性化基板を事前にクリーニングすることにより、任意選択的に改善することができる。例えば、そのような事前クリーニングは、アセトン浴、エタノール浴、又はそれらの組合せ等の溶媒浴を含むことができる。溶媒浴は超音波処理を含むことができる。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスが組み立てられて、マイクロ流体回路を画定するエンクロージャを形成した後、蒸着を使用してマイクロ流体デバイスの内面をコーティングする。
表面修飾リガンドを有する基板が調整修飾試剤と更に反応して、調整された表面を有する基板を準備する場合、反応は、試剤を溶解可能であり、マイクロ流体回路材料又は表面修飾リガンドを有する表面を妨げない任意の適する溶媒を使用してインサイチューで実行され得る。幾つかの実施形態では、溶媒は水溶液である。
調整された表面又は表面修飾リガンドを含む表面を準備する方法
したがって、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を有するマイクロ流体デバイスの修飾表面を準備する方法が提供され、この方法は、マイクロ流体デバイスの基板の表面を提供するステップであって、基板はＤＥＰ構成を含む、ステップと、表面の酸化物を修飾試剤と反応させ、それにより、基板の表面を修飾表面に変換するステップとを含む。幾つかの実施形態では、基板の表面はプラズマクリーニングされて、表面に酸化物を提供し得る。幾つかの実施形態では、表面は、マイクロ流体デバイスを組み立てる前にプラズマクリーニングし得る。他の実施形態では、表面は、マイクロ流体デバイスを組み立てた後にプラズマクリーニングし得る。
表面の酸化物を修飾試剤と反応させるステップが、修飾試剤を含む液体に表面を暴露することにより実行される、方法である。幾つかの実施形態では、表面の酸化物を反応させるステップは、低圧で修飾試剤を含む蒸気に表面を暴露することにより実行され得る。
幾つかの実施形態では、修飾試剤は、表面と共有反応するように構成された第１の部分と、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された第２の部分とを有する表面調整試剤を含み得、それにより、表面を細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された表面に変更する。
表面調整試剤は化学式６の構造を有し得る。
第１の部分は結合基ＬＧを含み得、結合基ＬＧはシロキサン基又はホスホン酸基であり得る。結合基ＬＧは、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に直接又は間接的に結合され得る。第１の部分は、第２の部分に直接（ｎ＝０）又は間接的に（ｎ＝１）結合され得、第２の部分は、リンカーＬの第１の端部への接続を介して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分である。リンカーＬは線状部を更に含み得、線状部の骨格は、ケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を有し得る。線状部の骨格は、１つ又は複数のアリーレン部分を更に含み得る。表面調整試剤の第２の部分（「部分」）は、アルキル若しくはフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含むが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸若しくはポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。表面調整試剤の第２の部分は、アルキル又はペルフルオロアルキル部分を含み得る。アルキル又はペルフルオロアルキル部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有し得る。表面調整試剤の第２の部分は、サッカリド部分を含み得、デキストランであり得る。他の実施形態では、表面調整試剤の第２の部分は、アルキレンエーテル部分を含み得る。アルキレンエーテル部分はポリエチレングリコールであり得る。表面調整試剤は、開裂可能部分を更に含み得、開裂可能部分はリンカーＬ内に配置されてもよく、又は表面調整試剤の第２の部分の一部であってもよい。開裂可能部分は、調整された表面の分裂を可能にし、それにより、１つ又は複数の生体細胞の可搬性を促進するように構成され得る。
様々な実施形態では、修飾試剤は、上で定義された化学式４の構造を有する表面修飾試剤を含み得、表面修正試剤は、表面と反応するように構成された第１の部分ＬＧと、アジド部分、アミノ部分、ブロモ部分、チオール部分、活性化エステル部分、サクシニミジル部分、又はアルキニル部分を含む反応部分であり得るか、又は反応部分を含むように修飾し得る第２の部分Ｒｘとを含み、それにより、上述したように、表面を化学式３の構造を有する表面修飾リガンドを含む表面に変換する。幾つかの実施形態では、表面の酸化物と反応するように構成された表面修飾試剤の第１の部分は、シロキサン又はホスホン酸であり得る。
幾つかの実施形態では、方法は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された第１の部分と、表面修飾リガンドの反応部分と反応するように構成された第２の部分Ｒｐｘとを含む調整修飾試剤と、表面修飾リガンド（化学式３）を含む表面とを反応させ、それにより、上述したように、化学式２の構造を有する生体細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された表面を提供するステップを含む。調整修飾試剤は化学式５の構造を有し得る。幾つかの実施形態では、調整修飾試剤の第１の部分は、アルキレンオキシド部分、アミノ酸部分、サッカリド部分、アニオン部分、カチオン部分、及び双性イオン性部分の少なくとも１つを含む。
様々な実施形態では、表面調整試剤、表面修飾試剤、又は調整修飾試剤のいずれかは、本明細書に記載されるように、開裂可能部分を更に含み得る。
他の成分を含む調整された表面
調整された表面は、生体適合性金属イオン（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウム、又はマグネシウム）、抗酸化剤、界面活性剤、及び／又は必須栄養素を含め、共有結合された部分により形成されるポリマー又は調整された表面への代替又は追加として、他の成分を更に含み得る。非限定的で例示的なリストは、Ｂ７、アルファトコフェロール、アルファトコフェロール酢酸エステル、ビタミンＡ、及びその酢酸塩等のビタミン；ＢＳＡ、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ等のタンパク質；コルチコステロン、Ｄ−ガラクタオーゼ、エタノールアミン塩酸塩、還元グルタチオン、Ｌ−カルニチン塩酸塩、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン二塩酸塩、及びトリヨード−サイロニン等の小分子；並びに塩であって、亜セレン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、及び／又はリン酸マグネシウムを含むが、これらに限定されない塩を含む。抗酸化剤は、カロテノイド、ケイ皮酸及び誘導体、フェルラ酸、フラボノイド等のポリフェノール、キノン及び誘導体（ミトキノン−Ｑを含む）、Ｎ−アセチルシステイン、及びアスコルビン酸、ビタミンＥ等の抗酸化ビタミンを含み得るが、これらに限定されない。調整された表面は、抗酸化剤及び上で列挙した他の成分の多くを含む、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント等の培養培地サプリメントを含み得る。Ｂ−２７（登録商標）サプリメントは、ThermoFisher Scientific（カタログ＃１７５０４０４４）から市販されており（５０×）、血清を含まない。
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を含み得る。幾つかの実施形態では、哺乳類血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）である。調整された表面は、定義された量及びタイプで無血清培地又は定義された培地から提供され得る、特定量及び血清に通常見られるタイプのタンパク質等の哺乳類血清の特定の成分を含み得る。
他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は哺乳類血清を含まない。様々な実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、いかなるチタン、ニッケル、又は鉄金属イオンも含まない。更に他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、いかなる有意濃度のチタン、ニッケル、又は鉄金属イオンも含まないことができる。更に別の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、いかなる金、アルミニウム、又はタングステン金属イオンも含まないことができる。
付着を低減する試剤処理、試剤の混合物
細胞がマイクロ流体デバイス内で培養される際、細胞は活発にタンパク質及び他の生体分子を分泌し、マイクロ流体デバイス内の表面に付着し得る同様の生体分子を消極的に出す。培養されている細胞は、互いに又は調整された表面に付着し得、マイクロ流体デバイスから搬出するために、成長室から取り出すのが難しくなり得る。更に、幾つかの状況下では、同じ又は異なるタイプの追加の細胞を培養細胞からマイクロ流体デバイス内に持ち込むことが望ましいことがある。これらの新たに送られた細胞も、マイクロ流体環境内で蓄積された表面ファウリングに付着し得、後の時点でデバイスから取り出す際に問題を呈する恐れがある。
トリプシン又はAccutase（登録商標）（タンパク質分解活性及びコラーゲン分解活性を有する酵素混合物、Innovative Cell Technologies）等のプロテアーゼを用いた処理は、非限定的な一例では、付着した細胞のマイクロ流体デバイスからの搬出を可能にするには十分な有効性を提供しないことがある。付着防止性を提供する１つ又は複数のタンパク質及び／又はペプチドは、両シナリオでそのような付着を低減する混合物として使用し得る。様々な細胞付着機構の１つに抗う活性を有する生体分子又は小分子が使用可能である。阻害し得る細胞付着機構の幾つかは、活性アクチンフィラメント形成及び関連するプロセスであり得、これは、マイクロフィラメント伸長の小分子阻害剤であるサイトカラシンＢ（New England Biosciencesカタログ番号：Ｍ０３０３Ｓ）等の化合物の使用により標的化し得る。フィブロネクチン（ファウリングされた表面で見られ得る）への付着を仲介するインテグリン受容体の阻害等であるが、これに限定されない特定の受容体駆動付着プロセスは、例えば、ＲＧＤ含有ペプチドの使用により標的化し得る。別のタイプのファウリング材料である死細胞からリリースされる核酸は、細胞結合を引き寄せ得、これは、ファウリング核酸を開裂させるエンドヌクレアーゼの使用により標的化し得る。１つの特定のエンドヌクレアーゼであるデオキシリボヌクレアーゼ１（DNase1、Sigma Aldrich、カタログ番号ＡＭＰＤ１−１ＫＴ）もアクチンに結合され、したがって、付着の二重活性ブロックを提供する。幾つかの実施形態では、３つ全てのブロック剤の混合物を使用して細胞付着を回避／低減し得る。
一般的な処理プロトコル、培養後
２日、３日、４日、又はそれを超える日数にわたりマイクロ流体デバイス内で成長した細胞の場合、３つの付着防止試剤の混合物又は後述するような１つの付着防止試剤をマイクロ流体デバイス内に流し得、細胞を搬出する前に、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、又は約６０分からの時間期間にわたり成長室内に拡散させ得る。
事前処理
マイクロ流体デバイスに搬入する細胞の場合、細胞は、約３０分間、付着防止試剤の混合物又は１つの付着防止試剤を含む培養培地内で予め培養され、それからマイクロ流体チップに搬入し得る。阻害は、試剤を更に追加せずに、１時間、２時間、３時間、又はそれを超える時間期間にわたり持続する。
ＲＧＤトリペプチド（ｍｗ．６１４．６、Santa Cruz Biotechnologyカタログ番号：ｓｃ−２０１１７６）は、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で培養培地又は搬入前培養培地に存在し得る。幾つかの実施形態では、ＲＧＤトリペプチドは、約０．１ミリモル、約０．５ミリモル、約０．７ミリモル、約１．０ミリモル、約３．０ミリモル、約５．０ミリモル、約６．０ミリモル、約８．０ミリモル、約１０．０ミリモル、又はその範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。サイトコラシンＢは、約０．０１マイクロモル〜約５０マイクロモルの濃度又は約０．０１マイクロモル、約０．０５マイクロモル、約０．１マイクロモル、約２マイクロモル、約４マイクロモル、約６マイクロモル、約８マイクロモル、約１０マイクロモル、約２０マイクロモル、約３０マイクロモル、約５０マイクロモル若しくは範囲内の任意の値の濃度で搬入前培養培地に存在し得る。DNase1は、約０．００１Ｕ／マイクロリットル〜約１０Ｕ／マイクロリットルの濃度又は約０．００１Ｕ／マイクロリットル、約０．００５Ｕ／マイクロリットル、約０．０１Ｕ／マイクロリットル、約０．０５Ｕ／マイクロリットル、約１．０Ｕ／マイクロリットル、約５．０Ｕ／マイクロリットル、約１０Ｕ／マイクロリットル、若しくは範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。
幾つかの実施形態では、１つの試剤を使用して、細胞がマイクロ流体デバイスで培養される前又は後に付着を低減し得る。例えば、ＲＧＤトリペプチドは、５ｍｇ／ｍＬの濃度で事前培養に使用し得、又は搬出前にマイクロ流体デバイス内の処理として流入させ得る。
使用し得る別の阻害剤は、テトラペプチドフィブロネクチン阻害剤（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＯＨ、ｍｗ．４３３．４、Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号：ｓｃ−２０２１５６）である。フィブロネクチン阻害剤は、約１．７５μｇ／ｍＬ（４マイクロモル）の濃度で使用し得る。
付着の低減又は回避にタンパク質試剤又は小分子試剤を使用することと同様に、細胞外付着関連タンパク質への抗体を使用して、マイクロ流体デバイス内で搬出及び可搬性を達成し得る。非限定的な一例は抗Ｂ１インテグリン：クローンＭ−１０６（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号：ｓｃ−８９７８）である。
開裂可能部分を含む調整された表面
幾つかの実施形態では、調整された表面は、調整された表面の共有結合分子又は非共有結合分子内に組み込まれる開裂可能部分を有し得る。調整された表面は、上記のような機能を有するＲＧＤ等のペプチドモチーフを含み得るか、又は細胞の成長を促進するか、若しくは細胞増殖のコンタクトキュー（contact cue）を提供する別のペプチドモチーフを有し得る。他の実施形態では、調整された表面は、非固有の支持を細胞に提供し、マイクロ流体デバイスのケイ素又は酸化アルミニウム表面から単純に細胞を緩衝する役割を果たし得る。ある期間の細胞培養が完了した後、マイクロ流体デバイスの成長室内の増えた細胞集団の搬出を促進するために、調整された表面を分裂させることが望ましいことがある。これは、細胞が付着挙動を示す場合、有用であり得る。調整された表面は、対象となる細胞によりそれほど分泌されないプロテアーゼの基板である他のペプチドモチーフを組み込むことにより、分裂させ、部分的又は完全に除去し得る。非限定的な一例では、ペプチドモチーフＥＮＬＹＱＳ（Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ）を予め設計された間隔で調整された表面に組み込み得る。このモチーフは、高い配列特異性を有し、したがって、高度に制御された開裂に有用であるＴＥＶプロテアーゼ（タバコエッチウィルスシステインプロテアーゼ、Sigma Aldrichカタログ番号：Ｔ４４５５）の基板である。培養期間が完了した後、ＴＥＶプロテアーゼはマイクロ流体デバイスに流入し、成長室の分離領域内に拡散され得る。調整された表面は、次に、分裂し、マイクロ流体デバイス内の細胞の搬出を促進する。したがって、様々な他のタンパク質分解モチーフを設計し、調整された表面に組み込み、当業者が考案することができるように適する特定のプロテアーゼにより開裂し得る。
流体培地
チャネル及び１つ又は複数の成長室を有するマイクロ流体デバイスについての上記考察に関して、流体培地（例えば、第１の培地及び／又は第２の培地）は、細胞を略生存可能状態に維持可能な任意の流体であり得る。生存可能状態は、生物学的微小物体及び実行中の培養実験に依存する。
第１及び／又は第２の流体培地は、細胞生存に必要な流体及び溶解ガス成分の両方を提供し得、緩衝流体培地、ｐＨ監視、又は両方を使用して所望の範囲にｐＨを維持することもできる。
細胞が哺乳類細胞である場合、第１の流体培地及び／又は第２の流体培地は、必須栄養素、ホルモン、成長因子、又は細胞の成長シグナルを提供可能である、当技術分野で既知のような哺乳類血清又は定義された無血清培地を含み得る。上記の調整された表面と同様に、第１の流体培地及び／又は第２の流体培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含み得る。代替的に、第１の流体培地及び／又は第２の流体培地は、いかなる動物由来の血清も含まず、生理学的に関連する金属イオン（限定ではなく、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及び／又は亜鉛を含む）、抗酸化剤、界面活性剤、及び／又は必須栄養素のいずれか又は全てを含み得る、定義された培地を含み得る。定義される培地は、無血清でありながらなお幾つかのタンパク質を含み得、タンパク質は定義された量及びタイプのものである。無血清培地中の成分の非限定的で例示的なリストは、Ｂ７、アルファトコフェロール、アルファトコフェロール酢酸エステル、ビタミンＡ、及びその酢酸塩等のビタミン；ＢＳＡ、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ等のタンパク質；コルチコステロン、Ｄ−ガラクタオーゼ、エタノールアミン塩酸塩、還元グルタチオン、Ｌ−カルニチン塩酸塩、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン二塩酸塩、及びトリヨード−サイロニン等の小分子；並びに塩であって、亜セレン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、及び／又はリン酸マグネシウムを含むが、これらに限定されない塩を含む。流体培地は、調整された表面について上述した任意の抗酸化剤を含み得る。
流体培地は、０．２２μｍフィルタユニット（ＶＷＲ、カタログ番号７３５２０−９８６）を通して滅菌濾過し得る。
幾つかの実施形態では、適する培養培地は、Dulbecco’s Modified Eagleの培地（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１１９６０−０５１）；FreeStyle（商標）培地（Invitrogen、ThermoFisher Scientific、カタログ番号１１９６０−０５１）；RPMI-1640（GIBCO（登録商標）、ThermoFisher Scientific、カタログ番号１１８７５−１２７）；Hybridoma-SFM（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１２０４５−０７６）；Medium E（StemCell、カタログ番号３８０５）；1X CD CHO培地（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１０７４３−０１１）；Iscove’s Modified Dulbeccoの培地（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１２４４０−０６１）；又はCD DG44培地（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１０７４３−０１１）を含み得るか、又はこれらの培地で全体的に構成され得る。
培養培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、GIBCO（登録商標）、ThermoFisher Scientificから入手可能）、熱不活性化ウシ胎児血清、又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Sigma-Aldrichカタログ番号Ｆ２４４２、Ｆ６１７６、Ｆ４１３５及び他）を更に含み得る。ＦＢＳは、約１％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖ；約１％ｖ／ｖ〜約１５％ｖ／ｖ、約１％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖ、又は約１％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、又は範囲のいずれかの中の任意の数値の濃度で存在し得る。
培養培地は、ペニシリン−ストレプトマイシン（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１５１４０−１６３）を更に含み得る。ペニ−ストレプは、約０．０１％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖ；約０．１％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖ；約０．０１％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ；約０．１％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ；約０．１％ｖ／ｖ〜約３％ｖ／ｖ；約０．１％ｖ／ｖ〜約２％ｖ／ｖ；約０．１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖの範囲；又は範囲のいずれかの中の任意の値の濃度で存在し得る。他の実施形態では、培養培地はジェネテシン（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１０１３１０−０３５）を含み得る。ジェネテシンは、約０．５μｇ／ｍＬ、約１．０μｇ／ｍＬ、約５．０μｇ／ｍＬ、約１０．０μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、又はこれらの範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。
培養培地は緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、Goodの緩衝剤の１つであり得る。緩衝剤は、４−（２−ヒドロキシチエル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１５６３０−０８０であり得るが、これらに限定されない。緩衝材は、約１ミリモル；約３ミリモル；約５ミリモル；約７ミリモル；約９ミリモル；約１０ミリモル；約１２ミリモル；約１５ミリモル；約２０ミリモル；約４０ミリモル；約６０ミリモル；約１００ミリモル；又はこれらの範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。
培養培地は、グルタミンのジペプチド置換であるGlutaMAX（商標）（GIBCO（登録商標）、ThermoFisher Scientific、カタログ番号３５０５０−０７９）を更に含み得る。グルタミンの置換は、約０．２ミリモル、約０．５ミリモル、約０．７ミリモル、約１．０ミリモル、約１．２ミリモル、約１．５ミリモル、約１．７ミリモル、約２．０ミリモル、約２．５ミリモル、約３．０ミリモル、約４．０ミリモル、約７．０ミリモル、約１０．０ミリモル、又はこれらの範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。培養培地は、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１０３７０−０８８）を含み得る。ＭＥＭ非必須アミノ酸は、約０．２ミリモル、約０．５ミリモル、約０．７ミリモル、約１．０ミリモル、約１．２ミリモル、約１．５ミリモル、約１．７ミリモル、約２．０ミリモル、約２．５ミリモル、約３．０ミリモル、約４．０ミリモル、約７．０ミリモル、約１０．０ミリモル、又はこれらの範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。
培養培地は、グルコース（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１５０２３−０２１）を更に含み得る。グルコースは、約０．１ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４．０ｇ／Ｌ、約５．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ、約１０．０ｇ／Ｌ、又はこれらの範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。
培養培地は、メルカプトエタノール（ThermoFisher Scientific、カタログ番号３１３５０−０１０）を更に含み得る。メルカプトエタノールは、約約０．００１％ｖ／ｖ〜約１．５％ｖ／ｖ、約０．００５％ｖ／ｖ〜約１．０％ｖ／ｖ、約０．０１％ｖ／ｖ〜約１．０％ｖ／ｖ、約０．１５％ｖ／ｖ〜約１．０％ｖ／ｖ、約０．２％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖ、又はこれらの範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。
培養培地は、オキサロ酢酸、ピルビン酸塩、及びインスリンを含むＯＰＩ培養培地添加剤（Sigma-Aldrich、カタログ番号Ｏ−５００３）を含み得る。ＯＰＩ培養培地添加剤は、約０．００１％ｖ／ｖ〜約１．５％ｖ／ｖ、約０．００５％ｖ／ｖ〜約１．０％ｖ／ｖ、約０．０１％ｖ／ｖ〜約１．０％ｖ／ｖ、約０．１５％ｖ／ｖ〜約１．０％ｖ／ｖ、約０．２％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖ、又はこれらの範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。培養培地はＢ−２７サプリメント（５０×）、無血清（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１７５０４−１６３）を含み得る。Ｂ−２７サプリメントは、約０．０１％ｖ／ｖ〜約１０．５％ｖ／ｖ、約０．０５％ｖ／ｖ〜約５．０％ｖ／ｖ、約０．１％ｖ／ｖ〜約５．０％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、又はこれらの範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。
本明細書に記載されるように、培養培地又は培養培地の添加剤は、調整された表面をもたらすのに有用な１つ又は複数のPluronic（登録商標）ポリマーを含み得、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、Ｆ６８、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）を含み得る。Pluronic（登録商標）ポリマーは、約０．００１％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖ、約０．０１％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、約０．０１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖ、又は約０．０５％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖの濃度で培養培地に存在し得る。キットとして提供され得る培養培地添加剤の場合、濃度は、１×、５×、１０×、１００×、又は最終培養培地濃度の約１００×であり得る。
培養培地はＩＬ ６（Sigma-Aldrich、カタログ番号ＳＲＰ３０９６−２０ＵＧ）を含み得る。ＩＬ ６は、約１ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、又はこれらの範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。
培養培地は、ピルビン酸ナトリウム（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１１３６０−０７０）を更に含み得る。グルタミンの置換は、約０．１ミリモル、約０．０２ミリモル、約０．０４ミリモル、約０．０６ミリモル、約０．０８ミリモル、約０．１ミリモル、約０．５ミリモル、約０．７ミリモル、約１．０ミリモル、約１．２ミリモル、約１．５ミリモル、約１．７ミリモル、約２．０ミリモル、約２．５ミリモル、約３．０ミリモル、約４．０ミリモル、約７．０ミリモル、約１０．０ミリモル、又はこれらの範囲内の任意の値の濃度で存在し得る。
ガス環境
システムは、酸素及び二酸化炭素を含むが、これらに限定されない、細胞生存に必要なガスの混合物を提供する。両ガスとも流体培地に溶解し、細胞により使用され得、したがって、時間の経過に伴い、成長室の分離領域における流体培地のガス含有量を変える。特に、二酸化炭素含有量は経時変化し得、これは、マイクロ流体デバイス内の流体培地のｐＨに影響する。幾つかの実験状況では、非最適酸素分圧を使用し得る。
温度制御
幾つかの実施形態では、成長室及び／又はフロー領域の少なくとも１つの調整された表面は、少なくとも１つの調整された表面の温度を制御することにより調整される。システムは、マイクロ流体デバイスの成長室及び／又はフロー領域の少なくとも１つの調整された表面の温度を制御又は変調することができる構成要素を含み得る。システムは、ペルチェ加熱、抵抗加熱、又は温度変調をマイクロ流体デバイスに提供する任意の他の適する方法を含み得る。システムは、センサ及び／又はフィードバック構成要素を含み、熱入力を所定範囲に制御することもできる。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、少なくとも約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃の温度を有し、その温度で安定する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの表面は、約２５℃よりも高い温度を有する。他の実施形態では、少なくとも１つの表面は、約３０℃〜約４０℃、約３５℃〜約３８℃、又は約３６℃〜約３７℃の範囲内の温度を有する。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は少なくとも約３０℃の温度を有する。
培養中にかん流を提供するフローコントローラ
フローコントローラは、上述したように、培養期間中にフロー領域において第１の流体培地をかん流させて栄養素を成長室内の細胞に提供し、老廃物を成長室から搬送し得、栄養素の交換及び老廃物の除去は実質的に拡散を介して行われる。コントローラは、マイクロ流体デバイスとは別個の構成要素であってもよく、又はマイクロ流体デバイスの一部として組み込まれてもよい。フローコントローラは、フロー領域において培地を非連続的にかん流させるように構成され得る。フローコントローラは、定期的に又は不規則的に培地をかん流させるように構成され得る。
幾つかの他の実施形態では、コントローラは、約４時間、約３時間、約２時間、約６０分、約５７分、約５５分、約５３分、約５０分、約４７分、約４５分、約４３分、約４０分、約３７分、約３５分、約３３分、約３０分、約２７分、約２５分、約２３分、約２０分、約１７分、約１５分、約１３分、約１０分、約７分、又は約５分毎に１回、フロー領域において流体培地をかん流させるように構成され得る。幾つかの実施形態では、コントローラは、約５分〜約２０分毎に１回、流体培地をかん流させるように構成され得る。他の実施形態では、コントローラは、約１５分〜約４５分毎に１回、流体培地をかん流させるように構成され得る。更に他の実施形態では、コントローラは、３０分〜約６０分毎に１回、流体培地をかん流させるように構成され得る。他の実施形態では、コントローラは、４５分〜約９０分毎に１回、流体培地をかん流させるように構成され得る。幾つかの他の実施形態では、コントローラは、６０分〜約１２０分毎に１回、流体培地をかん流させるように構成され得る。代替的に、コントローラは、２時間〜６時間毎に１回、流体培地をかん流させるように構成され得る。
幾つかの実施形態では、コントローラ２２６は、約５秒、約１０秒、約１５秒、約２０秒、約２５秒、約３０秒、約３５秒、約４０秒、約４５秒、約５０秒、約５５秒、約６０秒、約６５秒、又は約７０秒であり得る時間期間中に培地をかん流させるように構成され得る。他の実施形態では、コントローラは、約１分、約１．２分、約１．４分、約１．５分、約１．６分、約１．８分、約２．０分、約２．２分、約２．４分、約２．５分、約２．６分、約２．８分、約３．０分、約３．２分、約３．４分、約３．５分、約３．６分、約３．８分、又は約４．０分にわたり培地をかん流させるように構成され得る。
様々な実施形態では、コントローラは、約５秒〜約４分、約１０秒〜約３．５分、約１５秒〜約３分、約１５秒〜約２分、約２５秒〜約９０秒、約３０秒〜約７５秒、約４０秒〜約２．０分、約６０秒〜約２．５分、約９０秒〜約３．０分、又は約１．８分〜約４分にわたり培地をかん流させるように構成され得る。
フローコントローラ（図示せず）は、成長室の分離領域からフローチャネルへの成分の平均拡散率よりもはるかに高い率でフロー領域における第１の流体培地をかん流させるように構成され得る。例えば、フロー領域での流体の流量は、約０．００９μＬ／秒、約０．０１μＬ／秒、約０．０２μＬ／秒、約０．０３μＬ／秒、約０．０５μＬ／秒、約０．１μＬ／秒、約０．２μＬ／秒、約０．３μＬ／秒、約０．４μＬ／秒、約０．５μＬ／秒、約０．６μＬ／秒、約０．７μＬ／秒、約０．８μＬ／秒、約０．９μＬ／秒、約１．０μＬ／秒、約１．１μＬ／秒、約１．２μＬ／秒、約１．３μＬ／秒、約１．４μＬ／秒、約１．５μＬ／秒、約１．７μＬ／秒、約１．９μＬ／秒、約２．０μＬ／秒、約２．２μＬ／秒、約２．４μＬ／秒、約２．６μＬ／秒、約２．８μＬ／秒、約３．０μＬ／秒、約３．２μＬ／秒、約３．４μＬ／秒、約３．６μＬ／秒、約３．８μＬ／秒、約４．０μＬ／秒、約４．２μＬ／秒、約４．４μＬ／秒、約４．６μＬ／秒、約４．８μＬ／秒、約５．０μＬ／秒、約６．０μＬ／秒、約７．０μＬ／秒、約８．０μＬ／秒、又は約９．０μＬ／秒であり得、これらの任意の数値は、成長室の接続領域を掃引する（ただし、成長室の分離領域を掃引しない速度率である。コントローラは、流体培地速度の非掃引率である第１の流体培地の速度、すなわち、過度の圧力に起因したマイクロ流体デバイスの破損を回避し、成長室内の第２の流体培地とフロー領域内の第１の流体培地との間での成分の移動を拡散に制限するマイクロ流体デバイスの最大速度Ｖｍａｘ未満の任意の適する率を提供することが可能であり得る。幾つかの実施形態では、コントローラは、約０．０５μＬ／秒、約０．０６μＬ／秒、約０．０７μＬ／秒、約０．０８μＬ／秒、約０．０９μＬ／秒、約０．１０μＬ／秒、約０．１１μＬ／秒、約０．１２μＬ／秒、約０．１３μＬ／秒、約０．１４μＬ／秒、約０．１５μＬ／秒、約０．１６μＬ／秒、約０．１７μＬ／秒、約０．１８μＬ／秒、約０．１９μＬ／秒、約０．２０μＬ／秒、約０．３０μＬ／秒、約０．４０μＬ／秒、約０．５０μＬ／秒、約０．６０μＬ／秒、約０．７０μＬ／秒、約０．８０μＬ／秒、約０．９０μＬ／秒、約１．００μＬ／秒、約１．１０μＬ／秒、約１．２０μＬ／秒、約１．３０μＬ／秒、約１．４０μＬ／秒、約１．５０μＬ／秒、約１．６０μＬ／秒、約１．７０μＬ／秒、約１．８０μＬ／秒、約１．９０μＬ／秒、約２．００μＬ／秒、約２．１０μＬ／秒、約２．２０μＬ／秒、約２．３０μＬ／秒、約２．４０μＬ／秒、約２．５０μＬ／秒、約２．６０μＬ／秒、約２．７０μＬ／秒、約２．８０μＬ／秒、約２．９０μＬ／秒、又は約３．００μＬ／秒でフロー領域を通して第１の流体培地をかん流させるように構成され得る。幾つかの実施形態では、コントローラは、約０．０１μＬ／秒、約０．０２μＬ／秒、約０．０３μＬ／秒、約０．０４μＬ／秒、約０．０５μＬ／秒、約０．０６μＬ／秒、約０．０７μＬ／秒、約０．０８μＬ／秒、約０．０９μＬ／秒、約０．１０μＬ／秒、又は約０．１１μＬ／秒で複数のフロー領域のそれぞれを通して第１の流体培地をかん流させるように構成され得る。
様々な実施形態では、かん流の流量及び持続時間は、フローチャネルの少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、又はそれを超える容積の総量の第１の流体培地を提供する。
様々な実施形態では、図７及び図８の方法に示され、以下に考察されるように、かん流は、持続時間の変更、流量の変更、及びかん流停止持続時間を使用して達成し得る。
培地調整及び導入構成要素であるリザーバ
システムは、マイクロ流体デバイスの流入口１２４に導入し得、フローコントローラによりかん流し得る流体培地を含むように構成されたリザーバを更に含み得る。リザーバは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス（非限定的な例は、１００、２００、２４０、２９０、又は４００を含む）に上流位置（図５Ａ〜図５Ｅ）で流体接続され得る。流体培地は、リザーバにおいて、所望のバランスのガス、すなわち、非限定的な一例では、培養下で細胞の最適な成長を提供する５％二酸化炭素を含む混合物を含むように調整し得ると共に、マイクロ流体デバイスでのｐＨを変調することもできる。
幾つかの実施形態では、リザーバは、マイクロ流体デバイス内で研究中の細胞と異なる細胞の集団を更に含み得る。この細胞の集団は支持細胞であり得、支持細胞は、マイクロ流体デバイス内での細胞の成長及び／又は生存に必要な可溶性シグナリング又は成長因子を生成する。このようにして、流体培地は、マイクロ流体デバイスに導入される前に、成長及び／又は生存を最適にするように調整し得る。リザーバを使用して支持細胞集団を収容することで、マイクロ流体デバイス内で培養中の細胞の集団の汚染を回避し得、支持細胞からの可溶性分泌物は、マイクロ流体デバイスに送られる流体培地に組み込み得るが、支持細胞は流体培地に引き込まれないことができる。
システムの調整及び導入構成要素であるリザーバの一実施形態を図５Ａに示す。この実施形態でのリザーバは別のマイクロ流体デバイス５０２であり得、マイクロ流体デバイス５０２内で調整される流体培地２０２（図示せず）を含む。マイクロ流体デバイス５０２は、エンクロージャ５１０及び基部５１２を有し、これらの少なくとも一方はガス透過可能である。マイクロ流体デバイス５０２は、支持細胞が、マイクロ流体デバイス５００Ａ内での細胞の成長及び／又は生存に必要な可溶性成長因子又は他の細胞シグナリング成分を生成するように維持される支持細胞集団を含むこともできる。リザーバ５０２は室５１６内に収容し得、ガス環境の非限定的な一例では、５％二酸化炭素ガス環境を提供する。リザーバ５０２内の流体培地２０２は、リザーバのガス透過壁を通してガス混合物（例えば、空気中に５％の二酸化炭素）を吸収すると共に、支持細胞からの可溶性分泌物も吸収する。培地２０２は、ポンプ５１４によりリザーバ５０２からガス不透過性接続コンジット５０６を通して、流入口１２４を介してマイクロ流体デバイス５００Ａにかん流され、マイクロ流体デバイス５００Ａのフローチャネル１３４においてフロー２１２を形成する。この実施形態では、ポンプ接続コンジット５０４（ラベルされず）、輸送接続コンジット５０６、基部１０４、又はエンクロージャ１０２のいずれもガス透過性ではない。流体培地フロー２１２は、マイクロ流体デバイス５００Ａの成長室を越えて掃引し、フローチャネル１３４内の流体培地２０２からの成分を成長室内に拡散させながら、流体培地２０４の廃棄物成分を成長室（図示せず）から出るように拡散させる。最終的に、使われた流体培地２０２’（図示せず）は、搬出接続コンジット５０８内の流出口１２４’を介してマイクロ流体デバイス５００Ａから出る。
別の実施形態では、流体培地２０２は、図５Ｂに示されるように、ポンプ接続コンジット５０４を介してガス透過性ブロック５１８を通してマイクロ流体デバイス５００Ｂ内に輸送される。ガス透過性ブロック５１８は、エンクロージャ１０２の上面に組み込まれ、エンクロージャ１０２の上面の一部を形成する。ガス透過性ブロック５１８により形成されるエンクロージャ１０２の上面の部分は、マイクロ流体デバイス５００Ｂの成長室の上流であり得る。マイクロ流体デバイス５００Ｂは室５１６内に収容され、室５１６は、マイクロ流体デバイス５００Ｂ内の流体培地内に交換されるガス環境（例えば、５％二酸化炭素）を提供する。室５１６は、温度及び／又は湿度に関しての調整をマイクロ流体デバイス５００Ｂに更に提供し得る。ポンプ接続コンジット５０４、エンクロージャ１０２、又は基部１０４のいずれもガス透過性ではなく、ガス透過性ブロック５１８を通しての交換は、マイクロ流体デバイス５００Ｂにとって「肺」のように機能し、マイクロ流体デバイス５００Ｂ内の培地を適宜調整し得る。この実施形態では、流体培地２０２は、ポンプ５１４に入れられる前に別の成分で更に調整し得、したがって、例えば、支持細胞培養からの分泌物質を含むこともできる。
別の実施形態では、図５Ｃに示されるように、ガス透過性ブロックは、マイクロ流体デバイス５００Ｃのエンクロージャ１０２の上面に一体化され、ガス透過性セクション５１８’を形成する。流体培地は、図５Ｂの実施形態に関して上述したように調整、導入し得、支持細胞集団からの分泌物質を更に含み得る。マイクロ流体デバイス５００Ｃは、ガス環境、例えば、空気中の５％二酸化炭素を含む室５１６に収容し得る。ガス環境は、ガス透過性セクション５１８’を横切って交換することができ、ガス透過性セクション５１８’は、エンクロージャ１０２の上面の１つ又は複数のセクションであり得る。室５１６は、適切な温度及び湿度についてデバイス５００Ｃを更に調整し得る。この実施形態では、ポンプ接続コンジット５０４、エンクロージャ１０２（ガス透過性ブロック５１８’以外）、及び基部１０４はガス不透過性であり得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのガス透過性セクション５１８’は、マイクロ流体デバイス５００Ｃの成長室の上に配置される。別の実施形態では、少なくとも１つのガス透過性セクション５１８’は、マイクロ流体デバイス５００Ｃのフロー領域１３４の上に配置される。更に別の実施形態では、ガス透過性セクション５１８’は、少なくとも１つの成長室及び少なくとも１つのフロー領域１３４の両方の上に配置し得る。
更なる実施形態では、図５Ｄに示すように、ガス透過性管５０４’を使用して、マイクロ流体デバイス５００Ｄに培地を導入する前に流体培地を調整（例えば、平衡）し得る。ガス透過性管５０４’の長さは、非限定的な例では、空気中の５％二酸化炭素等のガス環境を含み得るエンクロージャ５１６内の効率的なガス交換及び平衡を行えるようにするのに十分な表面積を提供するように選択し得る。５１６の環境は、温度及び／又は湿度に関してガス透過性ポンプ接続コンジット５０４’内の培地を更に調整し得る。ガス透過性接続コンジットに使用することができるガス透過性材料の非限定的な一例は、Teflon（登録商標）ＡＦである。流体培地は、支持細胞集団に接触することにより、ポンプ構成要素５１４に導入する前に調整し得、その結果、マイクロ流体デバイス５００Ｄで培養中での細胞の成長及び／又は生存を最適化し得る分泌物質を含み得る。支持細胞集団を用いた事前調整は、室５１６内で行ってもよく、又は温度、湿度、ｐＨ、及び／又はガス環境のいずれかについてそれ自体の環境制御を有する別の培養構成要素内で実行され得る。この実施形態では、マイクロ流体デバイス５００Ｄのエンクロージャ１０２及び基部１０４は、ガス不透過性であり得る。
システムの培地調整及び導入構成要素であるリザーバの更に別の実施形態では、培地は、図５Ｅに示されるように、適切なガス環境下に置くことが可能なリザーバ５０２’において調整し得る。リザーバ５０２’は、マイクロ流体デバイス又はいかなる特定のタイプの培養構成要素である必要もない。リザーバ５０２’は、ガス環境源５２４からの接続フィード５２６を提供することにより、例えば、空気中の５％二酸化炭素等の適切なガス環境下に置かれる。リザーバ５０２’内の流体培地は、ソース５２４から提供されるガス環境とガスを交換し、それにより調整される。リザーバ５０２’内の流体培地は、支持細胞の培養を含み、マイクロ流体デバイス５００Ｅで培養中での細胞の成長及び／又は生存を最適化し得る分泌物質を提供することもできる。調整流体培地は、リザーバ５０２’から、ポンプ５１４の弁５２０に接続する輸送接続コンジット５２２を介して輸送し得、ポンプ５１４により接続コンジット５０４を介してマイクロ流体デバイス５００Ｅのチャネル１３４に注入し得る。マイクロ流体デバイス５００Ｅに注入された流体培地は流フロー２１２を形成する。フローチャネル１３４を横切った後、使われた流体培地２０２’は、搬出コンジット５０８を介してマイクロ流体デバイス５００Ｅを出る。この実施形態では、輸送接続コンジット５２２、接続コンジット５０４、弁５２０、ポンプ５１４、エンクロージャ１０２、及び基部１０４は全てガス不透過性であり得る。幾つかの実施形態では、ソース５２４をリザーバ５０２’に接続する接続コンジット５２６は実質的にガス不透過性であり得る。他の実施形態では、接続コンジット５２６は、実質的にガス不透過性である必要はなく、比較的ガス不透過性であり得る。
図５Ｅに示されるシステムの幾つかの実施形態では、ガス（図示せず）は、連続して流れてもよく、又はパルス化されてもよく、例えば、ソース５２４から定期的に繰り返し搬入されて交換されてもよく（図示せず）、空気中の５％二酸化炭素であり得る。他の実施形態では、ソース５２４から搬入されるガスは、１００％二酸化炭素であり得る。１００％二酸化炭素ガスが使用される場合、小量の二酸化炭素ガスをリザーバ５０２’のヘッドスペース（図示せず）に注入して、ヘッドスペースを５％二酸化炭素混合物に維持し得る。幾つかの実施形態では、ガスがリザーバ５０２’のヘッドスペースに注入される場合、リザーバ５０２’は、ファン（図示せず）を更に含み、注入ガスをヘッドスペース（図示せず）に既に存在する他のガス成分（図示せず）と混合させ得る。幾つかの実施形態では、ガスの搬入がパルス化される場合、マイクロ流体デバイス５００Ｅの蓋１０２は、蓋１０２に組み込まれるか、又は取り付けられる二酸化炭素センサ（図示せず）を有し得る。幾つかの実施形態では、１００％二酸化炭素ガスをソース５２４から搬入して、空気ガス混合物中の市販の５％二酸化炭素の使用と比較してコストを節減し得る。他の実施形態では、１００％二酸化炭素ガスをソース５２４に導入し、そこで空気と混合して５％二酸化炭素混合物を準備し得る。
任意の上記実施形態では、室５１６は、室のガス環境がマイクロ流体デバイス及び／又はリザーバ内の流体培地の浸透圧を変えないように更に加湿され得る。
別の実施形態では、適切なガス交換を成長室内で培養されている細胞に提供する代替の手法は、マイクロ流体デバイス（図示せず）のフロー領域を通してガスフローを提供し得る。適切なガス（例えば、５％二酸化炭素）は、フローチャネルを通して直接ポンピング又はパルス化し得る。成長室の分離領域は主に非掃引容積であるように設計されるため、内部に配置される細胞は、フローチャネル（掃引領域）を通って移動する空気又は気泡によって妨げられない。これは、フローチャネル内のガスと、成長室内部の流体培地との間での非常に高速のガス交換を提供し、その理由は、拡散距離が、例えば、５０ｍＬ円錐管内の拡散距離と比較して非常に小さいためである。次に、ガスは、任意の選択された時間量後、流体培地で置換し得る。ガスフローは、任意の所望の頻度で繰り返して溶解ガス成分を安定濃度に維持することができ、安定濃度に維持することは、流体培地のｐＨへの影響も有する。代替的に、最適未満のガス組成又は反復を使用して細胞の環境を摂動させ得る。
まとめると、調整培地を本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスの成長室内の細胞に提供するのに使用し得る様々な構成要素及び構成がある。任意のマイクロ流体デバイス１００、２００，２４０、２９０、又は４００は、図５Ａ〜図５Ｅの任意の実施形態と併用し得る。システム及びキットは、マイクロ流体デバイスの流入口及び／又は流出口に接続するように構成された接続コンジットを含み得る。接続コンジットは、リザーバ及び／又はポンプ構成要素に接続するように構成することもできる。
したがって、１つ又は複数の生体細胞を培養するマイクロ流体デバイスが提供され、マイクロ流体デバイスは、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、少なくとも１つの成長室とを含み、成長室は、マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含み、少なくとも１つの成長室は、分離領域及び接続領域を含み、分離領域は、接続領域に流体接続され、及び接続領域は、フロー領域への基端開口部を含む。様々な実施形態では、マイクロ流体の分離領域は、第２の流体培地を含むように構成され得る。フロー領域及び少なくとも１つの成長室に第１及び第２の流体培地がそれぞれ実質的に充填される場合、第２の流体培地の成分は、第１の流体培地に拡散し得、及び／又は第１の流体培地の成分は、第２の流体培地に拡散し得、及び第１の培地は、分離領域に実質的に流入しない。様々な実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、マイクロ流体デバイス内の１つ又は複数の生体細胞の可搬性を支持するように調整され得る。幾つかの実施形態では、調整された表面の部分は、マイクロ流体デバイス内の生体細胞の可搬性を支持するように構成され得る。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、カルボン酸部分、硫酸部分、核酸部分、又はホスホン酸部分を含むポリマーを含み得る。更に他の実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、サッカリド部分を含むポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、サッカリド部分を含むポリマーは、デキストランであり得る。幾つかの他の実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、アミノ酸部分を含むポリマーを含み得る。
代替的に、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を含み得る。哺乳類血清の成分は、培養培地へのサプリメントであり得る。幾つかの実施形態では、哺乳類の血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）であり得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、サッカリド部分を含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキレンエーテル部分を含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アミノ酸部分を含み得る。幾つかの他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキル又はペルフルオロアルキル部分を含み得る。幾つかの実施形態では、アルキル又はペルフルオロアルキル部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキル若しくはフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含むが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸若しくはポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸であり得る部分を含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、マイクロ流体デバイスの表面に共有結合された結合基を含み得、及び結合基は、マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、シロキシ結合基であり得る。他の実施形態では、結合基は、ホスホン酸塩結合基であり得る。幾つかの実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。幾つかの実施形態では、調整された表面の部分は、マイクロ流体デバイス内の生体細胞の可搬性を支持するように構成され得る。他の実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に直接結合され得る。他の実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分にリンカーを介して間接的に結合され得る。様々な実施形態では、リンカーは、トリアゾリレン部分を含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、双性イオンを含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、ホスホン酸部分又はカルボン酸部分を含み得る。更に他の実施形態では、調整された表面は、アニオンを含み得る。幾つかの他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アミノ部分又はグアニジン部分を含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、カチオンを含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を含み得る。少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、アクチンフィラメントの形成を妨げ、インテグリン受容体をブロックし、又はＤＮＡファウリング表面への細胞の結合を低減し得る。少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、サイトカラシンＢ、ＲＧＤ含有ペプチド、又はDNase1タンパク質であり得る。更に他の実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、２種類以上の細胞接着ブロック分子の組合せを含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、少なくとも約３０℃の温度に加熱されるように構成される。少なくとも１つの調整された表面は、少なくとも約３０℃の温度で安定するように構成され得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、フロー領域の少なくとも部分を構成するマイクロ流体チャネルを更に含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの成長室の接続領域は、マイクロ流体チャネルに直接開口し得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの成長室の分離領域は、約１００個の範囲の細胞への細胞増殖を支持するのに十分な寸法を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの成長室に１×１０２以下の生体細胞が維持され得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの成長室の容積は、約２×１０６立方μｍ以下であり得る。他の実施形態では、１×１０２以下の生体細胞が少なくとも１つの成長室に維持され得、少なくとも１つの成長室の容積は、約１×１０７立方μｍ以下であり得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、第１又は第２の流体培地をフロー領域に入れるように構成された少なくとも１つの流入口と、第１の培地がフロー領域から出る際、第１の培地を受け取るように構成された少なくとも１つの流出口とを更に含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、１つ若しくは複数の生体細胞を成長室内に導入するか、又は１つ若しくは複数の生体細胞を成長室から出すように構成された誘電泳動（ＤＥＰ）構成を有する基板を更に含み得る。ＤＥＰ構成は、光学的に作動され得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの成長室又はその分離領域の上に変形可能蓋領域を更に含み得、それにより、変形可能蓋領域を押すと、生体細胞を分離領域からフロー領域に搬出するのに十分な力が及ぼされる。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、蓋の少なくとも部分がガス透過性であり、それにより、マイクロ流体デバイスに配置される流体培地へのガス分子源を提供する蓋を含み得る。幾つかの実施形態では、蓋のガス透過性部分は、少なくとも１つの成長室の上に配置し得る。幾つかの実施形態では、蓋のガス透過性部分は、フロー領域の上に配置し得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの成長室又はその分離領域の上に変形可能蓋領域を更に含み得、それにより、変形可能蓋領域を押すと、生体細胞を分離領域からフロー領域に搬出するのに十分な力が及ぼされる。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、調整された表面は、開裂可能部分を含み得る。開裂可能部分は、調整された表面の分裂を可能にし、それにより、培養後に１つ又は複数の生体細胞の可搬性を促進するように構成され得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、少なくとも１つの成長室は、複数の成長室を含み得る。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、複数の生体細胞を含み得る。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、１つ又は複数の哺乳類細胞を含み得る。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、１つ又は複数のハイブリドーマ細胞を含み得る。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、１つ又は複数のリンパ球又は白血球細胞を含み得る。他の実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、又はそれらの組合せを含み得る。様々な実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、１つ又は複数の接着細胞を含み得る。幾つかの実施形態では、成長室内の１つ又は複数の生体細胞は、単一の細胞であり得、及びコロニーは、生体細胞のクローンコロニーであり得る。
ｐＨセンサ
システムは、図６に示されるように、マイクロ流体デバイス６００の少なくとも１つの流入口１２４及び／又は少なくとも１つの流出口１２４’に接続される少なくとも１つのセンサを更に含み得る。デバイス６００は、代替的に、デバイス１００、２００、２４０、２９０、４００、又は５００Ａ〜Ｅの任意の１つであり得る。センサは、第１の流体培地がマイクロ流体デバイス６００に入る際、第１の流体培地のｐＨを検出するように構成され得る。代替的に、センサは、第１の流体培地がマイクロ流体デバイス６００から出る際、第１の流体培地のｐＨを検出するように構成され得る。センサは、マイクロ流体デバイスに組み込まれてもよく、又はマイクロ流体デバイスの流入口１２４及び／又は流出口１２４’に取り付け可能であるか、若しくはこれらと一列に並んだ別個の構成要素であり得る。
幾つかの実施形態では、ｐＨセンサは、光学センサである。光学センサは、電極ベースの卓上装置よりも有利であり得、その理由は、電極ベースの装置が嵩張るプローブを含み得、小量（マイクロリットル）の流体のｐＨの測定を難しくするか、又は不可能にするためである。同様に、インラインフロースルー解決策は、微小電極の性質に起因して非常に長い整定時間（５分〜１５分）を必要とし得、各使用前に長い校正手順を必要とし得る。更に、電極は短時間で劣化し得、したがって、より多くのメンテナンスを必要とする。
光学センサは、照明のためのＬＥＤと、可視色検出のための一体型比色計センサとを含む一体型電極レスデバイスであり得る。比色計センサは、色に対する感度が高いフォトトランジスタであり得る。比色計センサは、可視光波長領域、例えば、約３９０ｎｍ〜約７００ｎｍにおいて検出し得る。フェノールレッド等であるが、これに限定されないｐＨ依存染料で染色された培地は、瞬時に無接触で光学信号を提供することができる。そのような光学センサを使用した測定の光学電極レス方法は、培地に接触する必要もなければ、ユーザ側での較正の必要もない。光学測定は、温度依存性を除去するように較正することができる。更に、光学センサの使用は、センサのファウリングリスクを最小に抑え、したがって、メンテナンス又は交換を低減する。光源（ＬＥＤ）及びカラーセンサの小型化も、光学センサを非常に小量の液体（＜１μＬ）のテスト及びポータブル又はハンドヘルド機器への統合に適するものにする。システムは、ＬＥＤ及びフォトトランジスタセンサの制御／監視機器１８０による駆動電子回路を含み得、ｐＨの検出により、ｐＨが所望の範囲外であると判断される場合、制御モジュール１７２によりアラームコンポーネントを更に提供し得る。更に、色検出の整定時間は短い（１秒未満）であるため、このセンサをフィードバックループに挿入して、培地周囲のガス環境の二酸化炭素含有量の変調を介して培地のｐＨを調整することが可能であり得る。代替的に、制御モジュール１７２又は制御／管理機器１８０は、緩衝剤及び／又は酸性又は塩基性培地成分の追加により、入ってくる流体培地のｐＨを変調してｐＨを所望の範囲に補正する構成要素を更に提供し得る。
幾つかの実施形態では、センサ６１０は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流入口１２４の近くで流体培地流入管６０６に接続される。管６０６は、透明、略透明、又は半透明であり得る。ＬＥＤ６１４は、管６０６及び管６０６内の染色された流体培地２０２ａ’を照明する。一体型比色計センサ６１２は、入ってくる流体培地のｐＨを監視し、ｐＨが特定の培養実験に所望の範囲内の値を有することを確かめ、ｐＨが所望の範囲外である場合に警告し得る。
幾つかの実施形態では、センサ６１０’は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流出口１２４’の近くで流体培地流出管６０８に接続される。管６０８は、透明、略透明、又は半透明であり得る。ＬＥＤ６１４’は、管６０８及び管６０６内の染色された流出流体培地２０２ａ’’を照明する。一体型比色計センサ６１２’は、入ってくる流体培地のｐＨを監視し、ｐＨが特定の培養実験に所望の範囲内の値を有することを確かめ、ｐＨが所望の範囲外である場合に警告し得る。
細胞
本発明のシステム及び方法で使用可能な細胞は、任意のタイプの細胞であり得る。例えば、細胞は、胚、卵母細胞、又は精子、幹細胞、前駆細胞、又は組織から解離された細胞、血液細胞、ハイブリドーマ、培養された細胞、細胞株からの細胞、がん細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞及び／又は形質転換細胞（株（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含むが、これに限定されない）、レポーター細胞等であり得る。細胞は、哺乳類細胞であってもよく、又は非哺乳類細胞であってもよい。細胞は、バクテリア、菌類、原生動物、又は寄生種（例えば、リーシュマニア又は熱帯熱マラリア原虫）に感染した哺乳類細胞であり得る。幾つかの実施形態では、哺乳類細胞はヒト、マウス、ブタ、又は関心のある任意の他の哺乳類であり得る。
幾つかの実施形態では、細胞は、培養で能動的に成長中の細胞の集団からのものであってもよく、又は新鮮な組織試料（例えば、生検又は微細針吸引等の固形組織試料の解離による）、血液、唾液、尿、若しくは他の体液から得られてもよい。代替的に、１つ又は複数の生体細胞は、前に凍結された他の試料の培養からのものであり得る。
幾つかの実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は１つ又は複数のハイブリドーマ細胞を含み得る。他の実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は、１つ又は複数のリンパ球又は白血球細胞を含み得る。幾つかの実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、若しくは他の免疫細胞タイプ、又は前駆細胞若しくは造血幹細胞等のその前駆体である。
様々な実施形態では、１つ又は複数の生体細胞は１つ又は複数の接着細胞である。１つ又は複数の接着細胞がマイクロ流体デバイスに導入される場合、追加の調整処理を提供して、生存継続及び／又は細胞増殖を可能にする適切な可溶性又は非可溶性環境因子（例えば、１つ又は複数の細胞外基質成分）を接着細胞に提供し得る。
実験の特定の目標に応じて、１つのみの細胞又は複数の細胞をマイクロ流体デバイスに導入して培養及び／又はクローン化し得る。１つのみの細胞がシステムの成長室に導入され、本明細書に記載の方法に従って培養される場合、その結果として増殖した集団は、成長室に元々導入された細胞のクローンコロニーである。
方法
少なくとも１つの成長室と、フロー領域とを有するマイクロ流体デバイスを含むシステムで少なくとも１つの生体細胞を培養する方法が提供される。フロー領域も有するマイクロ流体デバイスの成長室内での細胞（又は複数の細胞）の培養は、栄養素、成長因子、又は他の細胞シグナリング種を選択された時間期間で特異的に導入して、細胞の成長パラメータ、生存パラメータ、又は可搬性パラメータの制御を達成し得るようにすることができる。少なくとも１つの生体細胞が、少なくとも１つの調整された表面を有する少なくとも１つの成長室に導入され、調整された表面は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する。幾つかの実施形態では、調整された表面は、マイクロ流体デバイス内での細胞可搬性を支持する。幾つかの実施形態では、可搬性は、マイクロ流体デバイスへの細胞の付着を阻止することを含む。他の実施形態では、可搬性は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する調整された表面を接着細胞に提供し、それと同時に、マイクロ流体デバイス内の培養期間後、細胞を移動できるようにすることを含む。少なくとも１つの調整された表面は、本明細書に記載される任意の調整された表面であり得る。少なくとも１つの生体細胞の導入は、本明細書に記載のように、幾つかの異なる原動力を使用して達成し得、原動力の幾つかは、特定の生体細胞をマイクロ流体デバイス上の特定の場所、例えば、予め選択された成長室内に配置するに当たり精密な制御を可能し得る。本明細書に記載の方法により可能になる細胞の配置／取り出し及び栄養素／シグナリング／環境刺激の精密な制御は、マクロスケールの培養又は他のマイクロ流体培養方法を用いて達成することが困難又は不可能である。
配置後、少なくとも１つの生体細胞は、少なくとも、少なくとも１つの生体細胞を増殖させて生体細胞のコロニーを生成するのに十分に長い時間期間にわたり培養される。生体細胞が別個の成長室に導入されると、その結果として増殖したコロニーは、生体細胞の別個の群として更に使用するために精密に識別することができる。１つのみの生体細胞が成長室に導入され、増殖される場合、その結果として生成されたコロニーは、生体細胞のクローン集団である。上述した細胞を含むが、これらに限定されない任意の適切な細胞を方法に使用し得る。
マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、３００、４００、５００Ａ〜Ｅ、又は６００であり得、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の構成要素を有するシステムの一部であり得る。少なくとも１つの成長室は、複数の成長室を含み得、本明細書で考察される、任意の適切な数の成長室が使用可能である。方法の幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、約５００〜約１５００個の成長室、約１０００〜約２０００個の成長室、約１０００〜約３５００個の成長室、約２０００〜約５０００個の成長室、約３０００〜約７０００個の成長室、約５０００〜約１００００個の成長室、約７５００〜約１５０００個の成長室、約１００００〜約１７５００個の成長室、又は約１２５００〜約２００００個の成長室を有し得る。
１つ又は複数の生体細胞を培養する方法では、少なくとも１つの調整された表面は、本明細書に記載されるような任意の調整された表面であり得る。調整された表面は、マイクロ流体デバイスに共有結合され得る。幾つかの実施形態では、調整された表面は、表面に共有結合された結合基を含み得、及び結合基は、マイクロ流体デバイス内での１つ又は複数の生体細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合され得る。幾つかの実施形態では、調整された表面を有するマイクロ流体デバイスは、１つ又は複数の生体細胞の搬入前に提供され得る。
少なくとも１つの生体細胞の導入
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの生体細胞を少なくとも１つの成長室に導入することは、少なくとも１つの生体細胞を移動させるのに十分な強度を有する誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用することを含み得る。ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）等の電子ピンセットを使用して生成され得る。幾つかの他の実施形態では、１つ又は複数の生体細胞を少なくとも１つの成長室に導入することは、流体フロー及び／又は重力を使用すること（例えば、細胞が細胞の下に配置される成長室内に落ちるようにマイクロ流体デバイスを傾けることによりを含み得る。
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの生体細胞は、マイクロ流体デバイスのフロー領域（例えば、フローチャネル）への流入口１２４を通してマイクロ流体デバイスに導入される。フローチャネル内の培地のフローは、細胞を成長室の開口部に近い位置に運ぶことができる。成長室の開口部に近い位置となった後、生体細胞は、次に、誘電泳動又は重力を含め、本明細書に記載される任意の原動力を使用して成長室内に移動し得る。誘電泳動力は、電気的に作動される力又は光学的に作動される力を含むことができ、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）により更に提供され得る。少なくとも１つの生体細胞は、フローチャネルを通って少なくとも１つの成長室の接続領域の基端開口部に移動し得、接続領域はフローチャネル／領域に直接開口し、フローチャネル／領域に流体接続される。少なくとも１つの成長室の接続領域は、少なくとも１つの成長室の分離領域にも流体接続される。少なくとも１つの生体細胞は、接続領域を通って少なくとも１つの成長室の分離領域内に更に移動し得る。少なくとも１つの成長室の分離領域は、細胞増殖を支持するのに十分な寸法を有し得る。しかし、通常、成長室の寸法は、そのような増殖を培養での約１×１０３個以下、約５×１０２個以下、約４×１０２個以下、約３×１０２個以下、約２×１０２個以下、約１×１０２個以下、約５０個以下、約２５個以下、約１５個以下、又はわずか１０個以下に制限する。幾つかの実施形態では、分離領域は、培養での約１×１０２個以下、約５０個以下、約２５個以下、約１５個以下、又は約１０個以下の細胞への細胞増殖を支持するのに十分な寸法を有し得る。驚くべきことに、約１×１０２個の細胞までの細胞培養及び／又は増殖が、約１．０×１０７立法μｍ以下、約６×１０６立法μｍ以下、約２×１０６立法μｍ以下、約１．５×１０６立法μｍ以下、又は約１．０×１０６立法μｍ以下の容積を有する分離領域で良好に実行され得ることが分かっている。幾つかの他の実施形態では、約１×１０２個の細胞までの細胞培養及び／又は増殖は、約４×１０５立法μｍ以下の容積を有する分離領域で良好に実行され得る。細胞のタイプに応じて、生体細胞のサイズは、直径約１μｍ及び容積約１立法μｍ３を有するバクテリアから、直径約７〜８μｍ及び容積約１００立法μｍを有する赤血球細胞等の小さいヒトの細胞、直径約４０μｍ（非融合性）及び容積約２０００立法μｍを有するＨｅＬａ等の免疫細胞株、直径約２５μｍから最大で約６０μｍ及び容積約４７００立法μｍ〜約１００，０００立法μｍを有する巨核球、又は直径約１２０μｍ及び容積約９００，０００立法μｍを有するヒトの卵母細胞まで大きく異なり得る。したがって、容積約４×１０５立法μｍを有する成長室では、大きい種類（容積約１×１０５立方μｍ）の巨核球細胞はごく少数の増殖、例えば、合計で５個未満までの細胞の増殖を可能にする。代替的に、同じ小さい成長室（容積約４×１０５立法μｍ）で、バクテリア細胞（容積約１立法μｍ）を最高で約４００，０００個のバクテリア細胞まで増殖させることができる。
方法は、マイクロ流体デバイスのフロー領域のマイクロ流体チャネルに第１の流体培地を導入することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、第１の流体培地の導入は、少なくとも１つの生体細胞を導入する前に実行される。少なくとも１つの生体細胞を導入する前に第１の流体培地が導入される場合、流量は、第１の流体培地が、例えば、任意の適する流量でマイクロ流体デバイスのフローチャネルから成長室内に流されるように選択し得る。代替的に、マイクロ流体デバイスが過度の１つ又は複数の調整試剤を含む培地でプライミングされている場合、第１の流体培地は、第１の流体培地がフロー領域内の過度の調整試剤を含む任意の残っている培地に置き換わるような流量でマイクロ流体チャネルに流される。
第１の流体培地のフローが少なくとも１つの生体細胞の成長室への導入後に導入される場合、第１の流体培地の流量は、分離領域を掃引しないように選択し得、少なくとも１つの生体細胞を分離領域から変位させない。少なくとも１つの成長室の分離領域において少なくとも１つの生体細胞を囲む流体培地は、第２の流体培地であり、第２の流体培地は第１の流体培地と同じであってもよく、又は異なってもよい。幾つかの実施形態では、第２の流体培地は、第１の流体培地と同じであり得るが、培養するステップ中、細胞老廃物及び消費された培地成分は、第２の流体培地を第１の流体培地と異なるものにし得る。
細胞の培養
本明細書に記載される方法では、少なくとも１つの生体細胞は、少なくとも、細胞を増殖させて生体細胞のコロニーを生成するのに十分な時間期間にわたり培養される。その時間期間は、約１日〜約１０日であるように選択し得る。他の実施形態では、培養期間は、１０日を超えて拡張し得、任意の所望の期間にわたり続け得る。成長室の分離領域内の細胞には、流体培地のかん流により栄養素が提供されると共に、老廃物が除去されるため、細胞は無制限に成長し得る。分離領域が増殖した細胞集団で充たされると、いかなる追加の増殖も、成長室の掃引領域である成長室の接続領域に存在する生体細胞の増殖につながる。かん流された培地は、増殖した生体細胞を成長室の接続領域から、続けてマイクロ流体デバイスから出るように掃引し得る。したがって、成長室の分離領域に存在する細胞数は、生体細胞のサイズ及び成長室の分離領域のサイズに依存する最大数で安定化し得る。分離された細胞集団中の細胞の最大数を安定化させる能力は、面倒な細胞集団分割をなくすことができるため、細胞培養に関して現在利用可能な他の方法よりも有利である。
幾つかの実施形態では、培養することは、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、又はそれを超えて実行され得る。培養期間は、約１日〜約６日、約１日〜約５日、約１日〜約４日、約１日〜約３日、又は約１日〜約２日の範囲であり得る。他の実施形態では、培養することは、約５日未満、約４日未満、約３日未満、又は約２日未満にわたり実行され得る。幾つかの実施形態では、培養することは、約３日未満又は約２日未満にわたり実行され得る。他の実施形態では、培養することは、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、又は約２３時間にわたり実行され得る。
培養ステップ中、培養ステップ全体を通して１つ又は複数の時点で、少なくとも１つの成長室及び成長室内に含まれる任意の細胞の画像を監視し得る。画像は、システムの処理構成要素のメモリに記憶し得る。
細胞のかん流
培養するステップ中、成長室の分離領域内に存在する第２の流体培地は、栄養素、成長因子、又は他の成長刺激が枯渇するようになり得る。第２の流体培地は、細胞老廃物を蓄積し得る。更に、少なくとも１つの生体細胞が培養期間中に成長を続けるにつれて、栄養素、成長因子、又は他の成長刺激を培養開始時の第１又は第２の培地のものと異なるように変更することが望ましいことがある。本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスの成長室内での培養は、少なくとも１つの生体細胞を導入し、少なくとも１つの生体細胞による検知される化学勾配を変更する特定の選択的能力を提供し得、これにより、生体内状況をはるかに密に近似し得る。代替的に、少なくとも１つの生体細胞による検知される化学勾配を意図的に非最適化された組の状況に変更することにより、疾患又は治療経路を探索するように設計された状況下で細胞を増殖できるようにし得る。したがって、方法は、培養するステップ中に第１の流体培地をかん流させることを含み得、第１の流体培地は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流入口１２４を介して導入され、第１の流体培地は、任意選択的に第２の流体培地からの成分を含み、マイクロ流体培地の少なくとも１つの流出口を介して搬出される。
新鮮な栄養素、可溶性成長因子等を提供する第１の流体培地の成分の交換及び／又は分離領域内の細胞を囲む培地の老廃物成分の交換は、実質的に拡散状況下で成長室の掃引領域と非掃引領域との界面で行われる。驚くべきことに、有効な交換は、実質的にフローがない状況下で生じることが分かっている。したがって、驚くべきことに、培養の成功に常時かん流が必要ないことが分かっている。その結果、かん流は非連続的であり得る。幾つかの実施形態では、かん流は定期的であり、幾つかの実施形態では、かん流は不規則的である。かん流期間の中断は、分離領域内の第２の流体培地の成分をフローチャネル／領域内の第１の流体培地に、及び／又は第１の流体培地の成分を第２の流体培地に、全て第１の培地の分離領域への実質的な流入なしで、拡散させるのに十分な持続時間のものであり得る。
別の実施形態では、低かん流率を利用して、成長室の非掃引領域の内外の流体培地の成分の効率的な交換を得ることもできる。
したがって、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの成長室内で少なくとも１つの生体細胞をかん流する一方法を図７に示し、この方法は、第１の流体培地が、マイクロ流体デバイスのフロー領域を通して、第１のかん流時間Ｄ１にわたり第１のかん流率Ｒ１で、成長室に流体接続されたフロー領域に流入する、かん流ステップ７００２を含む。Ｒ１は、本明細書に記載のように、非掃引流量であるものとして選択し得る。方法７００は、第１のかん流停止時間Ｓ１にわたり、流体培地のフローを停止するステップ７００４を更に含む。ステップ７００２及び７００４は、Ｗ回にわたって繰り返され、ここで、Ｗは１〜約１０００で選択される整数であり得、Ｗ回繰り返されると、かん流プロセス７００は完了する。幾つかの実施形態では、Ｗは２〜約１０００の整数であり得る。
マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの成長室内で少なくとも１つの生体細胞をかん流させる別の方法８００を図８に示し、この方法は、マイクロ流体デバイスのフロー領域を通して、第１のかん流時間Ｄ１にわたり第１のかん流率Ｒ１で、成長室に流体接続されたフロー領域に流体培地を流入させるステップ８００２を含む第１のかん流サイクルを含む。Ｒ１は、本明細書に記載のように、非掃引流量であるものとして選択し得る。第１のかん流サイクルは、第１のかん流停止時間Ｓ１にわたり、流体培地のフローを停止するステップ８００４を含む。第１のかん流サイクルはＷ回繰り返し得、ここで、Ｗは１〜約１０００で選択される整数であり得る。第１のかん流サイクルのＷ回目の繰り返しが完了した後、方法８００は、第２のかん流サイクルを更に含み、第２のかん流サイクルは、第２のかん流時間Ｄ２にわたり第２のかん流率Ｒ２で第１の流体培地を流すステップ８００６を含み、ここで、Ｒ２は非掃引流量であるものとして選択される。方法８００に第２のかん流サイクルは、第２のかん流停止時間Ｓ２にわたり流体培地のフローを停止するステップ８００８を更に含む。その後、方法は、第１のかん流サイクルのステップ８００２及び８００４に戻り、組み合わせられた２つのサイクルかん流プロセスはＶ回繰り返され、ここで、Ｖは１〜約５０００の整数である。Ｗ及びＶの組合せは、所望の培養期間終点を満たすように選び得る。
方法７００又は８００の様々な実施形態では、かん流率Ｒ１は、フローコントローラ構成の上述したような流体培地の任意の非掃引流量であり得る。幾つかの実施形態では、Ｒ１は、約０．００９μＬ／秒、約０．０１０μＬ／秒、約０．０２０μＬ／秒、約０．０３０μＬ／秒、約０．０４０μＬ／秒、約０．０５μＬ／秒、約０．０６μＬ／秒、約０．０７μＬ／秒、約０．０８μＬ／秒、約０．０９μＬ／秒、約０．１０μＬ／秒、約０．１１μＬ／秒、約０．１２μＬ／秒、約０．１３μＬ／秒、約０．１４μＬ／秒、約０．１５μＬ／秒、約０．１６μＬ／秒、約０．１７μＬ／秒、約０．１８μＬ／秒、約０．１９μＬ／秒、約０．２０μＬ／秒、約０．３０μＬ／秒、約０．４０μＬ／秒、約０．５０μＬ／秒、約０．６０μＬ／秒、約０．７０μＬ／秒、約０．８０μＬ／秒、約０．９０μＬ／秒、約１．００μＬ／秒、約１．１０μＬ／秒、約１．２０μＬ／秒、約１．３０μＬ／秒、約１．４０μＬ／秒、約１．５０μＬ／秒、約１．６０μＬ／秒、約１．７０μＬ／秒、約１．８０μＬ／秒、約１．９０μＬ／秒、約２．００μＬ／秒、２．１０μＬ／秒、約２．２０μＬ／秒、約２．４０μＬ／秒、約２．５０μＬ／秒、約２．６０μＬ／秒、約２．７０μＬ／秒、約２．８０μＬ／秒、約２．９０μＬ／秒、又は約３．００μＬ／秒であり得る。
方法８００の様々な実施形態では、第２のかん流率Ｒ２は、フローコントローラ構成の上述したような流体培地の任意の非掃引流量であり得る。幾つかの実施形態では、Ｒ２は、０．００９μＬ／秒、０．０１０μＬ／秒、０．０２０μＬ／秒、０．０３０μＬ／秒、０．０４０μＬ／秒、０．０５μＬ／秒、０．０６μＬ／秒、０．０７μＬ／秒、０．０８μＬ／秒、０．０９μＬ／秒、０．１０μＬ／秒、０．１１μＬ／秒、０．１２μＬ／秒、０．１３μＬ／秒、０．１４μＬ／秒、０．１５μＬ／秒、０．１６μＬ／秒、０．１７μＬ／秒、０．１８μＬ／秒、０．１９μＬ／秒、０．２０μＬ／秒、０．３０μＬ／秒、０．４０μＬ／秒、０．５０μＬ／秒、０．６０μＬ／秒、０．７０μＬ／秒、０．８０μＬ／秒、０．９０μＬ／秒、１．００μＬ／秒、１．１０μＬ／秒、１．２０μＬ／秒、１．３０μＬ／秒、１．４０μＬ／秒、１．５０μＬ／秒、１．６０μＬ／秒、１．７０μＬ／秒、１．８０μＬ／秒、１．９０μＬ／秒、２．００μＬ／秒、２．１０μＬ／秒、２．２０μＬ／秒、２．４０μＬ／秒、２．５０μＬ／秒、２．６０μＬ／秒、２．７０μＬ／秒、２．８０μＬ／秒、２．９０μＬ／秒、又は３．００μＬ／秒であり得る。流量Ｒ１及び／又はＲ２は、任意の組合せで選び得る。通常、かん流率Ｒ２はかん流率Ｒ１よりも大きい値であり得、Ｒ１の５×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×、又はそれを上回ることができる。幾つかの実施形態では、Ｒ２はＲ１よりも少なくとも１０倍高速である。他の実施形態では、Ｒ２はＲ１よりも少なくとも２０倍高速である。更に別の実施形態では、Ｒ２はＲ１の率の少なくとも１００×である。
方法７００又は８００の様々な実施形態では、第１のかん流時間Ｄ１は、フローコントローラ構成の上述したような任意の適するかん流持続時間であり得る。様々な実施形態では、Ｄ１は、約５秒、約１０秒、約１５秒、約２０秒、約２５秒、約３０秒、約３５秒、約４０秒、約４５秒、約５０秒、約５５秒、約６０秒、約６５秒、約７０秒、約８０秒、約９０秒、約１００秒、約１１０秒、約１２０秒、約１３０秒、約１４０秒、約１５０秒、約１６０秒、約１７０秒、又は約１８０秒であり得る。他の実施形態では、Ｄ１は、上述したように、時間範囲、例えば、約１０秒〜約４０秒であり得る。幾つかの実施形態では、Ｄ１は約３０秒〜約７５秒であり得る。他の実施形態では、Ｄ１は約１００秒であり得る。他の実施形態では、Ｄ１は約６０秒〜約１５０秒の範囲内であり得る。更に他の実施形態では、Ｄ１は、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約８０分、約９０分、約１１０分、約１２０分、約１４０分、約１６０分、約１８０分、約２００分、約２２０分、約２４０分、約２５０分、約２６０分、約２７０分、約２９０分、又は約３００分であり得る。幾つかの実施形態では、Ｄ１は約４０分〜約１８０分である。
方法７００又は８００の様々な実施形態では、第２のかん流時間Ｄ２は、フローコントローラ構成の上述したような任意の適するかん流持続時間であり得る。様々な実施形態では、Ｄ２は、約５秒、約１０秒、約１５秒、約２０秒、約２５秒、約３０秒、約３５秒、約４０秒、約４５秒、約５０秒、約５５秒、約６０秒、約６５秒、約７０秒、約８０秒、約９０秒、又は約１００秒であり得る。他の実施形態では、Ｄ２は、上述したように、時間範囲、例えば、約５秒〜約２０秒であり得る。他の実施形態では、Ｄ２は約３０秒〜約７０秒であり得る。他の実施形態では、Ｄ２は約６０秒であり得る。
方法７００又は８００の様々な実施形態では、第１のかん流時間Ｄ１は第２のかん流時間Ｄ２と同じであってもよく、又は異なってもよい。Ｄ１及びＤ２は任意の組合せで選び得る。幾つかの実施形態では、かん流の持続時間Ｄ１及び／又はＤ２は、停止期間Ｓ１及び／又はＳ２よりも短いように選択し得る。
方法７００又は８００の様々な実施形態では、第１のかん流停止時間Ｓ１は、フローコントローラ構成のかん流期間の時間間隔について上述したように、任意の適する時間期間であるように選択し得る。幾つかの実施形態では、Ｓ１は、約０分、５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約６０分、約６５分、約８０分、約９０分、約１００分、約１２０分、約１５０分、約１８０分、約２１０分、約２４０分、約２７０分、又は約３００分であり得る。様々な実施形態では、Ｓ１は、かん流のフローコントローラ構成間隔について上述したように、任意の適する時間範囲、例えば、約２０分〜約６０分であり得る。幾つかの実施形態では、Ｓ１は約１０分〜約３０分であり得る。他の実施形態では、Ｓ１は約１５分であり得る。更に他の実施形態では、Ｓ１は約０秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒、７０秒、８０秒、又は９０秒であり得る。幾つかの実施形態では、Ｓ１は約０秒である。
方法７００又は８００の様々な実施形態では、第２のかん流停止時間Ｓ２は、フローコントローラ構成のかん流期間の時間間隔について上述したように、任意の適する時間期間であるように選択し得る。幾つかの実施形態では、Ｓ２は、約０分、５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約２０分、約３０分、約４５分、約５０分、約６０約９０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約２７０分、又は約３００分であり得る。様々な実施形態では、Ｓ２は、かん流のフローコントローラ構成間隔について上述したように、任意の適する時間範囲、例えば、約１５分〜約４５分であり得る。幾つかの実施形態では、Ｓ２は約１０分〜約３０分であり得る。他の実施形態では、Ｓ２は約８分又は約９分であり得る。他の実施形態では、Ｓ２は約０分である。
方法７００又は８００の様々な実施形態では、第１のかん流停止時間Ｓ１及び第２のかん流停止時間Ｓ２は、任意の適する値から独立して選択し得る。Ｓ１はＳ２と同じであってもよく、又は異なってもよい。
方法８００又は９００の様々な実施形態では、反復回数Ｗは、反復回数Ｖと同じ又は異なるように選択し得る。
方法７００又は８００の様々な実施形態では、Ｗは、約１、約４、約５、約６、約８、約１０、約１２、約１５、約１８、約２０、約２４、約３０、約３６、約４０、約４５、又は約５０であり得る。幾つかの実施形態では、Ｗは、約１〜約２０であるように選択し得る。幾つかの実施形態では、Ｗは１であり得る。
方法８００の様々な実施形態では、Ｖは、約５、約１０、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６０、約８０、約１００、約１２０、約２４０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約６００、約７５０、約９００、又は約１０００であり得る。幾つかの実施形態では、Ｖは約１０〜約１２０であるように選択し得る。他の実施形態では、Ｖは約５〜約２４であり得る。幾つかの実施形態では、Ｖは約３０〜約５０又は約４００〜約５００であり得る。
方法８００の様々な実施形態では、反復回数Ｗは、反復回数Ｖと同じ又は異なるように選択し得る。
方法７００又は８００の様々な実施形態では、第１のかん流ステップ（ステップ７００２／７００４又は８００２／８００４で表される）の合計時間は約１時間〜約１０時間であり、Ｗは整数１である。様々な実施形態では、第１のかん流ステップの合計時間は約９分〜約１５分である。
方法８００の様々な実施形態では、かん流サイクルの第２のステップ（８００６／８００８で表される）の合計時間は、約１分〜約１５分又は約１分〜約２０分である。
方法７００又は８００のいずれかでは、かん流方法は、生体細胞の培養期間全体にわたり、例えば、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、又はそれを超えて継続し得る。
図８の方法８００の別の非限定的な実施形態では、コントローラは、かん流ステップ８００２中、より長いかん流期間Ｄ１を有するフロー領域で流体培地をかん流させるように構成され得る。コントローラは、約４５分、約６０分、約７５分、約９０分、約１０５分、約１２０分、約２．２５時間、約２．５時間、約２．４５時間、約３．０時間、約３．２５時間、約３．５時間、約３．７５時間、約４．０時間、約４．２５時間、約４．５時間、約４．７５時間、約５時間、又は約６時間の期間にわたり、第１の率で流体培地をかん流させ得る。第１のかん流期間Ｄ１が終了すると、流体培地のフローは、停止時間期間Ｓ１にわたり停止し得、停止期間Ｓ１は、約０秒、１５秒、３０秒、約４５秒、約１分、約１．２５分、約１．５分、約２．０分、約３．０分、約４分、約５分、又は約６分であり得る。幾つかの実施形態では、第１の流量Ｒ１は、約０．００９μＬ／秒、約０．０１μＬ／秒、約０．０２μＬ／秒、約０．０３μＬ／秒、約０．０５μＬ／秒、約０．１μＬ／秒、約０．２μＬ／秒、約０．３μＬ／秒、約０．４μＬ／秒、又は約０．５μＬ／秒であるように選択し得る。流体培地のフローは、約１分未満のかん流停止期間Ｓ１にわたり停止し得るか、又はＳ１は０秒であり得る。代替的に、Ｓ１は約３０秒、約１．５分、約２．０分、約２．５分、又は約３分であり得る。第２のかん流期間Ｄ２は、異なるかん流率を使用して続き得る。幾つかの実施形態では、第２のかん流率は第１のかん流率よりも高い値であり得る。幾つかの実施形態では、第２のかん流率Ｒ２は、約１．０μＬ／秒、約１．１μＬ／秒、約１．２μＬ／秒、約１．３μＬ／秒、約１．４μＬ／秒、約１．５μＬ／秒、約１．７μＬ／秒、約１．９μＬ／秒、約２．０μＬ／秒、約２．２μＬ／秒、約２．４μＬ／秒、約２．６μＬ／秒、約２．８μＬ／秒、約３．０μＬ／秒、約３．２μＬ／秒、約３．４μＬ／秒、約３．６μＬ／秒、約３．８μＬ／秒、約４．０μＬ／秒、約４．２μＬ／秒、約４．４μＬ／秒、約４．６μＬ／秒、約４．８μＬ／秒、約５．０μＬ／秒、約６．０μＬ／秒、約７．０μＬ／秒、約８．０μＬ／秒、又は約９．０μＬ／秒から選択し得る。第２のかん流期間Ｄ２は、約１秒、約２秒、約３秒、約４秒、約５秒、約６秒、約１０秒、約１５秒、約３０秒、約４５秒、約６０秒、約６５秒、約７５秒、約８０秒、又は約９０秒であり得る。次に、かん流は、第２のかん流停止期間Ｓ２にわたり停止し得、第２のかん流停止期間Ｓ２は、約０秒、１０秒、約２０秒、約３０秒、約４０秒、約５０秒、約６０秒、約１．５分、約１．７５分、約２．０分、約２．５分、約２．７５分、約３．０分、又は約４．０分であり得る。幾つかの実施形態では、Ｄ１は、約２時間、約３時間、又は約４時間であり得る。様々な実施形態では、Ｄ１は約４時間であり得る。様々な実施形態では、Ｓ１は０秒又は約１分未満であり得る。第２のかん流期間Ｄ２は約１秒〜約６秒であり得る。幾つかの実施形態では、第２のかん流停止期間Ｓ２は約４０秒〜約１．５分であり得る。
したがって、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの成長室内で少なくとも１つの生体細胞をかん流させる方法が提供され、この方法は、第１のかん流ステップを使用して少なくとも１つの生体細胞をかん流させるステップを含み、このステップは、マイクロ流体デバイスのフロー領域を通して、第１のかん流期間Ｄ１にわたり第１のかん流率Ｒ１で第１の流体培地を流すことであって、Ｒ１は非掃引流量であるように選択される、流すことと、第１のかん流停止時間Ｓ１にわたり第１の流体培地のフローを停止させることと、第１のかん流をＷ回繰り返すことであって、Ｗは１〜１０００から選択される整数である、繰り返すこととを含む。方法は、第２のかん流ステップを使用して少なくとも１つの生体細胞をかん流させるステップを更に含み、このステップは、第２のかん流時間Ｄ２にわたり第２のかん流率Ｒ２で第１の流体培地を流すことであって、Ｒ２は非掃引流量であるように選択される、流すことと、第２のかん流停止時間Ｓ２にわたり第１の流体培地のフローを停止させることと、第１のかん流ステップを実行し、次に第２のかん流ステップを実行することをＶ回繰り返すことであって、Ｖは１〜１０００の整数である、繰り返すこととを含む。
第２のかん流率Ｒ２は、第１のかん流率Ｒ１よりも大きい値であり得る。第１のかん流時間Ｄ１は、第２のかん流時間Ｄ２と同じであってもよく、又は異なってもよい。第１のかん流停止時間Ｓ１は、第２のかん流停止時間Ｓ２と同じであってもよく、又は異なってもよい。反復回数Ｗは、第２のかん流ステップが実行される場合、反復回数Ｖと同じであってもよく、又は異なってもよい。Ｒ２は、Ｒ１の少なくとも１０倍高速であり得る。代替的に、Ｒ２は、Ｒ１よりも少なくとも２０倍高速であり得る。Ｒ２はＲ１の１００倍高速であり得る。Ｄ１は約３０秒〜約７５秒であり得る。他の実施形態では、Ｄ１は約４０分〜約１８０分であり得、又は約１８０分〜約３００分であり得る。幾つかの他の実施形態では、Ｄ１は約６０秒〜約１５０秒であり得る。Ｓ１は約１０分〜約３０分であり得る。他の実施形態では、Ｓ１は約５分〜約１０分であり得る。更に他の実施形態では、Ｓ１は０であり得る。幾つかの実施形態では、Ｄ１は約４０分〜約１８０分であり得、Ｓ１は０であり得る。他の実施形態では、Ｄ１は約６０秒〜約１５０秒であり得、Ｓ１は約５分〜約１０分であり得る。更に他の実施形態では、Ｄ１は約１８０分〜約３００分であり得、Ｓ１は０であり得る。第１のかん流ステップの合計時間は約１時間〜約１０時間であり得る。他の実施形態では、第１のかん流ステップの合計時間は約２時間〜約４時間であり得る。幾つかの実施形態では、Ｗは２よりも大きい整数であり得る。幾つかの実施形態では、Ｗは約１〜約２０であり得る。幾つかの実施形態では、Ｄ２は約１０秒〜約２５秒であり得る。他の実施形態では、Ｄ２は約１０秒〜約９０秒であり得る。幾つかの実施形態では、Ｓ２は約１０分〜約３０分であり得る。他の実施形態では、Ｓ２は約１５分であり得る。幾つかの実施形態では、Ｖは約１０〜約１２０であり得る。幾つかの実施形態では、Ｖは約３０〜約５０であり得、又は約４００〜約５００であり得る。幾つかの実施形態では、Ｄ２は約１秒〜約６秒であり得、Ｓ２は０秒であり得る。幾つかの実施形態では、Ｄ２は約１０秒〜約９０秒であり得、Ｓ２は約４０秒〜約１．５分であり得る。幾つかの実施形態では、第２のかん流ステップの１回反復の合計時間は、約１分〜約１５分であり得る。
培地の調整
少なくとも１つの生体細胞の成長及び／又は生存を持続し強化する培地（例えば、第１又は第２の培地）を提供するために、第１の流体培地は、液体成分及びガス成分の両方を含み得る（例えば、ガス成分は液体成分に溶解し得る）。更に、流体培地は、液体成分に溶解する生体分子、ビタミン、及びミネラル等の他の成分を含むことができる。当業者に既知のように、任意の適する成分を流体培地内で使用し得る。幾つかの非限定的な例は上述されているが、本明細書に記載される方法から逸脱せずに、多くの他の培地組成物が使用可能である。培地は動物性血清を含んでもよく、又は含まなくてもよい。幾つかの実施形態では、流体培地は、化学的に定義される培地（少なくとも細胞又は細胞含有流体に接触する前）を含み得、更に、タンパク質又はペプチドを含有しない化学的に定義される培地であり得る。幾つかの実施形態では、流体培地は血清低減培地を含み得る。
第１の流体培地は、第１の流体培地をマイクロ流体デバイスに導入する前に、初期流体培地を溶解したガス分子で飽和させることにより準備し得る。更に、初期流体培地を溶解したガス分子で飽和させることは、第１の流体培地がマイクロ流体デバイスに導入される直前まで続け得る。初期流体培地を飽和させることは、溶解したガス分子で初期流体培地を飽和させることが可能なガス環境にマイクロ流体デバイスを接触させることを含み得る。初期流体培地を飽和させ得るガス分子は、酸素、二酸化炭素、及び窒素が挙げられるが、これらに限定されない。
第１の流体培地は、第１の流体培地のｐＨを適度にすることを更に含み得る。第１の流体培地のｐＨを適度にすることは、例えば、溶解したガス分子導入前及び／又は導入中に行うことができる。そのような適度化は、緩衝種の添加により達成し得る。適する緩衝種の非限定的な一例はＨＥＰＥＳである。他の緩衝種も培地に存在し得、二酸化炭素の存在に依存しても、又はしなくてもよく（炭酸緩衝系等）、当業者により選択することができる。細胞の成長に必要な塩、タンパク質、炭水化物、脂質、ビタミン、及び他の小分子は、第１の流体培地組成物の一部をなすこともできる。
幾つかの実施形態では、ガス成分での第１の流体培地の飽和は、流入口を介する導入前にリザーバにおいて実行され得る。他の実施形態では、ガス成分での第１の流体培地の飽和は、リザーバと流入口との間のガス透過性接続コンジット内で実行され得る。更に他の実施形態では、ガス成分での第１の流体培地の飽和は、マイクロ流体デバイスの蓋のガス透過性部分を介して実行され得る。幾つかの実施形態では、流体培地のガス飽和は、マイクロ流体デバイス内の流体培地の浸透圧が培養期間中に変化しないように、ガス交換環境内の湿度を維持することも含む。
第１の流体培地の組成は、支持細胞培養からの少なくとも１つの分泌成分を含むこともできる。分泌される支持細胞成分は、成長因子、ホルモン、サイトカイン、小分子、プロテオグリカン等を含み得る。支持細胞培養からの少なくとも１つの分泌成分の導入は、ガス成分での第１の流体培地の飽和が実行されるリザーバと同じリザーバ内で実行されてもよく、又は支持細胞培養からの少なくとも１つの分泌成分の第１の流体培地への導入は、飽和ステップ前に行われてもよい。
幾つかの他の実施形態では、第１の培地の組成は、添加剤への細胞の応答をテストするために変更された流体培地を提供するように設計された添加剤を含むこともできる。そのような添加剤は、例えば、細胞生存性又は成長を増大又は低減することができる。
幾つかの実施形態では、方法は、第１の流体培地が少なくとも１つの流入口を介して導入される際、第１の流体培地のｐＨを検出することを含み得る。ｐＨの検出は、流入口の直近の位置で実行され得る。幾つかの実施形態では、方法は、第１の流体培地が流出口を介して搬出される際、第１の流体培地のｐＨを検出することを含み得る。ｐＨの検出は、流出口の直近の位置で実行され得る。ｐＨの検出に使用される検出器のいずれか一方又は両方は、光学センサであり得る。幾つかの実施形態では、検出器は、ｐＨが許容可能範囲から逸脱する場合、アラームを提供することが可能であり得る。幾つかの他の実施形態では、検出器により測定されたｐＨ値が許容可能範囲から逸脱する場合、第１の流体培地の組成を変更し得る。
培養するステップ中、少なくとも１つの成長室及び成長室に含まれる任意の細胞の画像を監視し得る。
少なくとも１つの生体細胞の搬出
培養するステップが完了した後、少なくとも１つの生体細胞又は細胞のコロニーは、成長室又は成長室の分離領域から搬出し得る。搬出は、１つ又は複数の生体細胞／細胞のコロニーを移動させるのに十分に強い誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用することを含み得る。ＤＥＰ力は、光学的又は電子的に作動され得る。例えば、マイクロ流体デバイスは、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成等のＤＥＰ構成を有する基板を含むことができる。他の実施形態では、少なくとも１つの生体細胞又は細胞のコロニーは、流体フロー及び／又は重力を使用して成長室又は分離領域から搬出し得る。更に他の実施形態では、少なくとも１つの生体細胞又は細胞のコロニーは、成長室又は成長室の分離領域の上にある変形可能蓋領域に対して圧縮力を使用し、それにより、成長室又は分離領域からの流体の局所化フローを生じさせて成長室又は分離質から搬出し得る。
少なくとも１つの生体細胞又は細胞のコロニーが成長室又は分離領域から搬出された後、細胞はマイクロ流体デバイスのフロー領域（例えば、チャネル）から搬出し得る。幾つかの実施形態では、細胞をフロー領域から搬出することは、１つ又は複数の生体細胞及び／又は細胞のコロニーを移動させるのに十分に強いＤＥＰ力を使用することを含む。ＤＥＰ力は、上述したように生成し得る。幾つかの他の実施形態では、細胞をマイクロ流体デバイスのフロー領域から搬出することは、流体フロー及び／又は重力を使用して細胞を移動させることを含む。
搬出ステップ中、少なくとも１つの成長室及び成長室に含まれる任意の細胞の画像を監視し得る。
少なくとも１つの表面の調整
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスに、調整された状態における少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面が提供される。他の実施形態では、少なくとも１つの成長室の表面は、少なくとも１つの生体細胞の導入前に調整され、１つ又は複数の生体細胞の培養方法の一環として実行し得る。表面を調整することは、ポリマー等の調整試剤を用いて表面を処理することを含み得る。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス（１００、３００、４００、５００Ａ〜Ｅ、及び６００）の少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を処理する方法が提供され、この方法は、過度の調整試剤を含む流体培地をフローチャネル（図１Ａ〜図１Ｃ、図２、図３、図４Ａ〜図４Ｃ）に流すステップと、選択された時間期間にわたりマイクロ流体デバイスを培養するステップと、チャネル内で培地を置換するステップとを含む。他の実施形態では、マイクロ流体デバイスをプライミングする方法は、調整試剤を含むプライミング溶液をフローチャネルに流すステップと、選択された時間期間にわたりデバイスを培養し、それにより、成長室の少なくとも１つの表面を調整するステップと、チャネル内の溶液を流体培地で置換するステップとを含む。プライミング溶液は、本明細書に記載される任意の流体培地を含み得る。調整溶液又は過度の調整試剤を有する流体培地を置換する流体培地は、本明細書に記載されるような任意の培地であり得、細胞を更に含み得る。
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの表面は、アルキレンエーテル部分を含むポリマー調整試剤を用いて処理し得る。アルキレンエーテル部分を有するポリマー調整試剤は、上述した任意のアルキレンエーテル含有ポリマーを含むが、これに限定されない任意の適するアルキレンエーテル含有ポリマーを含み得る。一実施形態では、成長室の表面は、ポリマー鎖内で異なる比率で異なる位置にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニット及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマー（例えば、Pluroic（登録商標）ポリマー）を用いて処理し得る。調整された表面の生成に有用な特定のPluronic（登録商標）ポリマーとしては、Plulonic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、Ｆ６８、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）が挙げられる。
他の実施形態では、表面は、カルボキシル部分を含むポリマー調整試剤を用いて処理し得る。適するカルボン酸含有ポリマー調整試剤の非限定的な例は、上述されており、任意の適するカルボン酸含有ポリマー調整試剤が表面の処理に使用可能である。
他の実施形態では、表面は、サッカリド部分を含むポリマー調整試剤を用いて処理し得る。適するサッカリド含有ポリマー調整試剤の非限定的な例は、上述されており、任意の適するサッカリド含有ポリマー調整試剤が表面の処理に使用可能である。
他の実施形態では、表面は、スルホン酸部分を含むポリマー調整試剤を用いて処理し得る。適するスルホン酸含有ポリマー調整試剤の非限定的な例は、上述されており、任意の適するスルホン酸含有ポリマー調整試剤が表面の処理に使用可能である。
他の実施形態では、表面は、アミノ酸部分を含むポリマー調整試剤を用いて処理し得る。適するアミノ酸含有ポリマー調整試剤の非限定的な例は、上述されており、任意の適するアミノ酸含有ポリマー調整試剤が表面の処理に使用可能である。アミノ酸含有ポリマー調整試剤はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、表面はタンパク質を用いて処理され、タンパク質は哺乳類血清に見られるか、又は哺乳類血清の部分である成分を含み得る。他の実施形態では、表面は哺乳類血清の成分を用いて処理される。幾つかの実施形態では、表面は、Ｂ−２７（登録商標）サプリメント（（５０Ｘ）、ThermoFisher Scientific、カタログ番号１７５０４０４４からの無血清）等の細胞培養培地サプリメントを用いて処理し得る。哺乳類血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）であり得る。代替的に、哺乳類血清は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）であり得る。
他の実施形態では、表面は、核酸部分を含むポリマー調整試剤を用いて処理し得る。適する核酸含有ポリマー調整試剤の非限定的な例は、上述されており、任意の適する核酸含有ポリマー調整試剤が表面の処理に使用可能である。
幾つかの実施形態では、２つ以上のポリマー調整試剤の混合物を使用して成長室の表面を処理し得る。
幾つかの他の実施形態では、調整するステップは、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を用いて少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を処理することを含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を用いて少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を処理するステップは、細胞をマイクロ流体デバイスから搬出する前に実行され得る。幾つかの実施形態では、調整するステップは、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を用いて細胞を事前に培養することを含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、アクチンフィラメント形成を阻止する役割を果たし得る。幾つかの実施形態では、細胞接着ブロック分子はサイトカラシンＢであり得る。他の実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、インテグリン受容体をブロックし得る。幾つかの実施形態では、細胞接着ブロック分子は、ＲＧＤモチーフを含むペプチドを含み得る。幾つかの他の実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、ＤＮＡファウリング表面への細胞の結合を低減し得る。ＤＮＡファウリング表面への細胞の結合を低減し得る細胞接着ブロック分子は、DNase1タンパク質を含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、小分子フィブロネクチン阻害剤を含み得る。更に他の実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、抗体、例えば、抗Ｂ１インテグリン抗体であり得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、２つ以上のタイプの細胞接着ブロック分子の組合せを含み得る。
他の実施形態では、調整することは、成長室の表面を約３０℃まで加熱することを含む。幾つかの実施形態では、方法は、表面を少なくとも約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃に加熱することを含む。幾つかの実施形態では、方法は、表面を約２５℃よりも高い温度に加熱することを含む。他の実施形態では、方法は、表面を約３０℃〜４０℃、約３５℃〜４０℃、又は約３６℃〜約３８℃の範囲の温度まで加熱することを含む。幾つかの実施形態では、方法は、表面を少なくとも約３０℃の温度まで加熱することを含む。幾つかの実施形態では、表面を加熱することは、ポリマーを用いて表面を処理することにより調整された少なくとも１つの表面を含む。
クローン集団
本明細書に記載される方法は、１つのみの生体細胞が少なくとも１つの成長室に導入される方法も含む。第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの成長室であって、分離領域は、接続領域に流体接続され、及び接続領域は、フロー領域への基端開口部を含む、少なくとも１つの成長室とを有するマイクロ流体デバイスを含むシステム内で生体細胞をクローン化する方法が提供され、この方法は、少なくとも１つの成長室に生体細胞を導入するステップであって、少なくとも１つの成長室は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を有するように構成される、ステップと、少なくとも、生体細胞を増殖させて生体細胞のクローン集団を生成するのに十分に長い時間期間にわたり、生体細胞を培養するステップとを含む。幾つかの実施形態では、システムは本明細書に記載されるような任意のシステムであり得る。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載されるような任意のマイクロ流体デバイスであり得る。
生体細胞をクローン化する方法の幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、表面に共有結合された結合基を含み得、及び結合基は、マイクロ流体デバイス内の１つ又は複数の生体細胞の細胞の成長、生存、又は可搬性を支持するように構成された部分に結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、シロキシ結合基を含み得る。他の実施形態では、結合基は、ホスホン酸結合基を含み得る。幾つかの実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。他の実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に直接結合され得る。結合基は、リンカーへの接続を介して、細胞の成長、生存、又は可搬性を支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、リンカーの第１の端部への接続を介して、細胞の成長、生存、又は可搬性を支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。幾つかの実施形態では、リンカーは、線状部を更に含み得、線状部の骨格は、ケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を含む。幾つかの実施形態では、線状部の骨格は、１つ又は複数のアリーレン部分を含み得る。他の実施形態では、リンカーは、トリアゾリレン部分を含み得る。幾つかの実施形態では、トリアゾリレン部分は、リンカーの線状部を中断してもよく、又はリンカーの線状部に第２の端部において接続されてもよい。様々な実施形態では、細胞の成長、生存、及び／又は可搬性を支持するように構成された部分は、アルキル若しくはフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸若しくはポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキル又はペルフルオロアルキル部分を含む。他の実施形態では、少なくとも１つの調整された表面は、アルキレンエーテル部分又はデキストラン部分を含む。
様々な実施形態では、方法は、少なくとも１つの成長室の少なくとも表面を調整するステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、調整することは、マイクロ流体デバイス内の細胞可搬性を支持する１つ又は複数の作用剤を用いて少なくとも１つの表面を処理することを含む。幾つかの実施形態では、調整することは、ポリマーを含む調整試剤を用いて少なくとも１つの成長室の少なくとも表面を処理することを含み得る。幾つかの実施形態では、ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含み得る。幾つかの実施形態では、ポリマーは、カルボン酸部分を含み得る。幾つかの実施形態では、ポリマーは、サッカリド部分を含み得る。他の実施形態では、ポリマーは、スルホン酸部分を含み得る。更に他の実施形態では、ポリマーは、アミノ酸部分を含み得る。更なる実施形態では、ポリマーは、核酸部分を含み得る。幾つかの実施形態では、調整することは、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を用いて少なくとも１つの成長室の少なくとも表面を処理することを含み得る。幾つかの実施形態では、哺乳類血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）であり得る。様々な実施形態では、調整することは、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を用いて少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を処理することを含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、ＲＧＤ含有ペプチドを含み得る。他の実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、サイトカラシンＢ、インテグリンへの抗体、フィブロネクチンの阻害剤、又はDNase1タンパク質であり得る。様々な実施形態では、調整することは、２つ以上のタイプの細胞接着ブロック分子の組合せを用いて少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を処理することを含み得る。
様々な実施形態では、調整することは、少なくとも１つの成長室の少なくとも表面を約３０℃の温度まで加熱することを含み得る。
様々な実施形態では、方法は、第１の流体培地をマイクロ流体デバイスのフロー領域のマイクロ流体チャネルに導入するステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、第１の流体培地を導入することは、生体細胞を導入する前に実行され得る。幾つかの実施形態では、生体細胞を少なくとも１つの成長室に導入することは、生体細胞を移動させるのに十分な強度を有する誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用することを含み得る。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光学的に作動され得る。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）により生成され得る。幾つかの他の実施形態では、生体細胞を少なくとも１つの成長室に導入することは、流体フロー及び／又は重力を使用することを含み得る。
幾つかの実施形態では、生体細胞を少なくとも１つの成長室に導入することは、生体細胞を少なくとも１つの成長室の分離領域に導入することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの成長室の分離領域は、１×１０２個以下の細胞への細胞増殖を支持するのに十分な寸法を有し得る。幾つかの実施形態では、分離領域は、少なくとも実質的に第２の流体培地で充填し得る。幾つかの実施形態では、フロー領域は、少なくとも１つの成長室の接続領域の基端開口部に流体接続され得、更に、接続領域は、成長室の分離領域に流体接続され得る。
様々な実施形態では、方法は、培養するステップ中に第１の流体培地をかん流させるステップを更に含み得、第１の流体培地は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流入口を介して導入し得、第１の流体培地は、任意選択的に第２の流体培地からの成分を含み、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流出口を介して搬出し得る。幾つかの実施形態では、かん流は非連続であり得る。幾つかの他の実施形態では、かん流は定期的であり得る。更に他の実施形態では、かん流は不規則であり得る。幾つかの実施形態では、第１の流体培地のかん流は、分離領域内の第２の流体培地の成分をフロー領域内の第１の流体培地に拡散させ、及び／又は第１の流体培地の成分を分離領域内の第２の流体培地に拡散させるのに十分な率で実行され得、及び第１の培地は、分離領域に実質的に流入しない。幾つかの実施形態では、第１の流体培地をかん流させることは、約４５秒〜約９０秒、約１０分毎〜約３０分毎の持続時間で実行され得る。幾つかの実施形態では、第１の流体培地をかん流させることは、約２時間〜約４時間の持続時間で実行され得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの生体細胞が培養される時間期間は、約１日〜約１０日であり得る。
幾つかの実施形態では、第１の流体培地の組成は、液体成分及びガス成分を含み得る。様々な実施形態では、方法は、第１の流体培地をマイクロ流体デバイスに導入する前に、溶解したガス分子で第１の流体培地を飽和させるステップを更に含み得る。様々な実施形態では、方法は、第１の流体培地又は第２の流体培地を溶解したガス分子で飽和させることが可能なガス環境にマイクロ流体デバイスを接触させるステップを更に含み得る。様々な実施形態では、方法は、溶解したガス分子を導入する前に第１の流体培地のｐＨを変調するステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、ガス成分で第１の流体培地を飽和させることは、流入口を介した導入前にリザーバ内で、リザーバと流入口との間のガス透過性コネクタ内で、又はマイクロ流体デバイスの蓋のガス透過性部分を介して実行され得る。幾つかの実施形態では、第１の流体培地の組成は、支持細胞培養からの選択された少なくとも１つの成分を含み得る。
様々な実施形態では、方法は、第１の流体培地が少なくとも１つの流入口を介して搬出される際、第１の流体培地のｐＨを検出するステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、検出するステップは、少なくとも１つの流出口の直近の位置で実行され得る。様々な実施形態では、方法は、第１の流体培地が少なくとも１つの流入口を介して導入される際、第１の流体培地のｐＨを検出するステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、センサは、光学センサであり得る。様々な実施形態では、方法は、第１の流体培地の組成を変更するステップを更に含み得る。
様々な実施形態では、方法は、少なくとも１つの成長室及び成長室に含まれる任意の細胞の画像を監視するステップを更に含み得る。
様々な実施形態では、生体細胞は、哺乳類細胞であり得る。幾つかの実施形態では、生体細胞は、免疫細胞であり得る。幾つかの実施形態では、生体細胞は、リンパ球又は白血球であり得る。幾つかの実施形態では、生体細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、又は樹状細胞であり得る。幾つかの実施形態では、生体細胞は、接着細胞であり得る。幾つかの実施形態では、生体細胞は、ハイブリドーマ細胞であり得る。
幾つかの実施形態では、生体細胞は、複数の生体細胞であり得、少なくとも１つの成長室は、複数の成長室である。様々な実施形態では、方法は、複数の生体細胞の１つ以下を複数の成長室のそれぞれに移動させるステップを更に含み得る。
生体細胞をクローン化する方法の幾つかの実施形態では、調整された表面は、開裂可能部分を更に含み得る。方法は、クローン集団の１つ又は複数の生体細胞を成長室又は成長室の分離領域から搬出する前に開裂可能部分を開裂させるステップを含み得る。
様々な実施形態では、方法は、クローン集団の１つ又は複数の生体細胞を成長室又は成長室の分離領域から搬出するステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、搬出することは、１つ又は複数の生体細胞を移動させるのに十分に強い誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用することを含み得る。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光学的に作動される。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）により生成され得る。幾つかの実施形態では、搬出することは、流体フロー及び／又は重力を使用することを含み得る。幾つかの実施形態では、搬出することは、成長室又は成長室の分離領域の上の変形可能蓋領域に対して圧縮力を使用することを含み得る。様々な実施形態では、方法は、マイクロ流体デバイスのフロー領域から、クローン集団の１つ又は複数の生体細胞を搬出するステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、搬出することは、１つ又は複数の生体細胞を移動させるのに十分に強いＤＥＰ力を使用することを含み得る。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光学的に作動される。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）により生成され得る。幾つかの実施形態では、搬出することは、流体フロー及び／又は重力を使用することを含み得る。
キット
生体細胞を培養するキットを提供し得、キットは、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、少なくとも１つの成長室とを有するマイクロ流体デバイス並びに表面調整試剤を含む。この実施形態では、少なくとも１つの成長室は、少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を調整するように事前処理されておらず、調整された表面は、細胞が導入される前に表面調整試剤を用いて処理することにより作成される。生体細胞を培養する他のキットも提供され、キットは、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの成長室とを有するマイクロ流体デバイスを含み、分離領域は、接続領域に流体接続され、及び接続領域は、フロー領域への基端開口部を含み、更に、少なくとも１つの成長室は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含む。生体細胞を培養する更に他のキットが提供され、このキットは、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの成長室とを含むマイクロ流体デバイスを含み、分離領域は、接続領域に流体接続され、及び接続領域は、フロー領域への基端開口部を含み、少なくとも１つの成長室は、表面修飾リガンドを有する少なくとも１つの表面を有する。代替的に、生体細胞を培養するキットを提供し得、このキットは、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持することができる少なくとも１つの調整された表面を有する少なくとも１つの成長室とを有するマイクロ流体デバイス並びに表面調整試剤を含む。任意のキットのマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイス１００、２００、２４０、２９０、４００、５００Ａ〜Ｅ、又は６００のいずれか１つであり得、上述した任意の特徴を有し得る。
任意のキットのマイクロ流体デバイスは、フロー領域の少なくとも部分を含むマイクロ流体チャネルを更に含み得、デバイスは、マイクロ流体チャネルに直接開口する接続領域を有する成長室を更に含み得る。成長室は、分離領域を更に含み得る。分離領域は、接続領域に流体接続され得、第２の流体培地を含むように構成され得、フロー領域及び少なくとも１つの成長室が第１及び第２の流体培地で実質的にそれぞれ充填される場合、第２の流体培地の成分は第１の流体培地に拡散し、及び／又は第１の流体培地の成分は第２の流体培地に拡散し、及び第１の培地は、分離領域に実質的に流入しない。
任意のキットの様々な実施形態では、成長室は、図１Ａ〜図１Ｃ、図２、図３、及び図４Ａ〜図４Ｃの成長室１２４、１２６、１２８、１３０、２４４、２４６、２４８、又は４３６のように構成され得、成長室の分離領域は、培養で約１×１０３個以下、約５×１０２個以下、約４×１０２個以下、約３×１０２個以下、約２×１０２個以下、約１×１０２個以下、約５０個以下、約２５個以下、約１５個以下、又は約１０個以下の細胞を支持するように構成された容積を有し得る。他の実施形態では、成長室の分離領域は、最高で約１０個、約５０個、又は約１×１０２個の細胞を支持することができる容積を有する。上述した成長室の任意の構成をキットのマイクロ流体デバイスの成長室に使用し得る。
任意のキットの様々な実施形態では、成長室のサイズは、１×１０２個以下の生体細胞を維持するように構成され、維持され得、成長室の容積は１×１０７立方μｍ以下であり得る。１×１０２個以下の生体細胞を維持し得る他の実施形態では、成長室の容積は、５×１０６立方μｍであり得る。更に他の実施形態では、５０個以下の生体細胞を維持し得、成長室の容積は、１×１０６立方μｍ以下又は５×１０５立方μｍ以下であり得る。キットでは、マイクロ流体デバイスは、上述したような任意の数の成長室を有し得る。
任意のキットのマイクロ流体デバイスは、流体培地（例えば、第１又は第２の流体培地）をフロー領域に入れるように構成された少なくとも１つの流入口と、流体培地がフロー領域を出る際、流体培地（例えば、消費された第１の流体培地）を受け取るように構成された少なくとも１つの流出口とを更に含み得る。
任意のキットのマイクロ流体デバイスは、複数のＤＥＰ電極を有する基板を更に含み得、基板の表面は、成長室及びフロー領域の表面を形成する。複数のＤＥＰ電極は、１つ若しくは複数の生体細胞（例えば、クローン集団）を成長室若しくは成長室の分離領域内に移動させるか、又は生体細胞培養の１つ若しくは複数の細胞を成長室若しくは成長室の分離領域外に移動させるのに十分に強い誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成され得る。ＤＥＰ電極、したがってＤＥＰ力は、光学的に作動され得る。そのような光学作動ＤＥＰ電極は、仮想電極（例えば、入射光に起因して導電性が増大した非晶質シリコン基板の領域）、フォトトランジスタ、又は対応するフォトトランジスタによりオンオフ切り替えされる電極であり得る。代替的に、ＤＥＰ電極、したがってＤＥＰ力は、電気的に作動され得る。幾つかの他の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、複数のトランジスタを有する基板を更に含み得、基板の表面は、成長室又はフロー領域の表面を形成する。複数のトランジスタは、生体細胞を成長室若しくは成長室の分離領域内に導入するか、又は生体細胞培養の１つ若しくは複数の細胞を成長室若しくは成長室の分離領域から移動させるのに十分に強い誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成することが可能であり得る。複数のトランジスタのそれぞれは、光学的に作動され得、ＤＥＰ力は、光電子ピンセットにより生成され得る。
任意のキットのマイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの成長室又は成長室の分離領域の上に変形可能蓋領域を更に含み得、それにより、変形可能蓋領域を押すと、１つ又は複数の生体細胞（例えば、クローン集団）を成長室からフロー領域に搬出する力が及ぼされる。
任意のキットのマイクロ流体デバイスは、ガスを実質的に透過しない蓋を有するように構成され得る。代替的に、蓋の一部の全ては、ガス透過性であるように構成され得る。蓋の透過性部分は、二酸化炭素、酸素、及び窒素の少なくとも１つを透過可能であり得る。幾つかの実施形態では、蓋（又はその一部）は、二酸化炭素、酸素、又は窒素の２つ以上の組合せを透過可能であり得る。
任意のキットは、流体培地を含むように構成されたリザーバを更に含み得る。リザーバは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイスに流体接続され得る。リザーバは、リザーバに存在する流体培地が、溶解したガス分子で流体培地を飽和させることが可能なガス環境により接触し得るように構成され得る。リザーバは、流体培地に流体的に接触した支持細胞の集団を含むように更に構成され得る。
任意のキットは、マイクロ流体デバイスの流入口及び／又は流出口に接続されるように構成された少なくとも１つの接続コンジットを含み得る。接続コンジットは、リザーバ又はポンプ構成要素等のフローコントローラに接続するように構成することもできる。接続コンジットはガス透過性であり得る。ガス透過性接続コンジットは、二酸化炭素、酸素、及び窒素の少なくとも１つを透過可能であり得る。幾つかの実施形態では、ガス透過性コンジットは、二酸化炭素、酸素、及び窒素の２つ以上の組合せを透過可能であり得る。
任意のキットは、第１の流体培地のｐＨを検出するように構成されたセンサを更に含み得る。センサは、マイクロ流体デバイスの流入口又はそれに取り付けられる接続コンジットに接続し得る（又は接続可能であり得る）。代替的に、センサはマイクロ流体デバイスに一体化し得る。センサは、流体培地がマイクロ流体デバイスに入る箇所の近くに接続し得る。キットは、マイクロ流体デバイスの流出口において流体培地のｐＨを検出するように構成されたセンサを含み得る。センサは、マイクロ流体デバイスの流出口又はそれに取り付けられる接続コンジットに接続し得る（又は接続可能であり得る）。代替的に、センサはマイクロ流体デバイスに一体化し得る。センサは、流体培地がマイクロ流体デバイスを出る箇所の近くに接続し得るセンサは、マイクロ流体デバイスの流入口に取り付けられるか、及び／又は流出口に取り付けられるかに関係なく、光学センサであり得る。光学センサは、ＬＥＤ及び一体型比色計センサを含み得、一体型比色計センサは、任意選択的に、色高感度フォトトランジスタであり得る。キットは、ｐＨセンサを制御し、ｐＨセンサから出力を受信する電子回路駆動構成要素を更に含み得る。キットは、ｐＨ検出試剤を更に含み得る。ｐＨ検出試剤は、可視光下で検出し得るｐＨ高感度染料であり得る。
任意のキットは、マイクロ流体デバイスでの生体細胞の生存性を強化可能な成分を有する培養培地を含むこともできる。これらの成分は、流体培地成分について上述した任意の成分を含め、当技術分野で既知のように、任意の適する培養培地成分であり得る。
任意のキットは、生体細胞又は細胞集団の状態を検出する少なくとも１つの試剤を更に含み得る。それの状態を検出するように構成された試剤は、当技術分野で周知であり、例えば、細胞の生死、細胞が抗体、サイトカイン、若しくは成長因子等の関心のある物質を分泌しているか否か、又は関心のある細胞表面マーカーを有するか否かを検出するのに使用し得る。そのような試剤は、本明細書に記載されるキット及び方法への制限なく使用し得る。
本明細書において提供される任意のキットでは、キットの構成要素は別個の容器内にあり得る。溶液で提供されるキットの任意の構成要素の場合、構成要素は、本発明の方法で使用される濃度の約１×、約５×、約１０×、約１００×、又は約１０００×の濃度で存在し得る。
マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの成長室が少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を調整するように事前処理されず、調整された表面が表面調整試剤を用いて処理することにより作成されるキットの場合、又は第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持することができる少なくとも１つの調整された表面を有する少なくとも１つの成長室とを有するマイクロ流体デバイス並びに表面調整試剤を含むキットの場合、成長室の表面は、表面調整試剤で事前に調整し得る。表面調整試剤はポリマーを含み得、ポリマーは、表面調整試剤としての使用について上述したポリマーの任意の１つ又は複数であり得る。幾つかの実施形態では、表面調整試剤は、アルキレンエーテル部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、アミノ酸部分、核酸部分、サッカリド部分、又はそれらの任意の組合せを含み得る。表面調整試剤は、Pluronic（登録商標）ポリマー（例えば、Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、又はＦ１２７等のＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、表面調整試剤は、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を含み得る。哺乳類血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）であり得る。
代替的に、成長室の表面の調整に使用される表面調整試剤は、マイクロ流体デバイスとは別個にキットに含まれ得る。キットの他の実施形態では、事前調整されたマイクロ流体デバイスが、成長室の表面の調整に使用されるものと異なる表面調整試剤と共に含まれる。異なる表面調整試剤は、上述した表面調整試剤のいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、２つ以上の表面調整試剤がキットに含まれる。
マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの成長室が少なくとも１つの表面を調整するように事前処理されていないマイクロ流体デバイスを有するキットの様々な実施形態では、キットは、１つ又は複数の生体細胞を培養するのに適する培養培地を含むこともできる。幾つかの実施形態では、キットは、成長室の表面の調整を補充することが可能な試剤を含む培養培地添加剤を含むこともできる。培養培地添加剤は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面の能力を強化する上述したような調整試剤又は別の化学種を含み得る。これは、成長因子、ホルモン、抗酸化剤、又はビタミン等を含むことができる。
キットは、少なくとも第１の流体培地をかん流させるように構成されたフローコントローラを含むこともでき、フローコントローラは、マイクロ流体デバイスの別個の構成要素であってもよく、又はマイクロ流体デバイスの一部として組み込まれてもよい。コントローラは、流体培地を非連続的にかん流させるように構成され得る。したがって、コントローラは、流体培地を定期的に又は不規則にかん流させるように構成され得る。
別の態様では、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの成長室とを有するマイクロ流体デバイスを有するマイクロ流体デバイスを含む、生体細胞を培養するキットが提供され、分離領域は、接続領域に流体接続され、及び接続領域は、フロー領域への基端開口部を含み、更に、少なくとも１つの成長室は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含む。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載されるような任意のマイクロ流体デバイスであり得、本明細書に記載されるような任意の成長室を有し得る。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の種類のＤＥＰ構成を有する基板を有し得る。ＤＥＰ構成は、光学的に作動され得る。マイクロ流体デバイスの基板は、化学式１又は化学式２の本明細書に記載されるような基板組成を含む表面を有し得、上述したような全ての特徴を有し得る。
キットのマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの調整された表面は、サッカリド部分、アルキレンエーテル部分、アミノ酸部分、アルキル部分、フルオロアルキル部分（ペルフルオロアルキル部分を含み得る）、アニオン部分、カチオン部分、及び／又は両性イオン部分を含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの調整された表面は、サッカリド部分、アルキレンエーテル部分、アルキル部分、フルオロアルキル部分、又はアミノ酸部分を含み得る。アルキル又はペルフルオロアルキル部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有し得る。幾つかの実施形態では、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するためのそれは、アルキル部分若しくはフルオロアルキル部分（ペルフルオロアルキルを含む）、アルキル若しくはフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸若しくはポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。
キットの幾つかの実施形態では、調整された表面は、マイクロ流体デバイスの表面に共有結合された結合基を含み得、及び結合基は、マイクロ流体デバイス内での１つ又は複数の生体細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合され得る。結合基は、シロキシ結合基であり得る。代替的に、結合基は、ホスホン酸エステル結合基であり得る。キットの幾つかの実施形態では、調整された表面の結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に直接結合され得る。
他の実施形態では、結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分にリンカーを介して間接的に結合され得る。結合基は、リンカーの第１の端部への接続を介して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に間接的に結合され得る。リンカーは、線状部を更に含み得、線状部の骨格は、ケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を含む。キットの幾つかの実施形態では、調整された表面のリンカーは、トリアゾリレン部分を更に含み得る。開裂可能部分は、調整された表面の分裂を可能にし、それにより、生体細胞の可搬性を促進するように構成される。キットは、調整された表面の開裂可能部分を開裂させるように構成された試剤を更に含み得る。
キットの様々な実施形態では、キットは、表面調整試剤を更に含み得る。幾つかの実施形態では、表面調整試剤は、アルキレンエーテル部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、ホスホン酸部分、アミノ酸部分、核酸部分、又はサッカリド部分の少なくとも１つを含むポリマーを含み得る。幾つかの他の実施形態では、表面調整試剤は、アルキレンエーテル部分、アミノ酸部分、又はサッカリド部分の少なくとも１つを含むポリマーを含む。幾つかの他の実施形態では、調整された表面は、開裂可能部分を含み得る。
キットの他の実施形態では、表面調整試剤は、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、アクチンフィラメント形成を妨げ、インテグリン受容体をブロックし、又はＤＮＡファウリング表面への細胞の結合を低減し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、サイトカラシンＢ、ＲＧＤ含有ペプチド、DNase1タンパク質、フィブロネクチン阻害剤、又はインテグリンへの抗体であり得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、２つ以上のタイプの細胞接着ブロック分子の組合せを含み得る。
キットの様々な実施形態では、表面調整試剤は、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を含み得る。哺乳類血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）であり得る。キットの様々な実施形態では、キットは、１つ又は複数の生体細胞の培養に適する培養培地を更に含み得る。幾つかの実施形態では、キットは、成長室の少なくとも１つの表面の調整を補充するように構成された試剤を含む培養培地添加剤を含み得る。培養培地添加剤は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面の能力を強化する上述したような調整試剤又は別の化学種を含み得る。これは、成長因子、ホルモン、抗酸化剤、又はビタミン等を含むことができる。
キットの様々な実施形態では、キットは、１つ又は複数の生体細胞の状態を検出する少なくとも１つの試剤を含み得る。
更に別の態様では、生体細胞を培養する生体細胞を培養するキットであって、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの成長室とを含む、１つ又は複数の生体細胞を培養するマイクロ流体デバイスを含み、分離領域は、接続領域に流体接続され、及び接続領域は、フロー領域への基端開口部を有し、少なくとも１つの成長室は、表面修飾リガンドを有する少なくとも１つの表面を有する、キットである。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイスであり得る。表面は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を有する基板を含み得る。ＤＥＰ構成は、本明細書に記載される任意のＤＥＰ構成であり得る。ＤＥＰ構成は、光学的に作動され得る。基板は、本明細書に記載されるような表面修飾リガンドを有する任意の基板であり、化学式３の構造を有し得、上述したような特徴の全てを含み得る。
表面修飾リガンドを含む少なくとも１つの表面を有するマイクロ流体デバイスを有するキットの様々な実施形態では、表面修飾リガンドは、基板の表面の酸化物部分に共有結合され得る。表面修飾リガンドは、反応部分を含み得る。表面修飾リガンドの反応部分は、アジド部分、アミノ部分、ブロモ部分、チオール部分、活性化エステル部分、サクシニミジル部分、又はアルケニル部分を含み得る。表面修飾リガンドは、結合基を介して酸化物部分に共有結合され得る。幾つかの実施形態では、結合基は、シロキシ部分であり得る。他の実施形態では、結合基は、ホスホン酸エステル部分であり得る。結合基は、表面修飾リガンドの反応部分にリンカーを介して間接的に接続し得る。リンカーは、線状部を含み得、線状部の骨格は、ケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜１００個の非水素原子を含み得る。幾つかの実施形態では、表面修飾リガンドは、１つ又は複数の開裂可能部分を含み得る。１つ又は複数の開裂可能部分は、形成されたマイクロ流体デバイスの調整された表面の分裂を可能にし、それにより、培養後に１つ又は複数の生体細胞の可搬性を促進するように構成され得る。
表面修飾リガンドを含む少なくとも１つの表面を有するマイクロ流体デバイスを有するキットの幾つかの実施形態では、キットは、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された第１の部分と、化学式５の構造を有し得、本明細書に記載されるような任意の特徴を有し得る表面修飾リガンドの反応部分と反応するように構成された第２の部分とを含む調整修飾試剤を更に含み得る。
第２の部分は、キットのマイクロ流体デバイスの表面修飾リガンドの反応部分との反応後、成長室内の１つ又は複数の生体細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された調整された表面に表面修飾リガンドを変換するように構成され得る。第１の部分は、アルキレンオキシド部分、サッカリド部分、アルキル部分、ペルフルオロアルキル部分、アミノ酸部分、アニオン部分、カチオン部分、又は双性イオン部分を含み得る。幾つかの実施形態では、第１の部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ若しくはポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル若しくはピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。第２の部分は、アミノ部分、カルボン酸部分、アルキン部分、アジド部分、アルデヒド部分、ブロモ部分、又はチオール部分であり得る。幾つかの実施形態では、調整修飾試剤の第１の部分又はリンカーＬ’（化学式５について上述したような）は、開裂可能部分を含み得る。開裂可能部分は、調整された表面の分裂を可能にし、それにより、生体細胞の可搬性を促進するように構成され得る。幾つかの実施形態では、キットは、調整された表面の開裂可能部分を開裂させるように構成された試剤を更に含み得る。
表面修飾リガンドを含む少なくとも１つの表面を有するマイクロ流体デバイスを有するキットの幾つかの実施形態では、キットは、表面調整試剤を更に含み得る。
表面修飾リガンドを含む少なくとも１つの表面を有するマイクロ流体デバイスを有するキットの幾つかの実施形態では、表面調整試剤は、アルキレンエーテル部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、ホスホン酸部分、アミノ酸部分、核酸部分、又はサッカリド部分の少なくとも１つを含むポリマーを含み得る。幾つかの他の実施形態では、表面調整試剤は、アルキレンエーテル部分、アミノ酸部分、又はサッカリド部分の少なくとも１つを含むポリマーを含む。幾つかの他の実施形態では、調整された表面は、開裂可能部分を含み得る。
表面修飾リガンドを含む少なくとも１つの表面を有するマイクロ流体デバイスを有するキットの幾つかの実施形態では、表面調整試剤は、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、アクチンフィラメント形成を妨げ、インテグリン受容体をブロックし、又はＤＮＡファウリング表面への細胞の結合を低減し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、サイトカラシンＢ、ＲＧＤ含有ペプチド、DNase1タンパク質、フィブロネクチン阻害剤、又はインテグリンへの抗体であり得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、２つ以上のタイプの細胞接着ブロック分子の組合せを含み得る。
表面修飾リガンドを含む少なくとも１つの表面を有するマイクロ流体デバイスを有するキットの幾つかの実施形態では、表面調整試剤は、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を含み得る。哺乳類血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎仔血清（ＦＣＳ）であり得る。
表面修飾リガンドを含む少なくとも１つの表面を有するマイクロ流体デバイスを有するキットの幾つかの実施形態では、キットは、１つ又は複数の生体細胞の培養に適する培養培地を更に含み得る。幾つかの実施形態では、キットは、成長室の少なくとも１つの表面の調整を補充するように構成された試剤を含む培養培地添加剤を更に含み得る。培養培地添加剤は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持する少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面の能力を強化する上述したような調整試剤又は別の化学種を含み得る。これは、成長因子、ホルモン、抗酸化剤、又はビタミン等を含むことができる。
表面修飾リガンドを含む少なくとも１つの表面を有するマイクロ流体デバイスを有するキットの幾つかの実施形態では、キットは、１つ又は複数の生体細胞の状態を検出する少なくとも１つの試剤を更に含み得る。
例
例１．Ｋ５６２赤白血病細胞の培養及び成長
材料：ヒト不死化骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２細胞をAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）（カタログＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣｌ−２４３（商標））から取得し、浮遊体細胞として提供された。１ｍＬ当たり１×１０３個の生細胞を播種し、５％二酸化炭素ガス環境を使用して３７℃で培養した。細胞を１ｍＬ当たり１×１０６個の細胞又は２〜３日毎に分割した。細胞を５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／９５％完全成長培地内で凍結した。
培養培地：イスコフ改変ダルベッコ培地（ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号３０−２００５）に１０％ウシ胎児血清（Hyclone、カタログ番号ＳＨ３００７１．２）を加えたものを組み合わせて、完全成長培地を作成した。培養期間中にかん流する場合、マイクロ流体デバイスに導入する前に完全成長培地を空気中の５％二酸化炭素を用いて連続して調整した。
プライミング溶液：０．１％Pluronic（登録商標）Ｆ１２７（（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含む完全成長培地。
システム及びマイクロ流体デバイス：Berkeley Lights, Inc.製。システムは、少なくともフローコントローラ、温度コントローラ、流体培地調整及びポンプ構成要素、光活性化ＤＥＰ構成用の光源、マイクロ流体デバイス、マウントステージ、及びカメラを含んだ。この実験で使用したマイクロ流体デバイスの成長室は、約１．４×１０５立方μｍの容積を有した。フローチャネルの断面積は約４×１０３二乗μｍであった。マイクロ流体デバイスは８つのチャネルを有した。
培養への準備：マイクロ流体デバイスをシステムに装填し、１００％二酸化炭素で５分間、１５ｐｓｉでパージした。二酸化炭素パージの直後、プライミング溶液を５μＬ／秒で８分間にわたりマイクロ流体デバイスにかん流させた。次に、完全成長培地を５μＬ／秒で５分間にわたりマイクロ流体デバイスに流した。
培養状況：マイクロ流体デバイスの温度を３７℃に維持した。培養実験の全期間にわたり、０．００１μＬ／秒の一定流量で培養培地をかん流させた。
重力を使用して、１つのＫ５６２細胞をマイクロ流体デバイスの１つの成長室に装填した。細胞装填後、ｔ＝０時間での成長室の写真を示す（図１０Ａ参照）。矢印１００２は、成長室内の単一の細胞の位置を指している。
１６時間の培養が完了した後、その時点で撮影された写真に示されるように（図１０Ｂ参照）、細胞は２つの細胞の集団に増殖した。矢印１００４は、成長室内の２つの細胞の位置を指している。
３４時間の培養が完了した後、図１０Ｃの写真に示されるように、細胞の集団は合計で４つの細胞に増大した。矢印１００６及び１００８は、成長室内にある２つの細胞の２つの群のそれぞれを指している。
５４時間の培養が完了した後、Ｋ５６２細胞の集団は、図１０Ｄの写真に示されるように、合計で８個の細胞に増大した。矢印１０１０及び１０１２は、成長室内の細胞群の片側にある細胞を指している。
７０時間の培養が完了した後、Ｋ５６２細胞の集団は、図１０Ｅの写真に示されるように、合計で１６個の細胞に増大した。矢印１０１４、１０１６、及び１０１８は、その群の細胞を指している。Ｋ５６２のクローン増殖集団をマイクロ流体デバイスの成長室に提供した。
例２．ＯＫＴ３ハイブリドーマ細胞の培養及び成長
材料：マウス骨髄腫ハイブリドーマ細胞株であるＯＫＴ３細胞をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号ＣＲＬ−８００１（商標））から取得した。細胞は、浮遊細胞株として提供された。１ｍＬ当たり約１×１０５〜約２×１０５個の生細胞を播種し、ガス環境として空気中の５％二酸化炭素を使用して３７℃で培養することにより、培養を維持した。細胞を２〜３日毎に分割した。ＯＫＴ３細胞の数及び生存性をカウントし、マイクロ流体デバイスに装填するために、細胞密度を５×１０５／ｍＬに調整した。
培養培地：イスコフ改変ダルベッコ培地（ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号３０−２００５）５００ｍＬ、ウシ胎児血清（ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号３０−２０２０）２００ｍＬ、及びペニシリン−ストレプトマイシン（Life Technologies（登録商標）、カタログ番号１５１４０−１２２）１ｍＬを組み合わせて、培養培地を作成した。完全培地を、０．２２μｍフィルタを通して濾過し、使用するまで光を避けて４℃で格納した。
培養期間中にかん流する場合、マイクロ流体デバイスに導入する前に空気中の５％二酸化炭素を用いて培養培地を連続して調整した。
プライミング溶液：０．１％Pluronic（登録商標）Ｆ１２７（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含む培養培地。
システム及びマイクロ流体デバイス：Berkeley Lights, Inc.製。システムは、少なくともフローコントローラ、温度コントローラ、流体培地調整及びポンプ構成要素、光源及び光活性化ＤＥＰ構成用のプロジェクタ、マイクロ流体デバイス、マウントステージ、及びカメラを含んだ。この実験で使用したマイクロ流体デバイスの成長室は、約１．５×１０６立方μｍの容積を有した。フローチャネルの断面積は約８×１０３二乗μｍであり、合計で６つのチャネルがマイクロ流体デバイスに存在した。
培養への準備：マイクロ流体デバイスをシステムに装填し、１００％二酸化炭素で５分間、１５ｐｓｉでパージした。二酸化炭素パージの直後、プライミング溶液を８μＬ／秒として、総量２．５ｍＬがマイクロ流体デバイスを通してかん流されるまでマイクロ流体デバイスにかん流させた。次に、培養培地を８μＬ／秒として、合計で１ｍＬの培養培地がマイクロ流体デバイスを通してかん流されるまでマイクロ流体デバイスに流した。細胞導入前の準備が整ったマイクロ流体デバイスを図１１Ａの写真に示す。１列になった４つの成長室が写真の下部に沿って広がっている。
培養状況：マイクロ流体デバイスの温度を３７℃に維持した。培養実験の全期間にわたり、変化するかん流方法を使用して培養培地をかん流させ、かん流方法は、０．０１ｍＬ／秒でのかん流の初期４時間期間、それに続く約３秒間の８μＬ／秒での短期高速かん流、それに続く約１分未満の短期かん流停止期間を含んだ。交互になったかん流率及び停止を含むこのサイクルを、培養実験全体を通して続けた。
重力により、１つのＯＫＴ３細胞を成長室に導入した。時間ｔ＝０において１つの細胞を有する成長室の写真を図１１Ｂに示し、矢印１１０２は、左から２番目の室の、特に室内の単一の細胞を指しており、細胞が存在する領域は円で更に囲まれている。
図１２Ａ〜図１２Ｃは、培養実験でのより後の時点でのマイクロ流体デバイスの写真を示し、クローン集団を形成する細胞増殖を示す。図１２Ａの写真は、１日の培養が完了したときに撮影され、矢印１２０２は、１つのＯＫＴ３細胞の導入場所である左から２番目の室内に約４つの細胞の群を指している。図１２Ｂは、２日の培養が完了したときに撮影された写真であり、矢印１２０４は、左から２番目の室内の更に増殖した細胞集団を指している。図１２Ｃは、３日の培養が完了したときに撮影された写真であり、矢印１２０６は、１つのＯＫＴ３細胞の培養から生じた多数の増殖したＯＫＴ３細胞を示している。
図１３Ａ〜図１３Ｃは、３日の培養が完了した後（すなわち、１２Ｃの時点後）のマイクロ流体デバイスの写真を示し、光電子ピンセットにより生成される誘電泳動力を使用して、増殖したＯＫＴ３細胞のうちの選択された細胞の搬出を示す。図１３Ａでは、誘電泳動力を開始する光のパターン（すなわち、矢印１３０２が指すライトトラップ）は、細胞周囲の白色の枠として示されている。細胞は、光学作動誘電泳動力により、成長室の下部からフローチャネルに向けて移動した。図１３Ｂの写真は、増殖したＯＫＴ３細胞のフロー領域への更なる移動を示す。細胞はなおもライトトラップ内に捕捉されており、ライトトラップと共に強制的に移動された（矢印１３０４）。図１３Ｃの写真は、細胞が完全にフロー領域に移動した後（矢印１３０６）の増殖細胞のリリースを示す。これらの細胞は、更なる研究のために、又は光学作動ＤＥＰ力、重力、若しくは流体フローの使用による増殖のためにマイクロ流体デバイスから搬出された。
この実験は、本明細書に記載されるデバイス及び方法の使用により提供される選択性、精密性、及び柔軟性を示す。
例３．マイクロ流体デバイスの調整された表面に無血清培地を使用した接着細胞の除去
システム及びマイクロ流体デバイス：例１と同様に、約７×１０５立方μｍの容積を有する成長室を用いた。
プライミングレジーム：２５０μＬの１００％二酸化炭素を流量１２μＬ／秒で流した。この後、０．１％Pluronic（登録商標）Ｆ２７（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含む２５０μＬのＰＢＳを１２μＬ／秒で流した。２５０μＬのＰＢＳを含むプライミングの最終ステップを１２μＬ／秒で流した。培養培地の導入が続いた。
かん流レジーム：かん流方法は以下の２つの方法のいずれかであった。
１．０．０１μＬ／秒で２時間かん流；２μＬ／秒で６４秒かん流；繰り返す。
２．０．０２μＬ／秒で１００秒かん流；フローを５００秒間停止：２μＬ／秒で６４秒かん流；繰り返す。
培養培地：無血清培地（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１２０４５−０９６）。
システム及びマイクロ流体デバイス：培養後のマイクロ流体デバイスのフローチャネルからの接着細胞の除去能力が、３０分間にわたり３６℃において調整培養培地添加剤Ｂ−２７（登録商標）サプリメント（２％ｖ／ｖ）を用いて無血清培養培地内で接着細胞（例えば、AddexBioカタログ番号Ｃ０００６０５から市販されているＪＩＭＴ１細胞であり得る）を事前に培養することにより示される。事前培養後、接着細胞をフローチャネルに導入し、フローを停止し、接着細胞を２時間〜２４時間の期間にわたり培養する。アッセイの完了後、無血清培養培地のフローを流量５μＬ／秒で導入する。マイクロ流体デバイス容積の約１５０×を表す約７５０μＬのフローがマイクロ流体デバイスを通過し、全ての付着ＪＩＭＴ１細胞はフローチャネル及びマイクロ流体チャネルから搬出される。この実験は、市販されているＢ２７等のサプリメント的成分を含み得る無血清培地が、付着レポーター細胞を組み込んだアッセイの過程中に付着を阻止することができ、マイクロ流体デバイスから接着細胞を搬出可能なことを示す。
例４．マイクロ流体デバイスの調整された表面に調整混合物を使用した接着細胞の除去
接着細胞：例３と同様。
培養培地：ＦＢＳ（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１６０００−０３６から市販）及びペニシリン−ストレプトマイシン（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１５１４０−１６３）を含むが、これに限定されない成分が添加された無血清培養培地（ThermoFisher Scientific、カタログ番号１２０４５−０７６）。
調整混合物：サイトカラシンＢ（Sigma Aldrich、カタログ番号Ｃ２７４３−２００ＵＬ）、DNase1（New England Biosciences、カタログ番号Ｍ０３０３Ｓ）、及びＲＧＤトリペプチド（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号ｓｃ−２０１１７６）。
接着細胞の準備：調整混合物を用いて、最終濃度４マイクロモルサイトカラシンＢ、０．１単位／μＬ DNase1、及び１ミリモルＲＧＤトリペプチドを有するように培養培地を改変する。マイクロ流体デバイスに搬入する前に接着細胞を３６℃で３０分間にわたり培養する。
システム及びマイクロ流体デバイス：上と同様に、約７×１０５立方μｍの容積を有する成長室を用いた。
培養後、マイクロ流体デバイスのフロー領域から接着細胞（例えば、ＪＩＭＴ１細胞）を除去する能力が、調整混合物を用いて、事前に培養された接着細胞集団を事前に培養することにより示される。特に、調整混合物の使用により、接着細胞の除去をなお提供しながら、マイクロ流体環境内で、この例で使用される培地等の血清含有培地の使用が可能になる。
事前に培養した接着細胞をマイクロ流体デバイスのフローチャネルに導入し、接着細胞を２時間〜２４時間の期間にわたり培養する。アッセイの完了後、培養培地のフローを流量５μＬ／秒で導入する。マイクロ流体デバイス容積の約１５０×を表す約７５０μＬのフローがマイクロ流体デバイスを通過し、全ての接着細胞はフローチャネル及びマイクロ流体チャネルから搬出される。この実験は、調整混合物が付着を阻止し、接着細胞の搬出を可能にすることを示す。
例５．調整された表面を有するマイクロ流体デバイスの準備
全ての準備に関して：マイクロ流体デバイス：例１と同様に、Berkeley Lights, Inc.製であり、受け取った状態のまま使用する。全ての事例で、調整された表面の合成前に、シリコーン（ＰＰＳ）がパターニングされたシリコン基板及びＩＴＯ／ガラス基板をNordson Asymtekプラズマクリーナー（１００Ｗ電力、５０秒）で酸素プラズマクリーニングした。
Ａ．ペルフルオロアルキルシロキシの調整された表面
材料：ヘプタデカルフルオロ−１，１，２，２−テトラハイドロデシルトリメトキシシランをGelest（カタログ番号ＳＩＨ５８４１．５）から取得し、受け取ったまま使用した。ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ（Acros）を受け取ったまま使用した。
準備方法：組み立てられたマイクロ流体デバイスを減圧下、高温でヘプタデカルフルオロ−１，１，２，２−テトラハイドロデシルトリメトキシシラン及び水蒸気に曝すことにより、化学的に修飾した。ヘプタデカルフルオロ−１，１，２，２−テトラハイドロデシルトリメトキシシラン３００μＬ及びＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ（水源）０．５ｇを清潔で乾燥した６インチ（約１５．２ｃｍ）のガラス真空デシケータの下部にある別個のアルミニウムボートに添加した。マイクロ流体デバイスをシラン試剤及び含水塩（水源）の上で穿孔板上において支持した。デシケータを室温で７５０ｍトールまでポンピングし、封止した。次に、デシケータを１１０℃オーブンに２４時間配置した。次に、ペルフルオロアルキルの調整された表面を有するマイクロ流体デバイスをデシケータから取り出し、使用した。
幾つかの実験では、マイクロ流体デバイスは、プリント回路基板に搭載される前に化学的に修飾された。
Ｂ．デキストランの調整された表面
材料：臭化物部分をアジ化ナトリウムで置換することにより、１１−ブロモウンデシルトリメトキシシラン（Gelest）から１１−アジドウンデシルトリメトキシシランを合成した。典型的な反応では、乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Acros）６０ｍＬ中にアジ化ナトリウム（Sigma-Aldrich）２．００ｇを含む溶液に１１−ブロモウンデシルトリメトキシシラン（Gelest）４．００ｇを添加した。この溶液を室温において窒素下で２４時間攪拌した。次に、溶液を濾過し、乾燥ペンタン（Acros）を用いて濾液を抽出した。１１−アジドウンデシルトリメトキシシラン粗生成物を回転蒸発により濃縮し、２つの連続した真空蒸留により精製した。
ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）修飾デキストラン（ＭＷ約３０００Ｄａ）をNanocsから購入し、受け取ったまま使用した。
準備方法、表面修飾リガンドの導入
減圧下、高温で、組み立てられたマイクロ流体デバイスの表面を１１−アジドウンデシルトリメトキシシラン及び水蒸気に曝すことにより、化学的に修飾した。１１−アジドウンデシルトリメトキシシラン３００μＬ及びＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ（水源）０．５ｇを清潔で乾燥した６インチ（約１５．２ｃｍ）のガラス真空デシケータの下部にある別個のアルミニウムボートに添加した。マイクロ流体デバイスをシラン及び含水塩（水源）の上で穿孔板上において支持した。デシケータを室温で７５０ｍトールまでポンピングし、封止した。次に、デシケータを１１０°Ｃオーブンに２４時間配置した。次に、１１−アジドウンデシルシロキシ部分である表面修飾リガンドを有するマイクロ流体チップをデシケータから取り出した。幾つかの実験では、プリント回路基板に搭載する前にマイクロ流体デバイスを化学的に修飾した。
デキストランの調整された表面の導入
１６６マイクロモルＤＢＣＯデキストランを含む少なくとも２５０μＬの水溶液を、蒸着後、表面修飾アジドリガンドを有するマイクロ流体デバイスに流すことにより、アジド末端マイクロ流体デバイス表面をＤＢＣＯデキストランと反応させた。反応を室温で少なくとも１時間進めさせた。次に、少なくとも２５０μＬのＤＩ水をチップに流すことによりチップを濯いだ。
Ｃ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の調整された表面
材料：上記のように１１−アジドウンデシルトリメトキシシランを合成した。アルキン修飾ＰＥＧ（ＭＷ約５０００Ｄａ）をJenKemから購入し、受け取ったまま使用した。アスコルビン酸ナトリウム及び硫酸銅五水和物をSigma-Aldrichから購入し、受け取ったまま使用した。（３［トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン）ＴＨＰＴＡ銅触媒クリック試剤（Glen Research）。
準備方法、表面修飾リガンドの導入
上記のように１１−アジドウンデシルシロキシ表面修飾リガンドを有するマイクロ流体チップを準備した。
ＰＥＧの調整された表面の導入
３３３マイクロモルのアルキン修飾ＰＥＧ、５００マイクロモルの硫酸銅、５００マイクロモルのＴＨＰＴＡリガンド、及び５ミリモルのアスコルビン酸ナトリウムを含む少なくとも２５０μＬの水溶液を、１１−アジドウンデシルシロキシ表面修飾リガンドを有するマイクロ流体デバイスに流すことにより、マイクロ流体デバイスのアジド末端表面をアルキレン修飾ＰＥＧと反応させた。反応を室温で少なくとも１時間進めさせた。次に、少なくとも２５０μＬの脱イオン水をデバイスに流すことにより、ＰＥＧの調整された表面を有するマイクロ流体デバイスを濯いだ。
Ｄ．表面に対してホスホン酸エステル結合基を有するアルキル修飾表面
材料：オクタデシルホスホン酸をSigma Aldrichから購入し、受け取ったまま使用した。アセトン及びエタノールをSigma Aldrichから購入した。
準備方法
マイクロ流体デバイスの表面を乾燥エタノール中の１０ミリモルのオクタデシルホスホン酸溶液に３５℃で４８時間曝す。堆積後、その結果得られた、ホスホン酸エステル結合基を介して取り付けられたアルキルの調整された表面を有するマイクロ流体デバイスを多量のエタノール及びＤＩ水で濯いだ。
例６：調整マイクロ流体表面でのＴリンパ球の培養及び搬出
材料：AllCells Inc.からのＣＤ３＋細胞、１ビーズ／１細胞の比率で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズ（Dynabeads（登録商標）、Thermofisher Scientificカタログ番号１１４５３Ｄ）と混合する。混合物を培養実験自体と同じ培地において、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃において５時間にわたり培養した。培養に続き、Ｔ細胞／ビーズ混合物を使用のために再懸濁した。
培養培地：ＲＰＭＩ−１６４０（GIBCO（登録商標）、ThermoFisher Scientific、カタログ番号１１８７５−１２７）、１０％ＦＢＳ、２％ヒトＡＢ血清（５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ２；R&D Systems）
プライミング手順：例３と同様。
かん流レジーム：例３と同様。
システム及びマイクロ流体デバイス：例３と同様。成長室は約７×１０５立方μｍの容積を有する。
調整された表面：マイクロ流体デバイスは、上述したように準備された、共有結合されたデキストランの調整された表面を有した。
再懸濁液を、流体流入口を通してマイクロ流体チャネルに流すことにより、Ｔ細胞にビーズを加えた）懸濁液をマイクロ流体デバイスに導入した。フローを停止させ、チップを傾斜させ、重力にＴ細胞／ビーズを成長室内に引き落とさせることにより、Ｔ細胞／ビーズを成長室にランダムに装填した。
Ｔ細胞／ビーズを成長室に装填した後、４日の期間にわたり、ナノ流体チップのマイクロ流体チャネルに培養培地をかん流させた。図１４Ａは、マイクロ流体デバイスの成長室のデキストランの調整された表面上のＴ細胞の成長を示した。デキストランの調整された表面上のＴ細胞の成長は、同様のマイクロ流体デバイス（データ図示せず）の非調整表面と比較して改善した。
次に、重力（例えば、マイクロ流体デバイスを傾斜させること）により、Ｔ細胞を成長室から取り出した。図１４Ｂは、２０分期間の終了時の成長室からの取り出しの広がりを示し、増殖したＴ細胞をフローチャネルに搬出する優れた能力を示し、この能力は、同様のマイクロ流体デバイスの非調整表面からのＴ細胞の取り出し能力と比較して改善した。次に、Ｔ細胞をマイクロ流体デバイス（図示せず）から搬出した。
ここに示される例は例示であり、説明全体を通して説明される方法及び装置の範囲を決して限定しない。

Claims (90)

  1. １つ又は複数の生体細胞を培養するマイクロ流体デバイスであって、
    第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、
    分離領域及び接続領域を含む少なくとも１つの成長室であって、前記分離領域は前記接続領域に流体接続され、前記接続領域は前記フロー領域への基端開口部を含む、少なくとも１つの成長室と
    を含み、
    前記少なくとも１つの成長室は、前記マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を更に含む、マイクロ流体デバイス。
  2. 前記少なくとも１つの調整された表面は、前記マイクロ流体デバイス内での細胞可搬性を支持する１つ又は複数の作用剤を用いて調整される、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  3. 前記少なくとも１つの調整された表面は、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを用いて調整される、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
  4. 前記少なくとも１つの調整された表面は、サッカリド部分を含むポリマーを用いて調整される、請求項１から３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  5. 前記少なくとも１つの調整された表面は、アミノ酸部分を含むポリマーを用いて調整される、請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  6. 前記マイクロ流体デバイスの前記少なくとも１つの調整された表面は、カルボン酸部分、スルホン酸部分、核酸部分、又はホスホン酸部分を含むポリマーを用いて調整される、請求項１から５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  7. 前記少なくとも１つの調整された表面は、前記マイクロ流体デバイスの表面に共有結合された結合基を含み、前記結合基は、前記マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合される、請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  8. 前記結合基は、シロキシ結合基である、請求項７に記載のマイクロ流体デバイス。
  9. 前記少なくとも１つの調整された表面は、アルキル又はフルオロアルキル部分を含む、請求項７又は８に記載のマイクロ流体デバイス。
  10. 前記アルキル又はフルオロアルキル部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有する、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
  11. 前記結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された前記部分にリンカーを介して間接的に結合される、請求項７から１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  12. 前記リンカーは、トリアゾリレン部分を含む、請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
  13. 前記少なくとも１つの調整された表面は、サッカリド部分を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  14. 前記少なくとも１つの調整された表面は、アルキレンエーテル部分を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  15. 前記少なくとも１つの調整された表面は、アミノ酸部分を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  16. 前記少なくとも１つの調整された表面は、双性イオンを含む、請求項７から１５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  17. 前記少なくとも１つの調整された表面は、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  18. 前記少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、ＲＧＤ含有ペプチドである、請求項１７に記載のマイクロ流体デバイス。
  19. 前記少なくとも１つの細胞接着ブロック分子は、２種類以上の細胞接着ブロック分子の組合せである、請求項１７又は１８に記載のマイクロ流体デバイス。
  20. 前記調整された表面は、開裂可能部分を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  21. 前記マイクロ流体デバイスの前記少なくとも１つの調整された表面は、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  22. 前記マイクロ流体デバイスは、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を有する基板を更に含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  23. 前記ＤＥＰ構成は、光学的に作動される、請求項２２に記載のマイクロ流体デバイス。
  24. 前記少なくとも１つの成長室は、哺乳類細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  25. 前記少なくとも１つの成長室は、免疫細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  26. 前記免疫細胞は、リンパ球又は白血球である、請求項２５に記載のマイクロ流体デバイス。
  27. 前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、又は樹状細胞である、請求項２５に記載のマイクロ流体デバイス。
  28. 前記少なくとも１つの成長室は、接着細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  29. 前記少なくとも１つの成長室は、ハイブリドーマ細胞の細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  30. 前記少なくとも１つの成長室は、単一の細胞及び生体細胞の対応するクローンコロニーの細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  31. マイクロ流体デバイスにおいて１つ又は複数の生体細胞を培養するシステムであって、
    マイクロ流体デバイスを含み、
    前記マイクロ流体デバイスは、
    第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、
    前記マイクロ流体デバイスでの細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を有する、少なくとも１つの成長室と
    を含む、システム。
  32. 前記マイクロ流体デバイスは、請求項１から３０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスのうちの任意の１つである、請求項３１に記載のシステム。
  33. 少なくとも前記第１の流体培地をかん流させるように構成されたフローコントローラを更に含む、請求項３１又は３２に記載のシステム。
  34. 前記コントローラは、前記少なくとも第１の流体培地を非連続的にかん流させるように構成される、請求項３３に記載のシステム。
  35. 前記マイクロ流体デバイスは、１つ又は複数の生体細胞を前記成長室内に導入するか、又は前記１つ又は複数の生体細胞を前記成長室外に移動させるように構成された誘電泳動（ＤＥＰ）構成を有する基板を更に含む、請求項３１から３４のいずれか一項に記載のシステム。
  36. 前記ＤＥＰ構成は、光学的に作動される、請求項３５に記載のシステム。
  37. 前記第１の流体培地を含むように構成されたリザーバを更に含み、前記リザーバは、前記マイクロ流体デバイスに流体接続される、請求項３１から３６のいずれか一項に記載のシステム。
  38. 前記リザーバは、溶解ガス分子で前記第１の流体培地を飽和させることが可能なガス環境によって接触されるように構成される、請求項３７に記載のシステム。
  39. 前記マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流入口に接続されたセンサを更に含み、前記センサは、前記第１の流体培地のｐＨを検出するように構成される、請求項３１から３８のいずれか一項に記載のシステム。
  40. 少なくとも１つの流出口に接続されたセンサを更に含み、前記センサは、前記第１の流体培地が前記マイクロ流体デバイスを出る際、前記第１の流体培地のｐＨを検出するように構成される、請求項３１から３９のいずれか一項に記載のシステム。
  41. 前記センサは、光学センサである、請求項３９又は４０に記載のシステム。
  42. 前記少なくとも１つの成長室及び前記成長室に含まれる任意の生体細胞の画像を捕捉するように構成された検出器を更に含む、請求項３１から４１のいずれか一項に記載のシステム。
  43. 誘電泳動（ＤＥＰ）構成及び表面を含む基板と、
    前記基板の前記表面の酸化物部分に共有結合された調整された表面と
    を含む組成物。
  44. 前記調整された表面は、前記表面の前記酸化物部分に共有結合された結合基を含み、前記結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合される、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記結合基は、シロキシ結合基である、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された前記部分に間接的に結合される、請求項４４又は４５に記載の組成物。
  47. 前記結合基は、リンカーの第１の端部への接続を介して、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された前記部分に間接的に結合される、請求項４４から４６のいずれか一項に記載の組成物。
  48. 前記リンカーは、線状部を更に含み、前記線状部の骨格は、ケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子を含む群の任意の組合せから選択される１から２００個の非水素原子を含む、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記リンカーは、トリアゾリレン部分を更に含む、請求項４７又は４８に記載の組成物。
  50. 細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された前記部分は、アルキル、フルオロアルキル、モノ若しくはポリサッカリド、アルコール、ポリアルコール、アルキレンエーテル、高分子電解質、アミノ基、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸アニオン、カルボキシベタイン、スルホベタイン、スルファミン酸、又はアミノ酸を含む、請求項４３から４９のいずれか一項に記載の組成物。
  51. 前記少なくとも１つの調整された表面は、アミノ酸、アルキル部分、ペルフルオロアルキル部分、デキストラン部分、及び／又はアルキレンエーテル部分を含む、請求項４３から５０のいずれか一項に記載の組成物。
  52. 前記調整された表面は、１つ又は複数の開裂可能部分を更に含む、請求項４３から５１のいずれか一項に記載の組成物。
  53. 前記開裂可能部分は、前記調整された表面の分裂を可能にし、それにより、培養後に前記１つ又は複数の生体細胞の可搬性を促進するように構成される、請求項５２に記載の組成物。
  54. 生体細胞を培養するキットであって、
    マイクロ流体デバイスを含み、
    前記マイクロ流体デバイスは、第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域を含み、
    少なくとも１つの成長室は、前記マイクロ流体デバイス内での細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を更に含む、キット。
  55. 前記マイクロ流体デバイスは、請求項１から３０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスである、請求項５４に記載のキット。
  56. 前記マイクロ流体デバイスの前記少なくとも１つの調整された表面は、アルキル部分、フルオロアルキル部分、モノ若しくはポリサッカリド部分、アルコール部分、ポリアルコール部分、アルキレンエーテル部分、高分子電解質部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、カルボキシベタイン部分、スルホベタイン部分、スルファミン酸部分、又はアミノ酸部分を含む、請求項５４又は５５に記載のキット。
  57. 前記マイクロ流体デバイスの前記少なくとも１つの調整された表面は、サッカリド部分、アルキレンエーテル部分、アルキル部分、フルオロアルキル部分、又はアミノ酸部分の少なくとも１つを含む、請求項５４から５６のいずれか一項に記載のキット。
  58. 前記アルキル又はフルオロアルキル部分は、１０炭素を超える骨格鎖長を有する、請求項５７に記載のキット。
  59. 前記少なくとも１つの調整された表面は、前記マイクロ流体デバイスの表面に共有結合された結合基を含み、前記結合基は、前記マイクロ流体デバイス内での前記１つ又は複数の生体細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合される、請求項５４から５８のいずれか一項に記載のキット。
  60. 前記結合基は、シロキシ結合基である、請求項５９に記載のキット。
  61. 前記結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された前記部分に間接的に結合される、請求項５９又は６０に記載のキット。
  62. 前記結合基は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された前記部分にリンカーを介して間接的に結合される、請求項６１に記載のキット。
  63. 表面調整試剤を更に含む、請求項５４から６２のいずれか一項に記載のキット。
  64. 前記表面調整試剤は、アルキレンエーテル部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、ホスホン酸部分、アミノ酸部分、核酸部分、又はサッカリド部分の少なくとも１つを含むポリマーを含む、請求項６３に記載のキット。
  65. 前記表面調整試剤は、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を含む、請求項６３に記載のキット。
  66. 前記表面調整試剤は、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を含む、請求項６３に記載のキット。
  67. 成長室の前記少なくとも１つの表面の前記調整を補うように構成された試剤を含む培養培地添加剤を更に含む、請求項５４から６６のいずれか一項に記載のキット。
  68. 前記調整された表面は、開裂可能部分を含む、請求項５４から６７のいずれか一項に記載のキット。
  69. 前記調整された表面の前記開裂可能部分を開裂させるように構成された試剤を更に含む、請求項６８に記載のキット。
  70. 第１の流体培地のフローを含むように構成されたフロー領域と、少なくとも１つの成長室とを有するマイクロ流体デバイスにおいて少なくとも１つの生体細胞を培養する方法であって、
    前記少なくとも１つの生体細胞を前記少なくとも１つの成長室に導入するステップであって、前記少なくとも１つの成長室は、細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように調整された少なくとも１つの表面を有するように構成される、ステップと、
    少なくとも、生体細胞のコロニーを生成するように前記少なくとも１つの生体細胞を増殖させるのに十分に長い時間にわたり、前記少なくとも１つの生体細胞を培養するステップと
    を含む方法。
  71. 前記マイクロ流体デバイスは、請求項１から３０のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスである、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記少なくとも１つの調整された表面は、前記表面に共有結合された結合基を含み、前記結合基は、前記マイクロ流体デバイス内での前記１つ又は複数の生体細胞の成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持するように構成された部分に結合される、請求項７０又は７１に記載の方法。
  73. 前記少なくとも１つの調整された表面は、アルキル又はペルフルオロアルキル部分を含む、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記少なくとも１つの調整された表面は、アルキレンエーテル部分又はデキストラン部分を含む、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を調整することを更に含む、請求項７０から７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 調整することは、ポリマーを含む調整試剤を用いて前記少なくとも１つの成長室の少なくとも表面を処理することを含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 調整することは、哺乳類血清の１つ又は複数の成分を用いて前記少なくとも１つの成長室の少なくとも表面を処理することを含む、請求項７５又は７６に記載の方法。
  78. 調整することは、少なくとも１つの細胞接着ブロック分子を用いて前記少なくとも１つの成長室の少なくとも１つの表面を処理することを含む、請求項７５から７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記少なくとも１つの生体細胞を前記少なくとも１つの成長室に導入することは、前記少なくとも１つの生体細胞を移動させるのに十分な強度を有する誘電泳動（ＤＥＰ）力を使用することを含む、請求項７０から７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記ＤＥＰ力は、光学的に作動される、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記培養するステップ中に前記第１の流体培地をかん流させることを更に含み、前記第１の流体培地は、前記マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流入口を介して導入され、且つ前記マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの流出口を介して搬出され、前記第１の流体培地は、搬出されると任意選択的に第２の流体培地からの成分を含む、請求項７０から８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記培養するステップ後に、前記調整された表面の１つ又は複数の開裂可能部分を開裂させ、それにより、前記成長室又はその分離領域から前記フロー領域への前記１つ又は複数の生体細胞の搬出を促進するステップを更に含む、請求項７０から８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記成長室又はその前記分離領域から前記フロー領域に前記１つ又は複数の生体細胞を搬出するステップを更に含む、請求項７０から８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記少なくとも１つの生体細胞は、哺乳類細胞である、請求項７０から８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記少なくとも１つの生体細胞は、免疫細胞である、請求項７０から８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記免疫細胞は、リンパ球又は白血球である、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、又は樹状細胞である、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記少なくとも１つの生体細胞は、接着細胞である、請求項７０から８５のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記少なくとも１つの生体細胞は、ハイブリドーマ細胞である、請求項７０から８５のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記少なくとも１つの生体細胞を前記少なくとも１つの成長室に導入することは、単一の細胞を前記成長室に導入することを含み、前記培養するステップによって生成された生体細胞の前記コロニーは、クローンコロニーである、請求項７０から８９のいずれか一項に記載の方法。
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