CN102099666B - 用于从溶液浓缩颗粒的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于浓缩悬浮在液体中的颗粒(例如，细菌、病毒、细胞和核酸)的方法和系统。电场感应力将颗粒驱向浸在液体中的第一电极。当颗粒靠近(例如接触)第一电极时，从液体中撤出电极，撤出的电极与液体表面之间形成的毛细管作用力将颗粒固定在电极上。当从液体撤出电极时，之前浸入液体的电极部分具有固定在其表面上的颗粒。

Description

用于从溶液浓缩颗粒的方法和系统
交叉参考相关申请
本申请要求2008年6月6日提交的美国临时申请61/059708和2008年10月27日提交的美国临时申请61/108799的权益，所述申请各自以其全文通过引用合并入本文。
政府许可权的申明
本发明是在国家科学基金会拨给的基金号0740525下和在由疾病控制中心拨给的基金号200-2007-M-22794下由政府资助进行的。政府具有本发明的某些权利。
背景
结核病(TB)，当今全球传播最广的疾病之一，已感染了三分之一的世界人口。在2006年，报导了九百二十万例新TB病例，一百七十万例涉及死亡，大部分发生在发展中国家。在2006年，在美国报导了大约15,000例新TB病例。因为具有活动但未治疗的TB的患者每年可传染平均10至15人，因此新TB患者的快速诊断是有效控制该疾病所必需的。
目前，存在多种用于TB诊断的技术。然而，可供利用的方法都不具有低检测限、分析时间和成本的优良组合。具有低检测限的此类技术非常费时，而相对快速的检测又具有高检测限并且通常需要通过(慢)测试来最终确认。尽管存在用于检测TB的成熟技术，但仍然需要改进的检测方法来在全球范围内对付该疾病。
另一种目的分析物是细胞外DNA，其在疾病诊断学和环境分子生物学领域中是极其吸引人的。与活细胞中的基因组DNA不同，细胞外DNA是从濒死细胞释放的游离DNA。因此，体液中循环的细胞外DNA可用作不同急性病例如癌症的早期指示剂。例如，健康人的细胞外DNA的浓度为大约30ng/mL，但对于癌症患者其浓度增加至大约300ng/mL。
为了进行环境监控，溶解在湖泊和土壤中的细胞外DNA是环境质量的指示剂，因为溶解的DNA是由细胞裂解和活生物体的排泄物产生的。
尽管极具吸引力，但细胞外DNA的研究受到目前利用的标准样品制备方法的阻碍。常规方法从粗制样品过滤、离心和收集DNA开始。样品制备过程通常需要数小时，这可降解和突变细胞外DNA。结果，细胞外DNA的原始信息在分析前就部分或完全丢失。因此，可浓缩细胞外DNA的快速方法对于鉴定病原体信息是非常重要的。
TB和细胞外DNA的上述实例是科学上重要的分析物，目前使用较慢的、低效的和不足的方法检测其。用于从溶液提取颗粒分析物例如TB和DNA的改进方法将通过改善用于疾病例如TB和癌症的测试的效率、成本和准确性而为全球卫生提供极大的益处。
概述
在一个方面，提供了用于浓缩颗粒的方法，其包括将具有高高宽比(aspect ratio)的第一电极浸入含有颗粒的液体，其中第一电极包含具有杆纬向尺寸(shaft latitudinal dimension)的杆和具有远端纬向尺寸(distal latitudinal dimension)的远末端，其中所述远端纬向尺寸为1纳米至1毫米；通过使用该第一电极产生电场感应力来将颗粒驱向第一电极；和利用毛细管作用力(通过从液体撤出第一电极而在第一电极与液体之间形成的)将颗粒固定在第一电极的表面上。
在另一个方面，提供了颗粒浓缩系统，其包含具有高高宽比的第一电极，其中第一电极包含具有杆纬向尺寸的杆和具有远端纬向尺寸的末端，其中所述远端纬向尺寸为1纳米至1毫米，第一液体包含第一颗粒；执行器，所述执行器的大小和构造适于用来将第一电极浸入第一液体和从其中撤出，以便在抽出的第一电极与第一液体之间形成的毛细管作用力将第一颗粒固定在第一电极的表面上；和电信号发生器，所述电信号发生器的大小和构造设计为利用第一电极产生电感应力，以便当将第一电极浸入第一液体时，优先将第一颗粒驱向第一电极。
在另一个方面，提供了用于浓缩颗粒的方法，其包括：将具有高高宽比的第一电极浸入含有颗粒的液体中，其中所述第一电极包含具有杆纬向尺寸的杆和具有远端纬向尺寸的末端，其中所述远端纬向尺寸为1纳米至1毫米；和通过使用第一电极产生电场感应力来将颗粒驱向第一电极。
附图概述
当结合附图参考下列详细描述时，本发明的上述方面和许多相伴的有利方面将变得更容易理解和领会，其中：
图1A是本发明代表性实施方案的一部分的图解说明，所述实施方案包括通过由第一电极产生的电场感应介电泳力驱动的液体中颗粒向第一电极的基本上线性的运动；
图1B是图1A中举例说明的本发明代表性实施方案的一部分的图解说明，其中从液体中撤出第一电极，并且作为毛细管作用力固定颗粒的结果，第一电极使颗粒从液体浓缩在其表面上，所述颗粒通过电场感应介电泳力被吸引至第一电极；
图2是本发明代表性实施方案的一部分的图解说明，所述实施方案包括通过电场感应电渗力驱动的液体中颗粒向第一电极的循环运动；
图3是本发明代表性实施方案的一部分的图解说明，所述实施方案包括液体中颗粒上介电力和电渗力的组合驱动颗粒朝向第一电极，所述第一电极包含能够结合附着至颗粒的第二结合伴侣的第一结合伴侣；
图4A和4B是可用于本发明的由碳化硅和碳纳米管制造的代表性第一电极的显微照片；
图4C和4D是可用于本发明的涂有聚合物的第一电极的显微照片；
图5A-5C是在进行本发明的方法后由碳化硅和碳纳米管制造的并且具有固定在其表面上的聚合物颗粒的代表性第一电极的显微照片；
图6A-6C是具有DNA固定在其表面上的本发明代表性第一电极的显微照片；
图6D是通过本发明的方法分析的一系列DNA溶液的DNA浓度对荧光强度的图；
图7是通过本发明的方法分析的一系列DNA和细胞的溶液的DNA浓度对荧光强度的图；
图8A是具有TB细胞固定在其表面上的第一电极的显微照片；
图8B是通过本发明的方法分析的一系列TB溶液的TB细胞浓度对荧光强度的图；
图9A是比较参照溶液和含有TB的溶液中第一电极的外施电压和测量的电流的图；
图9B是通过本发明的方法分析的一系列包含TB的溶液的TB细胞浓度对标准化电流的图；
图10是具有DNA在其表面上杂交的第一电极和不具有DNA的参照第一电极的电压对电流的图；
图11A是使用本发明的方法进行DNA杂交的AC电压对荧光的图；
图11B是使用本发明的方法进行DNA杂交的DNA杂交时间对荧光的图；
图12是通过本发明的方法将HIV固定在其表面上的第一电极的显微照片；
图13A是第一电极在用于本发明方法之前的荧光显微照片；
图13B是图13A中画出的第一电极在进行本发明方法后的荧光显微照片，其中HIV被固定在电极的表面上；
图14是作用于固定在根据本发明电极上的颗粒的力的图解说明；
图15A是当颗粒被固定在从液体撤出的电极上时液体与不同大小的颗粒之间形成的临界角的图解说明；
图15B是当颗粒被固定在从液体撤出的电极上时液体与不同大小颗粒之间形成的分离角(split angle)的图；
图16A是作用于固定在从液体撤出的电极上的颗粒的力的图解说明；和
图16B是固定在电极的侧面上的多个颗粒的图解说明。
发明详述
在一个方面，提供了浓缩颗粒的方法，其包括将具有高高宽比的第一电极浸没在含有颗粒的液体中，其中所述第一电极包含具有杆纬向尺寸的杆和具有远端纬向尺寸的远末端，其中所述远端纬向尺寸为1纳米至1毫米；通过使用该第一电极产生电场感应力来驱动颗粒朝向第一电极；和利用通过从液体撤出第一电极而在第一电极与液体之间形成的毛细管作用力将颗粒固定在第一电极的表面上。
提供了用于浓缩悬浮于液体中的颗粒(例如，细菌、病毒、细胞和核酸)的方法和系统。电场感应力驱动颗粒朝向浸入在液体中的第一电极。当颗粒紧靠(例如，接触)第一电极时，从液体撤出电极并且撤出的电极与液体表面之间形成的毛细管作用力将颗粒固定在电极上。在从液体撤出电极时，颗粒被固定在之前浸入液体中的电极的部分上。取决于电极的几何形状，颗粒被固定在远端尖端上、侧面或两者上。与溶液中的颗粒相比较，电极表面上的颗粒更密集地浓缩在电极上，从而改进了颗粒的分析(例如，通过荧光光谱法)。
除了浓缩颗粒以进行分析外，可进一步操作浓缩的颗粒。例如，可贮存电极上的颗粒以待将来使用(例如，使用低温冰冻)或将其引入第二液体(例如，将颗粒原位引入细胞内)。
如将在下文中进一步详细描述的，本文中公开的方法和系统提供了用于就多种医学相关分析物例如细菌(例如，结核)、病毒(例如，HIV)、细胞(例如，果蝇细胞)和核酸(例如，DNA和RNA)分析生物流体的简单、快速和廉价的方法。
例如，已显示本发明的方法通过将TB细菌浓缩和固定在电极上并且用荧光光谱法分析该细菌而在10分钟内直接从人痰中检测结核病(TB)。目前接受的检测TB的方法，即Ziehl-Neelsen涂片试验，通常需要多至3天来完成。因此，在该示例性实施方案中，本发明提供了显著改进的TB检测；另外的实施方案提供了用于检测其他疾病的相似能力。
所述方法从将第一电极浸入含有颗粒的液体中开始。液体通常包含许多颗粒并且颗粒通常是分析物，例如细菌、病毒或待检测的其他靶分子。
第一电极是用导电材料例如金属、掺杂半导体或导电聚合物制造的。金属涂层的绝缘体也可用于该方法，只要可使用第一电极产生足够的电场以产生如下所述的电场感应力即可。
如本文中使用的，术语关于第一电极的″高宽比(aspect ratio)″意指第一电极的直径(例如，远尖端的直径)与浸没在液体中的第一电极的长度的比率。如果电极是圆锥形的，那么电极的平均直径是第一电极的直径的估计。
所述第一电极具有高的高宽比，以便提供相对大的浸没在液体中的表面积。对于具有高高宽比的第一电极，远尖端的直径小于1mm，从而提供了相对小的面积用于在进行该方法过程中产生高强度电场。例如，在一个示例性实施方案中，第一电极的高高宽比提供了足以吸引DNA至使用DEP的电极的强电场。在一个实施方案中，高的高宽比具有1∶1至1∶100的直径∶长度比。
在一个实施方案中，所述第一电极包括尖端(tip)，其中第一电极的尖端是第一电极的远末端并且终止于单个点。第一电极尖端可以是圆锥形的、圆形的或截断的。在一个实施方案中，该远末端是被截断的并且不具有终止于单个点的尖端。
第一电极包括具有杆纬向尺寸的杆和具有远端纬向尺寸的远端尖端。对于圆锥形尖端，远端纬向尺寸比杆纬向尺寸小。对于不具有尖端的圆柱形第一电极，两种纬向尺寸是相等的。
可改变第一电极的形状以适合特殊应用。尖端的几何形状将决定第一电极上通过本发明的方法优先固定颗粒的位置。例如，具有截断的远末端的圆柱形第一电极将倾向于将颗粒浓缩在与圆柱形的截断远末端相对的圆柱体侧面上。
术语“纳米尖端”和“微尖端(microtip)”在本文中用于描述分别具有小于大约1微米的直径和大于大约1微米的直径的第一电极。
所述液体是能够悬浮或溶解颗粒的任何液体。代表性液体包括水、有机溶剂和离子性溶剂。该方法的液体可以是溶液或悬浮液，并且代表性液体包括生物流体，例如血液、痰、粘液和唾液。生物流体特别地通常是高度复杂的，并且包含许多颗粒，包括细菌、细胞、蛋白质、DNA和其他实体。在本发明的一个实施方案中，将第一电极直接浸入从活生物体提取的生物流体例如血液样品、粘液样品、唾液样品或痰样品中。使用本发明的方法将特定的分析物颗粒例如结核病细菌浓缩和固定在第一电极上。在一个实施方案中，在从该活生物体提取和测试之间处理所述生物流体。这样的处理可包括酸和/或碱处理、稀释、化学处理、加热/冷却或制备可用于本方法的样品所必需的其他处理步骤。然而，与一些已知的用于检测例如结核病细菌的方法相比较，本发明的一个好处是不需要或只需要极少的生物流体制备来进行本发明的方法，然而对于已知的方法而言需要样品的大量处理。
将第一电极浸入液体中以使电极靠近待固定的颗粒。将第一电极完全或部分浸入液体。所述方法通过第一电极产生驱动颗粒朝向第一电极表面的电场感应力而持续进行。电场感应力是从第一电极延伸并且作用于颗粒的电动力或介电动力(dielectrokinetic force)。代表性的电场感应力包括介电泳、电渗流、电泳和其组合。在一个实施方案中，在第一电极与和液体接触的第二电极之间产生所述电场感应力。电场感应力通常需要第一电极和第二电极来产生该力。第一电极与液体接触，因为其被浸入液体中。第二电极也与该液体接触，其可以是插入液体的电极或可以是所述液体的支持物，如将针对图1A-3进一步论述的。
第一电极的纬向截面可具有任何形状。代表性的形状包括圆形、三角形和正方形截面。圆锥形电极特别有用，因为可用于制造本发明的第一电极的普通微米或纳米尺寸制造方法产生圆锥形电极(例如，将中尺寸的导线切割成点或将纳米导线装配成圆锥形结构)。代表性的第一电极还包括一些几何形状的截面(例如，正方形)，其然后在逐渐变细的远末端(“尖端”)截断，例如在圆锥形或半球形尖端截断的圆形截面导线。
可用于本发明方法的电场感应力对于本领域技术人员来说是已知的，并且将只在本文中进行简要描述。介电泳(DEP)是其中颗粒中的被诱导偶极子导致颗粒至高或低电势的吸引或排斥(基于DEP效应是正DEP还是负DEP)的介电力(dielectric force)。通常将交流电用于驱动DEP力。在本文中所述的实施方案中，正DEP通常用于将颗粒吸引至第一电极的表面。
电渗在液体中产生流动，所述流动通过导致颗粒浓缩的曳力(drag force)而将颗粒运输至第一电极。当将AC场施加于第一电极时，在第一电极的表面上形成离子层。电极(和所得的双层)的电荷的符号根据电势交替而改变。在这样的情况下，在对表面的切向上产生带电荷离子的静电力，该静电力引起AC电渗流。电场强度随着离第一电极末端的距离增加而减小，流速在电极远末端最大并且沿电极杆向上而快速减小。由于由第一电极上的场强引起非均匀流速，因此在液体中产生旋涡(其将颗粒浓缩在第一电极的附近)。
图1A举例说明其中将第一电极105浸入由第二电极115支持的液体110中的本发明代表性实施方案的简图。许多颗粒120悬浮在液体110中。将电信号发生器125有效地连接至第一电极105和第二电极155以在电极105和115之间施加AC和/或DC信号。依赖于电极105和115的形状、来自电信号发生器125的施加的信号、颗粒120的电/介电性质和液体110的电/介电性质，可产生几个不同的电场感应力来操纵颗粒120。图1A举例说明了颗粒120受DEP影响，从而在应用电场后驱动颗粒120线性朝向第一电极105。箭头130标示颗粒120上的力的方向，并且通常在第一电极105的方向上驱动整个溶液中的颗粒。
图2是与图1A的简图类似的简图，只是图1A与图2之间电场感应力发生变化。在图2中，由电信号发生器125在第一电极105与第二电极115之间产生的电场导致电渗流，如标示电场在液体110内产生流动模式(所述模式在液体110中产生环形循环模式)的椭圆形205所举例说明的。颗粒120受电渗流205影响，并且一些颗粒120被优先驱向第一电极105。
图3举例说明与图1A和2中举例说明的系统相似的系统。图3举例说明电渗流205和DEP 130，并且还包括一层涂铺第一电极105的表面的第一结合伴侣305。第一结合伴侣305优先结合附着至颗粒120的第二结合伴侣。因此，图3中举例说明的系统中有3种力起作用，包括在液体中循环颗粒120的电渗流205；优先驱动颗粒120朝向第一电极105的DEP130；和附着至第一电极105上的第一结合伴侣305，其优先结合附着至颗粒120的第二结合伴侣。所产生的力在颗粒120通过液体110朝向第一电极105(颗粒被浓缩在其表面上)的运动中累积到极值。
本文中公开的方法继续进行使用在第一电极与液体之间形成的毛细管作用力(通过从液体撤出第一电极形成的)将分析物固定在第一电极表面的步骤。
图1B举例说明了图1A中举例说明的实施方案的图解说明，其中已从液体110撤出第一电极105，并且液体110与第一电极105之间的界面上的毛细管作用沿着撤出的第一电极105的表面固定在该界面上捕获的颗粒。例如，在图1A中举例说明了在第一电极105与液体110之间的界面上的颗粒120，在所述图中为了清楚起见以夸张的方式举例说明了表面张力。当从液体110撤出第一电极105时，界面上的表面张力将与第一电极105相邻的颗粒120固定在第一电极105的表面上。图1B举例说明固定在撤出的第一电极105表面上的颗粒120′和其他颗粒120。
颗粒在第一电极从液体中撤出时被固定在其表面上。在从液体中撤出之前，电场感应力和任选地结合伴侣相互作用驱动颗粒紧密靠近第一电极，并且在撤出时，这种与电极的密切靠近结合在电极和液体以及环境大气之间的界面(固体-液体-气体界面)上的毛细管作用力，在颗粒上产生了朝向第一电极表面的力。一旦颗粒被固定在电极上，在从液体中撤出时，多种力作用以将颗粒保持固定在第一电极的表面上，包括静电力、毛细管作用力、化学键合和主动电动力(activeelectrical force)(例如，电信号继续通过第一电极)。
从液体撤出电极的速度可影响固定在第一电极表面上的颗粒的大小和数量。撤出速度范围为1μm/秒至10mm/秒。缓慢的撤出速度用于精确地控制毛细管作用，这可帮助测定捕获的颗粒的大小和数量。较快的撤出速度可用于不需要精确操作的装置(例如便携式和/或一次性装置)。
所述方法可用于固定比第一电极在固体-液体-气体界面处的纬向尺寸(例如，直径)小的颗粒。用于将颗粒固定在第一电极上的力的平衡通常是使得固定在第一电极的表面上的颗粒的直径(假定为球状颗粒)比第一电极的直径(假定圆锥形或圆柱形的第一电极形状)小。
对于圆锥形电极105，如图1A-3中所举例说明的，第一电极的尖端的直径沿着第一电极的圆锥形部分的长度变化。如图1A和1B中举例说明的，线150代表圆锥形第一电极在特定位置上的纬向直径。从液体固定至第一电极上的颗粒120在直径上将全都比第一电极在线150上的直径小。图1A和1B中举例说明的圆锥形第一电极105的直径梯度导致这样的可能性，即在含有多个颗粒大小的液体110中使用这样的第一电极105形状将产生最大颗粒大小的梯度。为了获得较窄的最大颗粒大小分布，可使用圆柱形第一电极。
球状颗粒不是本发明的方法产生固定所必需的。使用球形来代表颗粒(例如在图1A-3中)和描述颗粒(例如，具有“直径”的颗粒)是比较方便的。然而，除了专门形成的微球和纳米球(例如，聚合物或无机纳米球)外，在微米和纳米尺寸上极少有球状颗粒。在一个实施方案中，颗粒的至少一个维度小于第一电极的纬向直径，从而电感应力的合力、第一电极的大小和毛细管作用力一起将颗粒固定在第一电极的表面上。
在一个实施方案中，所述颗粒选自有机颗粒、无机颗粒、病毒、细菌、核酸、细胞和蛋白质。本文中未引述的其他颗粒(包括生物颗粒)也与本文中描述的方法相容。
在一个实施方案中，所述病毒选自柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、人巨细胞病毒、人类疱疹病毒8型、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、黄病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、伊波拉病毒(ebola)、马尔堡病毒(marburg)、汉塔病毒(hanta)、呼肠孤病毒(reovirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncitialvirus)、禽流感病毒和西尼罗病毒。在一个实施方案中，所述细菌选自结核病细菌(tuberculosis)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、沙门氏菌(salmonella)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。在一个实施方案中，所述细胞是果蝇细胞。
在一个实施方案中，第一电极的纬向尺寸小于1mm。在一个实施方案中，第一电极的纬向尺寸大于1nm。在一个实施方案中，第一电极的纬向尺寸为1nm至1mm。如上所描述的，特定的第一电极的形状，例如圆锥形电极，具有不断变化的纬向尺寸，并且此实施方案的尺寸范围是指测量的最小纬向尺寸，即电极的末端尖端。
在一个实施方案中，第一电极至少部分涂有表面涂层。可以为了几个目的涂铺第一电极，包括在电极材料与颗粒和/或液体之间提供缓冲剂；对第一电极功能化以选择性结合颗粒；和对第一电极功能化以选择性排斥特定类型的颗粒(例如，不期望固定的颗粒)。
在一个实施方案中，表面涂层是单层或聚合物层。已知单层例如自装配单层(SAM)提供了通过将特定分子类别接枝至表面来功能化该表面的途径。例如，硫氢基与金之间的键对于本领域技术人员来说是特别熟知的，因此，可用含硫氢基的分子对金第一电极功能化，以产生具有范围从疏水性变化至亲水性的表面性质和此外定制的化学功能性的金第一电极。
聚合物层也可用于涂铺第一电极。在一个实施方案中，所述聚合物是聚硅氧烷。示例性的聚硅氧烷是聚二甲基硅氧烷(PDMS)，其用作第一电极的导电材料与颗粒和液体之间的缓冲剂以保持第一电极材料的完整性。在一个示例性实施方案中，电极是由碳化硅(SiC)纳米线和碳纳米管(CNT)的杂化材料制造的。所述聚合物保护第一电极免受由于对液体的暴露而引起的降解，并且还阻止颗粒例如DNA与第一电极的CNT之间的非特异性结合。
表面涂层至少部分涂铺第一电极，并且，通常整个电极均被涂层覆盖。然而，只选择性涂铺第一电极的部分可用于指导颗粒朝向或离开被涂铺的或未涂铺的第一电极的部分。
在一个实施方案中，表面涂层可增强颗粒在第一电极上的固定。由涂层产生的固定的增强可通过本领域技术人员已知的任何机制来实现。特别地，通过提供优先结合具有相似的疏水或亲水特征的颗粒的疏水或亲水性涂层(例如，第一电极上的氟代烷烃涂层将通过疏水-疏水相互作用而优先结合具有疏水特征的颗粒)。
在一个实施方案中，表面涂层包含第一结合伴侣，并且颗粒包含能够结合第一结合伴侣的第二结合伴侣。此类结合伴侣的利用提供了当通过使用电场感应力在液体中驱动颗粒靠近第一电极时第一电极与颗粒之间的结合。结合伴侣对于本领域技术人员来说是已知的，并且包括化学结合伴侣、抗体-抗原伴侣、核酸结合(例如，DNA和/或RNA)、酶-底物结合、受体-配体结合、核酸-蛋白质结合和细胞结合(例如，细胞、细胞膜或细胞器与细胞、细胞膜或细胞器的配体的结合)。下文中提供了本发明的方法中第一结合伴侣与第二结合伴侣的结合的几个示例性实施方案。
在将颗粒固定在第一电极上之后，可提供几个任选的额外步骤以进一步处理浓缩的颗粒，包括固定颗粒的分析、贮存和释放。在一个实施方案中，所述方法包括分析固定在第一电极的表面上的颗粒。
分析可在颗粒的固定之前、期间或之后进行。代表性的分析技术包括在第一电极浸没时进行的技术(例如，电阻检测)，和在溶液外进行的其他技术。代表性的分析技术包括电学、机械、光学和表面成像技术和其组合。在一个实施方案中，光学分析包括将发光化合物(例如，荧光标记物)连接至颗粒(例如，DNA分子)以提供发光颗粒和使用荧光显微镜和/或荧光光谱法检测来自发光颗粒的发光的步骤。
可将固定的颗粒浸入含有与固定颗粒相互作用以产生特殊效应(例如荧光)的化合物的第二液体中。例如，可将固定在电极上的DNA浸入含有当与DNA杂交时发荧光的分子的溶液中。在与DNA杂交后，DNA可通过荧光光谱法检测。
用于分析物颗粒的电学检测的代表性技术包括用于测量电容、电阻、电导、阻抗和其组合的技术。
所述方法还可以贮存第一电极以保存固定的颗粒。在一个代表性的实施方案中，贮存第一电极包括低温冰冻以保存固定的颗粒。低温冰冻任选包括在冷冻前将固定的颗粒浸入冷冻保护剂(例如，DMSO)。可保存贮存的颗粒以待将来使用上述技术进行分析，或可在更迟的时间进行进一步操作。
在一个实施方案中，所述方法还包括释放固定的颗粒，例如将颗粒从第一电极释放至溶液中，从而使这样的溶液富含之前固定的颗粒。释放固定的颗粒可包括将颗粒释放入选自细胞、病毒和细菌的实体中。如下文中进一步描述的，所述方法可用于从一种溶液例如人血液样品选择性浓缩一种类型的颗粒(例如DNA)，然后从血液样品收回第一电极上浓缩的DNA并且将DNA插入第二环境(例如，细胞)，将固定的DNA释放入细胞中以提供富集DNA的第二样品。可使用本文中描述的任意颗粒进行该选择性连接、浓缩和释放顺序，因此，可通过固定和释放所选择的颗粒以形成期望的复合物来获得分子和纳米尺寸的构造物。
可通过操作热能、化学能、电能、机械能或其组合来实现固定和释放。
在一个实施方案中，所述方法包括将相对大的颗粒(例如，细胞)固定在微尖端上和使用纳米尖端固定来自该较大颗粒内部的相对小的颗粒(例如，DNA)。
在一个实施方案中，产生电场感应力包括确定表面涂层的方向。具体地，如果表面涂层是单层分子或薄层聚合物分子，那么提供该电场感应力的电场可能倾向于将表面涂层的分子例如沿着电场线排列-并且该排列可通过提供定向和对齐的表面以在液体中吸引结合至颗粒的结合伴侣来促进第一结合伴侣与第二结合伴侣之间的结合。
在一个实施方案中，第一电极由通过美国专利申请案61/108799(以其全文通过引用合并入本文)中描述的方法形成的碳化硅纳米线和碳纳米管的杂化材料(CNT/SiC)组成。简而言之，所述杂化材料由金属材料(例如具有金涂层的钨)的微米大小的尖端制造。使用超声处理数小时将组合的碳纳米管和碳化硅线分散在分开的容器中。在使用之前合并溶液并且超声处理1小时。将微尖端插入合并的CNT/SiC溶液并且将AC电势施加于该微尖端，然后以大约10μm/秒的速度撤出微尖端，这导致产生碳纳米管束粘附、到碳化硅纳米线上并与之连接在一起，如图4A和图4B的显微照片中所举例说明的。在图4C和4D中举例说明了涂铺有PDMS的CNT/SiC电极。
所述方法还提供了上述的单个第一电极浓缩器(concentrator)的多路形式(multiplexed version)。在该实施方案中，所述方法还包括将具有高高宽比的第三电极浸入含有所述颗粒的液体中；使用第三电极产生电场感应力以便液体中的颗粒被优先驱向第三电极；和从液体撤出第三电极，以使得撤出的第三电极与液体之间形成的毛细管作用力将颗粒固定在第三电极的表面。第三电极与之前描述的实施方案中的第一电极类似。可任选地将第四电极引入该实施方案的方法以便第一电极与第二电极配对，从而在液体中产生一个电场感应力，以及第三与第四电极配对，从而在液体中产生另一个电场感应力。在可选择的实施方案中，将第一电极和第三电极浸入分开的液体实体内(例如，第一电极存在于第一液体内，并且第三电极存在于第二液体中)，其中各液体可包含相同或不同的颗粒。因此，可将几个电极用于从单个液体实体或从多个液体实体浓缩颗粒，例如用于药物候选物筛选或生物测试的平行测定中。此外，通过电极(例如第一电极)的表面功能化，可同时特异性固定和检测和/或贮存多个类别，这可增加处理量以及减少检测成本和时间。
在另一个方面，本发明提供了颗粒浓缩系统。在一个实施方案中，所述颗粒浓缩系统包括具有高高宽比和的第一电极；包含纬向尺寸小于第一电极的纬向尺寸的第一颗粒的第一液体；执行器，所述执行器的大小和构造被设置成将第一电极浸入第一液体和从其撤出，以便在撤出的第一电极与第一液体之间形成的毛细管作用力将第一颗粒固定在第一电极的表面上；和电信号发生器，所述电信号发生器的大小和构造被设置成用第一电极产生电感应力，以便当将第一电极浸入第一液体时，优先将第一颗粒驱向第一电极。
在上文中已通过参考本发明的方法描述了颗粒浓缩系统，并且这样的方面如电极、液体和颗粒均适用于所述方法和系统。
其大小和构造被设置成将第一电极浸入液体和从其中撤出的执行器可以是本领域技术人员已知的任何执行器，在一个优选实施方案中，执行器是机械执行器例如压电执行器或可人工定位的执行器(例如，显微操作器)。执行器具有能够将第一电极的一部分伸入液体和将整个第一电极从液体撤出以便可进一步操作或分析固定的颗粒的移动范围。
电信号发生器可以是本领域技术人员已知的任何信号发生器，例如能够将AC和/或DC信号传递至系统的第一和第二电极的发生器。
还预期包括另外的电极对的系统，并且各电极对的电信号和传动可独立于其他电极对或结合其他电极对来控制。
在另一个方面，提供了用于浓缩颗粒的方法，其包括：将具有高高宽比的第一电极浸入含有颗粒的液体，其中第一电极包含具有杆纬向尺寸的杆和具有远端纬向尺寸的远末端，其中所述远端纬向尺寸为1纳米至1毫米；和通过使用第一电极产生电场感应力而将颗粒驱向第一电极。在本文中已就上述方面和实施方案描述了本实施方案的各种细节(例如，颗粒、电极材料和液体)。
在一个实施方案中，如上所述，使用电场感应力将颗粒固定在第一电极的表面上。固定任选地包括如上所述的结合相互作用。在此实施方案中，电学检测(例如，电阻测量)可用于检测第一电极的表面上的结合事件，如本文中所描述的。
聚合物纳米球的固定和大小选择性
在此示例性的实施方案中，介电泳和毛细管作用力用于将聚苯乙烯纳米球固定在电极上。将CNT/SiC电极(″纳米尖端″)浸入含有纳米球的水溶液，作为钨线圈(用作第二电极)内的2μL微滴形式支持着。在电极之间施加10kHz的20Vpp的AC电势，并且纳米尖端附近的聚苯乙烯球被产生的DEP力吸引至纳米尖端。当以8μm/s的速度从溶液撤出时，球被固定在纳米尖端上，如图5A(450nm的球；525nm的尖端)；图5B(475nm的球；515nm的尖端)和图5C(100nm的球，从100nm的球和6微米的球的混合物中捕获在600nm的尖端上)中举例说明的。图5C举例说明本发明的大小选择性：固定比尖端直径更少的球，然而不固定更大的球。
当电极被一簇球围绕时，多颗粒相互作用可发生并且球被固定至尖端的侧面，如图5B中显示的。围绕电极的簇状构造(clusterformation)在纳米球固定过程中产生，因为球被毛细管作用驱向固体-液体-气体界面。球至界面的递送可通过DEP力结合液体的蒸发和因毛细管作用而引起的压缩力来产生。
除了几何效应和多颗粒相互作用效应外，电极的表面性质和电场效应(例如电湿润)可影响表面张力，从而影响起着固定颗粒作用的力的平衡。此外，还存在分子相互作用力(例如，范德瓦尔斯力)。因此，有几个变量会影响导致颗粒固定在气体-液体-固体介面上的条件，并且各颗粒系统、电感应力、液体和环境条件将产生独特的参数组合而固定靶颗粒。可最优化实验条件以优先固定目的靶颗粒。
DNA的固定
在该示例性实施方案中，将DNA捕获在电极上。在TRIS EDTA(乙二胺四乙酸)缓冲液中制备λ-DNA。通过使用CNT/SiC纳米尖端和AC场，通过介电泳和毛细管作用将λ-DNA浓缩在电极上。图6A-6C举例说明了以小纤维的形式存在于纳米尖端上的捕获的λ-DNA分子。
通过将纳米尖端浸入DNA溶液(浓度：500μg/mL)和从其中撤出，在尖端的末端形成了约400μm长的DNA纤丝。因为许多DNA分子存在于溶液中，因此当从溶液中撤出尖端时分子通过毛细管作用力形成纤丝。图6A是纳米尖端上的捕获DNA的光学显微照片，图6B是相应的荧光显微照片(荧光由与
Figure BDA0000043997500000171
试剂混合的DNA产生)。图6C是图6A的样品的电子显微照片。
固定的DNA的EDS(能谱法，Energy Dispersive Spectroscopy)分析(加速电压：10kV)鉴定了元素，包括C、N、O、Na、Si、P和Cl。C和Si源于SiC纳米线和CNT。Na和Cl存在于缓冲溶液中。还检测到DNA的元素C、N、O和P。特别是P，其是该系统中DNA所独有的元素。因此，纤丝被确认为DNA。在不含DNA的对照样品中未检测到P。
检查了纯样品和混合样品的DNA固定。将具有不同浓度的DNA分子固定在纳米尖端上。通过荧光显微镜检查分析捕获的DNA。以10为系数制备从1pg/mL(32aM)至1μg/mL(32pM)的一系列DNA溶液浓度。图6D是使用本发明方法测量的不同DNA浓度的荧光强度的图。对于每一个DNA浓度重复实验3次。将荧光强度与使用纯
Figure BDA0000043997500000172
试剂测量的阴性对照相比较。用于该实验实例的纳米尖端的检测限是10pg/mL(320aM)。
为了检查从含有细胞的样品混合物中大小特异性地捕获DNA，将果蝇细胞与纯λ-DNA分子混合在TRIS EDTA缓冲液中。制备的DNA浓度为0.67pg/mL(21aM)至0.67μg/mL(21pM)，10倍梯度。图7是将具有从DNA/细胞混合物提取的固定DNA的电极的所检测荧光强度与含有DNA但无细胞的溶液的重复组相比较的图。所得的强度值表明DNA溶液中存在细胞并不影响所述方法的准确性。DNA分子被固定在纳米尖端上，而细胞由于其更大的尺寸和相对更大的毛细管作用力将它们保持在液体中而留在溶液中。因为果蝇细胞的标准化直径(10μm)比纳米尖端直径(544nm)大得多，因此细胞未被捕获在纳米尖端上。然而，在一个接下来的实验中，使用AC电势(20Vpp5MHz)将细胞固定在直径250μm的微尖端上。这种大小特异性捕获使得能够在粗制剂或最低限度处理的样品中进行DNA检测，从而无需纯化样品即可检测DNA，而纯化样品是已知的DNA检测方法所必需的。
还可使用本发明的方法检测游离核酸(例如，循环或溶解的DNA)。循环DNA在疾病诊断和环境分子生物学领域特别引人注意。与正常细胞中的基因组DNA不同，循环DNA是从死亡细胞释放的游离DNA。因此，在体液中循环的细胞外DNA可用作各种急性疾病例如癌症的早期指征。例如，健康人的循环DNA的浓度为大约30ng/mL，但对于癌症患者而言其浓度增加至高达大约300ng/mL。
对于环境监控，溶解在湖泊和土壤中的循环DNA是环境质量的指标。
尽管存在其诊断潜力，但循环DNA的研究受到标准样品制备方法的限制。常规技术始于从粗样品过滤、离心和收集DNA。在此类方案中，基因组DNA被释放出来并且与循环DNA混合。此外，较慢的样品制备过程可降解和突变循环DNA。因此，可浓缩循环DNA的快速方法将是一种有益的诊断和分析工具。
本发明的方法可以直接浓缩和检测游离DNA。例如，将CNT/SiC纳米尖端电极用于从湖水中固定游离DNA。实验结果显示了循环dsDNA(双链DNA)的大小选择性捕获，同时排除使用光学显微镜在粗溶液中观察到的细胞或其他更大的颗粒。通过荧光标记和显微镜检查鉴定了游离DNA。
使用介电泳进行的DNA的序列特异性浓缩
在此示例性实施方案中，在高频AC场下利用感应偶极子(DCP)力矩递送样品溶液中的靶DNA并且将其浓缩在CNT/SiC纳米尖端电极上。通过与固定化的探针DNA进行序列特异性杂交来实现靶DNA的特异性结合。在从溶液撤出纳米尖端的过程中用毛细管作用力促进了DNA最终固定至纳米尖端上。通过荧光和/或电学测量检测捕获的DNA。
假设2mm直径的球状小滴中的靶DNA被浓缩在纳米尖端末端的1μm3区域中，那么浓缩倍数将为大约1010倍。由于这种显著的浓缩效应，因此检测DNA的灵敏度比常规的非酶促生物传感器提高106至108倍。此外，通过高频AC场加速了DNA的杂交，这导致与已知的检测方法所需的数小时或数天相比较，本方法仅需10分钟的检测时间。
在该示例性实施方案中，用聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂铺CNT/SiC纳米尖端以避免DNA分子与纳米尖端的CNT之间的非特异性结合。为了研究尖端传感器的灵敏度，将AC场(5MHz)和杂交时间最优化，得到分别为10Vpp和5分钟的参数。将结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)(MTB)的探针DNA制备为5′-生物素-CAG CGC CGA CAGTCG GCG CTT GTG-3′(SEQ ID No.1)(初始浓度：38.3μM，Invitrogen)。该序列包括MTB rpoB基因(野生型)的密码子531，其被视为TB的系统发育标志，也被当作对利福平(两种常用的一线抗肺结核药中的一种)的敏感性的灵敏指标。将探针DNA固定在纳米尖端的末端。模拟的靶DNA是具有序列5′-CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCGCTG-3′(SEQ ID No.2)的寡核苷酸(初始浓度：35.3μM)。将嵌入染料(
Figure BDA0000043997500000191
，Invitrogen)用于通过荧光确认杂交。按10倍的增量将靶浓度控制在1aM至1nM。测量的检测限为10aM(10-17M，或6,000个拷贝/mL)，这与现有技术中的检测方法例如涂片显微镜检查法相当。
使用电渗流进行的细菌固定
为了进行细菌的无培养检测(culture-free detection)，将微米尺寸的电极(″微尖端″)用于固定和浓缩结核分枝杆菌(MTB)的细菌细胞。用通过AC场产生的循环流(电渗流)浓缩水溶液中的细菌。浓缩的细菌被电渗流和静电引力(电泳)吸引至微尖端表面。在从液体撤出电极的过程中由毛细管作用力导致细菌的最终固定。图8A显示在光学(上)和荧光(下)成像下在其表面上具有固定化MTB细胞的微尖端的显微照片。
使用荧光显微镜检测MTB。为了进行荧光测量，使用特异于MTB的表面抗原的荧光素标记多克隆抗体(ViroStat Inc，Portland，ME)。将具有固定化MTB细胞的微尖端浸入抗体溶液中进行5分钟，用去离子水漂洗。然后在荧光显微镜(Olympus BX-41，Olympus America Inc.，Melville，NY)下检测MTB细胞。
微尖端传感器的灵敏度为至少800个细胞/mL，如图8B中举例说明的。检测在10分钟内完成。这种细菌浓缩方法可从粗制生物样品例如人痰中捕获MTB细菌。为了增强捕获的特异性，可将抗体任选地固定在电极上。
在另外的实施方案中，将固定化的MTB细菌释放入纯水(例如，通过浸入沸水中)以提取其基因组DNA用于使用纳米尖端的种特异性检测，如上文中针对DNA所描述的。由于本发明的方法是非酶促性的，从而不对裂解物中的干扰物质高度易感，因此可通过快速且简单如在裂解/杂交缓冲液中短暂煮沸、然后使用纳米尖端进行本发明提供的方法以选择性捕获释放的DNA的方法来完成DNA的提取。
MTB细胞的电学检测
上述之前的示例性实施方案包括使用光学和/或荧光检测进行的固定化颗粒的检测。在此示例性实施方案中，将电学检测用于MTB检测。
将XYZ平台用于精确地定位控制涂有金的钨的微尖端(用于TB的传感)和类似构建的参照传感器，将这两者都浸入样品溶液。将MTB传感器用于捕获和检测MTB，而参照传感器用于补偿溶液体积、电极之间的距离和缓冲液的温度及离子浓度。在一个可选择的实施方案中，可使用包括用于参照传感的微电极的微孔(microwell)。
使用5μL的溶液体积。
图9A图解性地举例说明具有MTB传感器和参照传感器的系统的典型电流-电压曲线。随着外施电压增加，测量的电流增加。在抗体-抗原反应后，电阻减小。与参照传感器的电流相比较，MTB传感器的电流增加。评估MTB与参照传感器之间的电流差异用于MTB的检测。
为了检查用于阴性对照的传感器的性能，将不具有MTB细胞的微尖端浸入抗体溶液中进行5分钟。然后，将电流测量为电压的函数。然后测量参照和MTB传感器(传感探针)的电流。为了进行此电学测量，将具有固定化的MTB细胞的尖端浸入抗体溶液。5分钟后测量电流，并且针对参照传感器的电流对其进行标准化。在使用3个不同微尖端对的3个测试中，MTB传感器与参照传感器的电流比[(ITB-I参照)/I参照]显示平均值和标准差为0.04±0.06。
当就0、8×103和8×104个细胞/mL的MTB浓度测量电流比时，电流比在80,000个细胞/mL处快速增加，如图9B中举例说明的。
使用单电极进行的电学DNA检测
上述示例性实施方案利用2个电极(探针电极和参照电极)在抗体/抗原反应中检测细菌。在此示例性实施方案中，使用单个电极进行颗粒的电学检测。靶颗粒包括金属颗粒以提高检测灵敏度。
例如，用掺杂胺的SWCNT或金属-SWCNT涂铺的CNT/SiC纳米尖端可提高检测用金属颗粒标记的颗粒的灵敏度。掺杂胺的SWCNT的能带隙在DNA结合后快速改变。
金属-SWCNT提高了装置的信噪比，因为SWCNT与金属电极之间的接触电阻与非金属SWCNT相比较有所减小。
为了进行杂交实验，在将颗粒固定在电极上之后测量电阻(Rf)和电容(Cd1)的变化。Cd1的变化归功于电极上的电双层效应，而Rf的变化归于DNA杂交。监控这些值的变化即可测定纳米尖端电极对杂交事件的灵敏度。当用矩形波信号完成了信号分析，即进行I-V(图10中显示的)或连续-DC分析以检测事件，然后可将其与荧光测量值相比较以进行确认。
使用电场增强电极上的反应
通过将电场施加于电极，可因电极表面上分子(例如，第一结合伴侣)的定向和其对附着至颗粒的第二结合伴侣的吸引而加速生物和化学反应。下面描述使用本发明的方法进行的DNA杂交的加速。
用PDMS涂铺CNT/SiC纳米尖端电极，然后用链霉抗生物素蛋白作为DNA的结合伴侣涂铺其。以0、5和10Vpp将AC电位施加于电极来杂交靶DNA(1pM，1.5μL)，进行5分钟。不施加大于10Vpp的电压，因为在这样的电压下会发生电击穿。在杂交后，将嵌入染料用于使用荧光光谱法研究DNA的杂交。将荧光强度用于测定在施加AC场后杂交的变化。
图11A显示在不同AC电位下固定的DNA的荧光强度。随着AC电位增加，强度因电极上更高浓度的DNA而增加。10Vpp提供了DNA杂交的最大增强。
也对杂交时间进行了研究。在10Vpp下在不同的杂交时间上测量荧光强度。当杂交时间大于5分钟时，荧光强度饱和，如图11B中举例说明的。
因此，对于上述系统，最佳AC电位和杂交时间分别测定为10Vpp和5分钟。
HIV-B病毒的固定和RNA检测
在该示例性实施方案中，将电极用于固定病毒(HIV-B)。在固定病毒后，使用荧光光谱法检测来自病毒的RNA。
将CNT/SiC纳米尖端(直径500nm)用作电极。HIV-B病毒溶液是Armored RNA Quant HIV-B试剂盒(Asuragen，Inc，Austin，TX)，浓度为50,000个拷贝/mL。为了进行RNA检测，使用DMSO中的Quant-iTRiboGreen RNA试剂，其中当与核酸结合时荧光激发/发射为500/525nm。将试剂稀释200x(从所购买的浓度)以进行RNA检测。
将纳米尖端(第一电极)浸入悬浮在金属线圈(第二电极)中的20μL病毒溶液微滴中。将14Vpp，5MHz的信号施加到电极之间进行1分钟以将HIV固定在纳米尖端上。然后以大约10μm/秒撤回纳米尖端以进一步固定HIV。然后使用SEM对纳米尖端上的固定化HIV成像，如图12中举例说明的。
将纳米尖端上的固定化HIV进一步用于检测RNA。在电场不存的情况下将具有固定化HIV的纳米尖端浸入2uL的RIBOGREEN试剂微滴进行5分钟，在该时间内将RIBOGREEN插入病毒内部的RNA。然后从溶液中撤出纳米尖端，通过荧光显微镜检查分析纳米尖端。图13A是在浸入RIBOGREEN溶液之前在其表面上具有固定化HIV-B的纳米尖端的荧光显微照片。提供白线以举例说明纳米尖端在显微照片中的位置。图13B是在用RIBOGREEN处理后纳米尖端的荧光显微照片。在用RIBOGREEN处理后固定在纳米尖端上的HIV-B中的RNA发荧光。
因此，可使用本发明的方法固定和检测病毒和病毒中包含的RNA。
固定化细胞中的核酸的检测
在此示例性实施方案中，描述了原位杂交(ISH)。利用荧光探针检测细胞中的核酸在本领域内是已知的。该技术被认为是直接研究细胞(例如，检测细菌细胞中的rRNA或mRNA作为活细菌的指标)和病毒(例如，检测病毒颗粒中的RNA或DNA)的强有力分析工具。然而，已知的ISH法受困于有限的灵敏度和将细胞固定至固体支持物(这是已知的方法所必需的)的困难。
此处描述的实施方案利用电极(例如，纳米尖端或微尖端)固定细胞以用于ISH分析。在所述方法中，将细胞固定在微尖端(第一电极)上，然后浸入含有允许检测细胞内的细胞核酸的核酸探针的第二溶液。细胞中核酸的原位检测可以实现提高的检测时间和最低限度的处理以获得细胞核酸的灵敏性检测。
首先，使用本发明的方法和任选地使用将细胞特异性结合至微尖端的功能化的微尖端来将细胞固定在微尖端上。将固定的细胞浸入含有核酸探针的第二溶液，该核酸探针具有与细胞中的遗传核酸(genetic nucleic acids)的特定区域相匹配的序列。探针渗入固定的细胞并且与细胞内的匹配遗传区域杂交。在杂交后，形成可检测的部分(例如，荧光部分)从而检测杂交的核酸。
异质颗粒溶液的纯化
本发明的方法可用于纯化颗粒的异质溶液(例如，不同大小和/或组成的颗粒)。按照本文中描述的方法进行颗粒在电极上的大小选择性固定。例如，如果固定的颗粒包含DNA和蛋白质的混合物，那么可将固定的颗粒浸入第二溶液并且从电极释放。然后将具有DNA和蛋白质的第二溶液过滤(例如使用滤纸或色谱法)。如果蛋白质从第二溶液中过滤出，那么DNA保留在第二溶液中。然后通过按照所提供的方法将DNA固定在电极上来重捕获DNA。
因此，可使用本文中描述的方法来纯化复杂混合物(例如，生物流体)。可使用所提供的方法分离本文中描述的任何颗粒混合物。
操作细菌、细胞和其他颗粒
可将本发明的方法用于分子工程。具体地，可将纳米尖端上的固定化分子用于操作生物颗粒和其它分子的性质用于分子设计；纳米制造；和精度控制(precision control)。
在一个实施方案中，将固定的分子定位在生物颗粒例如细菌内。因此，单个细菌(病毒)被用作由细胞膜限定的生物化学实验室。在这样的系统中，利用化学能扩增DNA，并且可就生物相容性和抗生素测试和检测蛋白质。本发明的方法使得能够进行这样的自主″分子铸造(molecular foundry)″。
在提供的分子铸造中，可通过使用选自电能、热能、机械能和化学能的能量以特异性的方式捕获和释放核酸和/或蛋白质。可将从纳米尖端插入细菌或病毒的颗粒用作疾病指示器(传感器)，用于药物递送(治疗剂)，用于遗传修饰和用于基因工程。
装置的形式
可在许多装置上实施本发明的方法。例如，一个示例性装置包括具有拥有光学和电学检测单元以及用于装置所有方面的控制单元的电极阵列的全自动化装置。
全自动化装置可用于多种病原体和各种分析物。
在一个示例性实施方案中，用于进行所述方法的装置包括便携式浓缩器，其包括用于分析的电子单元和尖端电极。这样的装置可以是高度便携的和一次性的，例如经塑形具有钢笔形状的装置，其具有用于开动尖端浸入样品溶液和将电极撤出样品溶液的手动“点击”功能。
颗粒固定的机制的分析
图14举例说明了使用AC电场和毛细管作用的颗粒固定方法。为了捕获颗粒，将纳米尖端电极浸入溶液，在纳米电极和与溶液接触的第二电极之间施加AC场。由电极产生的不均匀电场导致颗粒的极化和颗粒被DEP吸引至纳米尖端。当从溶液撤回尖端时，可基于毛细管作用和DEP力的组合效应将被吸引的颗粒捕获或释放在尖端上。DEP力将颗粒吸引至尖端，而毛细管力可将颗粒捕获或释放在尖端上。为了预测颗粒的捕获过程，下面检查因毛细管作用而产生的捕获和释放力。
为了测定作用在球上的毛细管作用力，使用通过杨-拉普拉斯公式产生的弯月面特征(meniscus profile)分析由于毛细管作用而产生的捕获和释放力。图15A举例说明了大小特异性捕获的机制。取决于颗粒对尖端的直径比，所述颗粒可从尖端捕获或释放。利用分离解α测定捕获，因为用于捕获和释放的毛细管作用力依赖于分离点(split point)上的周长。在分离点上，溶液被分成上和下部分。当分离角大于90°时，颗粒留在溶液中(图15A中的情况(1))。当分离角小于90°时，颗粒被捕获在尖端上(图15A中的情况(3))。在正好90°的分离角上(图15A中的情况(2))，不能测定颗粒的捕获，因为作用于尖端和溶液的毛细管力相等。
临界标准化直径[(dn)critical]定义为分离角为90°时的标准化直径。通过数值分析，图15A的情况(2)的构型中(dn)critical估计为0.39，如图15B中显示的。通过该理论分析，只要颗粒直径(dp)与尖端直径(dt)的比率小于0.39，颗粒就可被捕获至尖端上。可通过(1)选自电能、化学能、机械能和热能的表面相互作用能量，(2)尖端形状和颗粒形态学和(3)颗粒-颗粒相互作用(例如，细胞的集落形成)改变(dn)critical。
在毛细管作用力的上述比较中，当计算(dn)critical时未考虑电学力(例如，DEP)。例如，如果将DEP包括在该计算中，那么(dn)critical将增加，因为将DEP力加入至捕获毛细管作用力。此外，(dn)critical受实验条件包括尖端几何形状、尖端颗粒相互作用以及颗粒和尖端与液体的接触角影响。
表1概括了聚苯乙烯球和CNT/SiC纳米尖端的固定结果。针对尖端直径标准化由尖端捕获的最大球体直径，以获得(dn)critical。根据表1，通过使用情况(2)、(3)、(4)和(5)，(dn)critical在0.84±0.07(平均值±标准差)的范围内。
这样，使用聚苯乙烯纳米球的(dn)critical经测定在0.77至0.92(0.84±0.07)的范围内。在上文关于图5C所述的100nm和6μm球体的混合实验中，6μm的球体未被固定在纳米尖端上，因为6μm的球体的(dn)ave远大于(dn)critical的范围。
表1：聚苯乙烯球在电极上的大小特异性固定
Figure BDA0000043997500000261
dnanotip：纳米尖端直径，dsphere：来自提供商信息的纳米球的标称直径，(dn)ave：平均标准化直径(dsphere/dnanotip)，(dcapture)max：捕获的球体的最大直径，(dn)critical：临界标准化直径[(dcapture)max/dnanotip]，以及‘NA’表示‘不适用’。
将实验结果的(dn)critical(0.84±0.07)与上述理论分析的(dn)critical(0.39)相比较，实验(dn)critical高于理论(dn)critical。该差异归因于由AC场产生的DEP力。因为DEP力被加到捕获毛细管作用力上，所以(dn)critical增加。附着至电极和颗粒的结合伴侣的使用可进一步增加(dn)critical。在一个实施方案中，颗粒具有大于第一电极的纬向尺寸的临界尺寸(例如，(dn)critical)。在一个实施方案中，颗粒具有小于第一电极的纬向尺寸的临界尺寸(例如，(dn)critical)。
如图5A的显微照片和图16A中图解举例说明的，DEP力将球体吸引至尖端的侧面。若没有DEP力，则球体主要被吸引至尖端末端，因为图16A中的分离角(α)总是大于90°。
除了DEP力外，理论和实验结果之间的(dn)critical的差异也缘于其他实验条件，包括尖端几何形状、多颗粒相互作用和接触角。
如果纳米尖端的表面是粗糙的或纳米尖端的方向在尖端撤出过程中不与球状液滴的切线正好正交，那么尖端的侧面上的球体可不被拉向尖端的末端。在该情况下，可立即产生小于90°的分离角，从而可将球体捕获至尖端的侧面。在尖端的侧面，还可通过静电吸引、化学结合能和非特异性分子相互作用固定颗粒。
当尖端被一簇球体围绕时，可通过多颗粒相互作用力将球体捕获至尖端的侧面，如图5B中显示的。经常在固定过程中观察到围绕尖端的簇状结构，因为球体通过毛细管作用被递送至固体-液体-气体界面。可通过DEP力与溶液的蒸发以及由于毛细管作用而产生的压缩力结合产生颗粒至界面的递送。随着蒸发继续，被吸引的球体间的毛细管作用可产生凝聚力，如图16B中图解举例说明的。因此，被递送的球体间的相互作用力可增加捕获力。
除了几何和多颗粒相互作用效果外，(dn)critical可因尖端表面的接触角而变化。尖端的接触角可通过改变尖端的表面性质、滞后作用(hysteresis)和电场(例如，电润湿)来进行改变。此外，分子相互作用力(例如，范德瓦尔斯力)可影响(dn)critical。因此，可通过特定实验条件改变(dn)critical，以从液体中选择性固定期望的颗粒。
虽然已举例说明和描述了示例性实施方案，但应理解，可在本文中进行各种改变而不背离本发明的精神和范围。
Figure IDA0000043997550000011

Claims (40)

1.用于浓缩多个颗粒的方法，其包括:
(a)将具有高高宽比的第一电极浸入含有多个颗粒的液体中，其中第一电极包含具有杆纬向尺寸的杆和具有远端纬向尺寸的远末端，其中所述远端纬向尺寸为1纳米至1毫米;
(b)通过使用第一电极产生电场感应力而将所述多个颗粒驱向第一电极;和
(c)利用通过从液体撤出第一电极而在第一电极与液体之间形成的毛细管作用力将所述多个颗粒固定在第一电极的杆和远末端上；
其中所述电场感应力是通过电场产生的，该电场在借助于在从液体撤出第一电极而在第一电极与液体之间形成的毛细管作用力将所述多个颗粒固定在第一电极的杆和远末端上的整个步骤期间一直维持。
2.权利要求1的方法，其还包括分析固定在第一电极上的所述多个颗粒。
3.权利要求2的方法，其中分析颗粒包括选自电学、机械、光学、表面成像技术和其组合的方法。
4.权利要求3的方法，其中光学分析包括将发光化合物附着至所述多个颗粒以提供多个发光颗粒和检测来自该多个发光颗粒的发光。
5.权利要求3的方法，其中电学检测包括用于测量选自电容、电阻、电导、阻抗和其组合的特征的技术。
6.权利要求1的方法，其中第一电极包括选自金属、掺杂半导体和导电聚合物的材料。
7.权利要求1的方法，其中第一电极的杆纬向尺寸为1纳米到1毫米。
8.权利要求1的方法，其中第一电极的杆纬向尺寸大于所述多个颗粒的纵向尺寸。
9.权利要求1的方法，其中所述第一电极至少部分涂有表面涂层。
10.权利要求9的方法，其中所述表面涂层选自单层和聚合物层。
11.权利要求9的方法，其中所述表面涂层增强所述多个颗粒在第一电极上的固定。
12.权利要求11的方法，其中表面涂层包含第一结合伴侣，并且颗粒包含能够结合该第一结合伴侣的第二结合伴侣。
13.权利要求12的方法，其中第一结合伴侣是抗体或其片段，并且第二结合伴侣是抗原。
14.权利要求12的方法，其中第一结合伴侣是抗原，并且第二结合伴侣是抗体或其片段。
15.权利要求12的方法，其中第一结合伴侣是第一核酸，并且第二结合伴侣是第二核酸。
16.权利要求12的方法，其中第一结合伴侣是酶，并且第二结合伴侣是底物。
17.权利要求12的方法，其中第一结合伴侣是受体，并且第二结合伴侣是受体的配体。
18.权利要求12的方法，其中第一结合伴侣是核酸，并且第二结合伴侣是蛋白质。
19.权利要求12的方法，其中第一结合伴侣是细胞、细胞膜或细胞器，并且第二结合伴侣是所述细胞、细胞膜或细胞器的配体。
20.权利要求1的方法，其中所述电场感应力是电渗。
21.权利要求1的方法，其中所述电场感应力在第一电极和与液体接触的第二电极之间产生。
22.权利要求1的方法，其中所述液体选自溶液和悬浮液。
23.权利要求1的方法，其中所述液体是选自血液、痰、粘液和唾液的生物流体。
24.权利要求1的方法，其中所述多个颗粒选自有机颗粒和无机颗粒。
25.权利要求1的方法，其中所述多个颗粒选自病毒和细菌。
26.权利要求1的方法，其中所述多个颗粒选自核酸、细胞和蛋白质。
27.权利要求25的方法，其中所述病毒选自柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、人巨细胞病毒、人类疱疹病毒8型、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、黄病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、人乳头瘤病毒、伊波拉病毒、马尔堡病毒、汉塔病毒、呼肠孤病毒、禽流感病毒和西尼罗病毒。
28.权利要求25的方法，其中所述细菌选自结核病细菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、抗甲氧西林金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和绿脓杆菌。
29.权利要求26的方法，其中所述细胞是果蝇细胞。
30.权利要求1的方法，其还包括贮存被固定的多个颗粒。
31.权利要求30的方法，其中贮存包括低温冰冻。
32.权利要求1的方法，其中第一电极的表面是连续的外表面。
33.权利要求1的方法，其中产生电场感应力包括电学定向该表面涂层。
34.权利要求1的方法，其还包括释放被固定的多个颗粒。
35.权利要求34的方法，其中释放被固定的多个颗粒包括将固定的多个颗粒释放至选自病毒和细菌的实体内。
36.权利要求34的方法，其中释放被固定的多个颗粒包括将固定的多个颗粒释放至细胞内。
37.权利要求1的方法，其还包括
(d)将具有高高宽比的第三电极浸入含有所述多个颗粒的液体中，其中第三电极包含具有杆纬向尺寸的杆和具有远端纬向尺寸的远末端，其中所述远端纬向尺寸为1纳米至1毫米;
(e)通过使用第三电极产生电场感应力，以便将液体中的多个颗粒优先驱向第三电极;和
(f)从液体中撤出第三电极，以便在撤出的第三电极与液体之间形成的毛细管作用力将所述多个颗粒固定在第三电极的表面上。
38.权利要求37的方法，其中所述多个颗粒包含第一颗粒和第二颗粒，其中第一颗粒被优先驱向第一电极，并且第二颗粒被优选驱向第三电极。
39.颗粒浓缩系统，其包含：
(a)具有高高宽比的第一电极，其中所述第一电极具有杆纬向尺寸的杆和具有远端纬向尺寸的远末端，其中所述远端纬向尺寸为1纳米至1毫米;
(b)包含多个颗粒的第一液体；
(c)执行器，其大小和构造被设置成将第一电极浸入第一液体和从其中撤出，以便在撤出的第一电极与第一液体之间形成的毛细管作用力将所述多个颗粒固定在第一电极的杆和远末端上；和
(d)电信号发生器，其大小和构造被设置成用第一电极产生电感应力，以便当将第一电极浸入第一液体时，所述多个颗粒被优先驱向第一电极。
40.用于浓缩多个颗粒的方法，其包括:
(a)将具有高高宽比的第一电极浸入含有多个颗粒的液体中，其中第一电极包含具有杆纬向尺寸的杆和具有远端纬向尺寸的远末端，其中所述远端纬向尺寸为1纳米至1毫米;
(b)通过使用第一电极产生电场感应力而将所述多个颗粒驱向第一电极，其中所述电场感应力是电渗;和
(c)利用通过从液体撤出第一电极而在第一电极与液体之间形成的毛细管作用力将所述多个颗粒固定在第一电极的杆和远末端上。
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