JP2004028953A - 生体関連物質または化学物質固定化用基盤、生体関連物質または化学物質の固定化方法、及び基盤のコーティング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】生体関連物質等をバックグラウンド値が低く、高密度に固定化するためのコーティングされた基盤を提供する。
【解決手段】基盤上に活性基含有カップリング剤を介して、一般式 Ａ−Ｌ−Ｂ ［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］で示される架橋試薬が結合した基盤。該基盤に生体関連物質等を固定化する。
【選択図】 図１
【解決手段】基盤上に活性基含有カップリング剤を介して、一般式 Ａ−Ｌ−Ｂ ［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］で示される架橋試薬が結合した基盤。該基盤に生体関連物質等を固定化する。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラス、プラスチック、セラミック等をはじめとする固定基盤上に生体関連物質等を固定化することに適した基盤、それら生体関連物質等の基盤への固定化方法、及び基盤のコーティング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップには、長鎖ＰＣＲ産物を基盤上に固定化したｃＤＮＡチップと、１００塩基以下の鎖長よりなる一本鎖オリゴヌクレオチドを固定化したオリゴヌクレオチドチップがある。ｃＤＮＡチップはＰＣＲ産物由来であるため、二本鎖ＤＮＡを固定化していることになり、検体由来のサンプルが、正しくないハイブリダイゼーション（交差ハイブリダイゼーション）を起こすことがある。
【０００３】
また、現在用いられているオリゴヌクレオチドチップには、オリゴヌクレオチドをガラス基盤上で合成する方法と、合成したオリゴヌクレオチドをガラス基盤上に固定化させる方法とに大別できる。チップ上でのオリゴヌクレオチド合成は、多種類のオリゴヌクレオチド合成が可能であるといった利点を有している。しかしながら、合成後のオリゴ精製を省いているため、純度が低いといった欠点を有している。また、このガラス上合成法では、一本鎖オリゴヌクレオチドのみしか合成不可能である。今後２本鎖ＤＮＡ、糖、タンパク質などの生体関連物質を固定化したチップを作製するには、基盤上で合成する方法は適していない。そこで、合成したオリゴヌクレオチドをスポットする方法は、今後高い汎用性が求められると思われる。
【０００４】
ガラスに代表される基盤にある特殊なコーティングを施し、その基盤にオリゴヌクレオチドをスポットし、固定化する方法はいくつか報告されている。しかしながら、いずれもサンプルを標識するために用いる蛍光色素が基盤表面へ非特異的に吸着することに由来する高いバックグラウンド値が問題である。また、核酸を溶解する溶液の粘性が低すぎると、スポットされた液滴が広がりすぎるといったことも報告されている。そのため、スポットに用いる溶液開発も、高密度でスポットする場合は重要な課題となる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記背景から、本発明の課題は，生体関連物質等をバックグラウンド値が低く、高密度に固定化するためのコーティングされた基盤、生体関連物質等をスポットして固定化する方法、及び基盤のコーティング方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者等は、特定の連結基を用いて基盤をコーティングすることにより、バックグラウンド値が低く、高濃度に生体物質を固定化するための基盤を作製可能であることを見出した。
第１に、本発明の基盤は、基盤上に活性基含有カップリング剤を介して、下記一般式（１）
【０００７】
【化３１】
で示される架橋試薬が結合した基盤である。
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］
前記活性基含有カップリング剤の具体例として、下記一般式（２）
【０００８】
【化３２】
で示されるアミノ基含有シラン化合物が好ましく例示される。
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、同一または異なる−Ｏ（ＣＨ２）ａＣＨ３またはＣｌを表し、ａは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｒは０から１０の整数を表す。］ また、前記活性基含有カップリング剤として、下記一般式（３）
【０００９】
【化３３】
で示される活性基含有シラン化合物が、好ましく例示される。
［式中Ｒ４は以下のいずれかの構造を表す。
【００１０】
【化３４】
ここで、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は同一または異なるＨ、Ｃｌ、Ｆを表す。］
更に、前記活性基含有カップリング剤として、下記一般式（４）
【００１１】
【化３５】
で示される活性基含有シラン化合物が好ましく例示される。
［式中、Ｒ１０は以下のいずれかの構造を表す。］
【００１２】
【化３６】
前記一般式（１）の架橋試薬Ａ−Ｌ−Ｂとして、以下のいずれかの化合物が好ましく例示される。
【００１３】
【化３７】
【００１４】
【化３８】
［Ｒ１１，Ｒ１２は同一または異なる−Ｈまたは−ＳＯ３］
【００１５】
【化３９】
【００１６】
【化４０】
【００１７】
【化４１】
【００１８】
【化４２】
【００１９】
第２に、本発明の基盤は、上記いずれかの基盤の、一般式（１）のＡ−Ｌ−Ｂで示される架橋試薬を介して、分子中に一級アミノ基を２個以上有する分枝剤が結合した基盤である。分子中の一級アミノ基の数は２個から６４個程度まで広く用いることができる。
前記分枝剤として、下記一般式（５）
【００２０】
【化４３】
で示される一級アミノ基を２個又は３個有する化合物が好ましく例示される。
［式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は同一または異なる一級アミノ基を有するアルキル基、アルキル基、水素原子から選ばれる。ただし、２個又は３個は一級アミノ基を有するアルキル基である。］
ここで、前記一般式（５）のＲ１３、Ｒ１４、Ｒ１５が、下記一般式（６）
【００２１】
【化４４】
で表されるアルキルアミノ基であることが好ましい。
［式中、ｂ、ｄ、およびｆは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｃおよびｅは同一または異なる０または１の整数を表す。ただし、ｂ、ｄ、ｆがいずれも０になる場合は含まれない。］
【００２２】
該分枝剤として、トリス（３−アミノプロピル）アミンとトリス（２−アミノエチル）アミンが特に好ましく例示される。また、下記式で表される４個の一級アミノ基を有するポリプロピレ二ミンテトラミンデンドリマーが好ましく例示される。
【００２３】
【化４５】
【００２４】
また、前記分枝剤として、分子中に多数の一級アミノ基を有するＰＡＭＡＭ化合物が好ましく例示される。ここで、ＰＡＭＡＭ化合物としては、分子中に８個の一級アミノ基を有するＳｔａｒｂｕｒｓｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ １（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）や分子中に１６個の一級アミノ基を有するＳｔａｒｂｕｒｓｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ２（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）が例示される。
【００２５】
更に、前記分枝剤が、２個以上の一級アミノ基を有するポリアミドデンドリマー化合物が好ましく例示される。ポリアミドデンドリマー化合物は、分枝鎖中にアミド基を有し、末端に一級アミノ基を有する化合物である。一級アミノ基を４，８，１６，３２，６４個有するものがあり，それぞれＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ ０．０， １．０， ２．０， ３．０， ４．０（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）と名づけられて入る。
４個の一級アミノ基を有するポリアミドデンドリマーとして、下記式のものが好ましく例示される。
【００２６】
【化４６】
【００２７】
第３に、本発明の基盤は、上記第２の本発明の基盤の、分子中に一級アミノ基を２個以上有する分枝剤を介して、更に、下記一般式（１）
【００２８】
【化４７】
の架橋試薬を結合させたことを特徴とする基盤である。
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］
【００２９】
第４に、本発明は、上記いずれかに記載の基盤の、一般式（１）Ａ−Ｌ−Ｂで示される架橋剤を介して、結合対象物である、核酸、タンパク質、糖、糖タンパク質、血液、体液等から選ばれる生体関連物質、または医薬品、環境ホルモン、ＰＣＢ等から選ばれる化学物質が固定化されることを特徴とする生体関連物質または化学物質固定化用基盤である。
【００３０】
第５に、本発明は、上記いずれかに記載の基盤に、核酸、タンパク質、糖、糖タンパク質、血液、体液等から選ばれる生体関連物質、または医薬品、環境ホルモン、ＰＣＢ等から選ばれる化学物質を固定化することを特徴とする生体関連物質または化学物質固定化方法である。
【００３１】
第６に、本発明は、基盤上に活性基含有カップリング剤を反応させ、続いて、下記一般式（１）
【００３２】
【化４８】
で示される架橋試薬を反応させることを特徴とする基盤のコーティング方法である。
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］
前記活性基含有カップリング剤として、下記一般式（２）
【００３３】
【化４９】
で示されるアミノ基含有シラン化合物が好ましく例示される。
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、同一または異なる−Ｏ（ＣＨ２）ａＣＨ３またはＣｌを表し、ａは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｒは０から１０の整数を表す。］ また、前記活性基含有カップリング剤として、下記一般式（３）
【００３４】
【化５０】
で示される活性基含有シラン化合物が好ましく例示される。
［式中Ｒ４は以下のいずれかの構造を表す。
【００３５】
【化５１】
ここで、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は同一または異なるＨ、Ｃｌ、Ｆを表す。］
更に、前記活性基含有カップリング剤として、下記一般式（４）
【００３６】
【化５２】
で示される活性基含有シラン化合物が好ましく例示される。
［式中、Ｒ１０は以下のいずれかの構造を表す。］
【００３７】
【化５３】
前記一般式（１）の架橋試薬Ａ−Ｌ−Ｂとして、以下のいずれかの化合物が好ましく例示される。
【００３８】
【化５４】
【００３９】
【化５５】
［Ｒ１１，Ｒ１２は同一または異なる−Ｈまたは−ＳＯ３］
【００４０】
【化５６】
【００４１】
【化５７】
【００４２】
【化５８】
【００４３】
【化５９】
【００４４】
第７に、本発明は、上記第６の本発明で製造された基盤に対し、分子中に一級アミノ基を２個以上有する分枝剤を反応させたことを特徴とする基盤のコーティング方法である。
前記分枝剤として、下記一般式（５）
【００４５】
【化６０】
で示される一級アミノ基を２個又は３個有する化合物が好ましく例示される。
［式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は同一または異なる一級アミノ基を有するアルキル基、アルキル基、水素原子から選ばれる。ただし、２個又は３個は一級アミノ基を有するアルキル基である。］
ここで、前記一般式（５）のＲ１３、Ｒ１４、Ｒ１５が、下記一般式（６）
【００４６】
【化６１】
で表されるアルキルアミノ基であることが好ましい。
［式中、ｂ、ｄ、およびｆは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｃおよびｅは同一または異なる０または１の整数を表す。ただし、ｂ、ｄ、ｆがいずれも０になる場合は含まれない。］
【００４７】
該分枝剤として、トリス（３−アミノプロピル）アミンとトリス（２−アミノエチル）アミンが特に好ましく例示される。また、下記式で表される４個の一級アミノ基を有するポリプロピレ二ミンテトラミンデンドリマーが好ましく例示される。
【００４８】
【化６２】
【００４９】
また、前記分枝剤として、分子中に多数の一級アミノ基を有するＰＡＭＡＭ化合物が好ましく例示される。ここで、ＰＡＭＡＭ化合物としては、分子中に８個の一級アミノ基を有するＳｔａｒｂｕｒｓｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ １（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）や分子中に１６個の一級アミノ基を有するＳｔａｒｂｕｒｓｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ２（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）が例示される。
【００５０】
更に、前記分枝剤が、２個以上の一級アミノ基を有するポリアミドデンドリマー化合物が好ましく例示される。ポリアミドデンドリマー化合物は、分枝鎖中にアミド基を有し、末端に一級アミノ基を有する化合物である。一級アミノ基を４，８，１６，３２，６４個有するものがあり，それぞれＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ ０．０， １．０， ２．０， ３．０， ４．０（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）と名づけられている。４個の一級アミノ基を有するポリアミドデンドリマーとして、下記式のものが好ましく例示される。
【００５１】
【化６３】
【００５２】
第８に、本発明は、上記第７の本発明で製造された基盤に対し、更に、下記一般式（１）
【００５３】
【化６４】
の架橋試薬を反応させたことを特徴とする基盤のコーティング方法である。
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］
【００５４】
本発明の基盤としては、ガラス、プラスチック等の平面基板、ガラス、プラスチック等で製造されたビーズなど、従来から生体関連物質や医薬品等の固定化用基盤として知られているものが用いられる。
図１〜図３に上記の本発明のフローを化学式で表す。
【００５５】
図１において、基盤（Ｉ）表面に存在する水酸基に活性基含有基含有カップリング剤としてアミノ基含有シラン化合物を反応させ（ＩＩ）、続いて、一般式（１）Ａ−Ｌ−Ｂで表される連結基Ｌを有する架橋試薬を反応させている（ＩＩＩ）。得られた基盤にオリゴ核酸を固定化している（ＶＩ）。
また、基盤（ＩＩＩ）に対し、分枝剤である下記一般式（５）で示される一級アミノ基を２個又は３個有する化合物を反応させている（ＩＶ）。
【００５６】
【化６５】
この分枝剤に対して、更に、一般式（１）の架橋試薬を反応させ（Ｖ）、１個の架橋試薬に対し２個のオリゴ核酸が固定化されている。
図２及び３においては、基盤（Ｉ）表面に存在する水酸基に活性基含有基含有カップリング剤として、
【００５７】
【化６６】
または
【００５８】
【化６７】
を反応させ（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、分子中に一級アミノ基を２個又は３個有する分枝剤である下記一般式（５）
【００５９】
【化６８】
で示される化合物を反応させている（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）。
この分枝剤に対して、更に、一般式（１）の架橋試薬を反応させ（Ｖ）、（ＸＩ）、それぞれ１個の架橋試薬に対し２個のオリゴ核酸が固定化されている。
【００６０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を示す。図４は、本実施例の全体を示すスキームである。
実施例１ スライドガラスの洗浄
スライドガラス（１０枚）を１０％水酸化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）に１５分間浸した後、水（２００ｍＬで２回）、１％塩酸水溶液（２００ｍＬ）、水（２００ｍＬで２回）の順で洗浄した。メタノール（２００ｍＬ）に浸し５分間の超音波洗浄を行い、遠心によって乾燥させ、さらに１２０度で２時間減圧乾燥した。
【００６１】
実施例２ アミノプロピルシラン化
乾燥させたスライドガラスを３−アミノトリメトキシシラン（１３ｍＬ）、水（８ｍＬ）、メタノール（３８０ｍＬ）中に浸し、室温で少なくとも５時間攪拌させた。その後スライドガラスを取り出し、メタノール（２００ｍＬ）で２回洗浄して遠心後、１２０度で２時間減圧乾燥させた。
【００６２】
実施例３ イソチオシアネート化
あらかじめ１，４−フェニレンジイソチオシアネート（１８３６ｍｇ）を１０％ピリジン・ジメチルフォルムアミド溶液（１９０ｍＬ）に溶解させ、これに上記スライドガラスを入れ、室温下１６時間攪拌させた。スライドガラスを取り出し、ジメチルフォルムアミド（２００ｍＬ）、ジクロロメタン（２００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）の順で洗浄し、減圧下室温で乾燥させ、実施例５のイソチオシアネート化に供した。
【００６３】
実施例４ デンドリマー化
デンドリマーとしてＰＡＭＡＭ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、以下の反応を行った。実施例３でアミノ化されたスライドガラスをガラス容器に敷き、そこに１０％ＰＡＭＡＭメタノール溶液（１３０μＬ）を滴下し、密封して３７度で５時間反応させた。その後スライドガラスをメタノール（２００ｍＬ）で２回、アセトン（２００ｍＬ）で１回洗浄し、減圧下室温で１時間乾燥させた。
【００６４】
実施例５ デンドリマーコーティング後のイソチオシアネート化
実施例４で得られた上記スライドガラスを、実施例３と同様の反応を行い、イソチオシアネート化し、オリゴヌクレオチドのスポットに供した。
【００６５】
実施例６ トリス（３−アミノプロピル）アミン化
実施例３で得られたスライドガラスをガラス容器に敷き、そこに２０または３０％ トリス（３−アミノプロピル）アミン・メタノール溶液（１３０μＬ）を滴下し、密封して３７度で５時間反応させた。その後スライドガラスをメタノール（２００ｍＬ）で２回、アセトン（２００ｍＬ）で１回洗浄し、減圧下室温で１時間乾燥させた。
【００６６】
実施例７ ３−アミノプロピルアミンコーティング後のイソチオシアネート化
実施例６で得られた上記スライドガラスを、実施例３と同様の反応を行い、イソチオシアネート化し、これをオリゴヌクレオチドのスポットに供した。
【００６７】
実施例８ ポリプロピレ二ミンテトラミンデンドリマー化
実施例３で得られたスライドガラスをガラス容器に敷き、そこに２０または３０％ ポリプロピレ二ミンテトラミンデンドリマー・メタノール溶液（１３０μＬ）を滴下し、密封して３７度で５時間反応させた。その後スライドガラスをメタノール（２００ｍＬ）で２回、アセトン（２００ｍＬ）で１回洗浄し、減圧下室温で１時間乾燥させた。
【００６８】
実施例９ ポリプロピレ二ミンテトラミンデンドリマーコーティング後のイソチオシアネート化
実施例８で得られた上記スライドガラスを、実施例３と同様の反応を行い、イソチオシアネート化し、これをオリゴヌクレオチドのスポットに供した。
【００６９】
実施例１０ オリゴヌクレオチドのスライドガラスへのスポットと結合反応
オリゴヌクレオチドライブラリー（８０ｐｍｏｌ； ＭＷＧ社製）を滅菌水（４μＬ）に溶解し、スポット溶液（４μＬ； １Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）：飽和Ｗａｋｏ ｇｅｌ Ｃ−３００（和光純薬工業株式会社の商品名）水溶液＝１：１）と混合させ、スポッター（ＳＰＢＩＯ２０００、日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社の商品名、ＳＰＢＩＯは登録商標）によって実施例５、７、９によって得られたコーティング済みスライドガラス上にスポットした。スポット後タイトボックスにろ紙を敷き、３００ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液を湿らせ、溶液が付かないようにスポット済みのスライドガラスを入れ、密閉後３７℃で放置した。１６時間後タイトボックスからスライドガラスを取り出しドライオーブンに移し６０℃で１５分間加温した。
【００７０】
実施例１１ オリゴヌクレオチドスポットガラスのブロッキング
スライドガラスを０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（２００ｍＬ）で室温５分間、０．０５％塩酸水溶液（２００ｍＬ）で室温２分間、０．１Ｍ 塩化カリウム（２００ｍＬ）で室温１０分間、滅菌水（２００ｍＬ）で室温１分間洗浄した。
続いて１Ｍ トリス−グリシン溶液（ｐＨ＝９．０）にガラスを浸し、室温で１時間攪拌しブロッキングを行った。滅菌水で２回洗浄後、ドラフト内で乾燥させて冷蔵保存した。
【００７１】
（参考例） 逆転写反応
マウス肝臓由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いた逆転写反応
マウス肝臓由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡ（１００μｇ）を逆転写反応用ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマー（２μＬ；０．５μｇ／μＬ）と滅菌水に溶解して全量を３０μＬとし、これを７０度で５分間、４２度で２分間加温した。その後あらかじめ調製しておいた色素を含む溶液（５０μＬ；逆転写反応用緩衝液（ｘ５、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、３７５ ｍＭ ＫＣｌ、 １５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ ｍＭ ＤＴＴ：１６μＬ）、０．１Ｍ ジチオスレイトール（８μＬ）、１０ｘｄＮＴＰ溶液（８μＬ；２ｍＭ ｄＴＴＰ、５ｍＭ ｄＡＴＰ、 ５ｍＭ ｄＣＴＰ、 ５ｍＭ ｄＧＴＰ）、１ｍＭ Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰ（８μＬ）、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （１０μＬ；４０ｕｎｉｔｓ／μＬ））を上記ＲＮＡ溶液と混合し、続けて逆転写酵素（１μＬ、２００ｕｎｉｔｓ；ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−；ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を添加し４２度で加温した。１時間後、上記逆転写酵素０．５μＬをさらに加え、４２度で１時間反応させた。この反応液に滅菌水（４０μＬ）、０．５ＭＥＤＴＡ（１０μＬ）、１Ｎ ＮａＯＨ（２０μＬ）を加え、６５度で３０分間加温し、１Ｎ ＨＣｌ（１５μＬ）を加え中和し、氷冷した。エタノール沈殿を行った後、滅菌水（５０μＬ）を加え、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ Ｐ３０（ＢＩＯ ＲＡＤ社の商品名）により脱塩した。溶出液をＳｐｅｅｄ Ｖａｃにて濃縮した。
【００７２】
実施例１２ マウス肝臓 ｔｏｔａｌ ＲＮＡから調製したｃＤＮＡとのハイブリダイゼ ーション
参考例に従って調製された蛍光標識ｃＤＮＡに２０ Ｘ ＳＳＣ（ １０μＬ）、１０％ ＳＤＳ（０．４μＬ）、および滅菌水を加え全量４０μＬのプローブ溶液を作成した。そのプローブＤＮＡ溶液を静かにＤＮＡチップ上にのせた後、カバーグラスを溶液上にのせ、４Ｘ ＳＳＣ溶液で湿らせたキムタオルを敷いたタイトボックス内に入れ、４０度で１６時間放置した。
【００７３】
ハイブリダイゼーション後、チップを１×ＳＳＣ−０．０５ ％ ＳＤＳ溶液（２００ｍＬ，４０度）に１０分間、０．２ ｘ ＳＳＣ−０．１ ％ ＳＤＳ溶液（２００ｍＬ，４０度）に２分間、続いて０．２ ｘ ＳＳＣ（２００ｍＬ）、０．０５ ｘ ＳＳＣ（２００ｍＬ）でそれぞれ室温で洗浄した。乾燥させた後、チップスキャナー（Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ、Ａ Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ の商品名）で検出した。マウス肝臓由来のＲＮＡをＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰで標識したｃＤＮＡを調製し、オリゴヌクレオチドチップによって解析した結果。緑色がＣｙ３、赤色がＣｙ５の検出波長の結果であった。
【００７４】
実施例１３ オリゴヌクレオチドのスライドガラス上への固定化の確認
１ｍＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ （２μＬ）、ジメチルスルフォキシド（４μＬ）、２５ｍＭ 塩化コバルト溶液（４μＬ）、反応緩衝溶液（ｘ５、１Ｍ カコジル酸カリウム、２５ｍＭトリス−塩酸、１．２５ｍｇ／ＢＳＡ、 ｐＨ６．６；８μＬ）、ターミナルトランスフェレース（５０ｕｎｉｔｓ）に滅菌水を加えて全量４０μｌとした反応溶液を調製後、直ちにスライドガラスに全量滴下した。カバーガラスを反応液上にのせ、３７度で放置した。１５分後４ＸＳＳＣ緩衝液（０．６ＭＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸二水和物）、０．１％ＳＤＳ溶液、５０％エタノール水溶液で洗浄し乾燥させ検出機（スキャンアレイ）で測定した。
【００７５】
【発明の効果】
基盤を本発明のようにコーティングすることで、生体関連物質等をバックグラウンド値が低く、高密度に固定化することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明のフローを示す化学式。
【図２】
本発明のフローを示す化学式。
【図３】
本発明のフローを示す化学式。
【図４】
本発明の実施例を示すスキーム。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラス、プラスチック、セラミック等をはじめとする固定基盤上に生体関連物質等を固定化することに適した基盤、それら生体関連物質等の基盤への固定化方法、及び基盤のコーティング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップには、長鎖ＰＣＲ産物を基盤上に固定化したｃＤＮＡチップと、１００塩基以下の鎖長よりなる一本鎖オリゴヌクレオチドを固定化したオリゴヌクレオチドチップがある。ｃＤＮＡチップはＰＣＲ産物由来であるため、二本鎖ＤＮＡを固定化していることになり、検体由来のサンプルが、正しくないハイブリダイゼーション（交差ハイブリダイゼーション）を起こすことがある。
【０００３】
また、現在用いられているオリゴヌクレオチドチップには、オリゴヌクレオチドをガラス基盤上で合成する方法と、合成したオリゴヌクレオチドをガラス基盤上に固定化させる方法とに大別できる。チップ上でのオリゴヌクレオチド合成は、多種類のオリゴヌクレオチド合成が可能であるといった利点を有している。しかしながら、合成後のオリゴ精製を省いているため、純度が低いといった欠点を有している。また、このガラス上合成法では、一本鎖オリゴヌクレオチドのみしか合成不可能である。今後２本鎖ＤＮＡ、糖、タンパク質などの生体関連物質を固定化したチップを作製するには、基盤上で合成する方法は適していない。そこで、合成したオリゴヌクレオチドをスポットする方法は、今後高い汎用性が求められると思われる。
【０００４】
ガラスに代表される基盤にある特殊なコーティングを施し、その基盤にオリゴヌクレオチドをスポットし、固定化する方法はいくつか報告されている。しかしながら、いずれもサンプルを標識するために用いる蛍光色素が基盤表面へ非特異的に吸着することに由来する高いバックグラウンド値が問題である。また、核酸を溶解する溶液の粘性が低すぎると、スポットされた液滴が広がりすぎるといったことも報告されている。そのため、スポットに用いる溶液開発も、高密度でスポットする場合は重要な課題となる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記背景から、本発明の課題は，生体関連物質等をバックグラウンド値が低く、高密度に固定化するためのコーティングされた基盤、生体関連物質等をスポットして固定化する方法、及び基盤のコーティング方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者等は、特定の連結基を用いて基盤をコーティングすることにより、バックグラウンド値が低く、高濃度に生体物質を固定化するための基盤を作製可能であることを見出した。
第１に、本発明の基盤は、基盤上に活性基含有カップリング剤を介して、下記一般式（１）
【０００７】
【化３１】
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］
前記活性基含有カップリング剤の具体例として、下記一般式（２）
【０００８】
【化３２】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、同一または異なる−Ｏ（ＣＨ２）ａＣＨ３またはＣｌを表し、ａは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｒは０から１０の整数を表す。］ また、前記活性基含有カップリング剤として、下記一般式（３）
【０００９】
【化３３】
［式中Ｒ４は以下のいずれかの構造を表す。
【００１０】
【化３４】
更に、前記活性基含有カップリング剤として、下記一般式（４）
【００１１】
【化３５】
［式中、Ｒ１０は以下のいずれかの構造を表す。］
【００１２】
【化３６】
【００１３】
【化３７】
【化３８】
【００１５】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
【化４２】
第２に、本発明の基盤は、上記いずれかの基盤の、一般式（１）のＡ−Ｌ−Ｂで示される架橋試薬を介して、分子中に一級アミノ基を２個以上有する分枝剤が結合した基盤である。分子中の一級アミノ基の数は２個から６４個程度まで広く用いることができる。
前記分枝剤として、下記一般式（５）
【００２０】
【化４３】
［式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は同一または異なる一級アミノ基を有するアルキル基、アルキル基、水素原子から選ばれる。ただし、２個又は３個は一級アミノ基を有するアルキル基である。］
ここで、前記一般式（５）のＲ１３、Ｒ１４、Ｒ１５が、下記一般式（６）
【００２１】
【化４４】
［式中、ｂ、ｄ、およびｆは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｃおよびｅは同一または異なる０または１の整数を表す。ただし、ｂ、ｄ、ｆがいずれも０になる場合は含まれない。］
【００２２】
該分枝剤として、トリス（３−アミノプロピル）アミンとトリス（２−アミノエチル）アミンが特に好ましく例示される。また、下記式で表される４個の一級アミノ基を有するポリプロピレ二ミンテトラミンデンドリマーが好ましく例示される。
【００２３】
【化４５】
また、前記分枝剤として、分子中に多数の一級アミノ基を有するＰＡＭＡＭ化合物が好ましく例示される。ここで、ＰＡＭＡＭ化合物としては、分子中に８個の一級アミノ基を有するＳｔａｒｂｕｒｓｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ １（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）や分子中に１６個の一級アミノ基を有するＳｔａｒｂｕｒｓｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ２（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）が例示される。
【００２５】
更に、前記分枝剤が、２個以上の一級アミノ基を有するポリアミドデンドリマー化合物が好ましく例示される。ポリアミドデンドリマー化合物は、分枝鎖中にアミド基を有し、末端に一級アミノ基を有する化合物である。一級アミノ基を４，８，１６，３２，６４個有するものがあり，それぞれＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ ０．０， １．０， ２．０， ３．０， ４．０（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）と名づけられて入る。
４個の一級アミノ基を有するポリアミドデンドリマーとして、下記式のものが好ましく例示される。
【００２６】
【化４６】
第３に、本発明の基盤は、上記第２の本発明の基盤の、分子中に一級アミノ基を２個以上有する分枝剤を介して、更に、下記一般式（１）
【００２８】
【化４７】
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］
【００２９】
第４に、本発明は、上記いずれかに記載の基盤の、一般式（１）Ａ−Ｌ−Ｂで示される架橋剤を介して、結合対象物である、核酸、タンパク質、糖、糖タンパク質、血液、体液等から選ばれる生体関連物質、または医薬品、環境ホルモン、ＰＣＢ等から選ばれる化学物質が固定化されることを特徴とする生体関連物質または化学物質固定化用基盤である。
【００３０】
第５に、本発明は、上記いずれかに記載の基盤に、核酸、タンパク質、糖、糖タンパク質、血液、体液等から選ばれる生体関連物質、または医薬品、環境ホルモン、ＰＣＢ等から選ばれる化学物質を固定化することを特徴とする生体関連物質または化学物質固定化方法である。
【００３１】
第６に、本発明は、基盤上に活性基含有カップリング剤を反応させ、続いて、下記一般式（１）
【００３２】
【化４８】
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］
前記活性基含有カップリング剤として、下記一般式（２）
【００３３】
【化４９】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、同一または異なる−Ｏ（ＣＨ２）ａＣＨ３またはＣｌを表し、ａは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｒは０から１０の整数を表す。］ また、前記活性基含有カップリング剤として、下記一般式（３）
【００３４】
【化５０】
［式中Ｒ４は以下のいずれかの構造を表す。
【００３５】
【化５１】
更に、前記活性基含有カップリング剤として、下記一般式（４）
【００３６】
【化５２】
［式中、Ｒ１０は以下のいずれかの構造を表す。］
【００３７】
【化５３】
【００３８】
【化５４】
【化５５】
【００４０】
【化５６】
【化５７】
【化５８】
【化５９】
第７に、本発明は、上記第６の本発明で製造された基盤に対し、分子中に一級アミノ基を２個以上有する分枝剤を反応させたことを特徴とする基盤のコーティング方法である。
前記分枝剤として、下記一般式（５）
【００４５】
【化６０】
［式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は同一または異なる一級アミノ基を有するアルキル基、アルキル基、水素原子から選ばれる。ただし、２個又は３個は一級アミノ基を有するアルキル基である。］
ここで、前記一般式（５）のＲ１３、Ｒ１４、Ｒ１５が、下記一般式（６）
【００４６】
【化６１】
［式中、ｂ、ｄ、およびｆは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｃおよびｅは同一または異なる０または１の整数を表す。ただし、ｂ、ｄ、ｆがいずれも０になる場合は含まれない。］
【００４７】
該分枝剤として、トリス（３−アミノプロピル）アミンとトリス（２−アミノエチル）アミンが特に好ましく例示される。また、下記式で表される４個の一級アミノ基を有するポリプロピレ二ミンテトラミンデンドリマーが好ましく例示される。
【００４８】
【化６２】
また、前記分枝剤として、分子中に多数の一級アミノ基を有するＰＡＭＡＭ化合物が好ましく例示される。ここで、ＰＡＭＡＭ化合物としては、分子中に８個の一級アミノ基を有するＳｔａｒｂｕｒｓｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ １（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）や分子中に１６個の一級アミノ基を有するＳｔａｒｂｕｒｓｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ２（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）が例示される。
【００５０】
更に、前記分枝剤が、２個以上の一級アミノ基を有するポリアミドデンドリマー化合物が好ましく例示される。ポリアミドデンドリマー化合物は、分枝鎖中にアミド基を有し、末端に一級アミノ基を有する化合物である。一級アミノ基を４，８，１６，３２，６４個有するものがあり，それぞれＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ ０．０， １．０， ２．０， ３．０， ４．０（Ａｌｄｒｉｃｈ社の商品名）と名づけられている。４個の一級アミノ基を有するポリアミドデンドリマーとして、下記式のものが好ましく例示される。
【００５１】
【化６３】
第８に、本発明は、上記第７の本発明で製造された基盤に対し、更に、下記一般式（１）
【００５３】
【化６４】
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］
【００５４】
本発明の基盤としては、ガラス、プラスチック等の平面基板、ガラス、プラスチック等で製造されたビーズなど、従来から生体関連物質や医薬品等の固定化用基盤として知られているものが用いられる。
図１〜図３に上記の本発明のフローを化学式で表す。
【００５５】
図１において、基盤（Ｉ）表面に存在する水酸基に活性基含有基含有カップリング剤としてアミノ基含有シラン化合物を反応させ（ＩＩ）、続いて、一般式（１）Ａ−Ｌ−Ｂで表される連結基Ｌを有する架橋試薬を反応させている（ＩＩＩ）。得られた基盤にオリゴ核酸を固定化している（ＶＩ）。
また、基盤（ＩＩＩ）に対し、分枝剤である下記一般式（５）で示される一級アミノ基を２個又は３個有する化合物を反応させている（ＩＶ）。
【００５６】
【化６５】
図２及び３においては、基盤（Ｉ）表面に存在する水酸基に活性基含有基含有カップリング剤として、
【００５７】
【化６６】
【００５８】
【化６７】
【００５９】
【化６８】
この分枝剤に対して、更に、一般式（１）の架橋試薬を反応させ（Ｖ）、（ＸＩ）、それぞれ１個の架橋試薬に対し２個のオリゴ核酸が固定化されている。
【００６０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を示す。図４は、本実施例の全体を示すスキームである。
実施例１ スライドガラスの洗浄
スライドガラス（１０枚）を１０％水酸化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）に１５分間浸した後、水（２００ｍＬで２回）、１％塩酸水溶液（２００ｍＬ）、水（２００ｍＬで２回）の順で洗浄した。メタノール（２００ｍＬ）に浸し５分間の超音波洗浄を行い、遠心によって乾燥させ、さらに１２０度で２時間減圧乾燥した。
【００６１】
実施例２ アミノプロピルシラン化
乾燥させたスライドガラスを３−アミノトリメトキシシラン（１３ｍＬ）、水（８ｍＬ）、メタノール（３８０ｍＬ）中に浸し、室温で少なくとも５時間攪拌させた。その後スライドガラスを取り出し、メタノール（２００ｍＬ）で２回洗浄して遠心後、１２０度で２時間減圧乾燥させた。
【００６２】
実施例３ イソチオシアネート化
あらかじめ１，４−フェニレンジイソチオシアネート（１８３６ｍｇ）を１０％ピリジン・ジメチルフォルムアミド溶液（１９０ｍＬ）に溶解させ、これに上記スライドガラスを入れ、室温下１６時間攪拌させた。スライドガラスを取り出し、ジメチルフォルムアミド（２００ｍＬ）、ジクロロメタン（２００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）の順で洗浄し、減圧下室温で乾燥させ、実施例５のイソチオシアネート化に供した。
【００６３】
実施例４ デンドリマー化
デンドリマーとしてＰＡＭＡＭ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、以下の反応を行った。実施例３でアミノ化されたスライドガラスをガラス容器に敷き、そこに１０％ＰＡＭＡＭメタノール溶液（１３０μＬ）を滴下し、密封して３７度で５時間反応させた。その後スライドガラスをメタノール（２００ｍＬ）で２回、アセトン（２００ｍＬ）で１回洗浄し、減圧下室温で１時間乾燥させた。
【００６４】
実施例５ デンドリマーコーティング後のイソチオシアネート化
実施例４で得られた上記スライドガラスを、実施例３と同様の反応を行い、イソチオシアネート化し、オリゴヌクレオチドのスポットに供した。
【００６５】
実施例６ トリス（３−アミノプロピル）アミン化
実施例３で得られたスライドガラスをガラス容器に敷き、そこに２０または３０％ トリス（３−アミノプロピル）アミン・メタノール溶液（１３０μＬ）を滴下し、密封して３７度で５時間反応させた。その後スライドガラスをメタノール（２００ｍＬ）で２回、アセトン（２００ｍＬ）で１回洗浄し、減圧下室温で１時間乾燥させた。
【００６６】
実施例７ ３−アミノプロピルアミンコーティング後のイソチオシアネート化
実施例６で得られた上記スライドガラスを、実施例３と同様の反応を行い、イソチオシアネート化し、これをオリゴヌクレオチドのスポットに供した。
【００６７】
実施例８ ポリプロピレ二ミンテトラミンデンドリマー化
実施例３で得られたスライドガラスをガラス容器に敷き、そこに２０または３０％ ポリプロピレ二ミンテトラミンデンドリマー・メタノール溶液（１３０μＬ）を滴下し、密封して３７度で５時間反応させた。その後スライドガラスをメタノール（２００ｍＬ）で２回、アセトン（２００ｍＬ）で１回洗浄し、減圧下室温で１時間乾燥させた。
【００６８】
実施例９ ポリプロピレ二ミンテトラミンデンドリマーコーティング後のイソチオシアネート化
実施例８で得られた上記スライドガラスを、実施例３と同様の反応を行い、イソチオシアネート化し、これをオリゴヌクレオチドのスポットに供した。
【００６９】
実施例１０ オリゴヌクレオチドのスライドガラスへのスポットと結合反応
オリゴヌクレオチドライブラリー（８０ｐｍｏｌ； ＭＷＧ社製）を滅菌水（４μＬ）に溶解し、スポット溶液（４μＬ； １Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）：飽和Ｗａｋｏ ｇｅｌ Ｃ−３００（和光純薬工業株式会社の商品名）水溶液＝１：１）と混合させ、スポッター（ＳＰＢＩＯ２０００、日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社の商品名、ＳＰＢＩＯは登録商標）によって実施例５、７、９によって得られたコーティング済みスライドガラス上にスポットした。スポット後タイトボックスにろ紙を敷き、３００ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液を湿らせ、溶液が付かないようにスポット済みのスライドガラスを入れ、密閉後３７℃で放置した。１６時間後タイトボックスからスライドガラスを取り出しドライオーブンに移し６０℃で１５分間加温した。
【００７０】
実施例１１ オリゴヌクレオチドスポットガラスのブロッキング
スライドガラスを０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（２００ｍＬ）で室温５分間、０．０５％塩酸水溶液（２００ｍＬ）で室温２分間、０．１Ｍ 塩化カリウム（２００ｍＬ）で室温１０分間、滅菌水（２００ｍＬ）で室温１分間洗浄した。
続いて１Ｍ トリス−グリシン溶液（ｐＨ＝９．０）にガラスを浸し、室温で１時間攪拌しブロッキングを行った。滅菌水で２回洗浄後、ドラフト内で乾燥させて冷蔵保存した。
【００７１】
（参考例） 逆転写反応
マウス肝臓由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いた逆転写反応
マウス肝臓由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡ（１００μｇ）を逆転写反応用ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマー（２μＬ；０．５μｇ／μＬ）と滅菌水に溶解して全量を３０μＬとし、これを７０度で５分間、４２度で２分間加温した。その後あらかじめ調製しておいた色素を含む溶液（５０μＬ；逆転写反応用緩衝液（ｘ５、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、３７５ ｍＭ ＫＣｌ、 １５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ ｍＭ ＤＴＴ：１６μＬ）、０．１Ｍ ジチオスレイトール（８μＬ）、１０ｘｄＮＴＰ溶液（８μＬ；２ｍＭ ｄＴＴＰ、５ｍＭ ｄＡＴＰ、 ５ｍＭ ｄＣＴＰ、 ５ｍＭ ｄＧＴＰ）、１ｍＭ Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰ（８μＬ）、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （１０μＬ；４０ｕｎｉｔｓ／μＬ））を上記ＲＮＡ溶液と混合し、続けて逆転写酵素（１μＬ、２００ｕｎｉｔｓ；ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−；ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を添加し４２度で加温した。１時間後、上記逆転写酵素０．５μＬをさらに加え、４２度で１時間反応させた。この反応液に滅菌水（４０μＬ）、０．５ＭＥＤＴＡ（１０μＬ）、１Ｎ ＮａＯＨ（２０μＬ）を加え、６５度で３０分間加温し、１Ｎ ＨＣｌ（１５μＬ）を加え中和し、氷冷した。エタノール沈殿を行った後、滅菌水（５０μＬ）を加え、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ Ｐ３０（ＢＩＯ ＲＡＤ社の商品名）により脱塩した。溶出液をＳｐｅｅｄ Ｖａｃにて濃縮した。
【００７２】
実施例１２ マウス肝臓 ｔｏｔａｌ ＲＮＡから調製したｃＤＮＡとのハイブリダイゼ ーション
参考例に従って調製された蛍光標識ｃＤＮＡに２０ Ｘ ＳＳＣ（ １０μＬ）、１０％ ＳＤＳ（０．４μＬ）、および滅菌水を加え全量４０μＬのプローブ溶液を作成した。そのプローブＤＮＡ溶液を静かにＤＮＡチップ上にのせた後、カバーグラスを溶液上にのせ、４Ｘ ＳＳＣ溶液で湿らせたキムタオルを敷いたタイトボックス内に入れ、４０度で１６時間放置した。
【００７３】
ハイブリダイゼーション後、チップを１×ＳＳＣ−０．０５ ％ ＳＤＳ溶液（２００ｍＬ，４０度）に１０分間、０．２ ｘ ＳＳＣ−０．１ ％ ＳＤＳ溶液（２００ｍＬ，４０度）に２分間、続いて０．２ ｘ ＳＳＣ（２００ｍＬ）、０．０５ ｘ ＳＳＣ（２００ｍＬ）でそれぞれ室温で洗浄した。乾燥させた後、チップスキャナー（Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ、Ａ Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ の商品名）で検出した。マウス肝臓由来のＲＮＡをＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰで標識したｃＤＮＡを調製し、オリゴヌクレオチドチップによって解析した結果。緑色がＣｙ３、赤色がＣｙ５の検出波長の結果であった。
【００７４】
実施例１３ オリゴヌクレオチドのスライドガラス上への固定化の確認
１ｍＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ （２μＬ）、ジメチルスルフォキシド（４μＬ）、２５ｍＭ 塩化コバルト溶液（４μＬ）、反応緩衝溶液（ｘ５、１Ｍ カコジル酸カリウム、２５ｍＭトリス−塩酸、１．２５ｍｇ／ＢＳＡ、 ｐＨ６．６；８μＬ）、ターミナルトランスフェレース（５０ｕｎｉｔｓ）に滅菌水を加えて全量４０μｌとした反応溶液を調製後、直ちにスライドガラスに全量滴下した。カバーガラスを反応液上にのせ、３７度で放置した。１５分後４ＸＳＳＣ緩衝液（０．６ＭＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸二水和物）、０．１％ＳＤＳ溶液、５０％エタノール水溶液で洗浄し乾燥させ検出機（スキャンアレイ）で測定した。
【００７５】
【発明の効果】
基盤を本発明のようにコーティングすることで、生体関連物質等をバックグラウンド値が低く、高密度に固定化することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明のフローを示す化学式。
【図２】
本発明のフローを示す化学式。
【図３】
本発明のフローを示す化学式。
【図４】
本発明の実施例を示すスキーム。
Claims (22)
- 基盤上に活性基含有カップリング剤を介して、下記一般式（１）
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］ - 前記活性基含有カップリング剤が、下記一般式（２）
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、同一または異なる−Ｏ（ＣＨ２）ａＣＨ３またはＣｌを表し、ａは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｒは０から１０の整数を表す。］ - 前記活性基含有カップリング剤が、下記一般式（３）
［式中Ｒ４は以下のいずれかの構造を表す。
- 前記活性基含有カップリング剤が、下記一般式（４）
［式中、Ｒ１０は以下のいずれかの構造を表す。］
- 前記一般式（１）の架橋試薬Ａ−Ｌ−Ｂが、以下のいずれかであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の基盤。
- 請求項１〜５のいずれかに記載された基盤の一般式（１）のＡ−Ｌ−Ｂで示される架橋試薬を介して、分子中に一級アミノ基を２個以上有する分枝剤が結合した基盤。
- 前記分枝剤が、下記一般式（５）
［式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は同一または異なる一級アミノ基を有するアルキル基、アルキル基、水素原子から選ばれる。ただし、２個又は３個は一級アミノ基を有するアルキル基である。］ - 前記一般式（５）のＲ１３、Ｒ１４、Ｒ１５が、下記一般式（６）
［式中、ｂ、ｄ、およびｆは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｃおよびｅは同一または異なる０または１の整数を表す。ただし、ｂ、ｄ、ｆがいずれも０になる場合は含まれない。］ - 前記分枝剤が、多数の一級アミノ基を有するポリアミドデンドリマーであることを特徴とする請求項６に記載の基盤。
- 請求項６〜９のいずれかに記載の基盤の分子中に一級アミノ基を２個又は３個有する分枝剤を介して、更に、下記一般式（１）
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］ - 請求項１〜１０のいずれかに記載の基盤の、一般式（１）Ａ−Ｌ−Ｂで示される架橋剤を介して、結合対象物である生体関連物質または化学物質が固定化されることを特徴とする生体関連物質または医薬品固定化用基盤。
- 請求項１〜１０のいずれかに記載の基盤に、生体関連物質または化学物質を固定化することを特徴とする生体関連物質または医薬品固定化方法。
- 基盤上に活性基含有カップリング剤を反応させ、続いて、下記一般式（１）
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］ - 前記活性基含有カップリング剤が、下記一般式（２）
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、同一または異なる−Ｏ（ＣＨ２）ａＣＨ３またはＣｌを表し、ａは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｒは０から１０の整数を表す。］ - 前記活性基含有カップリング剤が、下記一般式（３）
［式中Ｒ４は以下のいずれかの構造を表す。
- 前記活性基含有カップリング剤が、下記一般式（４）
［式中、Ｒ１０は以下のいずれかの構造を表す。］
- 前記一般式（１）の架橋試薬Ａ−Ｌ−Ｂが、以下のいずれかであることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の基盤のコーティング方法。
- 請求項１３〜１７のいずれかに記載された基盤に対し、分子中に一級アミノ基を２個以上有する分枝剤を反応させたことを特徴とする基盤のコーティング方法。
- 前記分枝剤が、下記一般式（５）
［式中、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は同一または異なる一級アミノ基を有するアルキル基、アルキル基、水素原子から選ばれる。ただし、２個又は３個は一級アミノ基を有するアルキル基である。］ - 前記一般式（５）のＲ１３、Ｒ１４、Ｒ１５が、下記一般式（６）
［式中、ｂ、ｄ、およびｆは同一または異なる０から１０の整数を表し、ｃおよびｅは同一または異なる０または１の整数を表す。ただし、ｂ、ｄ、ｆがいずれも０になる場合は含まれない。］ - 前記分枝剤が、２個以上の一級アミノ基を有するポリアミドデンドリマーであることを特徴とする請求項１８に記載の基盤のコーティング方法。
- 請求項１９〜２１のいずれかに記載の基盤に対し、更に、下記一般式（１）
［式中、ＡおよびＢは同一または異なる、活性エステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、イミダゾール基、カルボジイミド基、アルデヒド基から選ばれ、上記活性基含有カップリング剤の活性基と反応する基を示す。ＬはＡとＢを連結する連結基であり、直鎖アルキル基、アリール基、アミド基を有するアルキル基から選ばれる。］
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