KR100379720B1 - 덴드리머 단일층 지지체 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이오 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 바이오 칩(chip) 제조시 슬라이드 글라스에 바이오폴리머를 고정시킬 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 지지체는 실리레이티드 슬라이드(silylated slide)상의 알데히드기와 덴드리머를 반응시켜 쉬프 베이스(schiff base)를 제조함으로써 덴드리머 단일층을 형성하는 단계와 상기 덴드리머 단일층이 형성된 슬라이드에 소듐 보로하이드라이드(NaBH4)로 슬라이드 글라스 상의 알데히드기를 알콜기로 변환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 지지체는 3차원 구조로 바이오폴리머를 효과적 고정시킬 수 있을 뿐만 아니라 지지체 내에 바이오폴리머의 상보적 결합을 돕는다.

Description

덴드리머 단일층 지지체 및 그의 제조방법{Supporter containing drimer monolayer and manufacturing method of same}
본 발명은 바이오 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바이오 칩(chip) 제조시 슬라이드 글라스에 바이오폴리머를 고정시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.
하이브리디제이션(Hybridization)에 기초를 둔 마이크로어레이(microarray)분석법은 최근 들어 가장 많이 사용되어지는 기술로 다양한 응용성을 가지고 있다. 이미 많은 분야에서 쓰여지고 있는 마이크로어레이 분석법은 표지된 핵산분자들이 고체 표면에 고정되어 있는 핵산분자들을 검출할 수 있다는 기본 개념에서부터 점차 발전되어지고 있다.
현재 DNA 칩 관련 연구는 미국에서 대부분 이루어지고, 일부 유럽에서 진행되고 있다. 또한 DNA 칩 제작과 응용에 관련된 수많은 벤처 회사들이 생겨났으며, Molecular Dynamics, Motorola 등 거대 기업들이 이에 가세하였다. 1998년도까지 일반 연구자가 구입할 수 있는 어레이(array)는 유전자들을 필터에 고정한 형태뿐이었으나, NEN life Science에서 DNA 칩의 대표적인 형태로 자리잡은 슬라이드 글라스 위에 2,400개의 인체 cDNA를 고정한 제품을 출시하였으며, Affymetrix, Incyte 등에서는 사람의 EST, 마우스, 효모, 몇 종의 박테리아 등에 대한 DNA 칩을 상품화하였고, Clontech사 역시 슬라이드 형태의 cDNA 어레이를 출시하였다. 이러한 제품들은 모두 이차원적인 평면에 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 고정하는 방법들을 사용하여 제작되어진 것이다. 즉, 폴리-라이신(poly-lysine)을 유리표면에 처리한 후에 DNA를 UV-교차결합(crosslinking) 등을 통하여 고정하거나, 유리표면에 알데히드기나 아민기의 SAM(self assembled monolayer)을 만들고 그 위에 DNA를 고정하는 방법을 사용한 것이다. 상기 방법은 슬라이드 글라스 표면의 아민기나 알데히드기가 DNA 올리고뉴클레오티드의 다른 작용기들과 반응하여 화학결합을 형성하여 상기 지지체를 짧은 DNA 올리고뉴클레오티드에서 긴 DNA 뉴클레오타이드까지 적용할 수 있는 장점이 있으나, 공간적 한계성 때문에 효율적이지 못한 실정이다.
상기한 이차원적 DNA 고정의 공간적인 한계성을 극복하기 위하여 유리표면에 아크릴아마이드 젤 패드, 젤라틴 패드, 한천필름 등을 입혀 DNA 올리고뉴클레오티드 고정성을 증가시키려는 지지체가 개발되었다. 상기 폴리아크릴아마이드 젤은 높은 DNA 폴리뉴클레오타이드 고정력을 가지는 삼차원 고체 지지체이지만 (Rehman,F.N., Audeh,M., Abrams,E.S., Hammond, P.W., Kenney,M., and Boles,T.C. (1999)Nucleic Acids Res., 27, 649 - 655 ; Guschin,D., Yershov,G., Zaslavsky,A., Gemmell,A., Shick,V., Proudnikov,D., Arenkov,P., and Mirzabekov,A. (1997)Anal. Biochem., 250, 203-211) 고체 지지체와 핵산사이의 적절한 공간 부족으로 인하여 하이브리디제이션의 효율이 떨어진다. 그리하여 하이브리디제이션 수율을 높이기 위하여 고정된 핵산과 고체 지지체 사이에 다양한 연결체들을 도입하고 있다.(Guo,Z., Guilfoyle,R.A., Thiel,A.J., Wang,R., and Smith,L.M. (1994)Nucleic Acids Res., 22, 5456-5465 ; Shchepinov,M.S., Case-Green,S.C., and Southern,E.M. (1997)Nucleic Acids Res., 25, 1155-1161) 그러나, 대부분의 방법들은 복잡할 뿐만 아니라 특정한 조건하에서만 가능하여 통상적인 지지체로 사용되어지지 못하고 있는 실정이다.
따라서, 본 발명은 DNA, 단백질, 항체 등의 바이오폴리머를 고정할 수 있는 지지체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 DNA, 단백질, 항체 등의 바이오폴리머를 고정할 수 있는 지지체 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 지지체에 포함되는 덴드리머(dendrimer)의 3세대 증가한 형태를 도시한 것이고,
도 2는 본 발명의 지지체에 포함되는 덴드리머(dendrimer)의 4세대 증가한 형태를 도시한 것이고,
도 3은 본 발명의 지지체 제조방법을 도시한 것이고,
도 4는 본 발명의 지지체를 도시한 것이고,
도 5는 본 발명의 DNA 칩 제조방법을 도시한 것이고,
도 6은 본 발명의 단백질 칩 제조방법을 도시한 것이고,
도 7은 본 발명의 지지체에 올리고뉴클레오티드를 고정한 다음 올리고뉴클레오티드 농도별 고정정도를 측정한 사진(a) 및 그래프(b)를 나타낸 것이고,
도 8은 본 발명의 지지체의 하이브리드형성 정도를 사진(a)과 그래프로(b)로 나타낸 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 알데히드(aldehyde)가 결합된 슬라이드 글라스의 표면에 있어서, 상기 알데히드에 덴드리머(dendrimer)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 덴드리머 단일층 지지체를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 실리레이티드 슬라이드(silylated slide)상의 알데히드기와 덴드리머를 반응시켜 쉬프 베이스(schiff base)를 제조함으로써 덴드리머 단일층을 형성하는 단계 및 (b) 상기 덴드리머 단일층이 형성된 슬라이드에 소듐 보로하이드라이드(NaBH4)로 슬라이드 글라스 상의 알데히드기를 알콜기로 변환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 덴드리머 단일층 지지체의 제조방법을 제공한다.
또한 상기의 지지체를 이용하여 DNA, 단백질, 펩타이드, 항체, 및 화학물질로 이루어진 군으로부터 선택되어진 것을 고정한 바이오 칩(chip)을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 질환 진단용 마이크로어레이 칩 시스템 개발에 있어서, 가장 근본적이고 핵심적인 바이오칩 제조과정 중 DNA, 단백질 등의 폴리머를 유리 표면에 효과적으로 고정시키는 방법을 개발하고자 하였다. 본 발명자들은 바이오칩에 필수적인 지지체와 이를 이용한 바이오칩을 고안하였다.
본 발명에서는 3차원적으로 바이오폴리머를 유리표면에 고정하기 위하여, 표면에 알데히드기의 단일 층을 가지도록 처리되어진 슬라이드 글라스에 구형고분자인 덴드리머(dendrimer)를 붙인 다음, 다시 바이오폴리머를 고정시키는 방법을 이용하였다. 상기 덴드리머는 80년대 중반부터 연구되어지기 시작한 물질로 현재까지 합성방법과 물리적, 화학적 특성에 대한 연구들이 진행되어 있으며 고분자의 가소제로서, 액정이나 레이어(layers)로서, 약물전달자로서 연구되어 있을 뿐 상업적으로 상용화되어 있진 않은 새로운 분자이다.
본 발명의 폴리아미도아민(Polyamidoamine; 이하 PAMAM 함) 덴드리머는 도 1에 나타나 있는 바와 같이, 뉴클레오필릭(nucleophilic) 또는 일렉트로필릭 (eletrophilic)중심부로부터 시작되어 방사상으로 뻗어있는 아미도아민(amido amine)기를 가지고 있는 새로운 형태의 고분자이며, 구형에 가까운 3차원적인 구조를 가지고 있다. 도 1의 3세대 형태인 덴드리머는 지름이 약 40 Å이고 32개의 아민기를 포함한다.
도 1의 덴드리머에서 한 세대가 증가할수록 아민기가 두배로 증가하게 되며 고분자 지름은 한 세대당 약 10 Å씩 증가한다. 도 2는 본 발명의 덴드리머가 4세대 증가한 형태로 총 64개의 아미노군(amino group)을 포함하고 있다. 본 발명의 덴드리머는 덴드리머의 고유한 구조와 가지쳐진 아민기가 3차원적 지지체를 제공하여 준다. 덴드리머는 타원형의 형태일 것으로 가정된다.(Tokuhisa,H., Zhao,M.,Baker,L.A., Phan,V.T., Dermody,D.L., Garcia,M.E., Peez,R.F., Crooks,R.M., and Mayer,T.M. (1998)J. Am. Chem. Soc. 120, 4492-4501 ; Bliznyuk,V.N., Rinderspacher,F., and Tsukruk,V.V. (1998)Polymer, 39, 5249-5252)
본 발명의 덴드리머는 1세대 내지 8세대까지 증가한 형태가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 2세대 내지 6세대이고, 가장 바람직하게는 3세대 내지 4세대이다.
본 발명의 덴드리머에 고정시키는 바이오폴리머는 DNA, 단백질, 펩타이드, 화학물질, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 DNA, 단백질이고, 가장 바람직하게는 DNA 뉴클레오티드이다.
본 발명의 지지체는 도 3의 (d)로 표현되며, 알데히드(aldehyde)가 결합된 슬라이드 글라스의 표면에서 상기 알데히드에 덴드리머(dendrimer)가 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 지지체는 덴드리머의 아민기에 링커가 연결되어 있는 것을 더욱 포함한다. 상기 링커는 바이오폴리머를 지지체에 쉽게 연결되도록 하는 연결체로, 하기 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물 및 n-하이드록시숙시니미딜 아이도아세테이트(n-hydroxysuccin imidyl iodoacetate; 이하 NIA라 함)로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
본 발명의 링커가 연결된 지지체는 도 4에 도시하였다. a는 화학식 1의 링커가 연결된 지지체이고, b는 화학식 2가 연결된 지지체이고, c는 화학식 3이 연결된 지지체이고, d는 NIA가 연결된 지지체이다. 도 4의 a, b, c, d 지지체는 올리고뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 항체 등에 고정할 수 있다.
본 발명의 PDC 링커가 연결된 덴드리머는 지름이 약 17 Å이 늘어나고, 덴드리머에 결합한 PDC의 티오시안산염기들(thiocyanate)의 표면 밀도는 대략적 0.06 nmol/cm2로 근접한 티오시안산염기 사이의 평균거리가 약 18 Å 정도이다. 상기 18 Å은 18 내지 20 Å인 DNA 나선지름과 거의 동일하다. 이는 기존의 2차원인 고체 지지체의 말단 작용기들이 약 0.3 nmol/cm2이상의 표면 밀도로 근접한 두 작용기 사이가 5 내지 10 Å인 것에 비하여(Guo,Z., Guilfoyle, R.A., Thiel,A.J., Wang,R., and Smith,L.M. (1994)Nucleic Acids Res., 22, 5456-5465 ; Matson,R.S., Rampal,J.B., and Coassin,P.J. (1994)Anal. Biochem., 217, 306-310) 본 발명의 덴드리머가 올리고뉴클레오티드를 고정하기에 매우 적합함을 나타내는 것이다. 또한 본 발명의 지지체는 말단 작용기(덴드리머에 결합된 PDC의 티오시안산염기)의 수가 다른 2차원 지지체들의 경우 보다 작음에도 불구하고, 본 발명의 지지체의 티오시안산염기가 3차원적인 배열을 가지고 또한 이상적인 작용기 사이의 거리를 가져 올리고뉴클레오티드를 고효율로 고정할 수 있다.
또한 본 발명은 덴드리머 단일층 지지체의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 지지체 제조방법은 도 3에 간략하게 도시하였으며, 실리레이티드 슬라이드(silylated slide)상의 알데히드기와 덴드리머를 반응시켜 쉬프 베이스(schiff base)를 제조함으로써 덴드리머 단일층을 형성하는 단계와 상기 덴드리머 단일층이 형성된 슬라이드 글라스에서 덴드리머가 고정되지 않은 알데히드기를 알콜기로 환원시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 지지체 제조방법은 상기 환원단계 이후에 링커를 연결시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 덴드리머 단일층을 형성하는 단계는 알데히드기가 한층으로 부착된 슬라이드 글라스를 0.5 %로 덴드리머를 포함하는 메탄올에 반응시키고 슬라이드 글라스상의 알데히드기와 덴드리머의 아민기를 반응시킴으로써 이루어진다. 상기 덴드리머 단일층 형성단계에서는 알데히드기와 덴드리머가 결합된 도 3의 (b)형태로 형성된 다음 탈수반응 후 (c)형태를 제조하게 된다.
상기 덴드리머가 고정되지 않은 알데히드기를 알콜기로 변환시키는 단계에서는 도 3의 (c) 형태의 쉬프베이스에 소듐 보로하이드라이드(NaBH4)를 첨가하여 슬라이드 글라스 상의 덴드리머와 반응하지 않은 알데히드기를 환원시켜 알콜기로 변환시킴으로써 (d) 형태의 쉬프 베이스를 제조하게 된다.
상기 링커를 연결시키는 단계에서는 덴드리머의 아민기에 링커를 결합시켜 이루어지고 상기 링커는 하기 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물 및 n-하이드록시숙시니미딜 아이도아세테이트(n-hydroxysuccin imidyl iodoacetate; NIA)로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 상기 링커의 연결방법(참조문헌: Chrisey, L. A., Lee, G. U. and OFerrall, C. E.Nucleic Acids Res.(1996) 24, 3031-3039, Singh, P.Bioconjugate Chem. (1998) 9, 54-63 Singh, P.Bioconjugate Chem. (1998) 9, 54-63)은 공지된 것으로 통상적으로 실시하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 지지체를 이용한 바이오칩을 제공한다. 상기 바이오칩은 DNA 칩, 단백질 마이크로어레이, 항체 지지체, 바이오센서(biosensor), 화학물질을 고정한 컴비네이토리얼(combinatorial) 화학물질이 바람직하다.
본 발명의 바이오칩은 본 발명의 지지체에 바이오폴리머가 고정되어 있는 것으로, 슬라이드 글라스 상의 알데히드기에 결합된 덴드리머에서 상기 덴드리머 아민기에 바이오폴리머가 고정되어 있는 형태이다. 상기 바이오칩의 제조는 통상적인 UV-교차반응(crosslinking) 또는 열반응으로 실시하는 것이 바람직하다. 도 5에 본 발명의 UV-교차반응(a, b)의 의한 DNA 칩 제조모식도를 일예로 도시하였다.또한 본 발명의 링커가 연결된 지지체를 이용한 바이오칩을 제공한다. 상기 바이오칩은 슬라이드 글라스 상의 알데히드기에 결합된 덴드리머의 아민기에 링커를 연결시킨 다음 상기 링커에 바이오폴리머를 결합시킨 형태이다. DNA 칩인 경우 도 5의 a, b와 같은 UV-교차반응이나 c와 같은 반응에 의하여 제조할 수 있다. 도 5의 c는 링커를 이용한 DNA 칩 경우를 도시한 것이고, 상기 지지체에 고정하는 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 5'말단이나 또는 3' 말단을 아민으로 치환시키거나 티올(thiol)로 치환시켜 제조한 올리고뉴클레오티드가 바람직하고, 통상적으로 사용하는 크기의 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 또한 올리고뉴클레오티드의 5'말단이나 3'말단을 티올(thiol)로 치환시켜 PDC 이외의 링커가 연결된 지지체에 고정함으로써 DNA 칩을 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 단백질 칩 경우에는 도 6에 그 일예를 도시하였다. 도 6의 a와 같이 단백질을 링커가 연결되어 있지 않은 덴드리머 지지체에 고정하거나, 링커가 연결된 지지체(도 6의 b)에 고정함으로써 단백질 칩을 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
하기 모든 시약은 Sigma-Alrich(미국)부터 구입하여 사용하였다. 실리레이티드 슬라이드 글라스(Silylated slide glass)는 Telechem (미국)사로부터 구입하여 사용하였다. 또한 사용되어진 모든 올리고뉴클레오티드는 제노텍(대전, 한국)에서 주문하여 합성하였다. 덴드리머는 시그마(Sigma Aldrich)사에서 3세대와 4세대를 구입하여 사용하였다.
지지체 제조
미리 세척되어진 알데히드가 고정되어 있는 실리레이티드 슬라이드 (silylated slides)를 0.5 % PAMAM 덴드리머(3세대; 도 1) 메탄올 용액에 1 내지 2일 동안 담가 두어 슬라이드 표면에 SAM(self assembled monolayer)형태로 존재하는 알데히드기와 덴드리머의 아민기 사이의 쉬프베이스(Schiff base)반응을 형성시킴으로써 슬라이드 글라스 표면에 덴드리머 한층을 제조하였다. 그 후 NaBH4를 반응시켜 덴드리머가 결합되니 않은 슬라이드 글라스상의 알데히드기를 알콜기로 변환시켰고, 반응이 끝난 슬라이드 글라스를 메탄올로 세 번 씻어 준 다음 30분 동안 진공상태에서 건조하였다.
[실시예 2]
상기 실시예 1과 동일하게 실시하여 제조한 지지체에 올리고뉴클레오티드는 3 X SSC에 녹인 다음 미리 제조된 상기 지지체에 스포팅하였다. 지지체에 스포팅된 용액을 건조시킨 다음 UV-교차반응기(UV- crossliker ; 60 mJ)에 넣어서 교차반응(cross-linking)이 일어나게 하였다.
[실시예 3]
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였으나, 덴드리머는 4세대 형태를 사용하였다.
[실시예 4]
상기 실시예 1의 제조방법으로 실시한 다음 링커가 연결된 지지체를 더욱 제조하였다. 먼저, 슬라이드 글라스에 고정된 덴드리머의 링커(linker)형성을 위하여, 말려진 슬라이드 글라스를 다시 10 % 피리딘/포름아미드용매상의 0.2 % 1,4-페닐렌 이이소소이시아네이드(phenylene diisothoicyanate; PDC, aldrich) 용액에 아르곤 하에서 3시간 동안 담가 두었다. 반응이 끝난 뒤 슬라이드 글라스를 메탄올로 씻어 준 뒤 사용하기 전까지 진공건조기에 보관하였다.
[실시예 5]
상기 실시예 3의 제조방법으로 실시한 다음 링커가 연결된 지지체를 더욱 제조하였다.
[비교예]
본 발명의 비교예로 슬라이드 글라스 표면에 알데히드기가 있는 실리레이티드 슬라이드를 사용하였다.
[실험예]
올리고뉴클레오티드의 고정화
올리고뉴클레오티드를 고정하는 지지체로 실시예 4, 실시예 5, 비교예를 사용하였고, 지지체에 고정하는 올리고뉴클레오티드는 3'말단이 아민으로 변형된 5'-CCG ACC GGA ATA AAT-NH2-3'를 사용하였다. 지지체에 고정되는 정도를 확인하기 위하여 올리고뉴클레오티드를 지지체에 고정화시키기전에 올리고뉴클레오티드의 5'말단에32P로 표지하였다. 올리고뉴클레오티드 10 pmol에 3 ul [γ-32P]ATP(>6,000 Ci/mol, 10 mCi/ml)와 T4 폴리뉴클레오티드 카이네이즈로 37 ℃에서 30분 반응시키고, 다시 95 ℃에서 2분 동안 가열하여 반응을 중지시킨 다음 표지된 올리고뉴클레오티를 G50 스핀 컬럼으로 정제하였다. 0.005, 0.001 0.03 pmol/ul의 농도로 올리고뉴클레오티드 용액을 0.5 ul씩 준비하여 상기 실시예 1, 실시예 3, 비교예의 준비한 슬라이드 글라스에 점적한 다음 실온에서 약 16시간동안 건조시켰다. 건조된 슬라이드 글라스는 물, 3 N의 NH4OH, 세척완충액(1x SSPE, 0.2 % SDS)으로 세척하여 고정화되지 않은 올리고뉴클레오티드를 제거하였다. 그 후 슬라이드 글라스에 고정된 올리고뉴클레오티드의 표면밀도는 올리고뉴클레오티드의 방사성(radioa ctivity)에 의해 BAS 1500 (FUJI, 일본)으로 정량하였다.
도 7은 본 발명의 지지체에 올리고뉴클레오티드를 고정한 다음 올리고뉴클레오티드 농도별 고정정도를 측정한 사진(a) 및 그래프(b)로, 올리고뉴클레오티드의 농도와 방사성의 비례정도를 보여주었다. 실시예 1과 실시예 3의 덴드리머 지지체는 비교예의 알데히드 지지체에 비해 2 배 내지 3배 높은 올리고뉴클레오티드 표면 밀도를 나타내었다. 이러한 결과는 같은 조건에서 올리고뉴클레오티드가 고밀도의 알데히드기를 가진 지지체보다 덴드리머 지지체에 더 많이 고정화된다는 것을 의미하는 것이다. 또한 실시예 4와 실시예 5를 비교하였을 때 실시예 3이 실시예 1에 비해 올리고뉴클레오티드를 고정할 수 있는 작용기가 두배나 많지만, 고정시키는 효율은 큰 차이를 보이지 않았다.
하이브리드형성 효율 조사
실시예 4, 실시예 5 및 비교예의 지지체에 올리고뉴클레오티드를 고정시킨 다음 고정된 올리고뉴클레오티드와 상보적인 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드 형성정도를 확인하였다. 먼저, 표지되지 않은 5'-CCG ACC GGA ATA AAT-NH2-3'를 상기 실험방법과 동일하게 실시하여 슬라이드 글라스상에 고정시켰고, 상보적인 올리고뉴클레오티드인 5'-ATT TAT TCC GGT CGG -3'를 [γ-32P]ATP로 5' 끝에 표지하여 하이브리드 형성의 탐침자로 준비하였다. 뉴클레오티드가 고정된 슬라이드 글라스를 하이브리디제이션 완충액(5 x SSPE, 0.2 % SDS)에 두시간 동안 반응시킨 다음 여기에 5' 끝이32P로 표지된 탐침자를 최종농도 2 pmol/ml가 되게 넣어준 다음 42 ℃에서 16시간동안 반응시켰다. 반응이 끝나고 하이브리디제이션되지 않은 탐침자들은 세척완충액 I(1 x SSPE, 0.2 % SDS), 세척완충액II(0.1 x SSPE, 0.2 % SDS)로 38 내지 40 ℃에서 30분 동안 세척하여 제거하였다. 하이브리디제이션 효율은 상기 고정화 반응의 정량화 방법과 마찬가지로 BAS 1500을 이용하여 측정하였다.
도 8은 본 발명의 지지체의 하이브리드형성 정도를 사진(a)과 그래프로(b)로 나타낸 것으로, 실시예 4 및 실시예 5의 지지체가 비교예의 지지체에 비해 최고 8배까지의 하이브리드 형성을 보였다. 이러한 결과는 상기 올리고뉴클레오티드의 고정화 실험에서 실시예 4와 실시예 5의 지지체가 비교예에 비해 2배 내지 3배의 증가를 보였지만, 실제적인 하이브리드 형성정도에서는 월등히 높은 효율을 가진다는 사실을 입증하는 것이다. 즉 핵산들의 하이브리드형성 효율에 많은 영향을 주는 요소인 스테릭 힌드런스(steric hinderance)를 극복하여 올리고뉴클레오티드의 하이브리드 형성에 충분한 3차원적인 공간을 제공하였으며, 또한 덴드리머와 올리고뉴클레오티드사이의 링커로 사용한 PDC가 유연성을 가져 하이브리드 형성의 효율을 높인 것으로 알 수 있었다.
또한 고정화된 핵산의 표면 밀도를 높이기 위해 변형된 슬라이드 글라스를 쓰는 DNA 마이크로어레이의 경우, 활성화된 표면에 비특이적으로 결합하는 핵산의 양도 많은 실정이다. 이러한 높은 비특이적인 결합은 마이크로어레이 분석의 민감도를 매우 감소시키는 원인이 된다.
본 발명의 덴드리머 지지체 또한 아민기를 포함하기 때문에 양전하를 띄고 있어 음전하를 가지는 핵산과의 전기적인력에 의한 결합이 발생할 수 있다. 하지만 도 7과 도 8에서는 PDC로 활성화된 실시예 4과 실시예 5의 지지체의 표면에 어떠한 비특이적 결합이 관찰되지 않았다. 따라서 덴드리머의 모든 아민기가 PDC와 반응하여 티오시아네이드기로 바뀌었다는 것을 의미한다. 즉 덴드리머의 모든 아민기가 올리고뉴클레오티드를 고정할 수 있는 형태로 되어 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 고정시켰으며, 그로 인하여 마이크로어레이 분석에 있어서 가장 문제가 되고 있는 비특이적 결합도 감소시킬 수 있었다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 지지체는 슬라이드 글라스상에 부착된 알데히드에 덴드리머가 결합되어 있어 3차원적인 구조를 가지고 있으며 그로 인하여 바이오폴리머가 효과적으로 고정되어 질 수 있다. 또한 본 발명의 지지체는 바이오 칩으로 제작하여 사용할 수 있으며, 특히 본 발명의 지지체를 이용한 DNA 칩은 비특이적 결합없이 상보적 결합만이 형성될 수 있다.

Claims (8)

  1. (a) 실리레이티드 슬라이드(silylated slide)상의 알데히드기와 덴드리머를 반응시켜 쉬프 베이스(schiff base)를 제조함으로써 덴드리머 단일층을 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 덴드리머 단일층이 형성된 슬라이드에 소듐보로하이드라이드 (NaBH4)로 슬라이드 글라스 상의 알데히드기를 알콜기로 변환시키는 단계
    를 포함하는 방법으로 제조된 덴드리머 단일층 지지체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 덴드리머 단일층 지지체는 덴드리머의 아민기(amine)에 링커가 더욱 연결된 것인 덴드리머 단일층 지지체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 링커는 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물 및 n-하이드록시숙시니미딜 아이도아세테이트(n-hydroxysuccin imidyl iodoacetate; 이하 NIA라 함)로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인 덴드리머 단일층 지지체.
    [화학식 1]
    [화학식 2]
    [화학식 3]
  4. 제 1항에 있어서, 상기 덴드리머는 제 1세대, 제 2세대, 제 3세대, 제 4 세대, 제 5세대, 제 6세대, 제 7세대 및 제 8세대로 이루어진 군으로부터 선택된 형태인 것인 덴드리머 단일층 지지체.
  5. (a) 실리레이티드 슬라이드(silylated slide)상의 알데히드기와 덴드리머를 반응시켜 쉬프 베이스(schiff base)를 제조함으로써 덴드리머 단일층을 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 덴드리머 단일층이 형성된 슬라이드에 소듐보로하이드라이드 (NaBH4)로 슬라이드 글라스 상의 알데히드기를 알콜기로 변환시키는 단계
    를 포함하는 덴드리머 단일층 지지체의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 (b)단계 후 상기 덴드리머 단일층에 링커를 결합시키는 것을 더욱 포함하는 것인 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 링커는 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물 및 n-하이드록시숙시니미딜 아이도아세테이트(n-hydroxysuccin imidyl iodoacetate; NIA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  8. 제 1항 내지 4항중 어느 한 항에 따른 지지체에 DNA, 단백질, 펩타이드, 항체, 및 화학물질로 이루어진 군으로부터 선택되어진 것을 고정한 바이오 칩(chip).
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