JPH08317785A - 糖鎖の固定化法及びそれを用いた細胞培養基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 糖鎖を安定に固定化でき、なおかつ固定化し
た糖鎖と細胞との相互作用の機能を発揮させるのに最適
な糖鎖の固定化法を提供する。 【解決手段】 糖鎖１及び基材１０の少なくとも一方
に、ベンゼン環構造含有疎水性炭化水素２を導入した
後、その疎水性炭化水素２を介して糖鎖１を基材１０表
面に固定化することからなる糖鎖の固定化法。ベンゼン
環構造含有疎水性炭化水素２としては、ポリスチレン誘
導体が好ましく、基材１０表面は、ベンゼン環構造含有
疎水性炭化水素２の代わりに他の疎水性炭化水素鎖１２
で修飾してもよい。 【効果】 糖鎖を基材表面に容易に固定化することがで
き、ベンゼン環構造含有炭化水素から形成される疎水場
によって細胞と糖鎖との特異的相互作用を発現させるの
に好適な環境が提供され糖鎖特有の機能を十分に発揮さ
せることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糖鎖の固定化法に
関し、特に、細胞の特異的認識性の発現に適した糖鎖の
固定化法、及びそれを利用した細胞培養基材に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年の糖鎖工学の進歩には目ざましいも
のがある。例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、
細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグ
リカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与え
る糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与してい
る糖タンパク質等が挙げられるが、これらの高分子の糖
鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは
阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構
が次第に明らかにされつつある。

【０００３】さらに、このような糖鎖と細胞の分化増
殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確に
されれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは
臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが
期待できる。

【０００４】その一例として、細胞表面の糖鎖や、糖鎖
-レセプター間の相互作用異常による疾病の発生、ある
いはエイズなどのウイルス感染における糖鎖の役割等に
関する研究が活発化してきている。また、細胞-細胞間
相互作用、細胞-マトリックス間相互作用における糖鎖
の関与に関する研究も、生体反応を理解する上で重要に
なってきている。

【０００５】各種細胞による糖鎖認識の特異性について
例示すると、肝実質細胞はガラクトース（Ｇａｌ）やマ
ンノース（Ｍａｎ）を選択的に認識するのに対し、肝非
実質細胞はＭａｎ、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ-アセチ
ルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に対する親和性が高
い。血清組織はＭａｎ、ＧｌｃＮＡｃ、及びＮ-アセチ
ルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）を、リンパ組織はＭａ
ｎＮＡｃ及びＧｌｃＮＡｃを特異的に認識する。

【０００６】また、各種細胞表面に存在するマクロファ
ージ上のアシアロ糖タンパク質やレクチン様タンパク質
等の糖鎖認識タンパク質も、各々選択的に糖鎖を認識す
る。例えば、肺胞マクロファージ上の分子量１７５Ｋの
タンパク質は、Ｍａｎ、フコース（Ｆｕｃ）、及びＧｌ
ｃＮＡｃを、腹腔マクロファージ上の分子量１８０Ｋの
タンパク質はＭａｎ、Ｆｕｃ、及びＧｌｃＮＡｃを、ラ
ットクッパー細胞上の分子量３０Ｋのタンパク質、腹腔
マクロファージ上の分子量４２Ｋのタンパク質、及び活
性化マクロファージ上の分子量４５〜６０Ｋのタンパク
質はＧａｌ及びＮ-アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮ
Ａｃ）を、各々特異的に認識する。

【０００７】本発明者らは、従来から糖鎖の特異的な親
和力に着目し鋭意研究を行ってきており、例えば、アシ
アロ糖タンパク質レセプターに対するリガンドのモデル
として、ガラクトースを側鎖に有する高分子であるポリ
（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシ
ル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミド］）（ＰＶ-ＬＡと略
記）を設計・合成した。例えば、このＰＶ-ＬＡを固定
化したシャーレ上での肝細胞培養実験において、ＰＶ-
ＬＡと肝実質細胞表面のアシアロ糖レセプターとの特異
的親和力を介して肝実質細胞が選択的に接着され、しか
もその接着形態が特異的であって三次元の自己集合体が
導かれることを見いだした。（由良洋文、赤池敏宏、
「細胞培養」、第１９巻、３１７−３２２頁、１９９３
年）。

【０００８】さらに本発明者らは、これら糖鎖高分子あ
るいは糖鎖を固定化する条件に関して詳細に検討した結
果、糖鎖を固定化した基材上での細胞接着性が固定化し
た糖鎖の量には依存せず、その固定化条件によることを
見いだし本発明をなすに至った。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】よって本発明における
課題は、糖鎖を安定に固定化でき、なおかつ固定化した
糖鎖と細胞との相互作用の機能を発揮させるのに最適な
糖鎖の固定化法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】かかる課題は、糖鎖及び
基材の少なくとも一方に、ベンゼン環構造を有する疎水
性炭化水素を導入した後、その疎水性炭化水素を介して
糖鎖を基材表面に固定化することからなる糖鎖の固定化
法によって解決できる。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の糖鎖の固定化法は、基材
表面と糖鎖の少なくとも一方にベンゼン環構造を有する
疎水性炭化水素を導入することにより、基材と糖鎖との
間に疎水場を形成し、その疎水場を介して基材表面に糖
鎖を固定化することを特徴とするものである。

【００１２】本発明の固定化法で固定化される糖鎖とし
ては、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マンノ
ース、マンノビオース、Ｎ-アセチルグルコサミン、ラ
ミナリビオース、ウロン酸関連物質、硫酸糖等の単糖
類、オリゴ糖類等のいずれでもよく、特に限定されるも
のではない。

【００１３】本発明の第１の実施態様を、図１を参照し
て詳細に説明する。この第１の実施態様においては、糖
鎖の固定化は吸着により行われる。まず、糖鎖１にベン
ゼン環構造含有疎水性炭化水素２を導入する。このベン
ゼン環構造含有疎水性炭化水素としては、ベンゼン環構
造含有ビニル系高分子が好ましく、中でもポリスチレン
誘導体が特に好ましい。

【００１４】このベンゼン環構造含有疎水性炭化水素の
導入は、如何なる方法によってもよいが、アミド結合、
エステル結合、エーテル結合等の共有結合を介して結合
させるのが好ましい。例えば、ポリスチレン誘導体等の
ベンゼン環構造含疎水性高分子を主鎖とし、その主鎖に
上述の糖鎖を側鎖として結合させた糖鎖高分子とするの
が特に好ましい。この糖鎖高分子は、主鎖を形成するモ
ノマーと糖鎖分子とを結合させてから重合してもよい
し、糖鎖と結合可能な官能基を有するモノマーを重合し
た後に糖鎖を結合させてもよい。但し、１分子中に導入
される糖鎖の数を制御できることから、糖鎖を結合させ
たモノマーを重合するのが好ましい。

【００１５】また、この糖鎖高分子は、糖鎖を結合させ
たモノマーを単独重合させたホモポリマーとするのが好
ましいが、他のモノマーとのコポリマーとしてもよく、
用途や目的、あるいは基材の性質に応じて適宜選択でき
る。また、これらの糖鎖高分子は、１種のみでも２種以
上を混合して用いてもよく、その使用目的に応じて適宜
選択できる。

【００１６】糖鎖高分子の中では、例えば、下記式
（１）から（１０）で表されるようなポリスチレン主鎖
を有する糖鎖高分子が特に好適に用いられる。

【００１７】

【化１】

【００１８】

【化２】

【００１９】

【化３】

【００２０】

【化４】

【００２１】

【化５】

【００２２】

【化６】

【００２３】

【化７】

【００２４】

【化８】

【００２５】

【化９】

【００２６】

【化１０】

【００２７】上記式（１）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→
４）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＬＡと略記
する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラクトースとか
ら合成されたモノマーを単独重合して得られるもので、
β-ガラクトース残基を有する。

【００２８】上記式（２）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-
Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＭＡと略記する）
は、ｐ-アミノメチルスチレンとマルトースとから合成
されたモノマーを単独重合して得られるもので、グルコ
ース残基を有する。

【００２９】上記式（３）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-マンノピラノシル-（１→４）-
Ｄ-マンナアミド］）（以後、ＰＶ-Ｍａｎと略記する）
は、ｐ-アミノメチルスチレンとマンノビオースとから
合成されたモノマーを単独重合して得られるもので、マ
ンノース残基を有する。

【００３０】上記式（４）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-α-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→
６）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＭｅＡと略
記する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとＯ-α-Ｄ-ガラ
クトピラノシル-（１→６）-Ｄ-グルコースとから合成
されたモノマーを単独重合して得られるもので、ガラク
トース残基を有する。

【００３１】上記式（５）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-６-カルボキシメチル-β-Ｄ-ガラクト
ピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-６-カルボキシメチル-グ
ルコンアミド］）（以後、ＰＶ-ＬＡＣＯＯＨと略記す
る）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラクトースとから
合成されたモノマーを単独重合し、それをカルボキシメ
チル化して得られるもので、カルボキシメチル化ガラク
トース残基を有する。

【００３２】上記式（６）で表されるポリ（３-Ｏ-４’
-ビニルベンジル-Ｄ-グルコース）（以後、ＰＶ-Ｇと略
記する）は、ｐ-クロロメチルスチレンとグルコースと
から合成されたモノマーを単独重合して得られるもの
で、グルコース残基を有する。

【００３３】上記式（７）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-
グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-
２-デオキシ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→４）-Ｏ-
Ｄ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミ
ド］）、上記式（８）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベ
ンジル-［Ｏ-２-アセトアミド-２-デオキシ-β-Ｄ-グル
コピラノシル-（１→４）-Ｏ-Ｄ-２-アセトアミド-２-
デオキシ-β-Ｄ-グルコンアミド］）、またはそれらの
混合物（以後、いずれもＰＶ-ＧｌｃＮａｃと略記す
る）は、ともにＮ-アセチルグルコサミン残基を有す
る。

【００３４】上記式（９）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビニ
ルベンジル-Ｄ-グルコンアミド）（以後、ＰＶ-ＧＡと
略記する）は、Ｄ-グルコースを開環させてｐ-アミノメ
チルスチレンと結合させたモノマーを単独重合して得ら
れるものである。

【００３５】上記式（１０）で表されるポリ（Ｎ-ｐ-ビ
ニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-グルコピラノシル-（１→
３）-Ｄ-グルコンアミド］）（以後、ＰＶ-Ｌａｍと略
記する）は、ｐ-アミノメチルスチレンとラミナリビオ
ースとから合成されたモノマーを単独重合して得られる
もので、β１→３グルコース残基を有する。

【００３６】次に、このようなベンゼン環構造含有炭化
水素２を導入した糖鎖１を、基材１０表面に吸着させ
る。好ましくは、ベンゼン環構造含有炭化水素２を導入
した糖鎖１を溶媒に溶かし、その溶液を基材１０表面に
キャスティングして溶媒を留去し、蒸留水で洗浄した
後、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）等で置換しておく。

【００３７】この第１の実施態様における基材１０は、
疎水性の基材、中でもポリスチレン誘導体等のベンゼン
環構造含有疎水性炭化水素を主原料とする基材を用いる
のが好ましいが、それに限られるものではなく、ガラ
ス、石英等の無機材料やポリメタクリル酸メチルやキト
サン等の他の高分子材料といった疎水性または親水性材
料からなる他の基材を用いてもよい。但し、前記他の基
材を用いる場合は、その基材表面にベンゼン環含有疎水
性炭化水素２を導入しておくのが好ましい。

【００３８】このベンゼン環構造含有疎水性炭化水素２
を導入する手段は特に限定されず、例えば、ベンゼン環
構造含有疎水性高分子で被覆するだけでもよい。このベ
ンゼン環含有疎水性高分子としては、吸着させる糖鎖高
分子の主鎖をなす高分子と同種の高分子とするのが好ま
しい。即ち、上記式（１）から（１０）に示したような
ポリスチレン誘導体を主鎖とする糖鎖高分子を使用する
場合は、基材表面に導入するベンゼン環構造含有疎水性
炭化水素もポリスチレン誘導体とするのが好ましい。

【００３９】以上の説明では、糖鎖１及び基材１０の両
方にベンゼン環構造含有炭化水素２を導入する方法を中
心に述べたが、糖鎖１にベンゼン環構造含有炭化水素２
を導入した糖鎖高分子を用いる場合には、基材１０表面
にベンゼン環構造含有炭化水素２を導入することは必ず
しも必要ではない。

【００４０】例えば、上記他の基材表面に糖鎖高分子を
直接吸着させる方法も本発明の範囲内である。しかしな
がら、特にキトサン等の親水性材料からなる基材であっ
て、表面に活性な官能基（アミノ基、カルボキシ基、ヒ
ドロキシル基等）を有する基材に、ポリスチレン誘導体
を主鎖とする糖鎖高分子を吸着させる場合には、その基
材表面を他の疎水性炭化水素鎖１２で修飾しておくのが
好ましい。この「他の疎水性炭化水素鎖１２」は、ベン
ゼン環構造を含有している必要はなく、その一端には基
材１０表面に存在する官能基と共有結合可能な官能基を
有し、多端には、例えばアルキル基等の疎水性基やｐ-
ｔｅｒｔ-ブチルフェニル基等のかさ高い疎水性基を有
する炭化水素鎖が好ましい。

【００４１】例えば、基材１としてキトサン・ビーズを
用い、その基材１に糖鎖高分子を吸着させる場合、ま
ず、湿らせた基材１を、ｐ-ｔｅｒｔ-ブチルフェニルグ
リシジルエーテルのＤＭＦ溶液に入れ、８０℃で３時間
処理することにより、基材１表面に、ｐ-ｔｅｒｔ-ブチ
ルフェニル基末端を有する疎水性炭化水素鎖１２が導入
される。次に、この疎水性炭化水素鎖１２で修飾した基
材１を、糖鎖高分子の水溶液中に室温で２時間程度浸漬
し、蒸留水で数回洗浄し、好ましくは、リン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）で置換することにより糖鎖１の固定化が完了
する。

【００４２】上述のような方法に従って糖鎖を固定化す
ることにより、基材１０表面及び／または糖鎖に導入さ
れたベンゼン環構造含有疎水性炭化水素２によって、基
材１０と糖鎖１との間には疎水場５が形成され、この疎
水場５を介して糖鎖が基材に安定に固定化される。

【００４３】本発明の固定化法の第２の実施態様におい
ては、糖鎖の固定化は共有結合を介してなされる。具体
的には、図２に示すように、基材１０表面に存在する官
能基に、ベンゼン環構造含有疎水性炭化水素鎖３の一端
を共有結合させ、そのベンゼン環構造含有疎水性炭化水
素鎖３の他端に糖鎖１を共有結合させることからなる。

【００４４】この炭化水素鎖３は、少なくとも１つのベ
ンゼン環構造を含有し、その両末端に活性な官能基を有
するものなら特に限られないが、ジグリシジル化合物等
が好適に用いられる。さらに、この炭化水素鎖３は、全
体が疎水性である必要はなく、少なくとも結合させた糖
鎖近傍を疎水性環境に保てるものであればよい。

【００４５】このような炭化水素鎖３に含有されるベン
ゼン環構造は、フェニルアラニン誘導体のように側鎖と
して存在してもよいし、フタル酸エステルのように主鎖
に組み込まれて存在していてもよい。フタル酸エステル
のように主鎖に組み込まれたベンゼン環は、炭化水素鎖
の回転を抑制して剛直性を付与する機能を有する。

【００４６】このようにして糖鎖１が共有結合を介して
固定化された基材１０においては、糖鎖１と基材表面１
０との間に疎水性炭化水素鎖３によって疎水場５が形成
され、その疎水場５を介して糖鎖１が基材１０に固定化
されている。

【００４７】本発明は、上記の固定化方法のいずれかの
ひとつ固定化法に従って、基材表面に糖鎖を固定化して
なる細胞培養基材にも関する。本発明の細胞培養基材に
は、シャーレ、プレート、キュベット、フィルム、ファ
イバー、またはビーズ等の従来から細胞培養に用いられ
ている基材、あるいはそれら以外の細胞培養に使用可能
な基材のいずれもが使用できる。これらの基材は、ガラ
ス、石英等の無機材料、ポリスチレン、ポリプロピレ
ン、ポリエチレン等の有機材料のいずれからなっていて
もよいが、滅菌可能な程度の耐熱性及び耐水性を有して
いる材料からなるのが好ましい。

【００４８】特に合成高分子材料は、価格や成形性の点
から好ましい。例えば、ポリスチレン誘導体を主鎖とす
る糖鎖高分子を固定化する場合には、ポリスチレン及び
その誘導体を主原料とする基材を使用するのが好まし
い。

【００４９】この細胞培養基材にあっては、基材と糖鎖
との間にベンゼン環構造含有疎水性炭化水素によって形
成された疎水場が存在し、この疎水場が、糖鎖と細胞と
の相互作用に好ましい影響を与える。その詳細な機構は
明かではないが、糖鎖とベンゼン環との疎水的相互作
用、疎水性炭化水素鎖の立体配置、ベンゼン環による疎
水性炭化水素鎖への剛直性付与等が複合的に作用して細
胞接着等に最適な環境を保つものと思量される。

【００５０】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明の糖鎖固定化法
をさらに具体的に説明する。 （実施例１）ポリスチレン主鎖を有する糖鎖高分子とし
て上記式（１）及び（２）で表されるＰＶ-ＬＡ及びＰ
Ｖ-ＭＡを合成し、これらの糖鎖高分子のポリスチレン
（ＰＳｔ）及びポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）プ
レートへの吸着性を比較した。まず、ＰＶ-ＬＡ及びＰ
Ｖ-ＭＡを、通常の方法に従いフルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光標識した。ＰＶ-ＬＡ及
びＰＶ-ＭＡともに、４０構造単位に１分子の割合でＦ
ＩＴＣ標識された。

【００５１】これらの糖鎖高分子溶液（100 μg/ml）
を、各々ＰＳｔ製及びＰＭＭＡ製のキュベット（Kartel
l S.P.A.、イタリア、ミラン社製）に入れ、所定時間経
過後に各糖鎖高分子溶液を取り除いた。キュベット内を
蒸留水で洗浄した後、剥離剤（Tween 20, 500 μg/ml）
を満たして超音波処理することにより吸着した糖鎖高分
子を剥離し、蛍光強度を測定することによって吸着量を
見積もった。結果を図２に示す。

【００５２】ＰＶ-ＬＡ及びＰＶ-ＭＡともに、ＰＳｔキ
ュベットには０．４５〜０．６０μｇ／ｃｍ²の密度で
吸着したが、ＰＭＭＡキュベットには０．０５〜０．２
０μｇ／ｃｍ²しか吸着しなかった。また、吸着平衡に
達する時間も、ＰＳｔキュベットの方が明らかにＰＭＭ
Ａキュベットより短く、ＰＳｔキュベット中のＰＶ-Ｌ
Ａは約１０分で吸着平衡に達した。即ち、ベンゼン環含
有疎水性炭化水素であるＰＳｔを導入した糖鎖であるＰ
ＶＬＡ及びＰＶＭＡは、エステル基を持つＰＭＭＡ上よ
りも疎水性炭化水素であるＰＳｔ上に良好に吸着される
ことが確認された。

【００５３】次に、ＰＳｔ製のシャーレ表面に前記ＰＶ
ＬＡ及びＰＶＭＡを吸着させて固定化し、肝細胞の培養
実験を行った。ＰＶ-ＬＡ及びＰＶ-ＭＡの水溶液（100
μg/ml）各１ｍｌを、各々ＰＳｔ製シャーレ（Falcon 1
008、日本ベクトン・ディッキンソン社製）に入れ、室
温で２時間放置した。減圧乾燥して、蒸留水中に２時間
以上浸漬した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で置換してＰ
Ｖ-ＬＡ及びＰＶ-ＭＡの固定化を完了した。

【００５４】ＰＶ-ＬＡ及びＰＶ-ＭＡを固定化したＰＳ
ｔシャーレ及び未被覆のＰＳｔシャーレに、肝細胞懸濁
液（３０×１０⁴細胞／ｍｌ）を１．５ｍｌずつ播種し
た。また、同様に肝細胞懸濁液を播種した各シャーレを
ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）で処
理した。それらのシャーレを、加湿した空気／ＣＯ₂（9
5/5 容量％）インキュベーター中に、３７℃で６０分間
保持した。その後、接着しなかった細胞をデカンテーシ
ョンにより収集し、ハンクスの調整塩溶液（ＨＢＳＳ）
でリンスした後に細胞接着率を測定した。

【００５５】結果を図３に示す。ガラクトース認識性を
有する肝細胞は、ガラクトース残基を持つＰＶ-ＬＡを
固定化したシャーレ上で選択的に接着されたが、グルコ
ース残基を有するＰＶ-ＭＡを固定化したシャーレ上で
は、未被覆のＰＳｔ上よりも細胞接着が抑制された。ま
た、未被覆及びＰＶ-ＭＡ固定化シャーレでは、アルブ
ミン処理により細胞接着率が低下したが、ＰＶ-ＬＡ固
定化シャーレでは、ほとんど変化が見られなかった。

【００５６】（実施例２）基材としてキトサン・ビーズ
を用い、その表面に本発明の固定化法に従って糖鎖を固
定化した。直径０．１ｍｍのキトサン・ビーズ（富士紡
績（株）製）を使用した。湿らせたキトサン・ビーズ２
０ｇを、１０ｍｇ／ｍｌのフェニルグリシジルエーテル
（EX141、ナガセ化成（株）製）ＤＭＦ溶液３０ｍｌ
中、８０℃で３時間処理し、図４（ａ）に示す炭化水素
鎖修飾キトサン・ビーズを作成した。同様に、ｐ-ｔｅ
ｒｔ-フェニルグリシジルエーテル（EX146、ナガセ化成
（株）製）ＤＭＦ溶液、及びラウリルアルコール（エチ
レンオキサイド）₁₅グリシジルエーテル（EX171、ナガ
セ化成（株）製）炭酸塩緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ１０）
溶液を用いて、図４（ｂ）及び（ｃ）に各々示す炭化水
素鎖修飾キトサン・ビーズを作成した。

【００５７】キトサン・ビーズをクロロメチルオキシラ
ンで処理して表面にオキシラン基を導入した後、０．２
Ｍのｎ-ブチルアミン（ＢＡ）を含む炭酸塩緩衝液中、
または０．２Ｍの１-テトラデシルアミン（ＴＤＡ）の
ＤＭＦ溶液中、８０℃で３時間処理し、図４（ｄ）及び
（ｅ）に示す炭化水素鎖修飾キトサン・ビーズを作成し
た。

【００５８】糖鎖としてガラクトースを選択し、上記式
（１）に示したガラクトース残基を有するポリスチレン
誘導体（ＰＶ-ＬＡ）を合成した。上記６種類の炭化水
素鎖修飾キトサン・ビーズを、ＰＶ-ＬＡ水溶液（100
μg/ml）中に浸漬して室温で２時間放置した後、蒸留水
で洗浄し、ＰＢＳで置換して糖鎖固定化を完了した。

【００５９】各ビーズに固定化された糖鎖の量は、β-
ガラクトースと特異的に相互作用するレクチンであるＡ
ｌｌｏ Ａの結合量から見積もった。具体的には、糖鎖
固定化したキトサン・ビーズ０．２ｇを、１００μｇ／
ｍｌのＢＳＡ溶液中に１０分間浸漬し、蒸留水で十分洗
浄した後、ペルオキシダーゼ修飾したＡｌｌｏ Ａ（１
μｇ）を含むＰＢＳ中に１時間浸漬させる。ビーズを取
り出して洗浄し、３，３’，５，５’-テトラメチルベ
ンジジン（ＴＭＢ）基質溶液中に移して３０分間撹拌し
た後に、上澄液の波長４０５ｎｍでの吸収を測定するこ
とにより行った。結果を表１に示す。

【００６０】糖鎖を固定化した各キトサン・ビーズを、
直径１３ｍｍ、長さ８ｍｍのカラムに充填し、肝細胞懸
濁液（２５０×１０⁴細胞／ｍｌ）０．２ｍｌをカラム
中に添加した。ＢＳＡ（1mg/ml）を含むＨＢＳＳ（5m
l）を約１．７ｍｌ／分の流速で通し、接着せずに流出
した細胞を７秒間収集して、コールターカウンターで計
数した。結果を表１に示す。

【００６１】

【表１】

【００６２】表１における「単位糖鎖量当たりの細胞接
着数」は、結合したＡｌｌｏ Ａの１ｍｇ当たりに換算
した接着細胞数である。末端にベンゼン環構造を有する
炭化水素鎖であるEX-141及びEX-146で修飾したキトサン
・ビーズには、ポリスチレン主鎖を持つＰＶ-ＬＡが良
好に吸着されている。しかしながら、接着された肝細胞
の数は、固定化された糖鎖の量にはよらず、固定化量が
最少のＴＤＡ修飾ビーズで最も多く接着された。

【００６３】単位糖鎖量当たりの細胞接着数を比較する
と、末端に疎水性の長鎖アルキル基を持つＴＤＡで最も
多く、かさ高い疎水性のｔｅｒｔ-ブチル基を持つEX-14
6が次いでいた。同じ長鎖アルキル基を有していても、
分子中に親水性基を有するEX-171や、親水性基がかさ高
い疎水性基で遮蔽されていないEX-141及びＢＡでは、未
被覆のキトサン・ビーズと同程度の値しか得られなかっ
た。これらの結果より、基材表面を修飾する炭化水素鎖
としては、疎水性のもの、あるいは親水性部分を有して
いてもそれが疎水性部分によって遮蔽され、糖鎖に影響
を与えないようなものが好ましいことが確認された。

【００６４】（実施例３）本発明の糖鎖固定化法の第２
の実施態様に従って、基材表面に糖鎖を共有結合を介し
て固定化した。基材としては、実施例２と同様のキトサ
ン・ビーズを用いた。乾燥したキトサン・ビーズ２０ｇ
を、１．４ｇのＦｍｏｃ-Ａｌａ-Ｏｐｆｐ及び０．３ｇ
のＨＯＢＴを含むＤＭＦ溶液中、または１．２ｇのＦｍ
ｏｃ-Ｐｈｅ-Ｏｐｆｐ及び０．２５ｇのＨＯＢＴを含む
ＤＭＦ溶液中に添加し、室温で１６時間撹拌した後、
０．２ｇのピペリジンＤＭＦ溶液で処理して保護基を取
り外した。４-Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→
４）-Ｄ-グルコン酸及び１-エチル-３-（３-ジメチルア
ミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩を、Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’-テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）緩
衝液中で、室温で２時間撹拌し、上記の処理を行ったキ
トサン・ビーズを加えて、室温で３日間撹拌し洗浄し
て、図５（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように糖鎖を固定化し
たキトサン・ビーズを作成した。図において、「ＬＡ」
はラクトース構造を示す。

【００６５】湿ったキトサン・ビーズ２０ｇを、各々１
００μｇ／ｍｌのネオペンチルジグリシジルエーテル
（EX211）、ｏ-フタル酸ジグリシジルエーテル（EX72
1）を含む３０ｍｌのＤＭＦ溶液中、または１００μｇ
／ｍｌのポリエチレングリコールジグリシジルエーテル
（EX861）を含む３０ｍｌの炭酸塩緩衝液中、８０℃で
３時間処理した。これらのジグリシジル化合物を導入し
たキトサン・ビーズを、洗浄後、０．２Ｍの脱水素エチ
レンジアミンを含む３０ｍｌの炭酸塩緩衝液で、８０℃
で３時間処理した。

【００６６】４-Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→
４）-Ｄ-グルコン酸及び１-エチル-３-（３-ジメチルア
ミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩を、Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’-テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）緩
衝液中で、室温で２時間撹拌し、上記の処理を行ったキ
トサン・ビーズを加えて、室温で３日間撹拌し洗浄し
て、図５（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）に示すように糖鎖を
固定化したキトサン・ビーズを作成した。

【００６７】これらのキトサン・ビーズに固定化された
ガラクトースの量、及び肝細胞の接着量を、実施例２と
同様にして測定した。結果を表２に示す。なお、表２に
おける「直接修飾」は、キトサン・ビーズ表面のアミノ
基に直接糖鎖を結合させたものである。

【００６８】

【表２】

【００６９】共有結合を介して糖鎖を固定化した場合
は、実施例２の糖鎖高分子を吸着させた場合に比較し
て、ビーズ表面に固定化される糖鎖の量は１／１０以下
になるが、細胞の接着数はあまり変わらない。従って、
単位糖鎖当たりの細胞接着数は１０倍以上となった。表
２の結果を、図５（Ａ）から（Ｃ）に示すような短い炭
化水素鎖を介して固定化したものと、図５（Ｄ）から
（Ｆ）に示すような炭化水素鎖を介して固定化したもの
とに分類して考えると、全般的に短鎖で修飾したビーズ
の方が糖鎖の固定化量が少ない傾向が見られる。それら
の中では、ベンゼン環構造を有するフェニルアラニンを
介して固定化した図５（Ｂ）で、最も多い細胞接着が得
られた。

【００７０】長鎖を介して固定化したビーズの中では、
やはりベンゼン環構造を含有するフタル酸を含む炭化水
素鎖を介して固定化した図５（Ｆ）で、最も高い細胞接
着率が得られた。これらのことから、ベンゼン環と糖鎖
との疎水的相互作用や、ベンゼン環の剛直性、あるいは
それらの炭化水素鎖で形成される立体構造等が、細胞に
よる糖鎖認識に好ましい影響を与えていることが示唆さ
れた。逆に、親水性を持つ炭化水素鎖は、細胞と糖鎖と
の相互作用に悪影響を与える可能性も示唆された。

【００７１】

【発明の効果】本発明の糖鎖固定化法によれば、特に糖
鎖高分子を用いた場合に、糖鎖を基材表面に容易に固定
化することができる。また、本発明の固定化法のいずれ
の態様によっても、糖鎖と基材との間にベンゼン環構造
含有炭化水素からなる疎水場が形成され、細胞と糖鎖と
の特異的相互作用を発現させるのに好適な環境が提供さ
れるので、糖鎖特有の機能を十分に発揮させることがで
きる。よって、本発明の固定化法で糖鎖を固定化した細
胞培養基材を用いれば、細胞を選択的に培養することが
可能になり、例えば、ハイブリッド型人工臓器への応用
も見込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の糖鎖固定化法の第１の実施態様に従
って糖鎖高分子を固定化した基材を示す図である。

【図２】 本発明の糖鎖固定化法の第２の実施態様に従
って糖鎖高分子を固定化した基材を示す図である。

【図３】 ＰＶ-ＬＡ及びＰＶ-ＭＡのＰＳｔ及びＰＭＭ
Ａ基材への吸着の時間変化を示すグラフである。

【図４】 ＰＶ-ＬＡ及びＰＶ-ＭＡを固定化したＰＳｔ
シャーレ及び未被覆のＰＳｔシャーレ上での肝細胞接着
の結果を示すグラフである。

【図５】 実施例２で作製した炭化水素鎖修飾キトサン
・ビーズを示す図である。

【図６】 実施例３で作製した糖鎖固定化キトサン・ビ
ーズを示す図である。

【符号の説明】

１…糖鎖、２…ベンゼン環構造含有疎水性炭化水素、３
…ベンゼン環構造含有疎水性炭化水素鎖、５…疎水場、
１０…基材、１２…他の疎水性炭化水素鎖

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 糖鎖及び基材の少なくとも一方に、ベン
   ゼン環構造を有する疎水性炭化水素を導入した後、その
   疎水性炭化水素を介して糖鎖を基材表面に固定化するこ
   とを特徴とする糖鎖の固定化法。
2. 【請求項２】 前記固定化が、吸着により行われること
   を特徴とする請求項１記載の固定化法。
3. 【請求項３】 前記疎水性炭化水素が、ポリスチレン誘
   導体であることを特徴とする請求項２記載の固定化法。
4. 【請求項４】 前記ポリスチレン誘導体が糖鎖にのみ導
   入され、前記固定化に先立って、前記基材表面を他の疎
   水性炭化水素鎖で修飾することを特徴とする請求項３記
   載の固定化法。
5. 【請求項５】 前記他の疎水性炭化水素鎖が、その末端
   にテトラデシルアミノ基またはｐ-ｔｅｒｔ-ブチルフェ
   ニル基を有することを特徴とする請求項４記載の固定化
   法。
6. 【請求項６】 前記固定化が、共有結合を介してなされ
   ることを特徴とする請求項１記載の固定化法。
7. 【請求項７】 前記疎水性炭化水素が、フェニルアラニ
   ン誘導体であることを特徴とする請求項６記載の固定化
   法。
8. 【請求項８】 前記疎水性炭化水素が、フタル酸構造を
   含む炭化水素鎖であることを特徴とする請求項６記載の
   固定化法。
9. 【請求項９】 請求項１から８のいずれかの固定化法に
   従って、基材表面に糖鎖を固定化してなることを特徴と
   する細胞培養基材。