JP2004511804A - バイオ支持体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明はバイオ支持体及びその製造方法に関し、さらに詳しくはバイオチップの製造時スライドガラスにバイオポリマーを固定させることができる方法に関する。バイオ支持体の製造方法は(a)シリレイテッドスライドガラス上のアルデヒド基とデンドリマーアミノ基間にシッフ塩基を形成してデンドリマー単一層を形成し、(b)テトラヒドロほう酸ナトリウム(NaBH4)で(a)のスライドの反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させることを含む。本発明の支持体は3次元構造を提供してバイオポリマーを効果的に固定させることができる。また、バイオ支持体はバイオポリマー間の相補的結合を促進させる。
Description
【0001】
【発明に属する技術分野】
本発明はバイオ支持体及びその製造方法に関し、さらに詳しくはバイオチップ製造時にスライドガラス上にバイオポリマーを固定させる方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ハイブリダイゼーション(Hybridization)に基づいたマイクロアレイ(microarray)分析法は最近最も多く使用されている技術で、様々な応用性を有している。多くの分野において使われているマイクロアレイ分析法は標識化された核酸分子が固体表面に固定されている核酸分子を検出するのに用いることができるという基本概念から次第に発展している。
【0003】
現在DNAチップに関連した主な研究は米国で行われており、一部研究はヨーロッパで行われている。また、DNAチップ製作と応用に関する幾多のベンチャー企業が合併しており、Molecular Dynamics、Motorolaなど大手企業がこれを支援している。1998年まで、一般研究者が購入できるアレイ(array)は遺伝子をフィルターに固定した形態のものであった。NEN life Scienceではスライドガラス上に2,400個のヒトcDNAを固定した製品を市場に発表した。Affymetrix、IncyteなどではヒトのEST、マウス、酵母、バクテリアなどのDNAチップを商品化し、Clontech社もスライド形態のcDNAアレイを市場に発表した。このような製品は全て二次元的な平面にオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)を固定する方式で製作されたものである。つまり、ポリ−リジン(poly−lysine)をガラス表面に処理した後、DNAをUV−架橋結合(crosslinking)などを通じてガラス上のポリ−リジンに固定するものである。他の方法としては、ガラス表面にアルデヒド基やアミノ基からなるSAM(self assembled monolayer)を形成させた後、DNAを前記ガラスに結合させることがある。前記方法では短いDNAオリゴヌクレオチドから長いcDNAまで固定できるが、付着された核酸の表面密度及び目的核酸とプローブ間のハイブリダイゼーション効率性によって適用には限界がある。
【0004】
表面密度とハイブリダイゼーション効率の制限要因を解決するために、多くの研究がアクリルアミドゲルパッド、ゼラチンパッド、寒天フィルムのような様々な固体支持体を開発するために行われており、ポリアクリルアミドゲルは優れた固定力を有する三次元固体支持体であるが(Rehman, F. N., Audeh, M., Abrams, E. S., Hammond, P. W., Kenney, M., and Boles, T. C. (1999) Nucleic Acids Res., 27, 649−655; Guschin, D., Yershov, G., Zaslavsky, A., Gemmell, A., Shick, V., Proudnikov, D., Arenkov, P., and Mirzabekov, A. (1997) Anal. Biochem., 250, 203−211)、固体支持体とオリゴヌクレオチド間の空間不足のためにハイブリダイゼーション効率が低い。ハイブリダイゼーション効率を高めるために、固定された核酸と固体支持体との間を連結する様々なリンカー(連結体)の導入が試みられている(Guo, Z., Guilfoyle, R. A., Thiel, A. J., Wang, R., and Smith, L. M. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 5456−5465; Shchepinov, M. S., Case−Green, S. C., and Southern, E. M. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 1155−1161)。しかし、修飾物質を含む大部分の方法は非常に複雑であるだけでなく、特定の条件下でのみ適用が可能なのが実情である。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、核酸、蛋白質、抗体などのバイオポリマーを固定することができるバイオ支持体を提供することにある。
【0006】
また、本発明の目的は、核酸、蛋白質、抗体などのバイオポリマーを固定することができるバイオ支持体製造方法を提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために本発明は、(a)表面上にアルデヒドを含むスライドガラス及び(b)前記(a)のアルデヒド基に結合されているデンドリマーを含むバイオ支持体を提供する。
【0008】
また、本発明は(a)シリレイテッドスライド上のアルデヒド基とデンドリマーのアミノ基を反応させてシッフ塩基を製造することにより、デンドリマー単一層を形成する段階及び(b)テトラヒドロほう酸ナトリウムでスライド(a)上の反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させる段階を含むバイオ支持体の製造方法を提供する。
【0009】
また、本発明は前記支持体に核酸、蛋白質、ペプチド、抗体、及び化学物質からなる群より選択されたバイオポリマーを固定したバイオチップを提供する。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明をさらに詳細に説明する。
【0011】
疾患診断用マイクロアレイチップシステムの開発において、本発明者はバイオチップ製造の核心であるポリマー(核酸、蛋白質など)をガラス表面上に固定させる方法について研究し、バイオ支持体及びバイオチップを開発した。
【0012】
本発明のバイオ支持体はスライドガラスの表面上に3次元構造でバイオポリマーを固定させることができるデンドリマーを含む。デンドリマーはスライドのアルデヒド基に結合させた後、バイオポリマーをデンドリマーに固定させる。前記デンドリマーは80年代中端から研究されており、合成方法と物理的、化学的特性に対する研究が進められている。デンドリマーに対する大部分の研究は可塑剤、液晶、レイヤー(layers)及び薬物伝達体に関するもので、デンドリマーはまだ商業的に商品化されてはいない。
【0013】
本発明のポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマーは図1に示されているように、求核性(nucleophilic)または求電子性(electrophilic)中心部から始まってアミドアミノ(amidoamine)基で分岐した放射形を有し、球形に近い3次元的な構造をしている。図1のPAMAMデンドリマー3世代は直径が約40Åであり、32個のアミノ基を含んでいる。
【0014】
PAMAMデンドリマーのアミノ基は一世代当り二倍に増加し、直径は約10Åずつ増加する。図2はまた64個のアミノ基を含むPAMAMデンドリマー4世代を示す。本発明のデンドリマーは固有な構造と分岐したアミノ基からなる3次元的構造を提供する。デンドリマーは楕円形の形態であると推定される(Tokuhisa, H., Zhao, M., Baker, L. A., Phan, V. T., Dermody, D. L., Garcia, M. E., Peez, R. F., Crooks, R. M., and Mayer, T. M. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120, 4492−4501; Bliznyuk, V. N., Rinderspacher, F., and Tsukruk, V. V. (1998) Polymer, 39, 5249−5252)。
【0015】
本発明の好ましいデンドリマーはデンドリマー1乃至8世代であり、さらに好ましくはデンドリマー2乃至6世代であり、最も好ましくはデンドリマー3乃至4世代である。
【0016】
デンドリマーに固定されるバイオポリマーは核酸、蛋白質、ペプチド、化学物質及び抗体からなる群より選択することができ、好ましくは核酸及び蛋白質であり、最も好ましくは核酸である。
【0017】
本発明のバイオ支持体のモデルは図3(d)で示すことができ、スライドガラスの表面に付着されたアルデヒド基に結合しているデンドリマーを含む。
【0018】
また、本発明のバイオ支持体はデンドリマーのアミノ基にリンカーがさらに連結されているものを含む。前記リンカーはバイオポリマーが固体支持体に容易に連結されるようにする連結体であって、前記の化学式1の化合物、化学式2の化合物(1,4−phenylene diisothiocyanate; PDC)、化学式3の化合物及びn−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート(NIA)からなる群より選択することができる。
【化3】
【0019】
リンカーを含むバイオ支持体は図4に示す。図4(a)は化学式1のリンカーを含むバイオ支持体であり、図4(b)は化学式2のPDCを含むバイオ支持体であり、図4(c)は化学式3のリンカーを含むバイオ支持体であり、図4(d)はNIAリンカーが連結されたバイオ支持体である。図4のバイオ支持体は核酸、蛋白質、ペプチド、抗体などを固定することができる。
【0020】
デンドリマーの直径はPDCとのカップリングによって約17Å増加する。このような事実とデンドリマーの優れたカバー力により、活性形チオシアネート基の表面密度は約0.06nmol/cm2であり、近接したチオシアネート基間の平均距離は約18Åである。前記18Åは18乃至20ÅであるDNA螺旋の直径とほとんど同一である。これは既存の2次元構造の固体支持体で0.3nmol/cm2の表面密度を有する末端作用基間の距離が5乃至10Åであることとは対照的である(Guo, Z., Guilfoyle, R. A., Thiel, A. J., Wang, R., and Smith, L. M. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 5456−5465;Matson, R. S., Rampal, J. B., and Coassin, P. J. (1994) Anal. Biochem., 217, 306−310)。これは本発明のデンドリマーバイオ支持体が核酸を固定するのに適していることを示す。
【0021】
本発明のバイオ支持体は末端作用基(PDC−デンドリマーを含むバイオ支持体の場合にはチオシアネート基の数)が2次元構造の他の支持体に比べて少ないが、本発明のバイオ−支持体はチオシアネートの3次元的な配列と理想的な作用基間の距離によってオリゴヌクレオチドを高効率で固定することができる。
【0022】
また、本発明はバイオ支持体の製造方法を提供する。本発明のバイオ支持体製造方法は図3に示しており、これを詳細に説明する。
【0023】
表面にアルデヒド基を有するスライドを本発明のバイオ支持体の基質として用いた。前記スライドはシリレイテッドスライド(silylated slide)が好ましい。市販されるシリレイテッドスライドは表面に反応性のアルデヒド基を含んでいる。まず、シリレイテッドスライドのアルデヒド基はデンドリマーと反応をしてアルデヒド基とデンドリマーの間にシッフ塩基が形成される。したがって、表面にデンドリマー単一層が形成されたスライドが製造される。次に、スライドにNaBH4で水素化反応を行って反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させる。このような方法でバイオ支持体を製造する。
【0024】
また、バイオ支持体製造方法は前記変換段階後にリンカーを連結させる段階をさらに含む。
【0025】
デンドリマー単一層形成段階において、スライドガラスを0.5%デンドリマーを含むメタノールと反応させると、スライドガラス上のアルデヒド基はデンドリマーと反応する。図3(b)に示したデンドリマーとアルデヒド基間の反応後に、シッフ塩基は図3(c)の脱水反応によって形成される。
【0026】
変換段階では、反応しないアルデヒド基がアルコールに転換され、図3(d)のバイオ支持体が形成される。
【0027】
リンカーの連結段階はデンドリマーのアミノ基にリンカーを結合させる。前記リンカーは下記の化学式1の化合物、化学式2の化合物、化学式3の化合物及びn−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート(NIA)からなる群より選択するのが好ましい。リンカーの連結方法は公知の方法で実施するのが好ましい(Chrisey, L. A., Lee, G. U. and O Ferrall, C. E. Nucleic Acids Res. (1996) 24, 3031−3039, Singh, P. Bioconjugate Chem. (1998)9, 54−63 Singh, P. Bioconjugate Chem. (1998)9, 54−63)。図4はリンカーを含むバイオ支持体を示す。
【0028】
また、本発明は前記バイオ支持体を利用したバイオチップを提供する。前記バイオチップはDNAチップ、蛋白質マイクロアレイ、抗体支持体、バイオセンサー(biosensor)及び化学物質を固定した組合せ(combinatorial)アレイが好ましい。
【0029】
本発明のバイオチップは本発明のバイオ支持体及び前記バイオ支持体に固定されたバイオポリマーを含む。さらに詳しくは、バイオポリマーはスライドガラスのアルデヒドに結合されているデンドリマーのアミノ基に固定されている。バイオチップの製造方法は通常のUV−架橋反応または熱反応で実施するのが好ましい。図5にDNAチップ製造過程を示す。
【0030】
本発明はリンカーをさらに含むバイオ支持体を利用したバイオチップを提供する。前記バイオチップは下記の段階を含む:(a)デンドリマーにスライドガラス上のアルデヒド基を反応させ、(b)スライド上の反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させ、(c)リンカーを(b)のデンドリマーアミノ基に反応させ、(d)バイオポリマーを(c)のリンカーに固定させる。DNAチップは図5(a)及び(b)で示したUV−架橋反応または図5(c)に示した反応で製造することができる。
【0031】
図5(c)はDNAチップ製造過程で、リンカーと5’または3’末端をアミノまたはチオール基に交換されたオリゴヌクレオチドを利用したDNAチップ製造過程を示したものである。オリゴヌクレオチドの大きさはDNAチップで一般に用いられるオリゴヌクレオチドの大きさであるのが好ましい。チオールに交換されたオリゴヌクレオチドを使用する場合、DNAチップはPDC以外の他の種類のリンカーを使用してオリゴヌクレオチドをバイオ支持体に固定させることによって製造することができる。
【0032】
また、本発明の蛋白質チップの場合、図6に蛋白質チップ製造過程を一例として示した。蛋白質チップは蛋白質をデンドリマーバイオ支持体に直接的(図6(a))にまたはリンカー(図6(b、c、d))を使用して固定させて製造することができる。
【0033】
本発明は下記の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明が下記の実施例に限られるわけではない。
【0034】
実施例1
全ての試薬は特に断らない限り、シグマ−アルドリッチ(米国)社から購入したものであり、シリレイテッドスライドガラスはCel Associates(USA)社から購入した。オリゴヌクレオチドはジェノテック(大田、韓国)で合成し、3世代及び4世代デンドリマーはシグマ−アルドリッチ社から購入した。
【0035】
バイオ支持体の製造
シリレイテッドスライドを洗浄し、0.5%PAMAMデンドリマー(3世代;図1)を含むメタノール溶液に1乃至2日間浸漬させておいた。これにデンドリマーアミノ基とスライド表面のSAM(self assembled monolayer)を形成するアルデヒド基間のシッフ塩基形成でスライドガラスの表面にはデンドリマー単一層が製造された。スライドガラス上に残存して反応しないアルデヒド基はテトラヒドロほう酸ナトリウムを添加してアルコール基に変換させた。反応後、スライドガラスは3回洗浄し、真空で30分間乾燥させた。
【0036】
実施例2
オリゴヌクレオチドを3X SSC(SSC:150mM NaCl, 15 mM 酢酸ナトリウム, pH7.0)に溶解し、実施例1と同様な方法で製造したバイオ支持体に点滴(滴下)した。点滴した溶液は乾燥させた後、UV−架橋剤(60mJ)で架橋した。
【0037】
実施例3
実験は実施例1と同様な方法で実施したが、デンドリマーは3世代の代りに4世代を使用した。
【0038】
実施例4
実施例1と同様な方法でバイオ支持体を製造した後、リンカーを含むバイオ支持体をさらに製造した。まず、リンカーをデンドリマーに接合させるために、乾燥したスライドガラスを10%ピリジン/ジメチルホルムアミド溶媒中の0.2%の1,4−フェニレンジイソチオシアネート(phenylene diisothiocyanate;PDC, Aldrich)溶液にアルゴン条件下で3時間処理した。反応が終わった後、スライドガラスをメタノールで洗い、使用前まで真空乾燥器に保管した。
【0039】
実施例5
実施例3と同様な方法でバイオ支持体を製造した後、実施例4と同様な方法でリンカーを含むバイオ支持体を製造した。
【0040】
比較例
スライドガラス表面にアルデヒドSAMがあるシリレイテッドスライドをDNAチップ用支持体として使用した。
【0041】
実験
オリゴヌクレオチドの固定化
実施例4、実施例5及び比較例で製造したバイオ支持体を使用した。オリゴヌクレオチドとして5’−CCGACCGGAATAAAT−NH2−3’を使用しており、これは3’末端にアミノ基を有する。オリゴヌクレオチドの固定効率を確認するためにオリゴヌクレオチドの5’末端に32Pで標識をつけた。オリゴヌクレオチド10pmolに[γ−32P]ATP(>6,000Ci/mol、10mCi/ml)とT4ポリヌクレオチドキナーゼを37℃で30分反応させた。95℃で2分間加熱して反応を中止した後、標識されたオリゴヌクレオチドをG−50スピンコラムで精製した。オリゴヌクレオチドは0.005、0.001及び0.03pmol/μlの濃度にした。各濃度別に0.5μl溶液を実施例4、実施例5、比較例で準備したバイオ支持体に点滴した後、常温で約16時間乾燥させた。乾燥されたバイオ支持体は水、3NのNH4OH及び0.2%のSDSを含む1X SSPE(150mM NaCl、10mM NaH2PO4、pH7.4、1mM EDTA)で洗浄して固定化されないオリゴヌクレオチドを除去した。その後、バイオ支持体に固定されたオリゴヌクレオチドの表面密度はスライドをBAS1500(FUJI、JAPAN)スキャンして確認した。
【0042】
図7はデンドリマーバイオ支持体にオリゴヌクレオチドを固定した後、測定したオートラジオグラフィー(a)及び棒グラフ(b)である。放射性はオリゴヌクレオチドの濃度に対応することが確認された。実施例4と実施例5のバイオ支持体の表面密度は比較例の支持体表面密度に比べて2〜3倍高かった。このような結果はオリゴヌクレオチドは高密度のアルデヒド基からなるSAMを有する支持体よりバイオ支持体にさらによく固定化されるということを意味する。また、実施例4と実施例5を比較した時、実施例5のバイオ支持体が実施例4のバイオ支持体より約2倍多いオリゴヌクレオチドを固定すると予想していたが、実施例4及び実施例5の固定化効率はほとんど同一であった。
【0043】
ハイブリダイゼーション効率分析
オリゴヌクレオチドを実施例4、実施例5及び比較例の支持体に固定させ、相補的なオリゴヌクレオチドを利用してハイブリダイゼーション効率を確認した。
【0044】
標識されていない目的オリゴヌクレオチド5’−CCGACCGGAATAAAT−NH2−3’をバイオ支持体に固定させ、相補的なオリゴヌクレオチド5’−ATTTATTCCGGTCGG−3’は[γ−32P]ATPの5’末端を標識化してプローブ(probe)として使用した。目的オリゴヌクレオチドが固定されたスライドガラスを0.2%のSDSを含む5X SSPEに2時間予備ハイブリダイズさせ、ここにプローブを最終濃度2pmol/mlで42℃16時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション反応の後、ハイブリダイズしていないプローブは0.2%SDSを含む1X SSPE及び0.2%SDSを含む0.1X SSPEで各々38乃至40℃で30分間洗浄し除去した。ハイブリダイゼーション効率はスライドをBAS1500でスキャンして測定した。
【0045】
図8はバイオ支持体を利用して製造したDNAチップのハイブリダイゼーション効率を示すオートラジオグラフィー(a)及び棒グラフ(b)である。実施例4及び5のバイオ支持体は比較例の支持体に比べてハイブリダイゼーション効率が最大8倍高かった。このような結果は実施例4及び5のバイオ支持体が比較例に比べてオリゴヌクレオチド固定率が2乃至3倍高かったことを考慮すれば、実施例4及び5のバイオ支持体がオリゴヌクレオチド固定効率が向上しただけでなく、ハイブリダイゼーション効率もやはり優れていることを示す。優れたハイブリダイゼーション効率は本発明のバイオ支持体が固定されたオリゴヌクレオチドでハイブリッドを形成するためにプローブが入れるように充分な3次元空間を提供するためであると解釈することができる。また、デンドリマーとオリゴヌクレオチドの間に位置したPDCリンカーの柔軟性もハイブリダイゼーション効率に貢献することができる。
【0046】
固定された核酸の表面密度を高めるために変形されたスライドガラスを使うDNAマイクロアレイの場合、活性化した表面に非特異的に結合したバックグラウンドシグナル(background signal)が多くなる。このような多量のバックグラウンドシグナルはマイクロアレイ分析時に感度を低下させる。
【0047】
本発明のデンドリマー支持体は陽電荷性アミノ基を含み、陰電荷を有する核酸との電気的な力によって相互結合することができる。しかし、図7と図8で実施例4及び実施例5のバイオ支持体表面では非特異的な結合が観察されなかった。これはバイオ支持体のデンドリマーにある全てのアミノ基がPDCと反応してチオシアン酸塩基に変わったということを意味する。つまり、デンドリマーの全てのアミノ基がオリゴヌクレオチドを固定することができる状態になってオリゴヌクレオチドを効果的に固定させ、非特異的な結合も減少させることができた。
【0048】
【発明の効果】
前記の通り、本発明のバイオ支持体はスライドガラス上のアルデヒドに接合されたデンドリマーを含み、バイオ支持体は3次元的な構造を有していてバイオポリマーを高効率に固定させる。また、バイオ支持体はバイオチップ製作用として一般に用いることができる。バイオ支持体を利用して製造したDNAチップは相補的な結合を示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のバイオ支持体に含まれるデンドリマー3世代を示す。
【図2】本発明のバイオ支持体に含まれるデンドリマー4世代を示す。
【図3】デンドリマーバイオ支持体の製造過程を示す。
【図4】本発明のデンドリマーバイオ支持体を示す。
【図5−1】本発明のDNAチップ製造工程を示す。
【図5−2】本発明のDNAチップ製造工程を示す。
【図6】蛋白質チップ製造工程を示す。
【図7】デンドリマーバイオ支持体にオリゴヌクレオチドを固定した後に測定した密度計写真及びオートラジオグラフィーである。
【図8】デンドリマーバイオ支持体のハイブリダイゼーション効率を示す写真及びオートラジオグラフィーである。
【発明に属する技術分野】
本発明はバイオ支持体及びその製造方法に関し、さらに詳しくはバイオチップ製造時にスライドガラス上にバイオポリマーを固定させる方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ハイブリダイゼーション(Hybridization)に基づいたマイクロアレイ(microarray)分析法は最近最も多く使用されている技術で、様々な応用性を有している。多くの分野において使われているマイクロアレイ分析法は標識化された核酸分子が固体表面に固定されている核酸分子を検出するのに用いることができるという基本概念から次第に発展している。
【0003】
現在DNAチップに関連した主な研究は米国で行われており、一部研究はヨーロッパで行われている。また、DNAチップ製作と応用に関する幾多のベンチャー企業が合併しており、Molecular Dynamics、Motorolaなど大手企業がこれを支援している。1998年まで、一般研究者が購入できるアレイ(array)は遺伝子をフィルターに固定した形態のものであった。NEN life Scienceではスライドガラス上に2,400個のヒトcDNAを固定した製品を市場に発表した。Affymetrix、IncyteなどではヒトのEST、マウス、酵母、バクテリアなどのDNAチップを商品化し、Clontech社もスライド形態のcDNAアレイを市場に発表した。このような製品は全て二次元的な平面にオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)を固定する方式で製作されたものである。つまり、ポリ−リジン(poly−lysine)をガラス表面に処理した後、DNAをUV−架橋結合(crosslinking)などを通じてガラス上のポリ−リジンに固定するものである。他の方法としては、ガラス表面にアルデヒド基やアミノ基からなるSAM(self assembled monolayer)を形成させた後、DNAを前記ガラスに結合させることがある。前記方法では短いDNAオリゴヌクレオチドから長いcDNAまで固定できるが、付着された核酸の表面密度及び目的核酸とプローブ間のハイブリダイゼーション効率性によって適用には限界がある。
【0004】
表面密度とハイブリダイゼーション効率の制限要因を解決するために、多くの研究がアクリルアミドゲルパッド、ゼラチンパッド、寒天フィルムのような様々な固体支持体を開発するために行われており、ポリアクリルアミドゲルは優れた固定力を有する三次元固体支持体であるが(Rehman, F. N., Audeh, M., Abrams, E. S., Hammond, P. W., Kenney, M., and Boles, T. C. (1999) Nucleic Acids Res., 27, 649−655; Guschin, D., Yershov, G., Zaslavsky, A., Gemmell, A., Shick, V., Proudnikov, D., Arenkov, P., and Mirzabekov, A. (1997) Anal. Biochem., 250, 203−211)、固体支持体とオリゴヌクレオチド間の空間不足のためにハイブリダイゼーション効率が低い。ハイブリダイゼーション効率を高めるために、固定された核酸と固体支持体との間を連結する様々なリンカー(連結体)の導入が試みられている(Guo, Z., Guilfoyle, R. A., Thiel, A. J., Wang, R., and Smith, L. M. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 5456−5465; Shchepinov, M. S., Case−Green, S. C., and Southern, E. M. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 1155−1161)。しかし、修飾物質を含む大部分の方法は非常に複雑であるだけでなく、特定の条件下でのみ適用が可能なのが実情である。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、核酸、蛋白質、抗体などのバイオポリマーを固定することができるバイオ支持体を提供することにある。
【0006】
また、本発明の目的は、核酸、蛋白質、抗体などのバイオポリマーを固定することができるバイオ支持体製造方法を提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために本発明は、(a)表面上にアルデヒドを含むスライドガラス及び(b)前記(a)のアルデヒド基に結合されているデンドリマーを含むバイオ支持体を提供する。
【0008】
また、本発明は(a)シリレイテッドスライド上のアルデヒド基とデンドリマーのアミノ基を反応させてシッフ塩基を製造することにより、デンドリマー単一層を形成する段階及び(b)テトラヒドロほう酸ナトリウムでスライド(a)上の反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させる段階を含むバイオ支持体の製造方法を提供する。
【0009】
また、本発明は前記支持体に核酸、蛋白質、ペプチド、抗体、及び化学物質からなる群より選択されたバイオポリマーを固定したバイオチップを提供する。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明をさらに詳細に説明する。
【0011】
疾患診断用マイクロアレイチップシステムの開発において、本発明者はバイオチップ製造の核心であるポリマー(核酸、蛋白質など)をガラス表面上に固定させる方法について研究し、バイオ支持体及びバイオチップを開発した。
【0012】
本発明のバイオ支持体はスライドガラスの表面上に3次元構造でバイオポリマーを固定させることができるデンドリマーを含む。デンドリマーはスライドのアルデヒド基に結合させた後、バイオポリマーをデンドリマーに固定させる。前記デンドリマーは80年代中端から研究されており、合成方法と物理的、化学的特性に対する研究が進められている。デンドリマーに対する大部分の研究は可塑剤、液晶、レイヤー(layers)及び薬物伝達体に関するもので、デンドリマーはまだ商業的に商品化されてはいない。
【0013】
本発明のポリアミドアミン(PAMAM)デンドリマーは図1に示されているように、求核性(nucleophilic)または求電子性(electrophilic)中心部から始まってアミドアミノ(amidoamine)基で分岐した放射形を有し、球形に近い3次元的な構造をしている。図1のPAMAMデンドリマー3世代は直径が約40Åであり、32個のアミノ基を含んでいる。
【0014】
PAMAMデンドリマーのアミノ基は一世代当り二倍に増加し、直径は約10Åずつ増加する。図2はまた64個のアミノ基を含むPAMAMデンドリマー4世代を示す。本発明のデンドリマーは固有な構造と分岐したアミノ基からなる3次元的構造を提供する。デンドリマーは楕円形の形態であると推定される(Tokuhisa, H., Zhao, M., Baker, L. A., Phan, V. T., Dermody, D. L., Garcia, M. E., Peez, R. F., Crooks, R. M., and Mayer, T. M. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120, 4492−4501; Bliznyuk, V. N., Rinderspacher, F., and Tsukruk, V. V. (1998) Polymer, 39, 5249−5252)。
【0015】
本発明の好ましいデンドリマーはデンドリマー1乃至8世代であり、さらに好ましくはデンドリマー2乃至6世代であり、最も好ましくはデンドリマー3乃至4世代である。
【0016】
デンドリマーに固定されるバイオポリマーは核酸、蛋白質、ペプチド、化学物質及び抗体からなる群より選択することができ、好ましくは核酸及び蛋白質であり、最も好ましくは核酸である。
【0017】
本発明のバイオ支持体のモデルは図3(d)で示すことができ、スライドガラスの表面に付着されたアルデヒド基に結合しているデンドリマーを含む。
【0018】
また、本発明のバイオ支持体はデンドリマーのアミノ基にリンカーがさらに連結されているものを含む。前記リンカーはバイオポリマーが固体支持体に容易に連結されるようにする連結体であって、前記の化学式1の化合物、化学式2の化合物(1,4−phenylene diisothiocyanate; PDC)、化学式3の化合物及びn−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート(NIA)からなる群より選択することができる。
【化3】
【0019】
リンカーを含むバイオ支持体は図4に示す。図4(a)は化学式1のリンカーを含むバイオ支持体であり、図4(b)は化学式2のPDCを含むバイオ支持体であり、図4(c)は化学式3のリンカーを含むバイオ支持体であり、図4(d)はNIAリンカーが連結されたバイオ支持体である。図4のバイオ支持体は核酸、蛋白質、ペプチド、抗体などを固定することができる。
【0020】
デンドリマーの直径はPDCとのカップリングによって約17Å増加する。このような事実とデンドリマーの優れたカバー力により、活性形チオシアネート基の表面密度は約0.06nmol/cm2であり、近接したチオシアネート基間の平均距離は約18Åである。前記18Åは18乃至20ÅであるDNA螺旋の直径とほとんど同一である。これは既存の2次元構造の固体支持体で0.3nmol/cm2の表面密度を有する末端作用基間の距離が5乃至10Åであることとは対照的である(Guo, Z., Guilfoyle, R. A., Thiel, A. J., Wang, R., and Smith, L. M. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 5456−5465;Matson, R. S., Rampal, J. B., and Coassin, P. J. (1994) Anal. Biochem., 217, 306−310)。これは本発明のデンドリマーバイオ支持体が核酸を固定するのに適していることを示す。
【0021】
本発明のバイオ支持体は末端作用基(PDC−デンドリマーを含むバイオ支持体の場合にはチオシアネート基の数)が2次元構造の他の支持体に比べて少ないが、本発明のバイオ−支持体はチオシアネートの3次元的な配列と理想的な作用基間の距離によってオリゴヌクレオチドを高効率で固定することができる。
【0022】
また、本発明はバイオ支持体の製造方法を提供する。本発明のバイオ支持体製造方法は図3に示しており、これを詳細に説明する。
【0023】
表面にアルデヒド基を有するスライドを本発明のバイオ支持体の基質として用いた。前記スライドはシリレイテッドスライド(silylated slide)が好ましい。市販されるシリレイテッドスライドは表面に反応性のアルデヒド基を含んでいる。まず、シリレイテッドスライドのアルデヒド基はデンドリマーと反応をしてアルデヒド基とデンドリマーの間にシッフ塩基が形成される。したがって、表面にデンドリマー単一層が形成されたスライドが製造される。次に、スライドにNaBH4で水素化反応を行って反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させる。このような方法でバイオ支持体を製造する。
【0024】
また、バイオ支持体製造方法は前記変換段階後にリンカーを連結させる段階をさらに含む。
【0025】
デンドリマー単一層形成段階において、スライドガラスを0.5%デンドリマーを含むメタノールと反応させると、スライドガラス上のアルデヒド基はデンドリマーと反応する。図3(b)に示したデンドリマーとアルデヒド基間の反応後に、シッフ塩基は図3(c)の脱水反応によって形成される。
【0026】
変換段階では、反応しないアルデヒド基がアルコールに転換され、図3(d)のバイオ支持体が形成される。
【0027】
リンカーの連結段階はデンドリマーのアミノ基にリンカーを結合させる。前記リンカーは下記の化学式1の化合物、化学式2の化合物、化学式3の化合物及びn−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート(NIA)からなる群より選択するのが好ましい。リンカーの連結方法は公知の方法で実施するのが好ましい(Chrisey, L. A., Lee, G. U. and O Ferrall, C. E. Nucleic Acids Res. (1996) 24, 3031−3039, Singh, P. Bioconjugate Chem. (1998)9, 54−63 Singh, P. Bioconjugate Chem. (1998)9, 54−63)。図4はリンカーを含むバイオ支持体を示す。
【0028】
また、本発明は前記バイオ支持体を利用したバイオチップを提供する。前記バイオチップはDNAチップ、蛋白質マイクロアレイ、抗体支持体、バイオセンサー(biosensor)及び化学物質を固定した組合せ(combinatorial)アレイが好ましい。
【0029】
本発明のバイオチップは本発明のバイオ支持体及び前記バイオ支持体に固定されたバイオポリマーを含む。さらに詳しくは、バイオポリマーはスライドガラスのアルデヒドに結合されているデンドリマーのアミノ基に固定されている。バイオチップの製造方法は通常のUV−架橋反応または熱反応で実施するのが好ましい。図5にDNAチップ製造過程を示す。
【0030】
本発明はリンカーをさらに含むバイオ支持体を利用したバイオチップを提供する。前記バイオチップは下記の段階を含む:(a)デンドリマーにスライドガラス上のアルデヒド基を反応させ、(b)スライド上の反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させ、(c)リンカーを(b)のデンドリマーアミノ基に反応させ、(d)バイオポリマーを(c)のリンカーに固定させる。DNAチップは図5(a)及び(b)で示したUV−架橋反応または図5(c)に示した反応で製造することができる。
【0031】
図5(c)はDNAチップ製造過程で、リンカーと5’または3’末端をアミノまたはチオール基に交換されたオリゴヌクレオチドを利用したDNAチップ製造過程を示したものである。オリゴヌクレオチドの大きさはDNAチップで一般に用いられるオリゴヌクレオチドの大きさであるのが好ましい。チオールに交換されたオリゴヌクレオチドを使用する場合、DNAチップはPDC以外の他の種類のリンカーを使用してオリゴヌクレオチドをバイオ支持体に固定させることによって製造することができる。
【0032】
また、本発明の蛋白質チップの場合、図6に蛋白質チップ製造過程を一例として示した。蛋白質チップは蛋白質をデンドリマーバイオ支持体に直接的(図6(a))にまたはリンカー(図6(b、c、d))を使用して固定させて製造することができる。
【0033】
本発明は下記の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明が下記の実施例に限られるわけではない。
【0034】
実施例1
全ての試薬は特に断らない限り、シグマ−アルドリッチ(米国)社から購入したものであり、シリレイテッドスライドガラスはCel Associates(USA)社から購入した。オリゴヌクレオチドはジェノテック(大田、韓国)で合成し、3世代及び4世代デンドリマーはシグマ−アルドリッチ社から購入した。
【0035】
バイオ支持体の製造
シリレイテッドスライドを洗浄し、0.5%PAMAMデンドリマー(3世代;図1)を含むメタノール溶液に1乃至2日間浸漬させておいた。これにデンドリマーアミノ基とスライド表面のSAM(self assembled monolayer)を形成するアルデヒド基間のシッフ塩基形成でスライドガラスの表面にはデンドリマー単一層が製造された。スライドガラス上に残存して反応しないアルデヒド基はテトラヒドロほう酸ナトリウムを添加してアルコール基に変換させた。反応後、スライドガラスは3回洗浄し、真空で30分間乾燥させた。
【0036】
実施例2
オリゴヌクレオチドを3X SSC(SSC:150mM NaCl, 15 mM 酢酸ナトリウム, pH7.0)に溶解し、実施例1と同様な方法で製造したバイオ支持体に点滴(滴下)した。点滴した溶液は乾燥させた後、UV−架橋剤(60mJ)で架橋した。
【0037】
実施例3
実験は実施例1と同様な方法で実施したが、デンドリマーは3世代の代りに4世代を使用した。
【0038】
実施例4
実施例1と同様な方法でバイオ支持体を製造した後、リンカーを含むバイオ支持体をさらに製造した。まず、リンカーをデンドリマーに接合させるために、乾燥したスライドガラスを10%ピリジン/ジメチルホルムアミド溶媒中の0.2%の1,4−フェニレンジイソチオシアネート(phenylene diisothiocyanate;PDC, Aldrich)溶液にアルゴン条件下で3時間処理した。反応が終わった後、スライドガラスをメタノールで洗い、使用前まで真空乾燥器に保管した。
【0039】
実施例5
実施例3と同様な方法でバイオ支持体を製造した後、実施例4と同様な方法でリンカーを含むバイオ支持体を製造した。
【0040】
比較例
スライドガラス表面にアルデヒドSAMがあるシリレイテッドスライドをDNAチップ用支持体として使用した。
【0041】
実験
オリゴヌクレオチドの固定化
実施例4、実施例5及び比較例で製造したバイオ支持体を使用した。オリゴヌクレオチドとして5’−CCGACCGGAATAAAT−NH2−3’を使用しており、これは3’末端にアミノ基を有する。オリゴヌクレオチドの固定効率を確認するためにオリゴヌクレオチドの5’末端に32Pで標識をつけた。オリゴヌクレオチド10pmolに[γ−32P]ATP(>6,000Ci/mol、10mCi/ml)とT4ポリヌクレオチドキナーゼを37℃で30分反応させた。95℃で2分間加熱して反応を中止した後、標識されたオリゴヌクレオチドをG−50スピンコラムで精製した。オリゴヌクレオチドは0.005、0.001及び0.03pmol/μlの濃度にした。各濃度別に0.5μl溶液を実施例4、実施例5、比較例で準備したバイオ支持体に点滴した後、常温で約16時間乾燥させた。乾燥されたバイオ支持体は水、3NのNH4OH及び0.2%のSDSを含む1X SSPE(150mM NaCl、10mM NaH2PO4、pH7.4、1mM EDTA)で洗浄して固定化されないオリゴヌクレオチドを除去した。その後、バイオ支持体に固定されたオリゴヌクレオチドの表面密度はスライドをBAS1500(FUJI、JAPAN)スキャンして確認した。
【0042】
図7はデンドリマーバイオ支持体にオリゴヌクレオチドを固定した後、測定したオートラジオグラフィー(a)及び棒グラフ(b)である。放射性はオリゴヌクレオチドの濃度に対応することが確認された。実施例4と実施例5のバイオ支持体の表面密度は比較例の支持体表面密度に比べて2〜3倍高かった。このような結果はオリゴヌクレオチドは高密度のアルデヒド基からなるSAMを有する支持体よりバイオ支持体にさらによく固定化されるということを意味する。また、実施例4と実施例5を比較した時、実施例5のバイオ支持体が実施例4のバイオ支持体より約2倍多いオリゴヌクレオチドを固定すると予想していたが、実施例4及び実施例5の固定化効率はほとんど同一であった。
【0043】
ハイブリダイゼーション効率分析
オリゴヌクレオチドを実施例4、実施例5及び比較例の支持体に固定させ、相補的なオリゴヌクレオチドを利用してハイブリダイゼーション効率を確認した。
【0044】
標識されていない目的オリゴヌクレオチド5’−CCGACCGGAATAAAT−NH2−3’をバイオ支持体に固定させ、相補的なオリゴヌクレオチド5’−ATTTATTCCGGTCGG−3’は[γ−32P]ATPの5’末端を標識化してプローブ(probe)として使用した。目的オリゴヌクレオチドが固定されたスライドガラスを0.2%のSDSを含む5X SSPEに2時間予備ハイブリダイズさせ、ここにプローブを最終濃度2pmol/mlで42℃16時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション反応の後、ハイブリダイズしていないプローブは0.2%SDSを含む1X SSPE及び0.2%SDSを含む0.1X SSPEで各々38乃至40℃で30分間洗浄し除去した。ハイブリダイゼーション効率はスライドをBAS1500でスキャンして測定した。
【0045】
図8はバイオ支持体を利用して製造したDNAチップのハイブリダイゼーション効率を示すオートラジオグラフィー(a)及び棒グラフ(b)である。実施例4及び5のバイオ支持体は比較例の支持体に比べてハイブリダイゼーション効率が最大8倍高かった。このような結果は実施例4及び5のバイオ支持体が比較例に比べてオリゴヌクレオチド固定率が2乃至3倍高かったことを考慮すれば、実施例4及び5のバイオ支持体がオリゴヌクレオチド固定効率が向上しただけでなく、ハイブリダイゼーション効率もやはり優れていることを示す。優れたハイブリダイゼーション効率は本発明のバイオ支持体が固定されたオリゴヌクレオチドでハイブリッドを形成するためにプローブが入れるように充分な3次元空間を提供するためであると解釈することができる。また、デンドリマーとオリゴヌクレオチドの間に位置したPDCリンカーの柔軟性もハイブリダイゼーション効率に貢献することができる。
【0046】
固定された核酸の表面密度を高めるために変形されたスライドガラスを使うDNAマイクロアレイの場合、活性化した表面に非特異的に結合したバックグラウンドシグナル(background signal)が多くなる。このような多量のバックグラウンドシグナルはマイクロアレイ分析時に感度を低下させる。
【0047】
本発明のデンドリマー支持体は陽電荷性アミノ基を含み、陰電荷を有する核酸との電気的な力によって相互結合することができる。しかし、図7と図8で実施例4及び実施例5のバイオ支持体表面では非特異的な結合が観察されなかった。これはバイオ支持体のデンドリマーにある全てのアミノ基がPDCと反応してチオシアン酸塩基に変わったということを意味する。つまり、デンドリマーの全てのアミノ基がオリゴヌクレオチドを固定することができる状態になってオリゴヌクレオチドを効果的に固定させ、非特異的な結合も減少させることができた。
【0048】
【発明の効果】
前記の通り、本発明のバイオ支持体はスライドガラス上のアルデヒドに接合されたデンドリマーを含み、バイオ支持体は3次元的な構造を有していてバイオポリマーを高効率に固定させる。また、バイオ支持体はバイオチップ製作用として一般に用いることができる。バイオ支持体を利用して製造したDNAチップは相補的な結合を示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のバイオ支持体に含まれるデンドリマー3世代を示す。
【図2】本発明のバイオ支持体に含まれるデンドリマー4世代を示す。
【図3】デンドリマーバイオ支持体の製造過程を示す。
【図4】本発明のデンドリマーバイオ支持体を示す。
【図5−1】本発明のDNAチップ製造工程を示す。
【図5−2】本発明のDNAチップ製造工程を示す。
【図6】蛋白質チップ製造工程を示す。
【図7】デンドリマーバイオ支持体にオリゴヌクレオチドを固定した後に測定した密度計写真及びオートラジオグラフィーである。
【図8】デンドリマーバイオ支持体のハイブリダイゼーション効率を示す写真及びオートラジオグラフィーである。
Claims (8)
- (a)表面にアルデヒド基を含むスライドガラス及び
(b)(a)のアルデヒド基に結合されたデンドリマーを含むバイオ支持体。 - 前記バイオ支持体はデンドリマーのアミノ基にリンカーをさらに含むものである、請求項1に記載のバイオ支持体。
- 前記デンドリマーはデンドリマー1乃至8世代である、請求項1に記載のバイオ支持体。
- (a)シリレイテッドスライド上のアルデヒド基とデンドリマーアミノ基間にシッフ塩基を形成してデンドリマー単一層を形成し、
(b)テトラヒドロほう酸ナトリウム(NaBH4)で(a)のスライドの反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させることを含むバイオ支持体製造方法。 - 前記方法は変換後にデンドリマーのアミノ基にリンカーを結合させることをさらに含む、請求項5に記載のバイオ支持体製造方法。
- 請求項1に記載のバイオ支持体に核酸、蛋白質、ペプチド、抗体及び化学物質からなる群より選択されるバイオポリマーを固定したバイオチップ。
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