JP2005534021A - バイオチップの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
−ホスフェート基と配位結合できる金属で覆われた表面を有する固体支持体;
−遊離ホスフェート基を担持する少なくとも1のバイオポリマー;
−任意に試薬、
を含んで成る。ホスホン酸の溶液は、例えば、仮に標的でない領域上の配位サイトを飽和することが所望される場合に有用である。ホスホン酸(例:C4H9PO3H2)1mM溶液は特に有用だろう。ウシ血清アルブミン(BSA)溶液も都合よく用いられる(典型的にBSA溶液の1質量%,3.5X SSC中の3%SDS)。
“バイオポリマー”とは、一般的に公知の配列に従って互いに接続された単量体ユニットを基礎とし、且つ生物学的活性を有し、又は生物学的活性を有する化合物と反応する化合物を意味する。
選定される平面の固体支持体は、本発明に従いチップタイプ製品の製造のために適した任意の材料で構成することができる。特にガラス、シリコーン、雲母、石英、もしくはプラスチックの支持体、又は様々な合成ポリマーに基づく支持体を使用することができる。当該支持体は薄金層で覆われたものも使用してよい。ガラス支持体は好適であり、例えばマイクロスコープスライド、及びより一般的には、任意のガラス、石英、もしくはシリコーンのプレート又はシートも使用することができる。支持体の形状は重要ではない。
バイオポリマーは、スポッティングにより簡単に支持体上に沈着させることができる。微小滴定(例えばおよそ50ピコリットル)又はロボットによるスポット(例えばマイクロタイタープレートのウェルからサンプルをとる)で沈着させる操作が普通含まれる。
本発明により製造されたバイオチップタイプの製品は、多くの用途を有す。例えば、生物学的分析、及び固定されたポリマーへ結合することができる化合物のスクリーニングに用いることができる。
1.1 支持体の獲得
図1で説明されたような、及びBenitez等.,J.Am.Chem.Soc.,2002,124:4363-4370で発表されたような、ジルコニウムホスホネートに基づくLBフィルムで覆われたガラスシートを使用する。
最初の実行可能性試験では、3’位がリン酸化され、及び5’位がCY3蛍光プローブによりラベル化された35塩基のオリゴヌクレオチドは、それ自体が自発的にスポッティングによって簡単にジルコニウムホスホネートに基づきラングミュアーブロジェットフィルムへ固定されることが示された。同一のスポッティング条件下で3’位がリン酸化されていない同一のオリゴヌクレオチドについて固着されるプローブの量がより少ない(5分の1)ことから、フィルムへの固定に責任を負うのは、確かに末端のホスフェートであるようだ。この“非特異的”固着は、おそらくヌクレオチドユニットを結ぶホスホジエステル基とジルコニウムの相互作用によって引き起こされる。更に、当該固着は、DNAチップを洗浄するための標準条件下において安定である。従って、リン酸化されていない相同体と比較して、リン酸化されたオリゴヌクレオチドの効率的なカップリングが観察された。
固定された4つのタイプのオリゴヌクレオチド、すなわち:
−35量体オリゴヌクレオチド(1と呼ぶ);
−5’位がリン酸化されたその類似体(2と呼ぶ。2=1−5’−OPO3H2);
−オリゴヌクレオチド及び末端ホスフェート基の間の11アデニンユニットのスペーサー基を含んで成る2の類似体、(3と呼ぶ。3=1−(A)11−5’−OPO3H2);及び
−リン酸化されていない3の類似体(4と呼ぶ。4=1−(A)11)、である。
1X SSC(HClを付加することによりpHを6に調整)の溶液中のオリゴヌクレオチドを、50μM、20μM、及び5μMの濃度でこれらのシート上にスポットした。
ハイブリダイゼーション試験は、固定化した4つのタイプのオリゴヌクレオチドを実施例1の通りに調整したガラスシートにより実施した。
1. スポット周辺のグランドノイズが弱い(dark ground)。
2. 1及び4に一致するスポットの蛍光強度は、同一の沈着濃度での5’位をリン酸化したそれらの相同体よりも6倍弱い。それは、支持体へのオリゴヌクレオチドのカップリングのため、ホスフェート基の存在が非常に好適であるという明確な効果を証明する。
3. 3に一致するスポットの蛍光強度が、同一の沈着濃度でのオリゴヌクレオチド2よりも1.6倍強い〔レーザーパワー80%、光電子増倍管パワー70%:強度48000〕。それは、オリゴヌクレオチド及びホスフェート基の間のスペーサー基(11アデニンユニット)の存在が非常に好適であるという明確な効果、オリゴヌクレオチドを支持体表面から除去することの可能化、及びこのようなハイブリダイゼーションの容易化を証明する。
オリゴヌクレオチドを実施例1で記載した条件と同一の条件下で固定し、ハイブリダイゼーション前にBSA溶液(ウシ血清アルブミン:1%BSA、3.5X SSC中の0.3%SDS)によりチップ上で表面処理も実施し、シグナル/ノイズ率を改善させるため、引き続き洗浄し乾燥させた。固定化は、異なる配列を有し、且つ5’末端がリン酸化された33量体オリゴヌクレオチド(5,6及び7と呼ばれるもの、それぞれについて)、並びに5’末端遊離ホスフェート、並びに(A)11−5、(A)11−6、及び(A)11−7;(C)11−5、(C)11−6、及び(C)11−7;(G)11−5、(G)11−6、及び(G)11−7;(T)11−5、(T)11−6、及び(T)11−7と呼ばれるオリゴヌクレオチド間のポリアデニン(11量体)、ポリシトシン(11量体)、ポリグアニン(11量体)もしくはポリチミン(11量体)タイプのそれぞれのスペーサーを担持する類似体についても実施した。
−オリゴヌクレオチド5、及びその類似体:化合物5と相補的な33量体オリゴヌクレオチドの溶液であり、且つCY3モチーフにより5’がラベル化された;
−オリゴヌクレオチド6、及びその類似体:化合物6と相補的な33量体オリゴヌクレオチドの溶液であり、且つCY3モチーフにより5’がラベル化された;
−オリゴヌクレオチド7、及びその類似体:化合物7と相補的な33量体オリゴヌクレオチドの溶液であり、且つCY3モチーフにより5’がラベル化された。
Claims (18)
- ホスフェート基と配位結合できる金属で覆われた表面を有す平面の固体支持体、並びにポリマーの遊離ホスフェート基及び当該金属との間のイオン性共有結合(ionocovalent bonding)により当該表面上で固定された当該遊離ホスフェート基OP(O)(OH)2を担持する少なくとも1のバイオポリマーを含んで成るバイオチップタイプの製品。
- 前記バイオポリマーが5’位をリン酸化された核酸である請求項1に記載の製品。
- 前記バイオポリマーが3’位をリン酸化された核酸である請求項1に記載の製品。
- 前記核酸が前記核酸自体及びホスフェート基との間にポリグアニン(ポリG)スペーサー基を有することを特徴とする請求項2又は3のいずれかに記載の製品。
- 前記バイオポリマーがリン酸化されたタンパク質である請求項1に記載の製品。
- 前記バイオポリマーがリン酸化されたオリゴ糖又は多糖である請求項1に記載の製品。
- 前記金属が、スペーサー分子を通じて前記支持体の表面へ結合する請求項1から6のいずれか1項に記載の製品。
- 前記スペーサー分子が、イオン性共有結合により前記金属が結合するホスホネート基を担持する脂肪酸の鎖を含んで成る請求項7に記載の製品。
- 前記金属がジルコニウムである請求項1から8のいずれか1項に記載の製品。
- 前記スペーサー分子が、オクタデシルホスホン酸であり、且つ前記金属がジルコニウムである請求項8に記載の製品。
- 前記支持体がガラスである請求項1から10のいずれか1項に記載の製品。
- ジルコニウムオクタデシルホスホネートの単一層で覆われた表面を有すガラスシート、並びに核酸のホスフェート基及び前記ジルコニウム間のイオン性共有結合により前記表面上に固定された5’位にホスフェート基を担持する少なくとも1の核酸、を含んで成る請求項1に記載の製品。
- ホスフェート基と配位結合できる金属で覆われた表面を有す固体支持体上での遊離ホスフェート基を担持する少なくとも1のバイオポリマーの固定化を含んで成り、ここで前記バイオポリマーは当該ポリマーの遊離ホスフェート基及び前記金属の間のイオン性共有結合により前記表面に固定化される、請求項1から12のいずれか1項に記載のバイオチップタイプ製品の製造方法。
- ホスフェート基を担持する前記バイオポリマーを得るステップも含んで成る請求項13に記載の方法。
- 前記ポリマーが、酵素的に5’位をリン酸化した核酸である請求項14に記載の方法。
- 以下の要素:
−ホスフェート基と配位結合できる金属で覆われた表面を有する固体支持体;
−ホスフェート基を担持する少なくとも1のバイオポリマー;
−任意に試薬、
を含んで成る請求項1から12のいずれか1項に記載のバイオチップタイプ製品の調整のためのキット。 - 前記固定されたバイオポリマーに結合することができる化合物のスクリーニングを目的とする請求項1から12のいずれか1項に記載のバイオチップタイプ製品の使用。
- in vitroでの診断具としての請求項1から12のいずれか1項に記載のバイオチップタイプ製品の使用。
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