DE69825722T2 - Substrat zum Drucken einer Matrize - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung umfasst biologische und chemische Arrays mit hoher Dichte und insbesondere ein verbessertes Substratmaterial, auf das die Arrays abgelegt sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Oligonukleotidhybridisierung wird weithin verwendet, um das Vorhandensein einer Sequenz, die komplementär zur Oligonukleotidsonde ist, in einer Nukleinsäure zu bestimmen. In vielen Fällen stellt dies eine einfache, schnelle und billige Alternative zu herkömmlichen Sequenzierungsmethoden dar. Die Hybridisierung verlangt kein Klonieren und Reinigen der Nukleinsäure, Durchführen basenspezifischer Reaktionen oder langwierige elektrophoretische Trennungen. Die Hybridisierung von Oligonukleotidsonden wurde erfolgreich für verschiedene Zwecke verwendet, wie z.B. Analyse von genetischen Polymorphismen, Diagnose von genetischen Krankheiten, Krebsdiagnose, Bestimmung von viralen und mikrobiellen Krankheitserregern, Screening von Klonen, Genomkartierung und Ordnen von Fragmentbibliotheken.
  • Ein Oligonukleotidarray besteht aus einer Zahl individueller Oligonukleotidspezies, die an die Oberfläche eines festen Trägers in einem regelmäßigen Muster angebunden sind, jede in einem anderen Bereich, sodass die Lage eines jeden Oligonukleotids bekannt ist. Ein Array kann eine bekannte Auswahl an Oligonukleotiden enthalten, z.B. Sonden, die spezifisch für alle bekannten, klinisch wichtigen Krankheitserreger sind, oder Spezifika für alle bekannten Sequenzmarker genetischer Krankheiten. Solch ein Array kann die Bedürfnisse eines diagnostischen Labors befriedigen. Alternativ kann ein Array alle möglichen Oligonukleotide einer gegebenen Länge n enthalten. Die Hybridisierung einer Nukleinsäure mit einem solchen umfassenden Array führt zu einer Liste aller seiner konstituierenden n-Mere, die verwendet werden können für eine eindeutige Genidentifizierung (z.B. für forensische Studien), zur Bestimmung unbekannter Genvarianten und Mutationen (einschließlich der Sequenzierung verwandter Genome, sobald die Sequenz von einem von ihnen bekannt ist), für überlappende Klone, und zur Überprüfung von Sequenzen, die mit herkömmlichen Verfahren bestimmt wurden. Schließlich kann die Überprüfung der n-Mere durch Hybridisierung zu einem umfassenden Array genügend Informationen bereitstellen, um die Sequenz einer vollständig unbekannten Nukleinsäure zu bestimmen.
  • Oligonukleotidarrays können durch Synthese aller Oligonukleotide parallel direkt auf dein Träger hergestellt werden, wobei die Verfahren von chemischer Festphasensynthese in Verbindung mit ortsgerichteten Masken, wie im US-Patent Nr. 5,510,270 beschrieben, verwendet werden. Unter Verwendung einer wirksamen photolithographischen Methode wurden Miniaturarrays gezeigt, die bis zu l 05 einzelner Oligonukleotide pro cm2 Fläche enthalten.
  • Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotidarrays beinhaltet genaue Tropfenablage unter Verwendung einer piezoelektrischen Pumpe, wie im US-Patent 5,474,796 beschrieben. Die piezoelektrische Pumpe liefert exakte Flüssigkeitsvolumina an eine Trägeroberfläche. Der Pumpenaufbau ist sehr ähnlich zu den Pumpen, die beim Tintenstrahldrucken verwendet wird. Diese Picopumpe ist in der Lage, 50 μm und 65 Picoliter Tröpfchen mit bis zu 3000 Hz zu liefern und kann genau ein 250 μm Ziel treffen. Wenn sie eingeschaltet wird, wird ein Mikrotröpfchen aus der Pumpe ausgeworfen und auf der Arrayplatte an einer funktionalisierten Bindungsstelle abgelegt.
  • Weitere Vorgehensweisen zur Bildung eines Arrays beinhalten das wiederholte In-Kontaktbringen einer Trägeroberfläche mit drucktechnischen Nadeln, die kleine Tröpfchen halten, und das Verwenden von Tintenstrahldruckverfahren, um eine Arraymatrix abzulegen.
  • Bei der Wahl eines Substrats zur Verwendung als Träger zum Binden von Oligonukleotiden müssen mehrere Eigenschaften berücksichtigt werden. Als erstes muss die Oberfläche kompatibel mit dein Verfahren der Bestimmung der Hybridisierung sein. Spektroskopische, Chemilumineszenz- und Fluoreszenzbestimmungsverfahren sind die Bestimmungsverfahren der Wahl in der DNA-Forschung unter Einbeziehung hoch dichter Arrays. Um diese Verfahren verwenden zu können ist es wünschenswert, dass das Substrat optisch transparent ist. Eine zweite wichtige Eigenschaft ist, dass die Bindung des vorletzten Oligonukleotids an die Oberfläche eine hohe chemische Stabilität aufweist, die zumindest gleich der des Polyphosphatrückgrates in DNA ist. Die Substrate, die die Arrays tragen, sind herkömmlicherweise 2,54 × 7,62 cm (1 × 3 Zoll) Objektträger, hergestellt aus Sodakalkglas und mit einem polaren Silan beschichtet, das z.B. eine Aminogruppe, die zur Verankerung von Oligonukleotidfestphasensynthesen und speziell zum Quervernetzen der DNA-Moleküle geeignet ist. Gemusterte Derivatisierung kann auf dieser Oberfläche durch Photoresist- oder Maskenverfahren erreicht werden. Auf diese Weise können gemusterte Benetzungsstellen auf einer ansonsten nicht benetzenden Oberfläche ebenso wie gemusterte funktionalisierte Stellen auf einer ansonsten nicht funktionalisierten Oberfläche erreicht werden.
  • Ein Problem bei der herkömmlichen Verwendung von Sodakalkglas als Substrat zum Tragen hoch dichter Arrays ist die Gegenwart von Partikelverunreinigung, die üblich bei der Herstellung von Glas solch geringer Härte ist. Partikelverunreinigung ist von speziellem Belang bei der Behandlung von Proben in einem solch kleinen Maßstab, wie 10.000 Targetstellen pro Objektträger. Des Weiteren kann das Natrium, das in dem Sodakalkglas enthalten ist, leicht mobilisiert werden, um das Glas zu verlassen. Anlaufen ist ein Ergebnis, das die Transparenz des Glases negativ beeinflusst und folglich die oben erwähnten Bestimmungsmethoden stört. Schlussendlich ist es schwierig, eine einheitliche, funktionalisierte Beschichtung zu erhalten, wie z.B. eine Amino funktionalisierte Silanbeschichtung auf der Oberfläche von Objektträgern, die derzeit in herkömmlicher Verwendung sind. Ohne eine gleichförmige Beschichtung ist das Anbringen von Oligonukleotiden ungleich, was zu veränderten und unzuverlässigen Bestimmungsergebnissen führt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Substrat zur Verwendung beim Tragen von hoch dichten biologischen und chemischen Arrays zur Verfügung, wobei das Substrat ein Boraluminosilicatglas mit einer Zusammensetzung, die einen Natriumoxidanteil von weniger als 12 Mol-% besitzt, umfasst, und das Substrat eine im Wesentlichen flache, glatte Oberfläche mit einer Rauheit von weniger als 10 nm aufweist, und wobei das Substrat eine gleichförmige, funktionalisierte Beschichtung aus einem polaren Silan aufweist, das zumindest einen Teil seiner Oberfläche bedeckt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die funktionalisierte Beschichtung der Oberfläche des Glassubstrats mit einer gleichförmigen Beschichtung eines polaren Silans, z.B. funktionalisiertes Amin, ist das Rückgrat für die Herstellung hoch dichter Arrays. Eine im Wesentlichen gleichförmige Beschichtung der funktionalisierten Beschichtung ist, wie oben beschrieben, erforderlich. Es wurde entdeckt, dass die Verwendung eines bekannten Glases, das durch bekannte Verfahren hergestellt werden kann, um eine besondere Glätte zu erreichen, wichtige Verwendungen als ein biologisches Substrat besitzt.
  • Das Substrat, das das Thema der vorliegenden Erfindung ist, das vorzugsweise die Form eines 2,54 × 7,62 cm (1 Zoll × 3 Zoll) Objektträgers besitzt, ist aus einem Boraluminosilicatglas hergestellt, und bevorzugter aus einem Corning Incorporated 1737 LCD-Glas, das im Wesentlichen, ausgedrückt in Mol-%, hergestellt ist aus:
    Figure 00040001
  • Die Objektträger können aus einer Glasplatte geschnitten werden, die vorzugsweise durch das Fusionsziehverfahren, das in den US-Patenten 3,338,696 und 3,682,609 offenbart ist, hergestellt wurde. Dieses Verfahren stellt die Herstellung von Hochliquidus-viskosen Gläsern, wie z.B. Boraluminosilicatgläsern, in Platten mit extremer Glätte bereit. Obwohl die Boraluminosilicatplatten durch andere Verfahren hergestellt und anschließend poliert werden können, ist die Verwendung des Fusionsziehprozesses bevorzugt, da Polierschritte bei der Herstellung zur Möglichkeit von Partikelverunreinigungen auf der Substratoberfläche führen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Objektträger aus Corning Incorporated 7059 LCD-Glas hergestellt. Auf jeden Fall hat die bevorzugte Glaszusammensetzung des Substratobjektträgers einen Gewichtsprozentanteil von weniger als 15% Natriumoxid, oder irgendeinem anderen Alkalimetalloxid.
  • Mehrere geeignete Glaszusammensetzungen sind im US-Patent 5,374,595 aufgeführt, das im Allgemeinen Boraluminosilicatgläser mit einer Zusammensetzung in Molprozent von im Wesentlichen Folgendem betrifft:
    Figure 00050001
  • Es wird weiterhin bevorzugt, dass der Objektträger eine einheitliche Oberflächenglätte besitzt, sodass die durchschnittliche Rauheit (Ra) der obersten Oberfläche, gemessen auf einer 20 μm × 20 μm Abfrage unter Verwendung eines Rasterkraftmikroskops (AFM), weniger als 10 nm beträgt und bevorzugt weniger als 1 nm (10 Å). Die oberste Oberfläche ist der Teil des Objektträgers, in dem das Bindungseinheitsarray vorzugsweise synthetisiert, deponiert oder anderweitig festgemacht ist. Sogar noch bevorzugter beträgt die durchschnittliche Rauheit weniger als 0,5 nm (5 Å). Das Flachglasbildungsverfahren mit Fusionsziehen, wie beschrieben in den US-Patenten 3,338,696 und 3,682,609, beispielsweise wenn es zur Herstellung von LCD 1737 Glas verwendet wird, stellt eine Oberfläche mit der bevorzugten durchschnittlichen Rauheit von weniger als 05, nm (5 Å) bereit. Alternativ kann die bevorzugte durchschnittliche Rauheit durch Polieren erreicht werden. Die Glätte der Oberfläche hilft dabei, die Anwendung einer gleichförmigen Oberflächenbeschichtung zu ermöglichen.
  • Die Beschichtung, die vorzugsweise auf das Boraluminosilikatsubstrat zur Verwendung in der Oligonukleotidimmobilisierung aufgetragen wird, ist ein polares Silan, das z.B. eine Aminogruppe enthält, die geeignet zum Verankern bei Oligonukleotidfestphasensynthese ist und insbesondere zum Quervernetzen der DNA-Moleküle. Alternativ kann das polare Silan eine Hydroxylgruppe nach der Hydrolyse enthalten (vor der Hydrolyse ist diese Gruppe bevorzugt eine Alkoxygruppe). Geeignete Beschichtungen beinhalten funktionalisierte Alkoxysilane oder Chlorsilane, wobei das Silan zwischen 1 und 3 Alkoxy- oder Chlorgruppen trägt. Des Weiteren kann die oberste Oberfläche eine gemusterte Derivatisierung durch die Verwendung von z.B. Photoresist- oder Maskenmethoden besitzen.
  • Die Verwendung eines Boraluminosilicatsubstrats ist nicht auf die Verwendung mit Amin funktionalisierten Beschichtungen für einen Oligonukleotidarrayträger beschränkt. Das Substrat kann als fester Träger für jeden von einer Vielzahl von Bindungseinheiten verwendet werden, die irgendein biologisches oder chemisches Molekül mit einer bestimmten Affinität für ein anderes Molekül durch kovalente Bindung oder nicht kovalente Bindung einschließt. Vorzugsweise enthält eine spezielle Bindungseinheit (entweder von Natur aus oder durch Modifizierung) eine funktionelle chemische Gruppe (primäres Amin, Sulfhydryl, Aldehyd, Carboxyl, Acryl usw.), eine allgemeine Sequenz (Nukleinsäuren), ein Epitop (Antikörper), ein Hapten oder einen Liganden, der es ermöglicht, mit einer allgemeinen funktionellen Gruppe auf der Oberfläche eines Substrats kovalent zu reagieren oder nicht kovalent zu binden. Spezielle Bindungseinheiten beinhalten – sind aber nicht beschränkt auf: Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA), synthetische Oligonukleotide, Antikörper, Proteine, Peptide, Lectine, modifizierte Polysaccharide, synthetische zusammengesetzte Makromoleküle, funktionalisierte Nanostrukturen, synthetische Polymere, modifizierte blockierte Nukleotide/Nukleoside, modifizierte blockierte Aminosäuren, Fluorophore, Chromophore, Liganden, Chelate und Haptene.
  • Beispiel
  • Eine Vergleichsuntersuchung wurde durchgeführt, um die Beständigkeit einer identischen Beschichtung, die auf 2,54 × 7,62 cm (1'' × 3'') Objektträgern aufgetragen wurde, die aus drei unterschiedlichen Gläsern hergestellt wurden: Sodakalkglas, Borsilicatglas und Boraluminosilicatglas. Eine Beschichtung mit gamma-Aminopropyltriethoxysilan wurde auf jeden der zu testenden Objektträger aufgetragen. Die Objektträger wurden dann in kochendes Wasser über einen Zeitraum im Bereich von 0,5 bis 5 h eingetaucht. Wenn die aminierte Beschichtung auf der Oberfläche des Objektträgers nach dem Aussetzen bestimmter Umgebungsbeanspruchungen (in diesem Fall kochendes Wasser) bewahrt wurde, gilt die Funktionalität der Oberfläche als Funktionalität beibehaltend und das Ergebnis der Untersuchung auf Beständigkeit ist positiv.
  • Die Beständigkeit der aminierten Beschichtung wurde unter Verwendung eines Anfärbetests, basierend auf einem Au/Ag-Wachstumsprozess, gemessen. Dieser Prozess offenbart das Vorhandensein von Aminfunktionen auf der Substratoberfläche. Wenn Au/Ag-Wachstum auftritt, ist der Nachweis auf das Vorhandensein von Aminfunktionen positiv. Ein positiver Nachweis wird durch visuelle Beobachtung einer dichten und gleichförmigen metallischen grauen Beschichtung gezeigt. Ein Substrat ohne Aminfunktionalität verfärbt sich nicht und bleibt klar.
  • Der Färbeverfahrensnachweis wurde folgendermaßen durchgeführt: Die Objektträger wurden in AURODYE FORTE RPN 490 (Amersham Life Science, Amersham International, USA) für 1 h eingetaucht. Die Objektträger wurden dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Objektträger wurden dann mit N2 getrocknet. Als nächstes wurden die Objektträger für 5 min in INTENSE BL SILVER ENHANCEMENT SOLUTION RPN 492 (Amersham Life Science, Amersham International, USA) eingetaucht. Die Objektträger wurden dann wiederum mit destilliertem Wasser gewaschen und mit N2 getrocknet. Das Vorhandensein oder das Fehlen einer metallischen grauen Beschichtung wurde durch visuelle Beobachtung bestimmt.
  • Wie erwähnt, wurden Substrate, die aus drei unterschiedlichen Materialien, namentlich Sodakalkglas, Borsilicatglas und Boraluminosilicatglas, hergestellt wurden, getestet. Tabelle 1 zeigt die Länge des Aussetzens in kochendem Wasser, die notwendig war, damit der gamma-Aminopropyltriethoxysilan beschichtete Objektträger seine Aminfunktionalität verliert (Zeit, die notwendig ist, damit der Verfärbenachweis negativ verläuft).
  • Tabelle 1
    Figure 00070001
  • Die Ergebnisse, die in Tabelle 1 gezeigt werden, verdeutlichen, dass die Beständigkeit der gamma-Aminopropyltriethoxysilanbeschichtung auf Boraluminosilicatgläsern der selben Beschichtung auf Sodakalkglas oder Borsilicatglas überlegen ist.
  • Obwohl es nicht beabsichtigt ist, dass man an die Erklärung gebunden ist, wird vermutet, dass die niedrigen oder nicht vorhandenen Niveaus an Natriumoxid in den Proben aus Boraluminosilicatglas die vorteilhaften Beständigkeitseigenschaften, die in den Tests gezeigt wurden, bereitstellten. Vorzugsweise hat das Glas, wie es für hochdichte Untersuchungssubstrate verwendet wird, einen Natriumoxidanteil von weniger als 12 Molprozent und sogar noch bevorzugter weniger als 8 Molprozent und immer noch bevorzugter gar keinen Natriumoxidanteil.
  • Die Zusammensetzung von Sodakalkglas wird als Beispiel in Tabelle 2 gegeben. Die Zusammensetzung von Borsilicatglas, wie sie in diesem Beispiel verwendet wurde, wird in Tabelle 3 gegeben. Die Zusammensetzung von 1737 LCD Glas, dein Borsilicatglas, das in diesem Beispiel verwendet wurde, ist oben gegeben.
  • Tabelle 2
    Figure 00090001
  • Tabelle 3
    Figure 00090002

Claims (12)

  1. Substrat zur Verwendung als Träger hochdichter biologischer oder chemischer Arrays, wobei das Substrat ein Boraluminosilicatglas mit einer Zusammensetzung umfasst, die einen Natriumoxidgehalt von weniger als 12 Molprozent aufweist, wobei das Substrat eine im wesentlichen flache, glatte Oberfläche mit einer Rauheit von weniger als 10 nm aufweist, und wobei das Substrat eine gleichförmige, funktionalisierte Beschichtung aus einem polaren Silan aufweist, das zumindest einen Teil seiner Oberfläche bedeckt.
  2. Substrat nach Anspruch 1, das weiterhin zumindest eine Bindungseinheit umfasst, ausgewählt aus biologischen oder chemischen Molekülen, wobei jede eine spezifische Affinität für ein anderes Molekül durch kovalente oder nichtkovalente Bindung aufweist.
  3. Substrat nach Anspruch 2, wobei die Bindungseinheit folgendes einschließt: Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Ribonukleinsäuren (RNA), synthetische Oligonukleotide, Antikörper, Proteine, Peptide, Lectine, modifizierte Polysaccharide, synthetische zusammengesetzte Makromoleküle, funktionalisierte Nanostrukturen, synthetische Polymere, modifizierte/blockierte Nukleotide/Nukleoside, modifizierte/blockierte Aminosäuren, Fluorophore, Chromophore, Liganden, Chelate und Haptene.
  4. Substrat nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die Oberfläche eine durchschnittliche Rauheit von weniger als 0,5 nm aufweist.
  5. Substrat nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das polare Silan eine Aminogruppe enthält.
  6. Substrat nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das polare Silan zumindest eine Hydroxylgruppe enthält.
  7. Substrat nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das polare Silan zumindest eine Alkoxy-Gruppe enthält.
  8. Substrat nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das polare Silan zumindest eine Chlorgruppe enthält.
  9. Substrat nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das polare Silan Aminopropyltriethoxysilan ist.
  10. Substrat nach einem der Ansprüche 1–9, wobei der Natriumoxid-Gehalt weniger als 8 Molprozent beträgt.
  11. Substrat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Boraluminosilicatglas in Molprozent eine Zusammensetzung aufweist, die im wesentlichen aus folgendem besteht:
    Figure 00110001
  12. Substrat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Boraluminosilicatglas eine Zusammensetzung in Molprozent aufweist, die im wesentlichen aus folgendem besteht:
    Figure 00110002
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