FI88515B - Enzymelektrod - Google Patents

Description

8851 5

Entsyymielektrodi - Enzymelektrod Tämä keksintö koskee entsyymielektrodeja, jotka käsittävät sähköisesti johtavalle substraatille inunobilisoidun entsyymin ja jotka reagoivat amperometrisesti entsyymin katalyyttiselle aktiviteetille sen vastaavan substraatin läsnäollessa. Keksintö koskee erityisesti, mutta ei yksinomaan, entsyymielektrodeja, joita voidaan käyttää glukoo-sitasojen määrittämiseksi sekä in vitro että in vivo, ja jotka käsittävät sähköisesti johtavan substraatin, jolle on immobilisoitu oksidoreduktaasi, esim. glukoosioksidaa-si, joka elektrodi reagoi amperometrisesti immobilisoidun entsyymin katalyyttiselle aktiviteetille kun se on pantu glukoosipitoiseen näytteeseen.

Amperometristen bioantureiden, jotka sisältävät entsyymin biokatalysaattorina, edut ovat yhteenvetona suhteellisen yksityiskohtaisesti esittäneet Aston ja Turner, (1984) Biotech. Genet. Eng. Rev. (ed. G. Russell), 1^, 89-120, Intercept, Newcastle-upon-Tyne, ja Davis, G., (1985) Biosensors, 1, 161-178. Ne vaihtelevat signaalin välittämis-tavaltaan ja eri tyypit voidaan karkeasti luokitella (a) sellaisiin, joissa sähkövaste johtuu entsyymireaktion tuotteen hapettumisesta elektrodilla; (b) "välittäjä-avusteisiin", joissa elektronit kulkeutuvat entsyymistä elektrodille hapetus-pelkistys ("redox")-aineen avulla tai (c) "suoraan elektronisiirtoon" (DET: direct electron transfer), joissa ei tarvita tällaista välittäjäapua).

Ryhmä (a) Tämä tyyppi voidaan havainnollistaa tiettyjen oksidaasien (esim. glukoosioksidaasin, alkoholioksidaasin) vaikutuksen avulla, jotka entsyymit tuottavat vetyperoksidia seuraavan reaktion mukaisesti: 2 88515 substraatti + O2---[oksidaasi]--->hapetettu tuote+H202 Tässä menetelmässä peroksidi hapettuu elektrodilla jolla on määrätty potentiaali: H202 -------> 02 + 2H+ + 2e Sähkösignaali muodostuu elektronien siirryttyä peroksidis-ta elektrodille ja suotuisissa olosuhteissa entsyymikata-lysoitu virta on suorassa suhteessa analyyttikonsentraa-tioon.

On esitetty lukuisia laitteita glukoosin määrittämiseksi mutta useimmat näistä ovat rajoitetut toistettavuuden ja vastenopeuden, sekä käytettävissä olevien glukoosikonsent-raatioiden suhteen. Eräät kohtuullisen menestyksen saaneista kaupallisista menetelmistä perustuvat peroksidin käyttöön, kuten edellä on selitetty, jossa glukoosi on substraattina ja hapetettu tuote on glukono-l,5-laktoni. Toiset menetelmät perustuvat peroksidin sekundäärisiin reaktioihin (esim. kolorimetriset menetelmät) tai fysiko-kemialliseen määritykseen, kuten johtokykyyn. Nämä ovat kuitenkin yleensä hitaasti reagoivia ja niillä on se epäkohta että ne ovat melko herkkiä näytteen happipaineelle, joka voi vaihdella huomattavasti; alhaisella happipaineel-la virtaresponssin lineaarisuuden yläraja voi olla alhaisempi kuin mitä toivotaan yksinkertaisille täsmällisille mittauksille. Samat näkökohdat pätevät muiden kuin glukoo-sisubstraattien mittausmenetelmiin.

Ryhmä (b) - Välittäjä-avusteiset bioanturit Näissä laitteissa entsyymi pidetään pelkistetyssä ("elektronirikkaassa") tilassa seurauksena sen reaktiosta substraatin kanssa, joka on analyytti, jonka konsentraatio 3 88515 on määritettävä. Edellytys käytännöllisen anturin aikaansaamiselle on sähköyhteyden perustaminen elektronilähteen (tiettyjä elektronirikkaita "aktiivisia kohtia" entsyymissä) ja itse elektrodin välillä. Mutta koska aktiiviset kohdat pyrkivät esiintymään makromolekulaarisessa entsyy-mirakenteessa olevissa syvennyksissä ja taitekohdissa, pääsy niihin on kokonaan tai osittain estetty, ja siten on jokseenkin vaikeata aikaansaada sähköinen yhteys, joka on riittävän tehokas luotettavan ja herkän signaalin kehittämiseksi. Elektronien siirtoa entsyymin ja elektrodin välillä voidaan kuitenkin edistää sisällyttämällä elektro-ninkantajaa tai "välittäjää", joka hapetetussa muodossa vastaanottaa elektroneja entsyymistä ja sitten pelkistetyssä tilassa siirtää ne elektrodille, jolla se hapettuu uudestaan.

Välittäjien käyttöä voidaan havainnollistaa vastikään kuvattujen bioantureiden avulla, joissa käytetään glukoosi-oksidaasia, joka on immobilisoitu hiilielektrodille. Eräs suoritusmuoto käyttää kovalenttisesti sitoutunutta entsyymiä, joka on immobilisoitu syanuurikloridimenetelmällä (Jonsson ja Gorton, 1985, Biosensors, 1, 355-369) jonka väitetään antavan hyvän stabiliteetin (useita kuukausia). Anturilla on kuitenkin vakavia epäkohtia siinä että käytetty välittäjä, N-metyyli-fenatsinium-ioni (fenatsiini-metosulfaatti), on pysymätön ja on myös helposti poispes-tävissä ja on käytössä korvattava päivittäin. Elektrodi on myös herkkä happikonsentraatiolle vaikkakin osoitettiin että sähkökemiallinenvälitys välittäjän kautta on kilpailukykyinen happipelkistysreaktion kanssa. Toinen bioanturi, jossa samoin on immobilisoitua glukoosioksidaasia, käyttää välittäjänä ferroseeniä tai sen jotain johdannaista: Cass et ai., 1984) Analyt. Chem. 5£, 667-673 ja EP-A-0 078 636. Elektronien siirto elektrodille välittäjän kautta tapahtuu seuraavasti: 4 88515 glukoosi + entsyymi[hapetettu]--->glukono-l,5-laktoni + entsyymi[pelkistetty] entsyymi[pelk.] + ferroseeni[hap.] ---> entsyymi[hap.] + ( ferrosinium-ioni) ferroseeni[pelk.] ferroseeni[pelk.] -(elektroni elektrodille)->ferrisinium- ioni Tämän elektrodin toiminnan mekanistiset yksityiskohdat eivät ole selviä: erityisesti ei ole selitetty miten ferroseenin erittäin liukenematon pelkistetty muoto siirtää varauksen elektrodille syklisen välittäjäaktivi-teetin ylläpitämiseksi (tätä huomautusta ei mahdollisesti voida esittää ionisia ferroseenijohdannaisia vastaan). Sen vaste on lisäksi melko hidas huomioon ottaen potentiaalisesti erittäin nopea vaste joka olisi odotettavissa ky seessä olevien entsyymireaktioiden tunnettujen nopeuksien perusteella, ja elektrodin kestoikä on rajallinen johtuen entsyymin rajallisesta stabiliteetistä.

Välittäjän käyttöön signaalinsiirrossa liittyy useita epäkohtia: mahdollisuus että se liukenee pois biokataly-saattorin sisältävältä alueelta, hapetettujen ja/tai pelkistettyjen muotojen rajallinen diffuusio ja itse välittäjän oma epästabiilisuus.

Ryhmä (c) - Suoran elektronisiirron (DET)-bioanturit

Mahdollisuus rakentaa bioanturia sisällyttämättä välittäjää on ehdotettu tuoreessa bioelektrokatalyysikat-sausteoksessa: Tarasevich (1985) Bioelectrochemistry 10, 231-295. Tällaisia laitteita voidaan kutsua "reagenssivapaiksi" tai "välittäjävapaiksi". Esimerkkejä välittäjävapaista entsyymielektrodeista on mainittu Tara- 5 8851 5 sevich'in katsauksessa, mutta niissä käytetään orgaanisia polymeerejä, esim. sisältäen metyyli-viologeeni-kal-taisia rakenneyksikköjä ja/tai johtavia orgaanisia suoloja, kuten NMP+TCNQ"(N-metyylifenatsinium-tetrasyano-4-ki-nodimetaania), jotka modifioivat elektrodien ominaisuudet ja täyttävät välittäjien tehtävät. Monet menetelmät, joissa elektroninsiirto tapahtuu redoks-proteiineista modifioitujen elektrodien kautta, kuuluvat tähän ryhmään.

Monille orgaanisille polymeereille ja suoloille ominainen epästabiilisuus on tunnettu. Niinpä NMP/TCNQ-modifioidun, alkoholibioanturissa käytetyn elektrodin aktiviteetin puoliintumisaika on noin 15 päivää. Tällaiset elektrodit ovat myös happiherkkiä.

Julkaistun aineiston perusteella näyttää siltä, että tähän mennessä on kehitetty vain harvoja puhtaasti välittäjäva-paita entsyymielektrodeja, vaikkain tiedossa on monia epäonnistuneita yrityksiä, joissa useimmiten käytetään hiiliperusteisia elektrodeja. Tuore kirjallisuus koskien glukoosioksidaasin käyttöä (Jonsson ja Gorton, loc. cit.) ehdottaa suurimman ongelman piileksivän entsyymin immobi-lisoinnissa, joka näyttää estävän sen elektronisiirtokyky-jä eteeristen tai muiden rajoituksien johdosta, siten tehden välittäjän sisällyttämisen välttämättömäksi.

On olemassa eräitä harvoja esimerkkejä erittäin aktiivisista oksidaaseista, jotka on immobilisoitu hiilellä tai platinalla. Esimerkiksi Ianiello et ai (1982) Analyt.

Chem. 54., 1098-1101 kuvaavat välittäjävapaita antureita, joissa glukoosioksidaasia ja L-aminohappo-oksidaasia on kovalenttisesti sidottu grafiittielektrodiin syanuuriklo-ridimenetelmällä. Entsyymielektrodeilla on kuitenkin rajallinen käyttöikä,joka on 20 - 30 vuorokautta: Ianiello ja Yacynych (1981) Analyt. Chem. 52, 2090-2095. Mitään tietoja elektrodien happiherkkyydestä ei anneta.

6 88515

Aikaisemmin on kuvattu lukuisia, edellä mainittujen periaatteiden mukaisesti toimivia bioantureita, erityisesti glukoosiantureita, ja edustava valinta näistä on jo esitelty; nyt kysymykseen tulevia tarkoituksia varten yhtä julkaisua on pidettävä erityisen relevanttina, nimittäin: Matsushita Electric Appliance Industry Company, japanilainen ei-tutkittu patenttijulkaisu no 56-163447. Tässä kuvataan epäsuoraa glukoosielektrodia, siis sellaista, jossa vetyperoksidi, joka tuotetaan glukoosin hapettuessa glukoosioksidaasin läsnäollessa: glukoosi + 02 --->glukonolaktoni + H2O2 entsyymi hapetetaan platinaelektrodin pinnalla: H2O2------> 2H+ + 2e” + 02 hapetusvirran tuottamiseksi, joka on verrannollinen näytteen sisältämän substraatin (glukoosin) pitoisuuteen. Elektrodi käsittää sähköisesti johtavan hiilikantajän, joka kantaa kerroksena immobilisoitua entsyymiä, esim. immo-bilisoitua glukoosioksidaasia. Sähköisesti johtava kantaja on itsessään valettua grafiittia, joka sisältää enintään 10 paino-osaa fluorihiilihartsia sideaineena, ja jolle on seostettu, esim. elektrolyyttisesti tai höyryllä, ohut (alle 1 /um) kalvo platinaa. Keksinnön avulla väitetään välttyvän ongelmista, jotka liittyvät entsyymin immobili-sointiin suoraan platinapinnalle, ja aikaansaadaan entsyy-mielektrodi, jolla väitetään olevan nopeat vasteajat (5 sekuntia), suuri herkkyys ja kestävyys. Vastikään suoritetut kokeet tällaisilla elektrodeilla eivät kuitenkaan ole vahvistaneet näitä etuja.

Näin ollen on edelleen olemassa tarve entsyymielektrodis-ta, erityisesti vaikkakaan ei yksinomaan, käyttöä varten 7 88515 glukoosibioantureissa, joka on luotettava ja toistettava, jolla on nopea vasteaika ja suuri herkkyys, ja jolla on pitkäaikainen stabiilisuus.

Keksinnön mukaisesti käytetään entsyymielektrodia varten uutta hiilisubstraattia, joka sallii entsyymin, esimerkiksi glukoosioksidaasin, kiinnittämisen elektrodiin edullisemmalla tavalla, ja joka sallii amperometrisen anturin rakentamisen, jolla on paljon parempi vaste ja stabiliteetti. Tässä parannetussa entsyymielektrodissa ei tarvitse käyttää välittäjä-reagenssia (vaikkakin se voidaan haluttaessa lisätä) ja sen on todettu toimivan erittäin alhaisten liuenneen hapen konsentraatioiden läsnäollessa. Se antaa suuren vasteen, esimerkiksi satojen mikroampeerien virtatiheyksiä kuutiosenttiroetriä kohti (elektrodin näennäispinta-ala) 10 mM:n glukoosiliuoksessa; tämän uskotaan olevan paljon suurempi kuin missään muussa aikaisemmassa amperometrisessa entsyymi-bioanturissa, ja sitä voidaan edullisesti käyttää valmistettaessa mikrosondi-bioantureita, joilla on alle 1 mm2:n elektrodipinta-ala tuottaen 0 - 100 nanoampeeria. Elektrodi voidaan myös rakentaa käyttäen erittäin pieniä määriä immobilisoitua entsyymiä. Se reagoi glukoosille paljon nopeammin kuin mikään muu tunnettu glukoosianturi, tyypillisesti 1-2 sekunnissa suojaavan membraanin poissaollessa, ja 10 - 30 sekunnissa membraanin kanssa. Sillä on huomattava stabiliteetti varastoitaessa sitä märkänä, jopa huoneen lämpötilassa; elektrodeilla on hyvä vaste myös useiden kuukausien jälkeen. Niillä on laajennettu käyttöalue, tarvitsevat normaalia huomattavasti alhaisem-man käyttöpotentiaalin (325 mV verrattuna tavallisempaan 650 mV), ja niillä on huomattavan alhainen tausta työpo-tentiaalissa.

'·* Tämän keksinnön perustana on entsyymielektrodi tai bioan turi, joka pystyy vastaamaan amperometrisesti entsyymin g 88515 katalyyttiselle aktiviteetille sen vastaavan substraatin läsnäollessa ja joka käsittää oksidoreduktaasientsyymin, joka on immobilisoitu tai adsorboitu sähköisesti johtavan tukielimen pinnalle, joka on hartsisidottujen hiili- tai grafiittipartikkeleiden huokoinen kerros tai joka sisältää sellaisen ja jotka partikkelit ovat kosketuksessa alkuainemuodossa olevan platinaryhmän metallin kanssa. Entsyy-mielektrodille on tunnusomaista, että alkuainemuodossa olevan platinaryhmän metalli on hienojakoisina partikkeleina tasaisesti dispergoituneena hartsisidotun hiili- tai grafiittikerroksen paksuudelle ja että mainitut partikkelit ovat mainitussa kerroksessa joko olennaisesti mainittujen hiili- tai grafiittipartikkeleiden ja mainitun hienojakoisen platinaryhmän metallin tasaisena sekoituksena, tai alkuainemuodossa olevan platinryhmän metallin hienojakoisina partikkeleina, jotka on esiadsorboitu hiili- tai grafiittihiukkasten pinnalle ennen sitomista mainitun hartsin kanssa.

Niinpä selvänä vastakohtana kerrostettuihin, ei-heterogee-nisiin platinoituihin hiilikantajiin, jotka on esitetty japanilaisessa julkaistussa hakemuksessa no 56-163447, keksinnön mukainen elektrodi muodostuu oleellisesti heterogeenisestä kerroksesta hartsisidottuja hiili- tai gra-fiittipartikkeleita tai sisältää näitä, jolloin mainittu platinaryhmän metalli on dispergoitu oleellisesti yhtenäisesti koko kerroksen läpi. Hartsisidottu hiilijauhekerros muodostetaan mieluimmin hartsisidotuista hiilijauhepartik-keleista, joille on saostettu tai adsorboitu kolloidaalista platinaa tai palladiumia ennen valamista substraatin muodostamiseksi. Edullisia hartsisideaineita käyttöä varten platinoitujen hiilipartikkeleiden valamiseksi keksinnössä käytetyn elektrodisubstraatin valmistamiseksi ovat fluorihiilihartsit, erityisesti polytetrafluorietyleeni.

9 88515

Hiili jauheena voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa hiili-tai grafiitti jauhetta, joka helposti sallii entsyymin myöhemmin tapahtuvan immobilisoinnin, ja tätä tarkoitusta varten tulisi käyttää hiili jauheita, joilla on suuri tiheys funktionaalisia ryhmiä, kuten karboksylaatti-, amino-ja rikkipitoisia ryhmiä, pinnalla, vastakohtana lasimai-sempiin hiililaatuihin, jotka sitovat entsyymejä vain huonosti. Partikkelikoko voi vaihdella välillä 3-50 nm, yleensä 5-30 nm.

Platina (tai palladium) voidaan levittää hiilipartikke-leille mielivaltaisella sopivalla tavalla, esim. höyry-faasisaostamalla, sähkökemiallisesti seostamalla tai yksinkertaisesti adsorboimalla kolloidaalisesta suspensiosta (mikä on edullista) platinaryhmän metallin kuormituksen aikaansaamiseksi, joka on 1 - 20 paino-% hiilestä laskettuna, edullisesti 5 - 15 %. Nämä rajat ovat kuitenkin lähinnä käytännöllisiä, eivätkä kriittisiä, Alle noin 1% platinaryhmän metallia, lähtösignaali laskee tasolle, joka käytännön tarkoituksia varten on liian alhainen mitattavaksi paitsi käyttäen erittäin herkkää laitetta. Yli noin 20%, platinaryhmän metallin kuormitus tulee epätalou- delliseksi lisähyödyn ollessa vähäinen mitä tulee vasteai- kaan, herkkyyteen jne. Itse asiassa, kun metallikuormitus on erittäin suuri, herkkyys alkaa laskea. Edullisessa menetelmässä hiili jauhe platinoidaan tai palladoidaan platina- tai palladiumyhdisteen, kuten klooriplatinahapon, tai edullisemmin, hapettuvan ligandin sisältävän platina-tai palladiumkompleksin hapettavalla hajoamisella, hiili-jauheen läsnäollessa, kolloidaalista kokoa olevan platinan tai palladiumin levittämiseksi suoraan hiilipartikkeleiden pinnalle, kuten on selitetty esimerkiksi julkaisuissa GB-A-1,357,494, US-A-4,044,193 ja US-A-4,166,143.

Platinoinnin tai palladisoinnin jälkeen platinoitu tai palladisoitu hiili jauhe muotoillaan käyttämällä sopivaa 1» 8851 5 vettähylkivää sidehartsia, mieluimmin fluorihiilihartsia, kuten polytetrafluorietyleeniä, joko täysin itsekantavan huokoisen muotoillun rakenteen valmistamiseksi, joka koostuu oleellisesti mainituista hartsisidotuista platinoiduista tai palladisoiduista hiilijauhepartikkeleista, tai tavallisemmin, tällaisten hartsisidottujen partikkeleiden huokoisesta muotoillusta pintakerroksesta, joka on sidottu sähköisesti johtavaan substraattiin, esimerkiksi metallista, hiilestä tai grafiitista. Erityisen edullinen subs-traattimateriaali muotoiltua, hartsisidottua platinoitua hiilikerrosta varten on hiilipaperi, kuten on esitetty julkaisussa US-A-4,229.490, tai avohuokoinen hiilikudos, kuten on esitetty julkaisussa US-A-4,293,396. Maksimaalisen huokoisuuden ylläpitämiseksi tulisi sideaineena käytetyn hartsimäärän olla mahdollisimman pieni elektrodiker-roksen mekaanisen eheyden ja stabiliteetin aikaansaamiseksi, jolloin tällaisen kerroksen paksuus harvoin on suurempi kuin noin 0,1 - 0,5 mm, vaikkakin suurempia paksuuksia voidaan käyttää. Ottaen huomioon rakenteellisen eheyden, mekaanisen lujuuden ja huokoisuuden asettamat vaatimukset sidehartsin määrät eivät ole kriittisiä, ja ne voivat vaihdella jopa niinkin pienestä määrästä kuin 5 tai 10 paino-%, laskettuna platinoidun tai palladisoidun hiili-jauheen määrästä, aina jopa 80 %:iin asti, määrän ollessa yleensä alueella 30 - 70 paino-%. Voidaan käyttää mitä erilaisimpia hartseja, mukaanluettuna johtavat tai puoli-johtavat hartsit, mutta edullisimpina pidetään synteettisiä fluorihiilihartseja, erityisesti polytetrafluorietyleeniä. Ottaen huomioon pieni mutta välttämätön hapen tarve hapetusprosessissa on olennaista että sidehartsi on happea läpäisevä. Tätä tarkoitusta varten sideaineen liukoisuus happeen nähden tulisi olla mahdollisimman pieni atmosfääripaineessa, joka on ainakin 2 x 10_3 cm3 O2 (mitattuna standardilämpötilassa ja -paineessa) polymeerin cm3 kohti.

11 8851 5

Sopivia sideaineita ja niiden tunnettuja happiliukoi-suuksia julkaisun The Polymer Handbook mukaan (Ed. J. Brandrup ja E.H. Immergut) 1 painos (1967), Interscien-ce, ovat: S x lO^ (cm^)

Polytetrafluorietyleeni (PTFE) 0,276

Fluorihiilipolymeerit, muut kuin PTFE vaiht. 0,2 ylös Polyetyylimetakrylaatti 8,6

Polystyreeni 18,2 (lask.)

Polyvinyyliasetaatti 6,3

Polyvinyylikloridi 2,92

Polykarbonaatti 0,51

Poly(4-metyylipenteeni-l) 24,3

Polyisopreeni 10,3

Polykloropreeni 7,5

Poly-1,3-butadieeni 9,7

Silikonikumi 31,1

Keksinnön mukaisesti käytettävät edullisemmat entsyymi-elektrodisubstraatit ovat itse asiassa kaupallisesti saatavia aineita, joita myydään tavaramerkillä Prototech, Prototech Company, Newton Highlands, Massachussets, ja niitä on aikaisemmin käytetty sähkökatalyyttisinä kaasu-diffuusioelektrodeina polttoainekennoissa. Tällaisten aineiden valmistus on selitetty yksityiskohtaisesti julkaisuissa US-A-4,044,193, US-A-4,166,143, US-A-4,293,396 ja US-A-4,478,696, joihin viitataan kaikkien yksityiskohtien osalta. Lyhyesti kuitenkin adsorboidaan kolloidaalista platinaa, jonka partikkelikoko on alueella 15 - 25 Angstrom (1,5 - 2,5 nm) hiili jauheen pinnalle (partikkeli-koko 50 - 300 Angstrom: 5-30 nm), esimerkiksi muodostamalla platinasooli in situ jauhemaisen hiilen läsnäollessa, joka toimii soolin ymppiaineena. platinoidut hiilipar-tikkelit valetaan sitten sähköisesti johtavalle kantaja- rakenteelle, esim. hiilipaperiarkille, käyttäen synteet tistä hartsisideainetta, edullisesti fluorattua hiilivety- hartsia, ja erityisesti polytetrafluorietyleeniä.

12 8851 5

Erään vaihtoehdon mukaan, joka on selitetty julkaisussa US-A-4,293,396, platinoidut hiilipartikkelit kyllästetään esivalmistettuun huokoiseen hiilikudokseen ja sidotaan siihen käyttäen fluorihiilihartsia, edullisesti polytetrafluorietyleeniä. On kuitenkin ymmärrettävä, että tämä keksintö ei ole rajoittunut Prototech-materiaalien käyttöön, vaan käsittää muut samantyyppiset substraattima-teriaalit, jotka sisältävät hartsisidottua ja muotoiltua platinoitua tai palladisoitua hiili jauhetta. Erityisesti on ajateltu että voidaan käyttää myös sellaisia aineita, joita on kuvattu polttoainekennoelektrodeina julkaisussa US-A-4,229,490, siis sellaisia hiilipaperielektrodeja, joissa on hiilipaperikantajaelin, joka mieluimmin on kyllästetty vettähylkivällä hartsilla, kuten polytetrafluo-rietyleenillä, ja jolle levitetään, esimerkiksi screen-painolla hartsisidottu katalysaattorikerros, joka sisältää platinamustan ja hiili- tai grafiittipartikkeleiden yhtenäisen kerroksen, jotka partikkelit on sidottu vettähylkivällä sideaineella, erityisesti taas polytetrafluoriety-leenillä.

Entsyymin immobilisointi hartsisidotun, platinoidun tai palladisoidun hiilisubstraatin pinnalle voidaan suorittaa käyttämällä erilaisia tunnettuja immobilisointimene-telmiä, esimerkiksi kovalenttista sitomista karbodi-imidi-tai karbonyylidi-imidatsolireagenssin kanssa, kovalenttista sitomista 1,6-dinitro-3,4-difluori-bentseenin (DFDNB) kanssa tai ristisitomista glutaraldehydin kanssa.

Tyypillisiä esimerkillisiä ohjekaavoja entsyymin, glu-koosioksidaasin, immobilisoimiseksi, ovat seuraavat: 13 88515 A. Karbodi-imidikäsittely: 1. Leikkaa sopivankokoisia elektrodipaloja Prototech-elektrodimateriaaliarkista.

2. Upota elektrodit etanoliin noin 5 minuutiksi PTFE-päällystetyn sideaineen ja rungon täydellisen kastumisen varmistamiseksi.

3. Poista elektrodit etanolista ja pese huolellisesti tislatulla vedellä etanoli jäännösten poistamiseksi.

4. Valmista 5 ml (tai vähemmän) l-sykloheksyyli-3- 2-morfolino)karbodi-imidi-p-metyylitolueenisulfonaatin 0. 15.M liuos 0,1 M pH 4,5 asetaattipuskurissa ja sijoita elektrodit tähän 90 minuutiksi huoneen lämpötilassa. Varovaista sekoitusta mekaanisella sekoittajalla voidaan käyttää. Jos elektrodit kelluvat liuoksen pinnalla niitä ei ole kostutettu riittävästi, ja käsittely tulisi toistaa vaiheesta 2.

5. Poista elektrodit ja pese ne huolellisesti tislatulla vedellä. Aseta ne vastavalmistettuun glukoosioksidaasi-liuokseen (5,0 mg/ml) pH 5,6 asetaattipuskurissa 90 minuutiksi huoneen lämpötilassa samalla lievästi sekoittaen mekaanisesti.

6. Poista elektrodit entsyymiliuoksesta ja huuhtele ne huolellisesti 0,1 M asetaattipuskurilla. Elektrodit ovat nyt valmiita käyttöä varten.

7. Säilytä elektrodit 4°C:ssä 0,1 M pH 5,6 asetaattipuskurissa.

B. Karbonyylidi-imidatsoli-käsittely 1. Suorita vaihe 1 edellä ja jätä pois vaiheet 2 ja 3.

2. Valmista N,N'-karbonyylidi-imidatsolin liuos vedettömässä dimetyyliformamidissa (40 mg/ml).

3. Sijoita elektrodit tähän liuokseen 90 minuutiksi huoneen lämpötilassa samalla haluttaessa varovasti me- 14 8851 5 kaanisesti hämmentäen.

4. Poista elektrodit liuoksesta ja kuivaa pois ylimääräinen karbonyylidi-imidatsoliliuos ennen niiden sijoittamista vastavalmistettuun glukoosioksidaasiliuokseen vielä 90 minuutiksi.

5. Suorita vaiheet 6 ja 7 edellä.

C. DFDNB-käsittely 1. Suorita vaiheet 1-3 kohdasta A edellä.

2. Pese elektrodit huolellisesti natriumboraattipuskurissa (0,1 M pH 8,5).

3. Valmista l,6-dinitro-3,4-difluoribentseenin liuos me-tanoliin (0,1021 g/5 ml) ja sijoita elektrodit tähän 10 minuutiksi huoneen lämpötilassa.

4. Poista elektrodit ja pese ne huolellisesti boraatti-puskurissa ennen niiden sijoittamista glukoosioksidaasiliuokseen vielä 90 minuutiksi huoneen lämpötilassa.

5. Suorita vaiheet 6 ja 7 kohdasta A edellä.

Immobilisointimenetelmässä voidaan käyttää muuntyyppisiä kytkentäaineita, mukaanlukien vaihtelevan ketjupituuden omaavia bifunktionaalisia aineita, esimerkiksi di-imidaatteja, kuten dimetyylimaloni-imidaattia tai dime-tyylisuberimidaattia.

Vaihtoehtoisesti on todettu että entsyymin yksinkertainen adsorptio hartsisidottuun platinoituun tai palla-disoituun hiilijauhekantajaan, siis ilman ristikytken-tää, on tehokas joidenkin entsyymien, ja erityisesti glukoosioksidaasin kanssa.

Tavallisesti, mutta ei välttämättä, on immobilisoidun entsyymin pintakerros fyysisesti suojattu sopivalla huo koisella, esimerkiksi polykarbonaattikalvolla tai 15 8851 5 -membraanilla, jonka luonnollisesti tulee olla määritettävään entsyymisubstraattiin (glukoosiin) nähden läpäisevä. Tällaiset membraanit vaikuttavat jonkin verran epäedullisesti nostaen anturin vasteaikaa, mutta siitä huolimatta jopa tällaisella membraanilla kyseisillä antureilla on vasteajat, jotka ovat verrattavissa tavallisiin entsyymielektrodeihin ja joissakin tapauksissa ovat huomattavasti parempia.

Kuten jo mainittiin keksintö koskee erityisesti glukoo-sioksidaasielektrodeja, siis sellaisia, joissa immobili-soitu entsyymi on glukoosioksidaasi, mutta on selvää että voidaan käyttää muita oksidoreduktaaseja vaikkakaan ei aina ekvivalenttisella tehokkuudella. Tämä ei välttämättä johdu entsyymin omasta tehottomuudesta, vaan muista tekijöistä. Esimerkiksi määritettäessä oksaalihappoa käyttäen oksalaattioksidaasia itse oksaalihapposubstraatti läpikäy sähkökemiallisen hapettumisen kantaelektrodilla siten peittäen suurelta osin entsyymin mahdollisen vaikutuksen. Muita sopivia oksidoreduktaaseja ovat laktaattioksi-daasi, galaktoosioksidaasi, kolesterolioksidaasi ja muut peroksidia tuottavat entsyymit, samoinkuin immobilisoitu-jen entsyymien kombinaatiot, mukaanlukien ei-oksidaasin ja oksidaasin kombinaatiot, jolloin ensimmäinen vaikuttaa kyseiseen substraattiin tuottaen hapetettavissa olevan substraatin oksidaasia varten, ja jolloin viimemainittu vaikuttaa hapetettavissa olevaan tuotteeseen mitattavissa olevan virran tuottamiseksi, joka on verrannollinen kyseisen substraatin konsentraatioon. Eräs tällainen kombinaatio on beta-galaktosidaasin ja glukoosioksidaasin yhdistelmä (laktoosin kvantitatiivista määritystä varten), tai beta-glukaania depolymeroivan entsyymin, beta-glukosidaa-sin ja glukoosioksidaasin yhdistelmä (beta-glukaanien määrittämiseksi).

ie 8851 5

Muuntyyppiset anturikäytöt käsittävät entsyymisten tai ei-entsyymisten reagenssien tai menetelmien käytön, jotka reagoivat mielenkiinnon kohteena olevan primäärisen substraatin kanssa prekursorireaktiossa, jolloin muodostuva tuote sisältää aineen, joka puolestaan toimii substraattina keksinnön mukaista entsyymielektrodia varten. Immunokemiallisten reaktioiden alalta löytyy useita esimerkkejä tällaisista prekursorivaiheista ja alan asiantuntijat tuntevat menetelmät tällaisten reaktioiden käyttämiseksi antureiden, mukaanlukien immunoantureiden rakentamisessa käyttämällä keksinnön mukaisia entsyymielektro-de ja.

Keksinnön mukaisten elektrodien ensisijainen käyttö on kuitenkin bioantureina hapetettavissa olevien substraattien, erityisesti glukoosin ilmaisemiseksi ja/tai kvantitatiiviseksi määrittämiseksi, näytteessä, erityisesti kliinisessä näytteessä, kuten veressä, seerumissa, plasmassa, virtsassa, hiessä, kynelnesteessä ja syljessä.

Muita mahdollisia, ei-kliinisiä sovellutuksia ovat: (a) käymisprosessin seuranta (b) teollinen prosessinohjaus (c) ympäristön seuranta, esim. nesteiden tai kaasujen jäte- ja saastekontrolli (d) elintarvikkeiden testaus (e) eläinlääketieteelliset sovellutukset, erityisesti sovellutukset, jotka liittyvät edellä ehdotettuihin kliinisiin sovellutuksiin.

Jos keksinnön mukaisen entsyymielektrodimateriaalin sisältävät bio- ja muut anturit voivat sisältää muita rakenteellisia elementtejä, sähköjohtoja, sähköisesti ei-johtavia (eristäviä) kannattimia tai sondeja jne., tällaiset elementit rakenteessa ovat konventionaalisia eikä 17 8851 5 niitä tarvitse selittää yksityiskohtaisesti. Jos, kuten asianlaita yleensä tulee olemaan, elektrodimateriaali on paperinohut arkki tai liuska riittää että bioanturi yleensä sisältää eristävän kannatinelimen tai sondin, joka kannattaa elektrodimateriaalin ja jonka avulla elektrodi-materiaali voidaan sijoittaa näytteeseen. Tällaisissa tapauksissa elektrodimateriaalikappaleen varsinainen koko voi olla hyvin pieni, ei suurempi kuin muutama neliömilli-metri, tai jopa pienempi. Sähkökontakti elektrodimateriaalin kanssa voidaan aikaansaada monella tavalla, esimerkiksi asentamalla elektrodimateriaali pinta pintaa vasten-kontaktiin sähköisesti johtavan koskettimen tai navan kanssa, joka on esim. platinaa, hopeata tai jotakin muuta sopivaa johtavaa ainetta. Tapauksissa, joissa elektrodimateriaali on riittävän paksu ja luja ollakseen täysin itse-kantava, voidaan jättää pois eristävät tukielimet tai kantajat elektrodimateriaalia varten, ja sähköjohdot yhdistetään suoraan elektrodimateriaalin pintaan.

Muita kuin hiilipaperia olevia kannatinelimiä voidaan käyttää tällaisena sähköisesti puolijohtavana pintana, esimerkiksi kanavatransistorin (FET) pintaa, tai sähköisesti ei-johtavaa pintaa. Viimemainitussa tapauksessa voidaan sähkökontakti tehdä suoraan platinaryhmän metallin hartsisidottuun hiili- tai grafiittikerrokseen.

Tämän keksinnön mukaisten entsyymimateriaalien valmistusta ja niiden ominaisuuksia on havainnollistettu seu-raavissa esimerkeissä.

Esimerkki 1: (Vertaileva)(Tekniikan taso) . . Valmistettiin tekniikan tason mukainen entsyymielektrodi ; saostamalla elektrolyyttisesti ohut kerros (<1 /um) pla- ·'·* tinaa sähköisesti johtavan kantajan pinnalle, joka koos- ie 8851 5 tul huokoisesta hartsisidotusta hiilipaperista, jossa oli johtavia hiilimustarakeita (Vulcan XC-72), joiden nimel-lispartikkelikoko oli 30 nm ja jotka oli valettu kaupallisesti saatavalle grafitoidulle hiilipaperiarkille käyttäen 10 paino-% polytetrafluorietyleeniä sideaineena.

Glukoosioksidaasia Aspergillus niqer'istS immobilisoi-tiin platinoidun hiilipaperin eri näytteiden pinnalle edellä mainittua karbodi-imidikäsittelyä käyttämällä, ja ristisitomalla glutaarialdehydillä käsittelemällä elektrodin platinoitua pintaa vesipitoisella glukoosioksidaa-siliuoksella, kuivaamalla ja sen jälkeen ristisitomalla saostettu entsyymi saattamalla se alttiiksi glutaarial-dehydille 25°C:ssa.

Jälkeenpäin seuraavaa testausta varten elektrodimateri-aali leikattiin halkaisijaltaan 2 mm:n kiekoiksi.

Esimerkki 2: Glukoosielektrodi

Glukoosioksidaasia Aspergillus niger’ista immobilisoi-tiin platinoidulle hiilipaperille, jota myydään kauppanimellä "Prototech", Prototech Co. Massachussetts, USA, ja joka käsittää platinoituja hiilijauhepartikkeleita (Vulcan XC-72), jotka valmistetaan julkaisun US-A-4,044, 193 esimerkin 1 mukaisesti seostamalla kolloidaalista platinaa (partikkelikoko 1,5 - 2,5 nm) hiili jauheen (nimel-lispartikkelikoko 30 nm) pinnalle kompleksisen platinasul-fiittihapon (II) hapettavalla hajoamisella käyttäen H2C>2:ta, ja sen jälkeen valamalla ja sitomalla platinoitu hiilijauhe kaupallisen, grafitoidun hiilipaperin pinnalle käyttäen noin 50 paino-% polytetrafluroetyleeniä. Platinan määrä lopullisessa tuotteessa on 0,24 mg cm”2.

Glukoosioksidaasia immobilisoitiin eri näytteille Prototech-materiaalia edellä mainittuja käsittelymenetel- 19 8851 5 miä käyttäen, siis käsittelemällä karbodi-imidillä, karbo-nyylidi-imidatsolilla ja DFDNB-käsittelyllä.

Erillisissä kokeissa glukoosioksidaasia immobilisoitiin Prototech-materiaalille ristisitomalla glutaarialdehy-dillä, ja yksinkertaisella adsorptiolla, siis ilman ris-tisitomista, suspendoimalla Prototech-materiaali vasta-valmistettuun glukoosioksidaasiliuokseen (5,0 mg ml“l) pH 5,6 asetaattipuskurissa 90 minuutiksi huoneen lämpötilassa. Vaihtoehtoisesti voidaan entsyymin adsorptio sopivasti aikaansaada elektroforeesimenetelmällä, jota tarkoitusta varten elektrodikantajamateriaali suspendoidaan positiivisella potentiaalilla entsyymiliuokseen 60 minuutiksi .

Esimerkki 3; Käyttämällä edellä selostettua karbodi-imidikäsittelyä immobilisoitiin seuraavat entsyymit platinoidulle hiili-paperille Prototech'iltä, siis PTFE-sidotulle hiilipape-rille, joka oli valmistettu esiplatinoidusta hiili jauheesta (US-A-4,044,193): laktaattioksidaasi galaktoosioksidaasi glukoosioksidaasi/beta-galaktosidaasi.

Keksinnön etujen ja keksinnön mukaisten entsyymimateri-aalien ominaisuuksien havainnollistamiseksi edelleen verrattuna aikaisemmin tunnettuihin elektrodeihin, edellä mainittujen esimerkkien mukaisetsi valmistetut entsyymimateriaalit testattiin amperometrisen vasteen suhteen kennossa, jossa oli modifioitu Rank-happielektrodi-systeemi (Rank Brothers, Bottisham, Cambridge) joka on esitetty oheisessa piirustuksessa ja myös julkaisussa Ana-lytica Chimica Acta, 183 (1986) 59-66. Tässä systeemissä 20 3851 5 membraani korvataan keksinnön mukaisella hiilipaperient-syymielektrodilla (5 mm halk.) joka kiinnitettiin platina-nappielektrodiin. vastaelektrodi (platinakalvo) asennettiin kennon kannen läpi. Vertailuna käytettiin hopea-hopeakloridi-elektrodia. Joissakin testeissä (käyttäen suojavaa membraania, ja sekoittamatonta liuosta) käytettiin 2-elektrodi-rakennetta? vasta/vertailuelektrodi oli ympäröivä kloridisoitu hopearengas. Yleensä testiliuokset pH-arvo 7,0 puskurissa hämmennettiin magneettisesti, samalla kun työelektrodi pidettiin 600 mV:n potentiaalissa vertailuun nähden potentiostaatin avulla. Käytettäessä 2-elektrodirakennetta käytettiin 325 mV:n potentiaalia. Annettiin ensin taustavirran riittävän pitkän aikaa laskea alhaiselle tasolle, minkä jälkeen substraattiliuosta injektoitiin ruiskeella. Virtavaste rekisteröitiin piirturille.

Saadut tulokset selitetään yksityiskohtaisesti jälempänä seuraavassa ja ne esitetään graafisesti oheen liitetyssä piirustuksessa, jossa kuvio 1 esittää keksinnön mukaisen glukoosioksidaa-sielektrodin vastetta verrattuna glukoosioksidaasiin, joka on immobilisoitu muihin tyyppisiin hiilielektrodeihin; kuvio 2 on ensimmäinen kaaviokuva, joka esittää glu-koosioksidaasielektrodin stabiliteettia; kuvio 3 on toinen kaaviokuva, joka esittää glukoosi-oksidaasielektrodin vastetta eri glukoosikonsentraatioil-lej kuvio 4 on kaaviokuva, joka esittää glukoosioksidaa-sielektrodin vastetta vaihtelevissa ympäristön hapen paineissa; kuvio 5 on kaaviokuva, joka esittää huoneen lämpötilassa tapahtuvan varastoinnin vaikutusta glukoosioksidaasielektrodiin; 2i 8851 5 kuvio 6 on vertaileva kaaviokuva, joka havainnollistaa huoneen lämpötilassa tapahtuvan varastoinnin vaikutusta tekniikan tason elektrodiin; kuvio 7 esittää vertailua tämän keksinnön mukaisen glutaarialdehydillä immobilisoidun glukoosioksidaasie-lektrodin ja tekniikan tason mukaisen glutaarialdehydillä immobilisoidun glukoosioksidaasielektrodin vasteiden välillä; kuvio 8 vastaa kuviota 7, mutta siinä on käytetty karbodi-imidi-immobilisointia; kuvio 9 esittää vertailua keksinnön mukaisen karbodi-imidi-immobilisoidun laktaattioksidaasielektro-din ja tekniikan tason mukaisen karbodi-imidi-immobilisoidun laktaattioksidaasielektrodin vasteiden välillä; kuviot 10 ja 11 esittävät vastaavasti tämän keksinnön mukaisten galaktoosioksidaasi- ja laktaattioksidaa-sielektrodien vasteprofiileja; kuvio 12 esittää keksinnön mukaisen yhdistetyn glukoosioksidaasi/beta-galaktosidaasi-elektrodin vasteprofiilia; kuvio 13 esittää keksinnön mukaisen glukoosioksidaasielektrodin vasteprofiilia, jossa käytetään polyvinyyli-asetaattia sideaineena platinoitua hiili jauhetta varten polytetrafluorietyleenin sijasta; kuvio 14 esittää keksinnön mukaisen glukoosioksidaasielektrodin vasteprofiilia, jossa glukoosioksidaasi on immobilisoitu hiilipaperielektrodille, joka käsittää hartsisidotun (polytetrafluroetyleeni) palladisoidun hiilijauheen pintakerroksen; kuvio 15 esittää modifioitua Rank-sähkökemiallista kennoa jota käytetään keksinnön mukaisten elektrodien käyttötunnusmerkkien määrittämiseksi; kuvio 16 esittää kaksi-elektrodirakennetta, jota käy-tetään joitakin määrityksiä varten.

O Q Cj c

22 O o ! D

Viitataan ensin kuvioon 15, koska suuri osa tässä esitetyistä tiedoista saatiin käyttämällä kuvion 15 mukaista sähkökemiallista kennoa. Tämä käsittää kaksiosaisen kennon, jossa on kanta (1) ja rengasmainen vaippa (2) joka rajaa vesikammion (h), jonka läpi voidaan kierrättää vettä kennon lämpötilan säätämiseksi, jolloin molemmat osat on yhdistetty keskenään tarttuvalla kierteisellä kaulusosalla (3). Keskeisesti kannassa (1) on platinakosketin (d) jolle asennetaan immobilisoidun entsyymin sisältävän paperielek-trodimateriaalin koekiekko (a) ja joka pidetään paikoillaan platinakoskettimen päällä O-renkaan muotoisten kumi-tiivisteiden (e) ja (f) avulla kun kennon molemmat osat on yhdistetty.

Kennon yläosaan, joka tietysti tulee sisältämään entsyy-misubstraattiliuoksen, on sijoitettu tulppa (4), jota kannattaa säädettävissä oleva kaulusosa (g) ja jossa on asennettuna platinavastaelektrodi (b) ja Ag/AgCl-vertailu-elektrodi (c). Kuten mainittiin, testit suoritettiin pitämällä työelektrodi arvossa 600 mV, jolloin virtateho mitattiin elektrodista, jonka näennäinen, substraatille altis pinta-ala oli 0,14 cm2. Tulokset on esitetty kuvioissa virtatiheytenä, siis virran tehona substraatille alttiin elektrodin pinta-alaa kohti.

Viitataan kuvioon 16, jossa platinakosketin (B) on vertailu/vasta-elektrodin (C) ympäröimänä, ja erotettu siitä eristävällä hoikilla (G). Huokoista polykarbonaat-timembraania, joka on asennettu "0"-renkaalle, käytetään koekiekon (E) (immobilisoidun entsyymin sisältävä pape-rielektrodimateriaali) pitämiseksi platinakoskettimella. Avoin näytekammio (F) sallii näytteiden tiputtamisen membraanille. Elektrodikenno on polarisoitu 325 mV:ssa ja virta seurataan potentiostaatilla (A). 325 mVsssä olevan 2-elektrodirakenteen käyttämisellä on etuja tavalliseen 600 mV:ssä olevaan 3-elektrodikennoon nähden, ni- 23 8851 5 mittäin se on helpompi käyttää ja sillä on alhaisempi taustavirta. Kuitenkin toisen systeemin valitseminen toisen sijasta ei vaikuta keksinnön mukaisten elektrodien toimintatunnusmerkkeihin, kuten varastointistabiliteet-tiin, käyttöstabiliteettiin, vasteen lineaarisuuteen tai happiriippuvaisuuteen.

Saadut tulokset selitetään yksityiskohtaisemmin seuraa-vassa.

Vasteiden lineaarisuus ia aikariippuvaisuus

Oheenliitetyn piirustuksen kuviossa 1 on esitetty tyypillisiä esimerkkejä elektrodivasteesta lisättäessä vähitellen glukoosia, niin että lopulliset konsentraatiot ovat alueella 0-35 mM, käyttäen 3-elektrodikennoa ja sekoittaen. Kaikilla kolmella elektrodilla A, B ja C oli glukoosioksidaasia immobilisoituna edellä mainitulla menetelmällä A. Elektrodi A käsitti keksinnön mukaisen aktivoidun platinakantajan, siis hartsisidotun (polytetra-fluorietyleeni) platinoidun hiili jauheen valettu arkki, jota myydään tavaramerkillä Prototech; elektrodi B käsitti sähköisesti johtavan kantajan, joka oli leikattu grafiit-tisauvan osasta; elektrodi C käsitti sähköisesti johtavan kantajan, joka oli leikattu kaupallisesti saatavasta ei-platinoidusta hiilipaperista. Kuten nähdään antoivat elektrodit B ja C pienemmät, suhteellisen hitaat vasteet, jotka muistuttavat niitä tuloksia jotka saadaan kirjallisuudessa yleisesti esitetyillä välittäjäantureilla. Elektrodi A antoi luotettavammat ja vakaammat vasteet, vasteajan ollessa noin 1 sekunti. ("Piikki" signaalissa, joka havaitaan alkuperäisen vasteen yläosassa, on merkityksetön ja osittain seuraus ruiskutusmenetelmästä; glukoosiriippu-vainen tasanne on mielenkiinnon kohteena oleva signaali). Kaikki kolme elektrodia antoi suhteellisen lineaarisen 24 8851 5 vasteen glukoosikonsentraatioon nähden (kuvio 2, tulokset esitetty vain A:lle, C:lle). Tämä kattaa sen alueen, joka tarvitaan glukoosin suoraa analyysiä varten verestä (1 -30 mM). Vastaavanlaiset tulokset, jotka on saatu tyyppiä A olevilla elektrodeilla käyttäen immobilisointimenetelmää B, viittaavat siihen että tämä menetelmä antaa vielä paremman lineaarisuuden laajenetulla alueella.

Kuten nähdään kuviosta 2, oli elektrodin A vaste käytännöllisesti katsoen muuttumaton 23 vuorokauden jälkeen, mutta muiden vasteet huononivat ajan myötä (kuten esitetty elektrodille C). Tämän tyyppinen käyttäytyminen havaittiin myös muille, edellä kuvatuille immobilisointimenetelmille, joita kaikkia voitaisiin käyttää herkkien ja stabiilien elektrodien valmistamiseksi Asta varten käytetyllä hiili-materiaalilla, mutta antoivat ei-tyydyttäviä elektrodeja monella muulla inaktiivisella hiilimateriaalilla. A:n vasteaika oli myös muuttumaton 23 vuorokauden jälkeen, kun taas muut elektrodit osoittivat vasteajan lisäyksen, alkuperäisten vasteaikojen ollessa noin 23 - 30 sekuntia, jotka kasvoivat 8 vuorokauden kuluttua 2-3 minuutiksi. Aktiivisilla elektrodeilla (kuten A) esiintyi yleensä jonkin verran laskua vasteessa ensimmäisen päivän aikana, mutta vaste saavutti sen jälkeen tason aikaan nähden. Tyyppiä A olevat elektrodit jotka varastoitiin märkänä (pH 5,6) 4°C:ssa ja testattiin aika ajoin 6 kuukauden jakson aikana muuttuivat vain vähän (ensimmäisten päivien jälkeen) ja vaikkakin esiintyi hieman asteettaista huononemista tämän ajan jälkeen, vaste 12 kuukauden jälkeen oli vielä 70% alkuperäisestä arvosta.

Kuviot 1 ja 2 esittävät elektrodin virtatehoa /u cm-2 käyttöpotentiaalissa 600 mV käyttäen kuvion 15 mukaista 3-elektrodirakennetta.

25 88515

Nyt kysymyksessä olevien elektrodien pidennettyä varastointi-ikää ja -stabiliteettiä havainnollistetaan kuviossa 5, jossa esitetään karbodi-imidi-immobilisoidun glukoosioksidaasielektrodin vaste 5 mM glukoosiin nähden varastoinnin jälkeen pH 5,6 asetaattipuskurissa huoneen lämpötilassa 180 vuorokautta kestävän ajanjakson aikana. Kuviossa 6 esitetään vertailevat tulokset tekniikan tason elektrodille (Esimerkki 1). Kuvion 5 mittaukset tehtiin 600 mV:ssä 3-elektrodisysteemillä ja kuvion 6 325 mV:ssä 2-elektrodirakenteella.

Lisävertailuja tekniikan tason mukaisten elektrodien (esimerkki 1) ja keksinnön mukaisten elektrodien välillä käyttäen erilaisia entsyymejä ja erilaisia immobiIisointimene-telmiä on esitetty kuvioissa 7-9, jossa kaikki mittaukset tehtiin 325 mV:ssa.

Vastekäyrät laktaatille, galaktoosille ja laktoosille (yhdistetty glukoosioksidaasi ja beta-galaktosidaasi) on esitetty kuviossa 10 - 12. Nämä mittaukset on tehty 600 mV:ssä.

Elektrodin uudelleenkäyttö: Sopivuus toistettavia ..· määrityksiä varten_

Jatkuvan kuormituksen alaisina tämän keksinnön mukaiset elektrodit osoittivat poikkeuksellista kestoa, jota ei ole aikaisemmin esitetty. Tätä havainnollistettiin seu-raavalla sarjalla vaativia kokeita.

Ensin sijoitettiin glukoosioksidaasielektrodi (esimerkki 2) suljettuun kennoon ja annettiin sen reagoida ampero-metrisesti hämmennettyyn glukoosiliuokseen nähden (alku-konsentraatio 5 mM, alkuvirta 100 /uamp). Sitä käytettiin .jatkuvasti 18 tuntia, jona aikana signaali vähitellen las- 26 8851 5 ki arvoon alle 10/uamp. Tuotettu kokonaissähkö vastasi noin 75% teoreettisesti odotetusta (perustuen 2 luovutettuun elektroniin glukoosimolekyyliä kohti). Tämä koe toistettiin välittömästi samalla elektrodilla uudistamalla glukoosiliuos, jonka jälkeen alkuvirta asetettiin uudestaan ja substraatin määritys jatkuvan kuormituksen alla antoi identtiset tulokset.

Seuraavassa kokeessa sähköntuotto käyttäen samaa elektrodia jatkettiin vielä 5,7 vrk, mutta syöttämällä glukoo-siliuosta kierrättämällä suuresta säiliöstä 5 mM:n kon-sentraation ylläpitämiseksi. Teho laski vähitellen 100 tunnin kuluessa mutta stabiloitui sitten arvoon 45 /uA, mikä arvo säilyi vielä 40 tuntia. On mahdollista että pieniä määriä löysästi sidottua entsyymiä irtaantui elekt-rodikannasta tänä aikana (vaikkakaan virtatehon riippuvuutta sekoitusnopeudesta ei esiintynyt), tai että tähän liittyy jokin muu vaikuttava tekijä.

Edellä kuvattujen pitkäaikaistestien jälkeen testattiin elektrodin vaste eri glukoosikonsentraatioilla, kuten edellä on mainittu. Vaikkakin signaalin amplitudi oli pienempi kuin vastavalmistetulla, elektrodi antoi erittäin tyydyttävän "askel"-funktion alueella 0 - 30 mM glukoosia, mikä vahvistaa sen ettei se ole kärsinyt mitään vahingollisia vaikutuksia jatketun käytön johdosta kuormituksen alaisena. Tämä johtopäätös vahvistettiin kolmessa lisätestissa 1 viikon varastoinnin (4°C), 8 viikon varastoinnin jälkeen ja taas käyttämisen jälkeen kuormituksen alaisena vielä 4,7 vuorokauden aikana: vasteet eri glukoosikonsentraatioille olivat muuttumattomat.

Nämä testit osoittavat että elektrodia voitiin käyttää yhteensä ainakin 250 tuntia (yli 15,000 minuuttia) siten antaen elektrodimateriaalille potentiaalisesti erittäin 27 8 851 5 pitkän käyttöiän. Tekniikan tason entsyymielektrodien käyttöikä on yleensä paljon lyhyempi kuin keksinnön mukaisten, joissakin tapauksissa vain muutamia tunteja: Turner, (1985) Proceedings Biotech 85 (Europe) Online Publications, Pinner UK 181-192. Esimerkiksi ferroseeni-kytkettyyn glukoosioksidaasiin perustuvilla glukoosi-elektrodeilla on yleensä vain noin 24 tunnin puoliintumis-ajat (Turner, loc. cit.), kun taas Cass et ai. (1984) Ana-lyt. Chem. j>6, 667-673 esittävät pysyvän kestoiän joka on yhteensä noin 50 tuntia samoille elektrodeille. Kun elektrodia käytettiin 50 peräkkäisessä 5 mM:n glukoosiliuoksen mittauksessa, standardipoikkeama oli pienempi kuin yksi prosentti.

Sopivuus jatkuvaa seurantaa varten

Edellä mainituissa uudelleenkäyttökokeissa (45 /uamp 5 mM:ssa glukoosia) mitattu lopullinen vastetaso pysyi muuttumattomana altistettaessa ilmastettuihin liuoksiin nähden, ja oli sama useita viikkoja kestäneen lisävaras-toinnin jälkeen. Tämän elektrodin virtatehon stabiliteetti 12 tunnin aikana tarkistettiin kontrollitestissä, jossa käytettiin steriloitua glukoosiliuosta olsosuhteissa, jotka oli suunniteltu bakteeriselta saastuttamiselta johtuvien mahdollisten glukoosihäviöiden eliminoimiseksi. Signaali oli vakio koko ajanjakson aikana, mikä viittaa siihen että elektrodin alkukonditioinnista johtuvat mahdolliset vaikutukset hämmennetyssä ja kierrätetyssä liuoksessa useiden vuorokauden aikana olivat täydellisiä. Tällaisilla elektrodeilla, jotka on sopivasti konditioitu tällä tai jollakin toisella sopivalla konditiointi/pesume-netelmällä, on käyttöä siellä missä tarvitaan glukoosin jatkuva seuranta.

28 8 851 5

Erän toistettavuus

Edellyttäen että ylläpidetään sopivan "puhtaita" valmis-tusolosuhteita kaikki tämän keksinnön mukaisesti valmistetut elektrodit toimivat esitetyllä tavalla antaen hyvän vasteen glukoosiin nähden. Identtistä kokoa olevien ja samalla tavalla valmistettujen elektrodien parit antoivat hyvin yhtäpitävät tulokset (virtavasteet muutamien prosenttien rajoissa testattuna identtisissä olosuhteissa). Lisäksi kaikilla näin valmistetuilla elektrodeilla oli erittäin pitkät kestoiät ja kestävyydet, kuten edellä on mainittu, verrattuna tekniikan tason mukaisiin elektrodei-hin. Niinpä keksinnön mukaisia elektrodeja voidaan varastoida luotettavasti ja käyttää useiden viikkojen ajan, kun taas tekniikan tason mukaiset elektrodit usein vaihtelivat samassa erässä. Esimerkiksi Turner, loc. cit., havaitsi, että vaikkakin muutamat glukoosielektrodit yhdessä erässä olivat poikkeuksellisen pitkäikäisiä (puoliintumisaika 600 tuntia) suurimmalla osalla oli noin 24 tunnin puoliintu-misajat. Niinpä niitä ei voitu luotettavasti käyttää paljonkaan yli 24 tuntia.

Vasteen riippuvuus happikonsentraatiosta

Liuenneen hapen vaikutuksen testaamiseksi muunnettiin koekenno happielektrodin sisällyttämiseksi glukoosielek-trodin ohella. Kokeita suoritettiin, joissa liuennutta happea huuhdeltiin ulos systeemistä argonilla. Näissä olosuhteissa tyyppiä A (edellä) oleva elektrodi antoi nopean vasteen glukoosilisäyksille, mikä viittaa mekanismiin, joka suurelta osin on riippumaton ympäröivästä happikonsentraatiosta. Tällaista tulosta, joka johtuu elektrodin pintarakenteen erityisominaisuuksista yhdistettynä suotuisaan entsyymi-immobilisointiin, ei ole havaittu aikaisemmin.

29 8 851 5

Toisessa kokeessa (kuvio 4) tyyppiä A olevan elektrodin (valmistettu menetelmän A avulla edellä) lähtösignaali 600 mV:ssa seurattiin jatkuvasti huuhtelemalla argonilla. Samanaikaisesti mitattiin happipaine näytteessä. Kuviossa 4 esitetyt tulokset osoittavat oleellisesti vakion virta-signaalin (ylempi käyrä) joka on oleellisesti riippumaton näyteliuoksen happipaineesta (alempi käyrä). Toisessa kokeessa signaali oli käytännöllisesti katsoen riippumaton 10 minuuttia kestäneen jakson aikana, kun taas happipaine laski nopeasti. Toisella elektrodilla (valmistettu menetelmällä B) virta laski alle 5 %:lla 3 minuutin jakson aikana, jona aikana happi oli kulunut 90 %:lla. Havaitaan myös lisäys virtavasteessa kun happea lisätään uudestaan systeemiin, vaikkakin tämä vaikutus ilmenee verraten hitaasti. Jatkettaessa huuhtelu argonilla elektrodit reagoivat vain rajoitetulle glukoosikonsentraatioalueelle, ja on mahdollista että happi jäännösten läsnäolo on tarpeen sen entsyymitoiminnan alkuunpanemiseksi joka on vastuussa vedyn sieppaamisesta substraatista. Ei myöskään voida sulkea pois sitä, että elektrodiin adsorboituneella hapella (alhaisessa konsentraatiossa, eikä happielektrodin ilmaisemaa) on rooli tässä käyttäytymisessä.

;;; ’ Entsyymikuormitus : Itsenäiset mittaukset koskien glukoosin kulumisnopeutta ja maksimaalisia virtatiheyksiä osoittavat, että elektro- : dia kohti (tyyppiä A) aktiivisesti immobilisoidun ent syymin määrä vastasi noin 7 /ug aktiivista entsyymiä elektrodipinnan kuutiosenttimetriä kohti.

(Kirjallisuudessa on vain vähän tietoja vastaavanlaisten glukoosioksidaasiperustäisten bioantureiden entsyymikuormituksista). Immobilisointimenetelmissä todettiin että jopa laimennettaessa entsyymiliuos 10-kertaisesti voitiin edelleenkin valmistaa erittäin aktiivisia elektrodeja.

30 8851 5

Vasteen lämpötilariippuvuus

Tyyppiä A olevia elektrodeja testattiin konsentraatio-alueella 0 - 30 mM glukoosia lämpötiloissa 10 - 37°C. Läm-pötilakerroin oli 2 - 3 % astetta kohti (vastaten Arrhe-niuksen aktivointienergiaa noin 24 kJmol“l). Tämä voidaan verrata arvoon 4% per °C joka on annettu ferroseeni-välit-teiselle bioanturille (Cass et ai., loc. cit.).

pH-riippuvuus

Havaittiin vasteen vähäistä riippuvuutta pH:sta. pH-arvojen 7,0 ja 8,0 välillä oli vaste kuitenkin käytännöllisesti katsoen riippumaton pH-arvosta, paitsi erittäin korkeissa glukoosikonsentraatioissa 025 mM).

Suojamembraanilla peitetyn elektrodin vaste

Todettiin että polykarbonaattimembraani aiheutti vain vähän muutoksia elektrodivasteen muodossa ja voimakkuudessa hämmennetyssä systeemissä. Vasteaika hämmentämättömässä systeemissä oli noin 20 sekuntia.

Elektrodin käyttö kokoverinäytteiden analysoimiseksi

Polykarbonaattimembraani11a varustettua elektrodia käytettiin tyydyttävästi glukoosin suoraa mittausta varten verestä. Askorbaatista, 0,2 mmoolia/litra, johtuva häiriö oli noin 2,5% kokonaisignaalista glukoositasolla 5 mmoolia/litra.

3i 8851 5

Elektrodin käyttö analyyttisten bioantureiden eri rakenteissa_

Keksinnön mukaisen elektrodin tuloksellista käyttöä Rank-tyyppisessä kennossa käyttäen modifioitua Clark-elektrodia vahvistavat edellä esitetyt tulokset. On myös osoitettu että elektrodi antaa erinomaisia tuloksia käytettynä muuntyyppisissä antureissa, kuten sondina.

Esimerkiksi halkaisijaltaan 2 mm:n sondi, joka on konven-tionaalisisssa elektrodeissa yleisesti käytettävää tyyppiä, rakennettiin jolloin elektrodi oli asennettu langalle ja suljettu lasiputkeen. Tämä voitiin upottaa (yhdessä kytkettyjen vertailu- ja vastaelektrodien kanssa) maljassa tai muussa astiassa oleviin hämmennettyihin liuoksiin glu-koosikonsentraation luotettavaksi mittaamiseksi ilman että oli tarve eliminoida atmosfäärinen happi. Tällä ja vastaavan rakenteen omaavilla pienemmillä sondeilla tehdyistä mittauksista todettiin, että elektrodin virtavaste tietyn glukoosikonsentraation omaavassa liuoksessa on suurinpiirtein verrannollinen elektrodin näennäispinta-alaan tai painoon.

Rakennettiin myös sondeja joissa elektrodi oli minimaalisen pieni (noin 0,25 - 0,50 mm^ pinta-ala, paino 30 -60 /ug). Lanka-asennus peitettiin muovihylsyllä ja peitetty sondi sijoitettiin katetrineulaan (halkaisija 1,5 mm). Neula voidaan työntää kumitiivisteen läpi astiaan (joka voi sisältyä fermenttoriin tai vastaavaan laitteeseen, tai jätesäiliöön) ja käyttää sondianturina astian sisältämän liuoksen glukoosikonsentraation määrittämiseksi. Tässä rakenteessa ympäröivä neula suojaa anturielek-trodin kun se sijoitetaan paikoilleen, mutta voidaan myös tarvittaessa työntää ulos neulasta paikoilleen sijoittamisen jälkeen.

32 8 8 51 5

Vaikkakin edellämainitut miniatyyrisondit antoivat signaaleja tyypillisesti alueella 1 - 10/uamp, voidaan sopivalla instrumentoinnilla saada tarkkoja mittauksia alueella 1 - 100 namp. Koska signaalivirrat tällä alueella aikaansaadaan entsyymielektrodeilla (keksinnön mukaisilla) joiden koko on erittäin pieni (noin 0,005 mn»2 pinta-ala, paino 1 /ug paino), tällaiset elektrodit voidaan sijoittaa hienoihin neulamikrosondeihin joita voidaan käyttää katetrisondeissa in vivo-mittauksia varten.

Vaikkakaan ei täysin ymmäretä elektrodien toiminnan perustana olevaa mekanismia tiettyjä johtopäätöksiä voidaan vetää saatujen tulosten perusteella. Niinpä tiedetään, että aktiivisten pintaryhmien läsnäolo hiilessä, jotka on muodostettu pintahapettamalla korkeassa lämpötilassa, mahdollistaa entsyymien immobilisointia varten välttämättömät ristikytkentäreaktiot, ja tällaisten pintaryhmien lukumäärä ja vaihtelevuus todennäköisesti lisääntyvät kun platinaa (tai muuta platinaryhmän metallia, kuten palladiumia) on läsnä ohutkerros-pintakatalysaatto-rina (Kinoshita ja Stonehart (1977), Modern Aspects of Electrochemistry, No. 12, Ed. Bockris ja Conway, Plenum Press, New York, 183-266). On ilmeistä, että entsyymin sitoutumisessa esiintyy eroavaisuuksia käytettäessä erilaisia immobilisointimenetelmiä. (Esimerkiksi monet julkaistuista menetelmistä käyttävät erilaisia aminohappotähteitä entsyymin kiinnitystä varten, kun taas syanuurikloridi-aktivoidulla aineella sidotut entsyymit kiinnittyvät pelkästään lysiini-tähteistään: vrt. Ianiello ja Yacynych (1981), Analyt. Chem. 53^ 2090-2095). Ei ole odotettavissa että immobilisoinnin tuloksena olevat variaatiot entsyymien tertiaarisessa rakenteessa ovat identtisiä kaikille immobilisointimenetelmille, mikä voi olla syynä suurille variaatioille entsyymiaktiviteetissa ja stabiliteetissa, joita havaitaan tämän tyyppisessä työssä.

33 8851 5 Tässä keksinnössä käytetyn kantaelektrodimateriaalin erittäin heterogeeninen luonne, vastakohtana sellaisen elektrodityypin kerrostetulle, ei-heterogeeniselle rakenteelle, jota on kuvattu esimerkiksi japanilaisessa julkaistussa patenttihakemuksessa 56-163447, maksimoi mahdollisuuden saada lukuisia eri tyyppiä ja suuntaa olevia ris-tisidoksia integroidussa kolmiulotteisessa rakenteessa. Ristisitovien reagenssien poissaollessa se mahdollistaa myös voimakkaan pinta-adsorption. Sidotussa hiilimatrlisissä olevat huokoset sallivat sen että entsyymimolekyylit pääsevät sisään ympäröimään matriisin komponentteja, jotka tarjoavat erittäin suuren pinta-alan entsyymille, ja sallivat konformaatioita, jotka ovat edullisia sen stabiliteetille ja aktiviteetille. (Tämä on vastakohtana sitomiselle suhteellisen tasaisille pinnoille, kuten platinalle, lasimaiselle hiilelle tai grafiitille, joiden pinta-ala on huomattavasti pienempi, mikä asettaa rajoituksia konfor-maatiolle, kuten on esitetty aikaisemmassa kirjallisuudessa) . Lisäksi keksinnön mukaisten elektrodien erittäin nopeat vasteajat (1-2 sekuntia) viittavaat erittäin nopeaan elektronien siirtoon elektrodille, joka edellyttää ei vain erittäin korkeata entsyymiaktiviteettia, mutta jota edesauttaa riittävä määrä elektronireseptorikohtia itse elektrodilla. Nämä aikaansaadaan hienojen platina-hiilirakeiden suurella tiheydellä, jotka rakeet on jaettu erittäin suuren pinta-alan yli mikrorakenteen sisällä, mikä tarjoaa mahdollisimman suuren todennäköisyyden että pintaplatinan kasvukohdat ovat entsyymien aktiivisten kohtien tavoitettavissa.

Muiden hartsien käyttökelpoisuuden osoittamiseksi sideaineina keksinnön mukaisissa entsyymielektrodeissa, samoinkuin muiden platinaryhmän metallien käyttökelpoisuuden osoittamiseksi, on rakennettu glukoosioksidaasi-elektrodeja käyttäen polyvinyyliasetaattia sideaineena, ja palladiumia platinaryhmän metallina.

34 8851 5

Edellisessä tapauksessa rakennettiin glukoosioksidaasi-elektrodi immobilisoimalla glukoosioksidaasi edellä kuvatulla menetelmällä A platinoidun hiilipaperielektrodin pinnalle, joka oli rakennettu oleellisesti kuten edellä on selitetty (esimerkki 2) mutta käyttämällä 50 paino-% poly-vinyyliasetaattia sideaineena polytetrafluorietyleenin asemesta.

Testattaessa käyttäen samaa modifioitua Rank-elektrodisys-teemiä 325 mV:ssa, saatiin oleellisesti lineaarinen vaste, kuten on esitetty kuviossa 13.

Jälkimmäisessä tapauksessa rakennettiin glukoosioksidaa-sielektrodi immobilisoimalla glukoosioksidaasia edellä kuvatulla menetelmällä A palladisoidun hiilipaperielektrodin pinnalle, joka oli valmistettu seostamalla palladiumia hiili jauheen (näennäispartikkelikoko 30 nm: Vulcan XC-72) pinnalle ja sen jälkeen sitomalla palladisoi-tu hiili jauhe ohuena kerroksena (0,1 mm) sähköisesti johtavan hiilipaperin pinnalle käyttämällä 50 paino-%, laskettuna palladisoidun hiili jauheen painosta, polytetra-fluorietyleeniä sideaineena.

2 mm:n kiekko, joka oli leikattu käsitellystä palladisoi-dusta hiilipaperista, asennettiin kuviossa 16 kuvatun 2-elektrodikennon platinakoskettimelle, ja testattiin vasteen suhteen 325 mV:ssa. Tulokset on esitetty kuviossa 14 ja osoittavat jälleen oleellisesti lineaarisen vasteen virtatiheytenä suhteessa glukoosikonsentraatioon.

Ottaen huomioon Pt:n, Pd:n, Ru:n ja Rh:n ja muiden platinaryhmän metallien selvä ekvivalenttisyys kaasudiffuu-sioelektrodeissa US-A-4,293,396 ja muiden julkaisujen mukaisesti, on odotettavissa että muut platinaryhmän metallit, esimerkiksi rutenium ja rodium, ovat tehokkaita 35 8851 5 vaihtoehtoja platinalle ja palladiumille keksinnön mukaisissa entsyymielektrodeissa.

Claims (9)

36 8 8515 Patenttivaatimukset;

1. Entsyymielektrodi, joka pystyy vastaamaan amperometri-sesti entsyymin katalyyttiselle aktiviteetille sen vastaavan substraatin läsnäollessa ja joka käsittää oksido-reduktaasientsyymin, joka on immobilisoitu tai adsorboitu sähköisesti johtavan tukielimen pinnalle, joka on hart-sisidottujen hiili- tai grafiittipartikkeleiden huokoinen kerros tai joka sisältää sellaisen ja jotka partikkelit ovat kosketuksessa alkuainemuodossa olevan platinaryhmän metallin kanssa, tunnettu siitä, että alkuaine-muodossa oleva platinaryhmän metalli on hienojakoisina partikkeleina tasaisesti dispergoituneena hartsisidotun hiili- tai grafiittikerroksen paksuudelle ja että mainitut partikkelit ovat mainitussa kerroksessa joko olennaisesti mainittujen hiili- tai grafiittipartikkeleiden ja mainitun hienojakoisen platinaryhmän metallin tasaisena sekoituksena, tai alkuainemuodossa olevan platinaryhmän metallin hienojakoisina partikkeleina, jotka on esiadsor-boitu hiili- tai grafiittihiukkasten pinnalle ennen sitomista mainitun hartsin kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymielektrodi, tunnettu siitä, että platinaryhmän metalli on platina tai palladium.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen entsyymielektrodi, tunnettu siitä, että synteettinen hartsiside-aine on fluorihiilihartsi tai polyvinyyliasetaatti.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen entsyymielektrodi, tunnettu siitä, että synteettinen hartsi on polytetrafluorietyleeni.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymielektrodi, tunnettu siitä, että oksidoreduktaasi on glukoo-sioksidaasi. 37 8851 5

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen entsyymi-elektrodi, tunnettu siitä, että sähköisesti johtava tukielin käsittää sähköisesti johtavan kannan, johon on sidottu pintakerroksena mainitut hartsisidotut hillitä i grafiittipartikkelit sekoitettuna mainitun hienoksijauhetun platinaryhmän metallin kanssa, tai jonka pinnalle mainittu metalli on adsorboitu tai saostettu.

7. Patenttivaatimuksen 7 mukainen entsyymielektrodi, tunnettu siitä, että sähköisesti johtava tukielin on sähköisesti johtava hiilipaperi.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen entsyymi-elektrodi, tunnettu siitä, että huokoinen kerros käsittää hartsisidottuja hiili- tai grafiittihiukkasia, joiden yksittäisten hiukkasten pinnalle on saostettu tai adsorboitu platinaryhmän metalli ennen sitomista hartsin kanssa.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen entsyymielektrodi, tunnettu siitä, että huokoinen kerros käsittää hartsisidottua platinoitua hiilijauhetta, jonka hiukkas-koko on alueella 5 - 30 nm ja jonka pinnalle on adsorboitu kolloidaalista platinaa, jonka hiukkaskoko on 1,5- 2,5 nm.