HU202577B - Fixed enzyme-electrodes - Google Patents

Description

A találmány olyan enzimelektródokra vonatkozik, amelyek egy enzimet egy elektromosan vezető szubsztrát felületén rögzítve tartalmaznak, és amelyek amperometrikusan reagálnak az enzim katalitikus aktivitására az enzim megfelelő szubsztrátuma jelenlétében. A találmány különösen - de nem kizárólagosan - olyan enzimelektródokra vonatkozik, amelyek glukóz szintek in vitro és in vivő kimutatására egyaránt alkalmazhatók. Ezek lényeges eleme egy elektromosan vezető hordozó, amelyen egy redox enzimet - pl. egy glukózoxidázt - rögzítünk. Az elektród ampcromctriásan reagál a rögzített enzim katalitikus aktivitására, amely egy glukózt tartalmazó mintába való bevitel során megnyilvánul.

Az enzimet mint biokatalizátort tartalmazó amperometrikus bioszenzorok előnyeit bizonyos részletességgel tárgyalja Aston és Tumer - Biotech. Génét. Eng. Rév. (kiadó G. Russel) 1,89-120,1984. Intercept, Newcastle-upon-Tyne - és G. Davis - Biosensors 1, 161— 178,1985 -. Ezek a bioszenzorok a jelátvitel módjában különböznek és megközelítően a következő csoportokba sorolhatók:

a) az elektromos válasz forrása az elektródon végbemenő enzim-reakció termékének oxidációja;

b) egy „mediátor” segítségével működők; ezekben az elektronokat az enzimről az elektródra egy redox reagens viszi át és

c) „közvetlen elektron átvitel” (DET) alapján működők; ezekben nincs szükség ilyen mediátor igénybevételére.

a) Kategória

Ez a kategória bizonyos oxidázok (pl. glukózoxidáz, alkoholoxidáz) hatására való hivatkozással jellemezhető; ezek az enzimek a következő reakció szerint hidrogénperoxidot termelnek:

szubsztrát + O₂ -(oxidáz)-> oxidált tennék + H₂O₂

Ennek az eljárásnak a keretében a peroxid oxidálódik a meghatározott feszültségre beállított elektródon:

H₂O₂ —> O₂ + 2H⁺+ 2e

Az elektronoknak a peroxidból az elektródra való átvitele után elektromos jel képződik, és megfelelő körülmények között az enzimes katalízis folytán keletkező áram erőssége arányos a meghatározandó anyag koncentrációjával.

Számos, glukóz meghatározására szolgáló berendezést írnak le, ezek legtöbbjét azonban korlátok jellemzik, ami a válasz reprodukálhatóságát és sebességét, valamint a meghatározható glukóz tartományt illeti. Néhány, mérsékelten sikeresnek mondható nagyléptékű módszer peroxidnak az alábbiak szerinti felhasználásán alapul, amikor is glukóz a szubsztrátum és az oxidáció terméke glukono-l,5-lakton. Más eljárások a peroxid szekunder reakcióit (pl. kolorimetriás vizsgálatok) vagy fizikokémiai méréseket (pl. vezetőképesség mérést) vesznek igénybe. Általában jellemző azonban ezekre, hogy lassú a válasz és hátrányos az a körülmény, hogy meglehetően érzékenyek a mintában jelenlevő oxigén nyomására, amely nagyon jelentős mértékben változhat. Alacsony oxigénnyomás mellett az áram-válasz linearitásának felső határa alacsonyabb lehet, mint az egyszerű, pontos mérések esetében megkívánt érték. Hasonló meggondolások érvényesek a glukóztól különböző szubsztrátumok indirekt vizsgálati módszerei vonatkozásában is.

b) Kategória - Mediátor igénybevételével működő bioszenzor

Ezeknek a készülékeknek az esetében az enzim a szubsztráttal végbemenő reakció eredményeként redukált („elektronokban gazdag”) állapotban marad vissza; a szubsztrátum az az anyag, amelynek koncentrációját meg kell határoznunk. A gyakorlatban alkalmazható szenzor vonatkozásában az egyik követelmény az, hogy elektromos kapcsolat jöjjön létre az elektronforrás (az enzimen belül egy elektrondús „aktív hely”) és maga az elektród között. Mivel azonban az aktív helyek hajlamosak arra, hogy a makromolekuláris enzim szerkezeten belül a repedésekben vagy hajlatokban rejtve maradjanak, az ezekhez való hozzájutás teljesen vagy részben blokkolt Ezért bizonyos nehézségekkel jár egy olyan elektromos kapcsolat létesítése, amely a megbízható és érzékeny jelátvitel szempontjából kellő mértékben hatékony. Elektronoknak egy enzim és egy elektród között való átvitele azonban megkönnyíthető egy olyan elektronhordozó - vagy „mediátor” - beiktatásával, amely az oxidált alakban az enzimből elektronokat vesz fel, majd a redukált alakban átviszi ezeket az elektródra, amelyen újra oxidálódik.

Mediátorok alkalmazása az utóbbi időben leírt olyan bioszenzorok segítségével illusztrálható, amelyek szén elektródon rögzített glukózoxidázt alkalmaznak. Az egyik berendezésben kovalensen kötött, a cianursavkloridos módszerrel rögzített enzimet (Jonsson és Gorton, Biosensors 1, 355-369, 1985) használnak fel, amely állítólag jó (több hónapos) stabilitással jellemezhető. A szenzornak komoly hátránya azonban az, hogy az alkalmazott mediátor, az N-metil-fenazinium ion (fenazin-metoszulfát) labilis és könnyen kimosható, ami a használat során napi újratöltést tesz szükségessé. Az elektród érzékeny az oxigén koncentrációra is, bár kimutatták, hogy a mediátor segítségével történő elektrokémiai átvitel hatásosan konkurál az oxigént redukáló reakcióval. Egy másik bioszenzorban, amely ugyancsak rögzített glukózoxidázt tartalmaz, mediátorként ferrocént vagy ennek valamelyik származékát alkalmazzák (Cass et al., Anal. Chem. 56, 667-673, 1984 és 0 078 636 sz. európai szabadalmi bejelentés). Az elektronoknak a mediátor segítségével az elektródra történő átvitele a következőképpen megy végbe: glukóz + (oxidált) enzim -> giukono-l,5-lakton + (redukált) enzim (redukált) enzim + (oxidált) feirocén -> (oxidált) enzim + + (redukált) ferrocén (ferricinium ion) (redukált) ferrocén —> (elektront az elektródhoz) -» ferricinium ion

Ennek az elektródnak a mechanikai jellemzői - működésének részletei - nem egyértelműek. Konkrétan nem áll rendelkezésre magyarázat arra vonatkozóan, hogy a ferrocén nagymértékben oldhatatlan redukált alakja hogyan szállítja a töltést az elektródhoz, a mediátor ciklikus aktivitásának fenntartására (bár ez az ellenvetés nem feltétlenül érvényes az ionos ferrocén származékok vonatkozásában). Ezen kívül: a válasz meglehetősen lassú, különös tekintettel arra, hogy potenciálisan nagyon gyors válasz lenne várható az itt szerepet játszó enzimreakciók ismert sebessége alapján, továbbá az elektród élettartama korlátozott, ami az enzim korlátozott stabilitásának tulajdonítható.

HU 202 577 Β

Mediátomak a jelátvitelben való alkalmazása számos hátránnyal jár együtt, amilyenek pl. a következők: kiszivárgás lehetősége a biokatalizátort tartalmazó tartományból; az oxidált (és/vagy a redukált) alak diffúziója korlátozott és maga a mediátor természeténél fogva labilis.

c) Kategória. Közvetlen elektronátvitel (DET) segítségével működő bioszenzorok

Annak a lehetőségét, hogy mediátor alkalmazása nélkül alakítsanak ki bioszenzort, Tarasevich-nek a bioelcktrokatalízisre vonatkozó egyik újabb cikke - Bioelectrochemistry 10,231-295,1985 - veti fel. Az ilyen berendezések „reagens nélkülinek” vagy „mediátor nélkülinek” tekinthetők. Tarasevich összefoglalója idéz néhány példát a mediátor nélküli enzim elektródokra, ezek azonban vezetőképes szerves polimereket - pl. a metilviologénhez hasonló szerkezeti egységeket - és/vagy szerves sókat - pl. NMP* - TCNG-t (N-metil-fenazinium-tetraciano-4-kino-dimetiletán) - tartalmaznak (ez utóbbiak ugyancsak vezetőképesek), amelyek módosítják az elektród tulajdonságait és betöltik a mediátor szerepét. Ebbe a ketagóriába sorolható számos olyan elektronátviteli módszer is, amely redox fehérjékből történik, módosított elektródok segítségével.

Ismeretes, hogy számos vezetőképes szerves polimerre és sóra természeténél fogva instabilitás jellemző, így pl. egy alkoholos bioszenzorban alkalmazott, NMP/TCNG-vel módosított elektród aktivitásának felezési ideje kb. 15 nap. Ezek az elektródok ezenkívül érzékenyek az oxigénre.

A nyilvánosságra hozott információk alapján tehát úgy tűnik, hogy eddig még kevés, valóban mediátor nélküli enzim elektródot hoztak létre, bár számos sikertelen kísérletet regisztráltak. Ezek során többnyire szén alapú elektródokat használtak fel. Újabb, a glukózoxidáz alkalmazására vonatkozó irodalmi adatok (Jonsson és Gorton, az előbbiekben idézett helyen) arra mutatnak, hogy a fő probléma az enzim rögzítésével függ össze; ez ugyanis képes gátolni - szférikus vagy más korlátozások folytán - az elektronátviteli kapacitást és így szükségessé teszi mediátor alkalmazását

Ismeretes néhány ritka példa arra vonatkozóan, hogy nagyon aktív oxidázokat szénen vagy platinán rögzítettek. Ianiello et al. (Anal. Chem. 54,1098-1101,1982) pl. olyan, mediátor nélküli szenzorokat úr le, amelyekben a cianursavkloridos módszerrel glukózoxidázt és L-aminosavoxidázt kötöttek kovalensen egy grafit elektródhoz. Az enzimelektródok működésképes élettartama azonban 20-30 nap (Inaiello és Yacynych, Anal. Chem. 53,2090-2095,1981). Nem közölnek adatot az elektródok oxigén érzékenységére vonatkozóan.

A technika állása számos bioszenzort ismertet, amelyek az előbbi elvek alapján működnek (ezek között különösen glukóz szenzorok fordulnak elő), és ezekből egy reprezentatív választék már rendelkezésre áll. A találmány szerinti célok vonatkozásában azonban különösen mérvadónak kell tekinteni az 56-163447 sz. nem vizsgált, közzétett japán szabadalmi bejelentést (Bejelentő: Matsushita Electric Appliance Industry Co.). Ez egy közvetett glukóz elektródot ismertet, azaz olyat, amelyben a glukóz glukózoxidáz jelenlétében történő oxidációja során keletkező hidrogénperoxid:

enzim glukóz +O₂-> glukonolakton + H₂O₂ egy platina elektród felületén oxidálódik:

H₂O₂—>2H⁺ + 2e+O₂ és az oxidáció során áram keletkezik, amelynek intenzitása arányos a mintában jelenlevő szubsztrátum (glukóz) koncentrációjával. Az elektród lényeges eleme egy elektromosan vezető szénalap, amely egy immobilizált enzim (pl. rögzített glukózoxidáz) réteget hordoz. Az elektromos vezetőképességgel rendelkező alap önmagában öntött grafit, amely kötőanyagként max. 10 tömegrész fluorokarbon gyantát tartalmaz és amelyre pl. elektrolízis útján vagy gőzlerakódással - vékony (1 pm-nél vékonyabb) - platinafilmet viszünk fel. A találmány segítségével állítólag elkerülhetők az enzimnek közvetlenül a platina felületen való rögzítésével összefüggő problémák és olyan enzimelektród állítható elő, amelyre gyors válasz (5 másodperc), nagy érzékenység és tartósság jellemző. Az ilyen elektródokkal végzett újabb kísérleti munka során azonban ezek az előnyök nem voltak igazolhatók.

Ennek megfelelően még mindig szükség van olyan enzimelektródra - különösen, de nem kizárólag glukóz bioszenzorokban való alkalmazásra -, amelyek megbízhatók, reprodukálható eredményeket szolgáltatnak, gyors választ adnak, magas érzékenységnek és hosszú időtartamra vonatkozó stabilitásuk megfelelő.

A találmány szerint egy új szénhordozót használunk fel az enzimelektród kialakításához, amely lehetővé teszi, hogy az enzim - pl. a glukózoxidáz - előnyösebb módon kapcsolódjék az elektródhoz. Ez lehetővé teszi a válasz és a stabilitás tekintetében nagymértékben továbbfejlesztett amperometriás szenzor létrehozását Ennek a továbbfejlesztett enzimelektródnak az esetében nincs szükség mediátor reagens alkalmazására (bár kívánt esetben ez alkalmazható), és azt találtuk, hogy nagyon alacsony oldott oxigén koncentrációk mellett működik. Nagy léptékű válaszreakciókat eredményez: pl. 10 mM töménységű glukóz oldatban, mikroamper/az elektród látszólagos felülete, cm² dimenzióban kifejezve, százas nagyságrendű áramsűrűségeket eredményez. Úgy látjuk, hogy ez sokkal nagyobb, mint a korábbi amperometriás enzim bioszenzorok esetében és előnyösen használható fel ez a körülmény lmm²-nél kisebb felületű, mikroelemző bioszenzorok előállítására, amelyekkel 0-100 nanoamper érhető el. Az elektród nagyon kis mennyiségű rögzített enzim felhasználásával is előállítható. Glukózra sokkal gyorsabban reagál, mint bármely eddig ismert glukóz szenzor. A reakcióidő tipikus esetben védőmembrán távollétében 1-2 másodperc, membránnal pedig 10-30 másodperc. Különlegesen stabil nedves körülmények között tárolva, még szobahőmérsékleten is. Az elektródok még több hónap múlva is jó választ adnak. Működési tartományuk megnövekedett, és a normálishoz képest lényegesen alacsonyabb üzemi feszültséget igényelnek (325 mV a szokásosabb 650 mV-tal szemben). Az üzemi feszültségen az általuk képviselt háttérérték feltűnően alacsony.

A találmány alapja egy enzimelektród vagy bioszenzor; ez egy elektromosan vezető hordozó elem felületén rögzített enzimből áll. A hordozó gyantával megkötött szén vagy grafit részecskékből álló porózus réteget tartalmaz (vagy egy ilyen réteg alkotja a hordozó elemet). Ezekkel a részecskékkel intenzíven összekeverünk egy finom eloszlású platina-csoportbeli fémet - vagy az említett réteg kialakítására vezető kötés képzése előtt ilyen fémet választunk ki vagy adszorbeáltatunk az

HU 202 577 Β egyes részecskék felületére így egy porózus hordozóréteget képezünk, amelyre az említett enzimet adszorbeáltatjuk vagy rögzítjük. A hordozó elem tehát egy gyantával összekötött szén vagy grafit részecskékből álló, lényegében heterogén réteg, mimellett az említett platinacsoportbeli fém lényegében homogénen oszlik el az egész réteg keresztmetszetében. így az 56-163 447. sz. japán közzétett szabadalmi bejelentésben tárgyalt réteges szerkezetű, nem heterogén, platina tartalmú szénhordozóval szemben, jellegzetes módon, a találmány szerinti elektród egy lényegében heterogén rétegből áll vagy ilyet taralmaz, amely réteg gyantával összekötött szén vagy grafit részecskékből áll és az említett platinacsoportbeli fém lényegében homogénen van diszpergálva a réteg teljes keresztmetszetében. A gyantával összekötött szénporréteget előnyösen gyantával kötődni képes szénpor részecskék alkotják, amelyekre - a hordozó öntéssel való kialakítása előtt - kolloid platinát vagy palládiumot választottunk le vagy adszorbeáltattunk. A találmány szerinti elektród-hordozó előállítása során a platinatartalmú szénrészecskék formába öntésére kitüntetett gyanta kötőanyagokként fluorokarbon gyantákat, különösen politetrafluoretilcnt alkalmazunk.

Ami a találmány szerinti enzimelektród részletesebb szerkezetét illeti: a kitüntetett elektród - mint jeleztük egy elektromosan vezető alapból áll, amelyet egy gyantával megkötött szénporréteg alkot (vagy amely egy ilyen réteget foglal magába) és a kötés kialakítása előtt a porrészecskék felületére egy platinacsoportbeli fémet - pl. platinát vagy palládiumot - adszorbeáltatunk.

Szénporként bármely megfelelő szén vagy grafitpor felhasználható, amely elősegíti az enzim későbbi rögzítését. E célból olyan szénporokat célszerű alkalmaznunk, amelyek felületén nagy sűrűségben funkciós csoportok (pl. karboxil-, amino-csoport és kéntartalmú csoportok) fordulnak elő, szemben az üveghez inkább hasonló vagy üvegszerű szenekkel, amelyek az enzimeket csak kevéssé kötik meg. A részecskenagyság 3-50 nm, szokásosabb módon 5-30 nm közötti lehet.

A platina (vagy a palládium) bármely célszerű módszer alkalmazásával vihető fel a szénrészecskékre. Ilyen pl. a gőzfázisból való leválasztás, az elektrokémiai kiválasztás vagy a kolloid szuszpenzióból kiinduló egyszerű adszorbeáltatás (ez utóbbit részesítjük előnyben). A szén tömegére vonatkoztatva 1-20 tömeg% előnyösen 5-15% platinacsoportbeli fém koncentrációt kell elérnünk. Ezek a határértékek azonban inkább gyakorlati szempontból fontosak és nem kritikusak. Kb. 1% platinacsoportbeli fém koncentráció alatt a kimenetijei olyan szintre esőken, amely a gyakorlatban túl alacsony a mérhetőséghez, hacsak nem alkalmazunk nagyon érzékeny berendezést. 20% felett a platinacsoportbeli fémmel való bevonás gazdaságtalanná válik; kevés további előny várható ettől, ami a reakcióidőt, érzékenységet stb. illeti. Rendkívül magas fémterhelések esetében az érzékenység ténylegesen csökkenni kezd. A kitüntetett megoldás szerint a szénrészecskét egy platina vagy palládium vegyület - pl. klórplatinasav -, vagy méginkább egy oxidálható ligandumot tartalmazó platina vagy palládium komplex oxidatív elbontása során vonjuk be a platinával vagy palládiummal, a műveletet szénpor jelenlétében végezve. így kolloid méretű platina vagy palládium vihető fel közvetlenül a szén részecskék felületére. Ezt a módszert ismertetik pl. a következő szabadalmi leírások: 1 357 494 sz. brit bejelentés;

044 193 és 4 166 143 sz. amerikai egyesült államokbeli bejelentés.

A platinával vagy palládiummal való bevonást követően a platinát vagy palládiumot hordozó port megfelelő víztaszító kötő gyanta - előnyösen egy fluorokarbon gyanta, pl. politetrafluoretilén - felhasználásával formába öntjük. így vagy egy teljesen önhordozó porózus öntött szerkezetet alakítunk ki - amely lényegében az említett gyantával megkötött, platinát vagy palládiumot hordozó szénpor részecskékből áll -, vagy (szokásosabb módon) egy porózus öntött felületi réteget alakítunk ki az ilyen gyantával összekapcsolt részecskékből, egy elektromosan vezető (pl. fém, szén vagy grafit) alaphoz való kapcsolással. Az öntött, gyantával megkötött platinatartalmú szénréteg esetében különösen kitüntetett hordozó a karbonpapír (amint ez a 4 229 490. sz. amerikai egyesült államokbeli leírásból megismerhető), vagy egy nyílt pórusú széntextília (4 293 396 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A maximális porozitás megőrzése érdekében a kötőanyagként alkalmazott gyanta mennyiségének minimálisnak kell lennie, amely az elektródréteg mechanikai homogenitásának és stabilitásának biztosításához szükséges. Ennek a rétegnek a vastagsága rendszerint max. kb. 0,ΙΟ,5 mm, bár nagyobb vastagságértékek is megengedhetők. A szerkezeti egység, mechanikai stabilitás és a porozitás iránti követelmények kielégítése esetén a kötőgyanta mennyisége nem kritikus; ez a platinát vagy palládiumot tartalmazó szénpor mennyiségére vonatkoztatva 5-10 tömeg%-tól 80%-ig terjedhet, de ez a mennyiség szokásosan a 30-70 tömeg% tartományba esik. Számos gyanta alkalmazható - ideértve a vezető és félvezető gyantákat -, de előnyben részesítjük a szintetikus fluorokarbon gyanták, különösen a politetrafluoretilén felhasználását. Tekintettel arra, hogy kismennyiségű oxigénnek jelen kell lennie az oxidációs folyamat végrehajtása érdekében — és ez a követelmény lényeges - fontos, hogy a kötőanyag áteresztő legyen az oxigénre nézve. Ez akkor teljesül, ha az oxigén oldhatósága a kötőanyagban atmoszférikus nyomáson min. 2xl0~³ cm³ Oycm³ polimer (normál nyomáson és hőmérsékleten mérve).

Néhány megfelelő kötőanyagot és ezek ismert oxigén-oldóképességét (S), a J. Brandrup ésE. H. Immergut által kiadott Polymer Handbook, (1. kiadás, 1967. Interscience) alapján a következőkben mutatunk be (az egyes anyagokra megadott értékeket százzal osztva megkapjuk az aktuális oldóképességet):

politetrafluoretilén (PIFE)	SxKPfcm3) 0,276
PIFE-től különböző fluorokarbon polimerek változó,	0,2-nél nagyobb
polietil-metakrilát	8,6
polisz tárol	18,2 (számított)
polivinilacetát	6,3
polivinilklorid	2,92
polikarbonát	0,51
poli(4-metil-pentén-1)	24,3
poliizoprén	10,3
polikloroprén	7,5
poli-l,3-butadién	9,7
szilikongumi	31,3

A találmány szerinti kitüntetett enzimelektród hordozók ténylegesen a kereskedelemben hozzáférhető anya-4Ί

HU 202 577 Β gok, amelyeket a Prototech Company (Newton Highlands, Massachussets) a Prototech védjeggyel hoz forgalomba és amelyeket korábban elektiokatalitikus gázdiffúziós elektródok anyagaként alkalmaztak üzemanyagcellákban. Ilyen anyagok előállítását részletesen ismerteti a 4 044 193; 4 166 143; 4 293 396 és 4 478 696 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és a teljesség kedvéért ezekre hivatkozunk. Nagy vonalakban azonban az mondható el, hogy a 15-25 A (1,5—2,5 nm) iészecskenagyság tartományba eső méretű kolloid platinát adszorbeáltatnak porított szén felületére (részecskenagyság 50-300 Á, azaz 5-30 nm (pl. oly módon, hogy in situ platina szólt képezünk porított szén jelenlétében, amely magképző ágensként hat a szól vonatkozásában. A platinatartalmú szén részecskéket ezután egy szintetikus gyanta kötőanyag - előnyösen egy íluorozott szénhidrogén gyanta és különösen politetrafluoretilén - alkalmazásával felvisszük egy elektromosan vezető hordozó szerkezetre, pl. egy karbonpapírlapra.

Egy másik megoldás szerint - amelyet a 4 293 396 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ír le - a platinát tartalmazó szén részecskéket impregnálással egy előformázott porózus széntextíliára visszük fel, és íluorokarbon gyanta, előnyösen politetrafluoretilén felhasználásával kötjük ahhoz. Magától értetődő azonban, hogy a találmány nem korlátozódik a Prototech anyagok alkalmazására, hanem magában foglalja más hasonló szubsztrát anyagok felhasználhatóságát, amilyen a gyantával megkötött és formába öntött, platina- vagy palládiumtartalmú szénpor. Konkrétan úgy látjuk, hogy olyan típusú anyagok is alkalmazhatók, amelyeket a 4 229 490 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás az üzemanyagcellák tekintetében leír. Ezek közelebbről karbonpapír típusú elektródok, amelyek egy - előnyösen egy vízlepergető gyantával, pl. politetrafluoretilénnel - impregnált karbonpapír hordozóelemet tartalmaznak és erre visznek fel - pl. filmnyomásos eljárással - egy gyantával megkötött katalizátor réteget. Ez a réteg egy víztaszító gyantával - előnyösen ugyancsak politetrafluoretilénnel - megkötött platinakorom és szén vagy grafit részecskék homogén keveréke.

Az enzimnek a gyantával megkötött, a platina- vagy palládiumtartalmú szénhordozón való rögzítését számos jól ismert rögzítési eljárás segítségével végezhetjük. Ilyen pl. egy karbodiimid vagy egy karbonil-diimidazol reagenssel képezett kovalenskötés kialakítása, kovalenskötés képzése l,6-dinitro-3,4-difluor-benzollal (DFDNB) vagy keresztkötések kialakítása glutáraldehiddel.

A következőkben jellegzetes példákat mutatunk be a glukózoxidáz rögzítésére vonatkozó előírások köréből.

A. Karbodümides kezelés

1. Megfelelő méretű elektródokat vágunk ki a Prototech elektród anyagból, amely lapok alakjában áll rendelkezésre.

2. Az elektródokat kb. 5 percen át etanolban tartjuk annak biztosítására, hogy a PTFE-vel bevont rögzítő rész és a hátlap alaposan nedvesedjék.

3. Az elektródokat eltávolítjuk az etanolból és az etanolnyomok teljes eltávolítására alaposan mossuk desztillált vízzel.

4. 0,1 mólos pH 4,5 acetát pufferrel elkészítünk 5 ml (vagy kevesebb) 0,15 mólos l-ciklohexil-3-/2-morfolino-karbodiimid-p-metil-toluol-szulfonát oldatot és az elektródokat 90 percen át szobahőmérsékleten ebben az oldatban tartjuk. Mechanikai keverő segítségével enyhe kevertetést alkalmazhatunk. Ha az elektródok az oldat felületén úsznak, ez azt jelenti, hogy nem nedvesedtek megfelelően, és a kezelést a

2. lépéstől kezdve meg kell ismételni.

5. Az elektródokat kiemeljük, és alaposan mossuk desztillált vízzel. pH 5,6 acetát pufferrel frissen elkészített, 5,0 mg/ml koncentrációjú glukózoxidáz oldatba helyezzük ezeket és enyhe mechanikai kevertetés mellett 90 percen át a rendszert szobahőmérsékleten tartjuk.

6. Az elektródokat kiemeljük az enzim oldatból és alaposan átöblítjük 0,1 mólos acetát pufferrel. Az elektródok ekkor használatra készek.

7. Az elektródokat 0,1 mólos pH 5,6 acetát pufferben 4 ’C-on tároljuk.

B. Kezelés karbonil-diimidazollal

1. Végrehajtjuk az előbbi 1. lépést, és elhagyjuk a 2. és

3. lépést.

2. Vízmentes dimetilformamiddal elkészítünk egy 40 mg/ml koncentrációjú Ν,Ν-karbonil-diimidazol oldatot.

3. Az elektródokat 90 percen át szobahőmérsékleten ebben az oldatban tartjuk, miközben kívánt esetben enyhe mechanikai kevertetést (rázatást) alkalmazunk.

4. Az elektródokat kiemeljük az oldatból és szárítással eltávolítjuk a karbonil-diimidazol oldat felesleget, majd az elektródokat további 90 percre frissen előállított glukózoxidáz oldatba helyezzük.

5. Végrehajtjuk az előbbi 6. és 7. lépést.

C. Kezelés DFDNB-vel

1. Végrehajtjuk az előbbi A. sorozat 1-3. lépését.

2. Az elektródokat alaposan mossuk 0,1 mólos pH 8,5 nátriumborát pufferrel.

3. Metanollal elkészítünk 5 ml 0,1 mólos 1,6-dinitro3,4-difluor-benzol oldatot és az elektródokat 10 percen át szobahőmérsékleten ebben az oldatban tartjuk.

4. Az elektródokat eltávolítjuk, és a borát pufferrel alapsan mossuk, majd további 90 percre szobahőmérsékleten glukózoxidáz oldatba helyezzük.

5. Végrehajtjuk az A. sorozat 6. és 7. lépését

A rögzítési eljárásban más típusú kapcsolószerek is alkalmazhatók, ideértve a különböző lánchosszúságú kapcsoló ágenseket, amilyen pl. a diimidátok csoportja (pl. dimetil-malonimidát vagy dimetil-parafasav-imidát).

Egy másik megoldás szerint azt találtuk, hogy az enzim egyszerű adszorpciója a gyantával megkötött, platinát vagy palládiumot tartalmazó szénpor felületre (amelynek során nem alakítunk ki keresztkötéseket), hatásosnak bizonyulhat egyes enzimek, konkrétan a glukózoxidáz esetében.

A rögzített enzim felületét rendszerint - de nem szükségszerűen - fizikai védelemben részesítjük, egy megfelelően porózus - pl. polikarbonát - film vagy membrán segítségével, amelynek természetesen permeábilisnek kell lennie a meghatározandó enzim szubsztrátra (pl. a glukózra). Ezek a membránok azzal a bizonyos mértékig hátrányos következménnyel járnak, hogy nö5

HU 202 577 Β vélik a szenzor válaszreakciójának időtartamát. Ennek ellenére, még ilyen membránok alkalmazása esetén is a találmány szerinti szenzorok képesek olyan reakcióidők biztosítására, amelyek összehasonlíthatók - és sok esetben lényegesen jobbak - a szokásos enzimelektródokkal elérhetőkkel (elérhetőknél).

Mint már említettük, a találmány tárgyát közelebbről glukózoxidáz elektródok képezik, azaz olyan elektródok, amelyekben a rögzített enzim glukózoxidáz. A következőkben azonban kimutatjuk, hogy más oxidoreduktázok is alkalmazhatók, bár nem mindig ugyanolyan hatásfokkal. Ez nem szükségszerűen az enzim termel szetes hatástalanságával függ össze, hanem más tényezőkre vezethető vissza. Az oxálsav oxalát-oxidáz alkalmazásával végzett meghatározása során pl. maga az oxálsav szubsztrátum elektrokémiai oxidáción megy át az alapelektródon, és ez nagymértékben elfedi az enzim hatását Megfelelő oxidoreduktáznak tekinthető azonban több más enzim, pl. a laktát-oxidáz, galaktóz-oxidáz, koleszterin-oxidáz és más, peroxidot termelő enzimek, valamint rögzített enzimek kombinációi, ideértve egy nem oxidáz és egy oxidáz típusú enzim kombinációját (ezek közül az első a számunkra érdekes szubsztrátra hat és oxidálható szubsztrátumot képez az oxidáz számára, míg az utóbbi az oxidálható termékkel reagál és eközben mérhető áramerősség észlelhető, amely arányos a számunkra érdekes szubsztrát koncentrációjával). Ilyen kombináció pl. a beta-galaktozidáz és a glukózoxidáz keveréke (a laktóz kvantitatív meghatározására) vagy a beta-glukán-depolimeráz, a beta-glukozidáz és a glukózoxidáz keveréke (a beta-glukánok meghatározására).

A szenzor más típusú alkalmazásai közé tartozik olyan enzimes vagy nem enzimes reagensek vagy eljárások alkalmazása, amelyek egy prekurzor reakcióban reagálnak egy számunkra érdekes primer szubsztrattal és a kapott tennék olyan anyagot tartalmaz, amely viszont szubsztrátként hat a találmány szerinti enzimelektród szempontjából. Az ilyen prekurzor reakciókra számos példa található az immunkémia területén és a szakember számára nyilvánvalók azok a módszerek, amelyek segítségével az ilyen reakciók felhasználhatók szenzorok - ideértve az immunszenzorokat is - létrehozására, a találmány szerinti enzimelektródok alkalmazásával.

A találmány szerinti elektródok primer alkalmazási területe azonban olyan bioszenzorok létrehozása, amelyek egy oxidálható anyag - különösen glukóz - egy mintában, különösen klinikai mintában - amilyen a vér, szérum, plazma, vizelet, izzadtság, könny és nyál - való kimutatására és/vagy kvantitatív meghatározására alkalmasak.

Más lehetséges, nem klinikai alkalmazások pl. a következők:

a) fermentációk követése,

b) üzemi eljárások ellenőrzése,

c) a környezet vizsgálata, pl. folyadékok és gázok ellenőrzése a termék-koncentráció és a környezetszennyezés szempontjából,

d) élelmiszerek vizsgálata,

e) állatgyógyászati alkalmazások, különösen olyanok, amelyek az előbbiekben említett klinikai alkalmazásokhoz kapcsolódnak.

Mivel a találmány szerinti enzimelektród anyagot tartalmazó bio- és más szenzorok tartalmazhatnak más szerkezeti elemeket is - amilyenek az elektromos vezetékek, elektromosan nem vezető (szigetelő) hordozók vagy minták, stb. -, meg kell jegyeznünk, hogy az ilyen elemek hagyományos szerkezetűek és részletes leírást nem igényelnek. Elég annyit mondanunk, hogy ha mint rendesen - az elektródanyaga vékony papírlap vagy érintkezőlemez, a bioszenzor általában magában foglal egy szigetelő hordozó elemet vagy mintát, amelyre az elektródanyagot felszereljük és amelynek segítségével az elektródanyag bevihető a mintába. Ilyen esetekben az elektródanyag darab tényleges mérete egészen kicsi lehet: max. néhány mm² vagy még kisebb. Az elektród anyagával az elektromos érintkezés többféle módon alakítható ki, pl. oly módon, hogy az elektród anyagát közvetlenül érintkeztetjük egy elektromosan vezető érintkezéssel vagy kimenettel, amely pl. platinából, ezüstből vagy más megfelelő vezető anyagból készül. Ha az elektród anyaga kellő vastagságú és szilárdságú ahhoz, hogy az elektród teljesen önálló lehessen, eltekinthetünk a szigetelő hordozók vagy elektród-vivőanyagok alkalmazásától és az elektromos vezetékeket közvetlenül hozzáköthetjük az elektródanyag felületéhez.

Elektromosan félvezető felületként - abban az esetben, ha karbonpapírtól különböző hordozóelemet alkalmazunk - pl. egy „terepen használható tranzisztor” (FET) felülete vehető igénybe, de karbonpapírtól eltérő hordozóként elektromosan nem vezető felületet is beiktathatunk. Az utóbbi esetben az elektromos érintkezés közvetlenül a gyantával megkötött szén vagy grafit rétegben jelenlevő platinacsoportbeli fémmel alakítható ki.

A találmány szerinti enzimclektród anyagok előállítását és jellemzőiket a következő példákban mutatjuk be.

1. példa (összehasonlító) 56-163 447 sz. közzétett japán szabadalmi bejelentés szerinti megoldás.

A találmány szerinti enzimelektródot állítunk elő oly módon, hogy elektrolízis segítségével vékony (1 pm-nél kisebb) réteg platina fémet viszünk fel egy elektromosan vezető alapra; ez egy porózus, gyantával kötött karbonpapír, amely 30 nm névleges részecskenagyságú (Vulcan XC-72) vezetőképes szénszemcséket (szénkormot) tartalmaz. A koromszemcséket kötőanyagként 10 tömeg% politetrafluoretilén alkalmazásával rögzítjük a kereskedelemben kapható grafitos karbonpapírlapra.

Aspergillus nigerből származó glukózoxidázt rögzítünk a platinát tartalmazó karbonpapír különböző darabjain, egyrészt az előbbiekben leírt karbodiimides kezeléssel, másrészt glutáraldehid segítségével keresztkötések kialakításával. Ez utóbbi műveletet úgy végezzük, hogy az elektród platinatartalmú felületét vizes glukózoxidáz oldattal kezeljük, az elektródot szárítjuk, majd a lerakodott enzimmel keresztkötéseket alakítunk ki, glutáraldehiddel, 25 °C-on való kezelés során.

A további vizsgálat céljából az elektród anyagot 2 mm átmérőjű korongokra vágjuk fel.

2. példa. Glukóz elektród

Aspergillus nigerből származó glukózoxidázt rögzítünk platinát tartalmazó karbonpapíron, amelyet a Prototech Co. (Massachussetts, USA) a „Prototech” kereskedelmi néven hoz forgalomba. Ez platinatartalmú szénpor részecskéket (Vulcan XC-72) tartalmaz, amelyeket a 4 044 193 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1. példája szerint állítunk elő. Úgy járunk el,

-611

HU 202 577 Β hogy kolloid platinát (részecskenagyság 1,5-2,5 nm) választunk le a szénpor (névleges részecskenagyság 30 nm) felületére, komplex platinaszulfitsav (II) H₂O₂ felhasználásával történő oxidatív elbontásával. Ezt követően kb. 50 tömeg% politetrafluoretilén alkalmazásával a platinával bevont szénport öntéssel és ragasztással felvisszük egy, a kereskedelemben kapható grafitos karbonpapír felületére. A végtermék platinaterhelése 0,24 mg.cm².

APrototech anyag különböző mintáin glukózoxidázt rögzítünk az előzőkben leírt kezelések valamelyikével, mint karbodiimides, karbonil-diimidazolos és DFDNBvel végzett kezeléssel.

Külön kísérletekben glukózoxidázt rögzítünk a Prototech anyagon glutáraldehides keresztkötéssel és egyszerű adszorpcióval, azaz keresztkötések kialakítása nélkül. Ez utóbbi esetben úgy járunk el, hogy a Prototech anyagot pH 5,6 acetát pufferrei frissen készített glukózoxidáz oldatban (5,0 mg-ml¹) szuszpendáljuk és 90 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Egy másik megoldás szerint az enzim adszorpciója célszerűen elektrofoiézis segítségével hajtható végre. Ebből a célból az elektród alapanyagot pozitív feszültség mellett 60 percen át szuszpendáljuk az enzim oldatban.

3. példa

Az előzőkben leírt karbodiimides kezelést alkalmazva a következő enzimeket rögzítjük a Prototechtől származó platinatartalmú karbonpapírokon, ill. egy PTFEkötésű karbonpapíron, amelyet a 4 044 193 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint platinával előkezelt szénporból állítottuk elő:

laktát-oxidáz galaktóz-oxidáz glukózoxidáz/beta-galaktoxidáz.

A találmány szerinti eljárás előnyeinek és a találmány szerinti enzimelektród anyagok tulajdonságainak szemléltetésére, a technika állása szerinti elektródokkal való összehasonlítás céljából, az előző példák szerint előállított enzimelektród anyagokat megvizsgáljuk az amperometriás válasz szempontjából. Ezt a vizsgálatot egy módosított Ránk oxigén elektród rendszert (Ránk Brothers, Bottisham, Cambridge) tartalmazó cellában hajtjuk végre, amelyet a rajzokon mutatunk be, és amelynek leírása az Anal. Chim. Acta 183, 59-66 (1986) helyen található meg. Ebben a rendszerben a membránt egy (5 mm átmérőjű) karbonpapír enzimelektród helyettesíti, amelyet a találmány szerint állítottuk elő; ezt a platinagomb-elektród hordozza. A mérőelektródot (platinafólia) a cella fedőlapján keresztül merítjük be. A referenciaelektród egy ezüst/ezüstklorid elektród. Egyes vizsgálatokban (védőmembrán jelenlétében és nem kevertetett ólatokban) kételektródos elrendezést alkalmazunk: a mérő/vonatkozási elektródot egy kloriddal bevont ezüstgyűrű képezi. A pH 7,0 pufferrei elkészített vizsgálandó oldatokat rendszerint mágneses keverővei kevertetjük, míg a munkaelektródot a vonatkozási elektródhoz képest 600 mV feszültségen tartjuk, egy potenciaosztat segítségével. Ha a kételektródos elrendezést alkalmazzuk, 325 mV feszültséget állítunk be. Megfelelő ideig várunk annak érdekében, hogy a háttéráram alacsony értékre álljon be, majd fecskendővel bevisszük a szubsztrát oldatot A válaszreakcióban keletkezett áramot diagram regisztráló berendezéssel rögzítjük.

A kapott eredményeket részletesen az alábbiakban beszéljük meg, és grafikusan a rajzokon mutatjuk be, amelyek közül az a)

1. ábra a találmány szerinti glukózoxidáz elektród válaszreakcióját tünteti fel más típusú szénelektródokon rögzített glukózoxidázzal összehasonlítva;

2. ábra egy első diagram, amely a glukózoxidáz elektród stabilitását tünteti fel;

3. ábra egy második diagram, amely a glukózoxidáz elektród egy adott glukóz-koncentráció tartományban mérhető reakcióját szemlélteti;

4. ábra egy olyan diagram, amely a glukózoxidáz elektród változó környezeti oxigénnyomás körülményei között észlelhető reakcióját ábrázolja;

5. ábra egy diagram, amely a glukózoxidáz elektród szobahőmérsékleten való tárolása eredményét mutatja be;

6. ábra egy összehasonlító diagram, amely azt mutatja be, hogy a szobahőmérsékleten való tárolás hogyan befolyásolja a technika állása szerinti elektródot;

7. ábra összehasonlítást mutat be egy, a találmány szerinti, glutáraldehiddel rögzített glukózoxidáz elektród és egy, a technika állása szerinti, glutáraldehiddel rögzített glukózoxidáz elektród válasza között;

8. ábra a 7. ábrának felel meg, de a rögzítés karbodiimiddel történik;

9. ábra összehasonlítást mutat be egy, a találmány szerint karbodiimiddel rögzített laktát-oxidáz elektród és egy, a technika állása szerinti, karbodiimiddel rögzített laktát-oxidáz elektród válaszreakciója között;

10., ill. 11. ábra a találmány szerinti galaktóz-oxidáz és laktát-oxidáz elektród válaszprofilját szemlélteti és a

12. ábrán egy találmány szerinti kombinált glukózoxidáz/beta-galaktozidáz elektród válaszprofilja látható.

A 13. ábrán egy találmány szerinti glukózoxidáz elektród válaszgörbéjét mutatjuk be, amelynek előállításakor politetrafluoretilén helyett a platinával bevont szénport kötőanyagaként poli vinilacetátot alkalmazunk.

A14. ábra egy találmány szerinti glukózoxidáz elektród válaszgörbéjét szemlélteti; ebben az esetben a glukózoxidázt olyan karbonpapír elektródon rögzítjük, amelynek felületi rétegét (politetrafluoretilén) gyantával kötött, palládium bevonatú szénpor alkotja.

A 15. ábra a módosított Rank-f. elektrokémiai cellát ábrázolja, amelyet a találmány szerinti elektródok működési jellemzői meghatározására használtunk fel.

A16. ábra a kételektródos konfigurációt szemlélteti, amelyet egyes mérések esetében alkalmaztunk.

Mindenekelőtt a 15. ábra kapcsán megjegyezzük, hogy az itt közölt adatok zömét a 15. ábrán bemutatott elektrokémiai cella felhasználásával kaptuk. Ez egy kétrészes cella, amely az (1) alappal és a (2) gyűrűs köpenynyel rendelkezik; ez a (h) vízkamrát fogja össze, amelyen keresztül víz cirkuláltatható, a cella hőmérsékletének ellenőrzésére. A két részt a (3) rögzített menetes karmantyú köti össze. Az (1) alapban középen helyeztük el a (d) platina érintkezőt, amelyre a rögzített enzimet hordozó papírelektród anyagból kivágott (a) korongot helyezzük. Ezt az (e) és (f) O-gumigyűrű-tömítés rögzíti a platina érintkezőn, a cella két részének összekapcsolásakor.

A cella természetesen tartalmazza a szubsztrát oldatot. Tetejébe illesztve helyezkedik el a (g) állítható csatlakozó által hordozott (4) dugasz; ebbe szereljük be a (b) platina mérőelektródot és a (c) Ag/AgCl vonatkozási elektródot. Mint említettük, a vizsgálatokat 600 raV-ra

-713

HU 202 577 Β beállított munkaelektródokkal végezzük és a keletkezett áramot egy 0,14 cm² névleges felületű, a szubsztrát oldatnak kitett elektróddal mérjük. Az ábrákon az eredményeket áramsűrűség dimenzióban (a szubsztrát oldatnak kitett (a) elektród egységnyi felületére számított áramkitermelésként) fejezzük ki.

A 16. ábrán látható, hogy a (B) platina érintkezést a (C) referencia/méró elektród veszi körül, tóle egy (G) szigetelő hüvellyel elválasztva. Egy „O” gyűrűre szerelt porózus polikarbonát membránt használunk fel arra, hogy az (E) vizsgálati korongot (a rögzített enzimet tartalmazó papírelektród anyagból) a platina csatlakozón rögzítse. Az (F) nyitott mintakamra lehetővé teszi, hogy a minta csepegtetéssel legyen a membránra felvihető. Az elektródot tartalmazó cellát 325 mV feszültségre állítjuk be és az áramot az (A) potenciosztát segítségével mérjük. A kételektródos, 325 mV-ra beállított cella alkalmazása előnyösebb, mint a szokásos 3 elektródos, 600 mV-ra beállított celláé, nevezetesen használata egyszerűbb és a háttéráram alacsonyabb. Egyik rendszernek a másikkal szemben való előnyben részesítése azonban nem befolyásolja lényegesen a találmány szerinti elektródok teljesítmény jellemzőit, amilyen a tárolási stabilitás, stabilitás a használat során, a válasz vagy az oxigénkoncentrációtól való függés linearitása.

A kapott eredményeket részletesebben a következőkben tárgyaljuk meg.

A válaszok linearitása és időfüggése

Az 1. ábrán jellegzetes példákat mutatunk be az elektródválaszra, amely fokozatos glukózadagolás esetén - a 0-35 mM végkoncentráció tartományban - megfigyelhető, 3 elektródás cella és kevertetés alkalmazása mellett. Mindhárom elektród - A, B és C - glukózoxidázt tartalmaz, amelyet az előbbi A. eljárással vittünk fel. Az A elektród egy találmány szerinti aktivált, platinával bevont szénhordozóból áll, azaz egy gyantával (politetraíluoretilén) megkötött, platinával bevont szénporból öntött lap. A B elektród egy elektromosan vezető test, amelyet egy grafitrúd metszetéből vágtunk ki; a C elektród egy elektromosan vezető hordozó, amelyet egy, a kereskedelemben hozzáférhető, platinát nem tartalmazó karbonpapírból vágtunk ki. Mint látható, a B és a C elektród kisebb, viszonylag elnyújtott válaszokat ad, amelyek az irodalomban általában a mediátoros szenzorokkal kapott bemutatott eredményekre emlékeztetnek. Az A elektród megbízhatóbb és állandó válaszokat ad és a válasz ideje kb. 1 másodperc. (A kezdeti válasz csúcsán megfigyelhető jelben a „hegy” részben jelentéktelen melléktermék, amely az injektálási módszerrel függ össze; az érdeklődésre számot tartó jel a glukóz koncentrációtól függő plató.) Mindhárom elektród lényegében lineáris választ ad a glukóz koncentráció függvényében (a 2. ábrán csak az A és a C elektródra vonatkozó eredményeket mutatjuk be). E koncentrációtartomány átfogja azt a közt, amely a glukóz vérben való közvetlen meghatározásához szükséges (0-30 mM). Hasonló eredményeket kapunk A típusú elektródokkal, ha az előbbi B rögzítési eljárást alkalmazzuk. Ez arra mutat, hogy az eljárás nagyobb tartomány esetében még jobb linearitással jellemezhető.

Mint a 2. ábrán ezt bemutatjuk, az A elektród válasza 23 nap múlva látszólag változatlan, a többi elektródé azonban (amint ezt a C elektródra vonatkozóan bemutatjuk) az időben romlik. Ilyen típusú viselkedést figyel8 tünk meg az előbbiekben leírt többi rögzítési mód esetében is. Mindegyik ilyen eljárás alkalmazható volt megfelelő válasz adására képes és stabil elektród előállítására az A elektród esetében alkalmazott szén anyagból, de nem megfelelő elektródokat szolgáltatott számos más inaktív szénanyag esetében. Az A elektród reakcióideje tehát 23 nap elteltével változatlannak bizonyul, míg más elektródok megnövekedett reakcióidőket mutatnak. A kiindulási válasz ideje kb. 23-30 másodperc; ez 8 nap múlva 2-3 percre nő. Az aktív elektródok (pl. az A elektród) esetében általában egy bizonyos csökkenés figyelhető meg a reakcióidőben az első nap során, de ekkor a reakcióidő az idő tekintetében egy platót ér el. A nedvesen (pH 5,6) 4 ’C-on tárolt és egy 6 hónapos periódus alatt időközönként vizsgált A típusú elektródok (az első néhány nap után) csak kismértékű változást mutattak és bár ezen időtartam után egy bizonyos fokozatos romlás volt megfigyelhető, 12 hónap után a válasz még mindig az eredeti érték 70%-a volt

Az 1. és 2. ábra az elektród áram kitermelését mutatja be - μΑ. errr² dimenzióban - 600 mV üzemi feszültség mellett, a 15. ábrán bemutatott 3 elektródos konfiguráció alkalmazása esetén.

A találmány szerinti elektródok megnövekedett tárolási idejét és stabilitását szemlélteti az 5. ábra is, amely a karbodiimiddel rögzített glukózoxidáz elektród 5 mmól glukózra adott válaszát mutatja be pH 5,6 acetát pufferben szobahőmérsékleten 180 napon át való tárolás után. A technika állása szerinti elektródra (1. példa) vonatkozó összehasonlító eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be. Az 5. ábrának megfelelő méréseket 600 mVon végezzük a 3 elektródos rendszerrel, a 6. ábra szerintieket pedig 325 mV-on, a 2 elektródos konfigurációval.

A technika állása szerinti elektródokkal (1. példa) és a találmány szerinti elektródokkal - különböző enzimek és különböző rögzítési eljárások alkalmazásával - kapott válaszgörbék további összehasonlítását a 7-9. ábrán mutatjuk be. Valamennyi mérést 325 mV-on végezzük.

A laktátra, galaktózra és laktózra (kombinált glukózoxidáz és beta-galaktozidáz) vonatkozó válaszgörbéket a 10-12. ábrán szemléltetjük. Ezeket a méréseket 600 mV-on végezzük.

Az elektród újra felhasználása: az ismételt mérésekre való alkalmasság

Folyamatos terhelés során a találmány szerinti elektródok kivételes tartósságot mutatnak; ez az élettartam korábban nem volt megfigyelhető. Az előbbi állítást a következő, extrém szigorúságú lépésekből álló reakciósorral igazoljuk.

Először egy glukózoxidáz elektródot (2. példa) elhelyezünk egy zárt cellában és hagyjuk amperometriásan reagálni egy kevertetett glukóz oldattal (kiindulási koncentráció 5 mM, kiindulási áramerősség 100 μΑ). A rendszert 18 ótún át folytonosan működtetjük; ezen idő alatt a jel értéke fokozatosan 10 μΑ alá csökken. A képződött teljes elektromosság az elméletileg várt érték kb. 75%-ának felel meg (azon az alapon számítva, hogy 1 molekula glukóz 2 elektront ad le). Ezt a kísérletet ugyanezzel az elektróddal azonnal megismételjük a glukóz oldat kicserélése mellett. Ennek során az eredeti áram viszonyok állnak újra be, és a szubsztrát folyamatos terhelés alatt való „kimerülése” azonos eredményeket ad.

Egy következő kísérletben az áramszolgáltatást

-815

HU 202 577 Β ugyanennek az elektródnak a felhasználásával újabb 137 órán át folytatjuk, de a glukóz oldat utánpótlását egy nagy tartályból történő cirkuláltatással biztosítottuk oly módon, hogy 5 mM koncentrációt tartsunk fenn. A kitermelés egy 100 órás időtartam alatt lassan csökken, majd 45 μΑ értéken stabilizálódik; ez az érték további 40 órán át fennmarad. Lehetséges, hogy ezen időtartam alatt egy bizonyos mennyiségi, lazán kötött enzim vált le az elektród hordozóról (bár nem figyelhető meg az áramkitermelésnek a kevertetési sebességtől való függése). ^vagy valamilyen más tényező hatása érvényesült.

Az előbbiekben leírt hosszú időtartamú kísérletek elvégzése után a korábbiakban leírt módon vizsgáljuk az elektród válaszreakcióját, egy meghatározott glukóz koncentráció tartományban. Bár a szignál amplitúdója kisebb, mint a frissen összeállított berendezés esetében, az elektród nagyon kielégítő „lépcsős” működést mutat a 0-30 mM glukóz koncentráció tartományban. Ez arra mutat, hogy a terhelés alatt való hosszú használat eredményeként nem szenvedett semmiféle káros hatást Ezt a következtetést három további kísérletben erősítjük meg I heti (4 'C-on való), majd 8 heti tárolás után, illetőleg további 113 órán át ismét terhelés alatti üzemeltetéssel. A meghatározott glukóz koncentráció tartományra vonatkozó válaszreakciók változatlannak bizonyulnak.

Ezek a vizsgálatok arra mutatnak, hogy egy elektród összesen legalább 250 órán (vagy több mint 15 000 percen át) működtethető, azaz az elektród anyag használhatósági időtartama becsülhetően rendkívül hosszú. A technika állása szerinti enzim elektródok üzemi élettartama rendszerint sokkal rövidebb, mint a találmány szerintieké: sok esetben csak néhány órát tesz ki: Tumer, Proceedings Biotech 85 (Europe), Online Publications, Pinner, Nagy-Britannia, 1985,181-192). A ferrocénhez kötött glukózoxidáz alapú glukóz elektródok felezési ideje pl. általában kb. 24 óra (Tumer, idézett hely), míg Cass et al. (Anal, Chem. 56,667-673,1984) ugyanerre az elektródra egy 50 órás, teljes stabilitásra mutató élettartamot ad meg. Ha egy (találmány szerinti) elektródot 50 egymásutáni mérés során 5 mM glukóz oldalban alkalmazunk, a standard eltérés 1%-nál kisebb.

Alkalmasság a folyamatos követés szempontjából

Az előbbiekben leírt újra felhasználási kísérletekben rögzített végső válasz-szint (45 μΑ 5 mM glukóz oldatban) változatlan marad levegőztetett oldatok alkalmazása esetén és több hetes további tárolás után is változatlan marad. Az erről az elektródról származó áramkitermelés stabilitását -12 óra alatt - ellenőrzött kísérleti körülmények között vizsgáljuk, sterilizált glukóz oldatok felhasználásával olyan körülmények között, amelyeket a bakteriális szennyezés hatására fellépő esetleges glukóz veszteség kiküszöbölése szempontja alapján alakítottunk ki. A jel a teljes időszak alatt állandó marad; ez arra mutat, hogy az elektród kiindulási „kondicionálása”, kevertetett és cirkuláltatott oldatban, több nap alatt teljes eredménnyel jár. Ezek az elektródok - amelyeket az előbbi, vagy valamilyen más, megfelelő kondicionálási/mosási eljárással megfelelően kondicionálunk, ott találnak alkalmazásra, ahol a glukóz koncentráció folyamatos követésére van szükség.

Az egyes sarzsok reprodukálhatósága

Feltéve, hogy megfelelően „tiszta” előállítási körülményeket létesítünk, a találmány szerinti eljárással előállított minden elektród a leüt módon működik, és jó eredményeket ad a glukóz meghatározása során. Azonos méretű, azonos eljárással előállított elektródpárok közel azonos válaszokat szolgáltatnak (azonos körülmények között való kipróbálás során az áramerősség értéke néhány %-os eltérést mutat). Ezenkívül valamennyi ily módon előállított elektród élettartama nagyon hosszú és tartóssága, mint ezt az előbbiekben jeleztük, megbízható, szemben a technika állása szerinti glukóz elektródokéval. így a találmány szerinti elektródok megfelelően tárolhatók és több héten át használhatók, míg a technika állása szerinti elektródok gyakran nagy eltéréseket mutatnak ugyanazon a sarason belül. Tumer (idézett hely) megjegyzi, hogy pl. bár egy sarason belül néhány glukózoxidáz elektród élettartama alkalomadtán kivételesen hosszú lehet (felezési idő600óra), a többség felezési ideje kb. 24 óra. Ezért az ilyen elektródok 24 óránál csak kevéssel hosszabb időtartamokon át használhatók biztonságosan.

A válasz függése az oxigén koncentrációtól

Az oldott oxigén hatásának vizsgálatára egy kísérleti cellát úgy módosítunk, hogy a glukóz elektródon kívül az egy oxigén elektródot is magába foglaljon. Kísérleteket végzünk amelyekben az oldott oxigént argonnal való átöblítéssel kiűzzük a rendszerből. Ilyen körülmények között az (előbbi) A típusú elektród glukóz hozzáadására gyors választ ad; ez arra mutat, hogy működési mechanizmusa nagymértékben független a környezeti oxigén koncentrációtól. Ez az eredmény az elektród felületi szerkezete és az enzim előnyös módon történt rögzítése kombinációjából származó konkrét jellemzőknek tulajdonítható és korábban nem volt megfigyelhető.

Egy további kísérletben (4. ábra) követjük az A típusú (az előbbi A módszerrel előállított) elektród kimenő szignáljának folyamatos argon-öblítés közben -600 mV feszültségen - való alakulását. Egyidejűleg mérjük a minta oxigén nyomását. A 4. ábrán bemutatott eredmények lényegében állandó áramszignált jeleznek (felső diagram), amely lényegében független a mintaoldat oxigén nyomásától (alsó görbe). Egy másik kísérletben a szignál látszólag nem változik egy 10 perces időtartam alatt, míg az oxigénnyomás gyorsan csökken. Egy másik (a B eljárással előállított) elektród esetében megfigyelhető az áramerősség gyors csökkenése - 3 perc alatt 5% alá -, miközben az oxigén 90%-a eltávozott. Az áramerősség növekedése ugyancsak megfigyelhető, ha az oxigént visszavezetjük a rendszerbe, bár a növekedés viszonylag lassan megy végbe. Argonnal való hosszas öblítés során az elektród csak korlátozott glukóz koncentráció tartományra reagál és lehetséges, hogy oxigénnyomok jelenlétére van szükség az enzim funkció azon részének „gerjesztésére”, amely hidrogénnek a szubsztrátumból való eltávolításáért felelős. Az sem zárható ki, hogy az elektródon (alacsony koncentrációban és az oxigén elektród által nem kimutatható módon) oxigén adszorbeálódott és bizonyos mértékben ez is szerepet játszik az elektród viselkedésében.

Enzim terhelés

A glukózfogyás sebességére és a maximális áramsűrűségekre vonatkozó független mérések arra mutatnak, hogy az (A típusú) elektród által aktívan rögzített enzim mennyisége kb. 7 tíg/cm² elektród-felület mennyiségű

-917

HU 202 577 Β aktív enzimnek felel meg. (Az irodalomban kevés információ áll rendelkezésre a hasonló, glukózoxidáz alapú bioszenzorok enzimterhelésére vonatkozóan.) A rögzítési eljárás során azt találjuk, hogy nagyon aktív elektródok állíthatók elő még abban az esetben is, ha az enzimoldatot nagymértékben - pl. 10-szeresére - hígítjuk.

A válasz hőmérsékletfüggése

Az A típusú elektródokat a 0-30 mM glukóz koncentráció tartományban 10 és 37 *C közötti hőmérsékleten vizsgáljuk. A hőmérsékleti együttható 2-3% (fok) (kb. 24 kJ mól·¹ Arrhenius-f. aktiválási energiának megfelelően). Ez összehasonlítható azzal 4%/C értékkel, amelyet a ferrocénnel működő bioszenzorok esetében leírnak (Cass et al., 1. az idézett helyet).

pl'1függés

Megfigyelhető, hogy a válaszreakció kismértékben függ a pH-tól. pH 7,0 és 8,0 érték között azonban a válasz gyakorlatilag pH-függetlennek mutatkozik, eltekintve a nagyon magas (25 mM-nál nagyobb) glukózszintek esetétől.

A védőmembránnal bevont elektród válaszreakciója

Azt találtuk, hogy egy polikarbonát membrán kis változást okoz az elektród válaszreakciójában, kevertetett rendszerben. Nem kevertetett rendszerben a válasz időtartama kb. 20 másodperc.

Az elektród teljes vérminták elemzésére való felhasználása

A polikarbonáttal bevont elektródok megfelelően alkalmazhatók a glukóz vérben való közvetlen meghatározására. Az aszkorbinsav sók interferenciája 0,2 mmól/liter koncentrációban a teljes jel kb. 2,5%-át képezi, 5 mmól/liter glukóz koncentráció mellett.

Az elektród különböző elrendezésű analitikai bioszenzorokban való alkalmazása

A találmány szerinti enzim elektród Rank-típusú cellákban, módosított Clark elektród alkalmazása mellett való sikeres felhasználását, amelyet az előbbiekben írtunk le, a fent tárgyalt eredmények igazolják. Ugyancsakkimutatható, hogy az elektród kiváló eredményeket ad más szenzor üzemmódokban, pl. minták meghatározása esetén.

Kialakítottunk pl. egy sokféle, szokásos elektródban általánosan használt, 2 mm átmérőjű szondát, amelyben az elektródot egy huzalra szereltük fel és beforTasztottuk egy üvegcsőbe. Ez (referencia- és mérőelektródokkal kiegészítve) bemeríthető egy kevertetett vizsgálandó oldatba, amelyet főzőpohárba vagy más edénybe öntöttünk be. így megbízható méréseket végezhetünk a glukóz koncentráció meghatározására anélkül, hogy szükség lenne az atmoszférikus oxigén kiküszöbölésére. Ezzel és kisebb szondákkal való, hasonló kialakítás mellett végzett mérések alapján az állapítható meg, hogy az elektród áram formájában jelentkező válasza egy meghatározott glukóz koncentrációjú oldatban közel arányos az elektród virtuális felületével vagy súlyával.

Szerkesztettünk olyan szondákat is, amelyekben az elektród méretei minimálisak (kb. 0,25-0,50 mm² felület, 30-60 gg tömeg). A szálra szerelt elektródot műanyag hüvellyel vonjuk be és a hüvellyel ellátott szondát behelyezzük egy katéter tűbe (1,5 mm átmérő). A tű egy gumidugón keresztül bevezethető egy edénybe (amely egy fermentor vagy hasonló berendezés vagy egy nagy tartály részét képezheti) és szenzor szondaként alkalmazható az edényben található oldat glukóz koncentrációjának mérésére. Ebben az elrendezésben az érzékelő elektródot a bemerítés idején védi az azt körülvevő tű, de szükség esetén a beviteli fázist követően a tű el is távolítható.

Míg az előbbiekben leírt miniatűr szondák jellegzetesen az 1-10 (lA tartományba eső jeleket adnak, megfelelő műszerezéssel biztosítható, hogy pontos méréseket végezhessünk az 1-100 nA tartományban. Mivel ebben a tartományban az áramjeleket (a találmány szerinti) nagyon kis méretű (kb. 0,005 mm² felületű, 1 gg tömegű) enzimelektródok szolgáltatják, ezek az elektródok beépíthetők olyan finom tűs mikroszondákba, amelyek az in vivő mérésekhez használt katéterekben kerülnek felhasználásra.

Bár a találmány szerinti elektródok működési alapmechanizmusa nem teljesen tisztázott, a kapott eredmények alapján levonhatunk bizonyos következtetéseket, így ismeretes, hogy aktív felületi csoportok jelenléte a szénen - ezek magas hőmérsékleteken végzett felületi oxidációval alakíthatók ki - hajlamossá teszi a felületet keresztkötéses reakcióba lépésre (ilyen reakciók szükségesek az enzimek rögzítéséhez), és az ilyen felületi csoportok száma és köre valószínűleg növelhető, ha vékonyréteg-felületi katalizátorként platina (vagy más, platina csoportbeli fém) van jelen (Kinoshita-Stonehart, Modem Aspects of Electrochemistry, No. 12, kiadó Bockris és Conway, Plenum Press, New York, 183-266, 1977). Nyilvánvaló, hogy különböző rögzítési módok esetén az enzimek kötődése különböző lehet. Számos leírt eljárás szerint pl. különböző aminosav maradékokat alkalmaznak az enzim rögzítésére, míg a cianursavklorídos aktiválású anyagokkal kötött enzimek esetében a kapcsolódás kizárólag a lizin maradékon keresztül jön létre (Ianielloés Yacynych, Anal. Chem. 53,2090-2095, 1981). Az enzimek tercier szerkezetében a rögzítés következtében végbement változások várhatóan nem azonosak minden rögzítési eljárás esetében. Ezzel magyarázható, hogy az ilyen típusú munka során nagy változatosság figyelhető meg az enzim aktivitásban és stabilitásban.

A találmány szerint alkalmazott alapelektród rendkívül heterogén jellege - szemben az olyan típusú elektródokkal, amelyeket réteges, nem heterogén szerkezet jellemez (ilyeneket ír le pl. az 56-163 447 sz. közzétett japán bejelentés) - maximálissá teszi annak a valószínűségét, hogy egy integrált háromdimenziós szerkezetben számos, különböző típusú és orientációjú keresztkötés alakuljon ki. Keresztkötöző reagensek távollétében ez szintén erős felületi adszorpciót eredményez. A kötött szénmátrixban jelenlevő pórusok lehetővé teszik, hogy az enzimmolekulák bejussanak a mátrix komponenseibe és körülvegyék ezeket; ez igen nagy felületet biztosít az enzimnek és olyan konformációk kialakulását teszi lehetővé, amelyek az enzim stabilitása és aktivitása szempontjából kedvezők. (Ez ellentétes a sokkal kisebb felületű, aránylag sík felületekre - amilyen a platina, az „üveges” szén vagy a grafit - való kötődés esetével, amelyben konformációs feszültségek lépnek fel, amint ezt korábbi irodalmi adatok jelzik). Ezenkívül a találmány szerinti elektródok rendkívül alacsony reak-1019

HU 202 577 Β cióideje (1-2 másodperc) arra mutat, hogy rendkívül gyors elektronátvitel következik be az elektródra; ez nemcsak magas enzimaktivitást igényel, de elő is segíthető magán az elektródon kellő számú elektron receptor hely jelenléte. Ezeket a platinával bevont finom szén részecskék nagy sűrűsége biztosítja, amelyek igen nagy felületen oszlanak el a mikroszerkezeten belül. Ez maximálissá teszi annak a valószínűségét, hogy a felületi platina csomópontok hozzáférnek az enzim aktív helyeihez.

Annak kimutatására, hogy más gyanták mint kötőanyagok is alkalmazhatók a találmány szerinti enzimelektródokban, és más platinacsoportbeli fémeket is választhatunk, glukózoxidáz elektródokat alakítunk ki kötőanyagként polivinilacetát és platinacsoportbeli fémként palládium felhasználásával.

Az előbbi esetben a glukózoxidáz elektródot úgy alakítjuk ki, hogy az előbbiekben leírt A eljárással glukózoxidázt rögzítünk platinával bevont karbonpapír elektródra, amelyet lényegében a 2. példa szerint állítottunk elő, kötőanyagként 50 tömeg% poli-vinil-acetátot használva fel poli-tetra-fluor-etilén helyett.

Ha ugyanezzel a módosított Rank-f. elektródrendszerrel 325 mV-on végezzük a vizsgálatot, lényegében lineáris választ kapunk, amint ezt a 13. ábrán bemutatjuk.

Az utóbbi esetben a glukózoxidáz elektródot úgy állítjuk elő, hogy a glukózoxidázt az előbbiekben leírt A eljárással rögzítjük a palládiummal bevont karbonpapír elektród felületén - amelyet úgy állítunk elő, hogy kolloidális platinát vittünk fel egy szénpor felületére (Vulcan XC-72, névleges részecskenagyság 30 nm), majd a palládiummal bevont szénport 0,1 mm-es vékonyrétegként kötéssel felvittük egy elektromosan vezetőképes karbonpapír felületére, a palládiummal bevont szénpor tömegére vonatkoztatva 50 tömeg% mennyiségű politetrafluoretilént használva kötőanyagként.

A kezelt, palládiummal bevont karbonpapírból 2 mm átmérőjű korongot vágunk ki és ezt felvisszük a 16. ábrával kapcsolatban leírt 2 elektródos cella platina érintkezésére, majd megvizsgáljuk, 325 mV-on, a glukózra adott válaszreakciót. Az eredményeket a 14. ábrán mutatjuk be. Ebben az esetben is lényegében lineáris válasz észlelhető, ami az áramsűrűségnek a glukóz koncentrációtól való függését illeti.

Annak alapján, hogy a 4 293 396 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint gázdiffúziós elektródokban kifejezett egyenértékűség áll fenn a Pt, Pd, Ru és Rh, ill. más platinacsoportbeli fémek között, az várható, hogy más platinacsoportbeli fémek, pl. a ruténium és a ródium is hatásosak lehetnek a platina és a palládium alternatívájaként-a találmány szerinti elektródokban.

Claims (14)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Enzimelektród, amely megfelelő szubsztrát jelenlétében a vizsgálandó enzim katalitikus aktivitása hatására amperometriás válasz adására képes, és amely az enzimet egy elektromosan vezető hordozó elem felületén rögzítve vagy adszorbeálva tartalmazza, azzal jellemezve, hogy az elektromosan vezető hordozó elem gyantával megkötött szén vagy grafitrészecskék porózus rétegből áll, vagy ilyet tartalmaz, ahol az említett részecskék finoman eloszlatott platinacsoportbeli fémekkel vannak homogénen összekeverve, vagy az említett részecskék felülete finoman eloszlatott platinacsoportbeli fémekkel van bevonva, vagy az említett részecskék felületére finoman eloszlatottplatinacsoportbeli fémek vannak adszorbeálva, így olyan porózus szubsztrát réteg van kialakítva, amelyre az említett enzim adszorbeálható vagy immobilizálható, ilyen módon a porózus réteg összességében gyantával megkötött szén- vagy grafit részecskéknek és ezeken belül lényegében egyenletesen eloszlatott, említett platinacsoportbeli fémeknek lényegében heterogén rétegéből áll.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy az említett platinacsoportbeli fémként platinát vagy palládiumot tartalmaz.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy szintetikus gyanta kötőanyagként fluorkarbon gyantát vagy poli-vinil-acetátot tartalmaz.
4. 4. A 3. igénypont szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy szintetikus gyanta kötőanyagként poli-tetra-fluor-eülént tartalmaz.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy a hordozó felületére rögzített vagy adszorbeált enzimként redox enzimet tartalmaz.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy redox enzimként glukózoxidázt tartalmaz.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy az elektromosan vezető hordozóelem egy elektromosan vezető alappal azonos, amely megkötve, felületi rétegként tartalmazza az említett, gyantával kötött szén vagy grafit részecskéket, amelyek az említett finom eloszlású platinacsoportbeli fémet tartalmazzák mint a keverék komponensét, vagy felületükre adszorbeálva, vagy bevonatként
8. 8. A 7. igénypont szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy elektromosan vezető hordozóelemként egy elektromosan vezető kaibonpapúrt tartalmaz.
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy az említett porózus réteg gyantával megkötött szén vagy grafit részecskéket tartalmaz, amelyek az említett gyantával való kötés kialakítása előtt - az egyes részecskék felületére - leválasztott vagy adszorbeált, említett platinacsoportbeli fémet tartalmaznak.
10. 10. A 9. igénypont szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy az említett porózus réteg gyantával kötött, platinával bevont szénporból áll, amely pornak a részecskenagysága az 5-30 nm tartományba esik és felületén adszorbeálva az 1,5-2,5 nm tartományba eső részecskenagyságú kolloid platinát tartalmaz.
11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy felületén egy mikroporózus membrán van, amely permeábilis az enzim szubsztrátumára.
12. 12. A 11. igénypont szerinti enzimelektród, azzal jellemezve, hogy az említett membránként egy polikarbonát membránt tartalmaz.
13. 13. Bioszenzor, oldatok összetételének meghatározására, azzal jellemezve, hogy valamely 1-12. igénypont szerinti enzimelektródot tartalmaz egy vagy több megfelelő védőburkolattal, továbbá áramjeltovábbító vezetékkel együtt.

    -1121

    HU 202 577 Β
14. 14. Amperometriás eljárás egy mintában levő anyag kvantitatív meghatározására, ahol a meghatározandó anyag egy enzim-szubsztrátum, vagy enzim-szubsztrátummá alakítható át, és amely képes katalitikusán reagálni az említett enzimmel mérhető erősségű áram keletkezése közben, azzal jellemezve, hogy a mintát szükséges esetben az említett meghatározandó anyagnak az említett reakcióképes enzim-szubsztrátummá való átalakítása után - érintkezésbe hozzuk valamely 112. igénypont szerinti enzimelektróddal, amely egy rögzített enzimet vagy enzimkeveréket tartalmaz, ahol az

    5 enzim vagy enzimek képesek reagálni a szubsztrátummal áram képződése közben.