FI92221B - Amperometrinen menetelmä 1,4-dihydronikotiiniamidiadeniinidinukleotidin (NADH) kvantitatiiviseksi määrittämiseksi liuoksessa - Google Patents
Amperometrinen menetelmä 1,4-dihydronikotiiniamidiadeniinidinukleotidin (NADH) kvantitatiiviseksi määrittämiseksi liuoksessa Download PDFInfo
- Publication number
- FI92221B FI92221B FI886050A FI886050A FI92221B FI 92221 B FI92221 B FI 92221B FI 886050 A FI886050 A FI 886050A FI 886050 A FI886050 A FI 886050A FI 92221 B FI92221 B FI 92221B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nadh
- electrode
- enzyme
- resin
- carbon
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/40—Apparatus specially designed for the use of free, immobilised, or carrier-bound enzymes, e.g. apparatus containing a fluidised bed of immobilised enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
- G01N33/5438—Electrodes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Electrodes For Compound Or Non-Metal Manufacture (AREA)
Description
92221
Amperometrinen menetelmä 1,4-dihydronikotiiniamidiadenii-nidinukleotidin (NADH) kvantitatiiviseksi määrittämiseksi liuoksessa -
Amperometrisk metod för kvantitativ bestämning av 1,4-di-hydronikotinamidadenindinukleotid (NADH) i lösning Tämä keksintö koskee menetelmää 1,4-dihydronikotiini-amidiadeniinidinukleotidin (NADH) kvantitatiiviseksi määrittämiseksi liuoksessa.
NADH ja sen hapettunut vastine NAD ovat kofaktoreita lukuisissa entsyymikatalysoiduissa redoks-reaktioissa. Eräissä niistä entsyymisubstraatti hapetetaan kofaktorin NAD ja sopivan oksidaasin tai dehydrogenaasin läsnäollessa, jolloin saadaan NADH liuoksessa; toisissa entsyymisubstraatti pelkistetään kofaktorin NADH läsnäollessa, jolloin saadaan NAD liuoksessa. Useissa tapauksissa voidaan NADH-konsentraation määritystä käyttää osoittamaan substraatin konsentraatiota, tai sen avulla voidaan seurata sellaisen entsyymireaktion kulkua, johon kuuluu NADH (tai NAD).
On tunnettua, että NADH-konsentraatio liuoksessa voidaan mitata kolorimetrisesti, mutta kolorimetriset menetelmät ovat yleisesti ottaen epäedullisia. Sähkökemialliset menetelmät ovat paljon edullisempia, mutta yritykset NADH:n ·; määrittämiseksi sähkökemiallisesti eivät tähän mennessä ole olleet kovinkaan menestyksellisiä. Tiedetään esimerkiksi, että NADH-konsentraatio voidaan määrittää ampero-metrisellä analyysillä, jossa NADH hapetetaan elektrodilla kiinteällä, säädetyllä potentiaalilla, jolloin virrankulku on sopivissa oloissa verrannollinen NADH-konsentraatioon. Valitettavasti NADH:n sähkökemialliseen hapetukseen vaaditaan suuri ylipotentiaali, eikä NADH yleensä hapetu puhtaana elektrodin pintaan; monissa tapauksissa esimerkiksi pintakalvon muodostuminen tukkii nopeasti elektrodin pinnan, mikä vaikuttaa sähkökemiallisen vasteen suuruuteen ja nopeuteen: I. Moiroux and P.J. Elving, J.Amer.Chem.Soc.
2 92221 (1980) 102, 6533-6538, ja D.G. Johnson, M.D. Ryan and G.S. Wilson, Analyt. Chem. (1968) 58, 42R.
Näitä ongelmia on yritetty välttää monin tavoin. On esimerkiksi ehdotettu käytettäväksi modifioituja elektrodeja, jotka on päällystetty johtavien orgaanisten suolojen kerroksella: J.J. Kulys, Biosensors (1986) 2, 3-13. Vaihtoehtoisesti on ehdotettu käytettäväksi adsorboitua redoks-välittäj ää kuten Meldolan sinistä hapetusreaktion kytkemiseksi tehokkaammin elektrodiin ja/tai alentamaan hapetus-potentiaalia: L. Gorton et ai., J.Electroanalyt.Chem. (1984) 161, 103-20. Eräässä toisessa ehdotuksessa redoks-välittäjiä on käytetty vapaassa liuoksessa. Metoksifenat-siinimetosulfaattia on esimerkiksi käytetty modifioidun pyroliittisen grafiittielektrodin kanssa: Y. Kimura ja K. Nihi, Analytical Sciences (1985), 1_, 271-4. Myös platina-, grafiitti- ja lasihiilielektrodeilla on suoritettu kokeiluja, mutta tähän asti ei ole kehitetty minkäänlaista sähkökemiallista menetelmää NADH:n määrittämiseksi, joka olisi sekä nopea että toistettavissa.
Tämän keksinnön mukaisesti on nyt yllättäen havaittu, että NADH voidaan hapettaa puhtaana ja hyvällä amperometrisellä vasteella sekä puskuriliuoksissa, jotka sisältävät pelkästään NADH:ia, että liuoksissa, jotka sisältävät entsyymiä, entsyymisubstraattia ja NADH:ia, käyttämällä tyypiltään polttokennotekniikassa käytettyä aktiivihiilielektrodia, joka muodostuu heterogeenisesta hartsisidotusta jalometal-likerroksesta, joka sisältää suositeltavasti platinoituja tai palladoituja (joita termejä tässä käytetään tarkoittamaan materiaaleja, jotka sisältävät platina- ja/tai palla-diumoksidia tai ovat niillä käsiteltyjä, samoinkuin materiaaleja, jotka sisältävät platina- ja/tai palladiummetallia tai ovat niillä käsiteltyjä) hiili- tai grafiittipar-tikkeleja, jotka on sidottu luonnon tai synteettisellä hartsisideaineella, suositeltavasti synteettisellä, hydro 3 92221 fobisella sideaineella, kuten hiilifluorihartsilla, suosi-teltavimmin polytetrafluorietyleenillä. Suositeltavasti käytetään platinoitua tai palladoitua aktiivihiilielektro-dia, jossa hiili- tai grafiittipartikkelit on platinoitu tai palladoitu adsorboimalla tai seostamalla kolloidista platina- tai palladiummetallia tai platina- tai palladiu-moksidia jauhepartikkelien pinnalle ennen sitomista, jolloin syntyvä elektrodi muodostuu heterogeenisesta huokoisesta aktiivihiilijauhekerroksesta, jossa on kolloidista platinaa tai palladiumia, tai vastaavia oksideja, olennaisesti tasaisesti kerrokseen jakautuneena. Platinoitujen tai palladoitujen aktiivihiili- tai -grafiittipartikkelien hartsisidottu kerros voi olla itsekantava, mutta tavallisesti se on tukielimen kannattama, suositeltavasti sähköä johtavan tukielimen, ja suositeltavasti sähköä johtavan hiilipaperikerroksen, johon platinoidut tai palladoidut hiili- tai grafiittipartikkelit on sidottu pintakerrokseksi tai imeytetty hiilikuitukudokseen. Vaikka platinoidut ja palladoidut materiaalit ovat suositeltavia, voidaan myös muita jalometalleja sisältäviä aktiivihiilielektrode-ja, esim. kultaa sisältäviä elektrodeja, käyttää.
Termeihin "platinoitu" ja "palladoitu" sisältyvät tässä oksidit, ellei asiayhteydestä muuta ilmene.
Myös tässä käytetyt termit "aktiivihiili", "aktiivigra-fiitti", jne. viittavat erittäin huokoisiin, suuripinta-alaisiin hiili- ja grafiittimateriaaleihin, joiden pinta-alat ovat 50 m2/g tai suurempia, ja tavallisemmin yli 200 m2/g, esim. 200-600 m2/g tai suurempia. Tällaisia suuri-pinta-alaisia materiaaleja saadaan esimerkiksi lämpökä-sittelemällä hiili- tai grafiittijauheita höyryssä tai C02:ssa siten, että saadaan suuripinta-alainen tuote, jota alalla yleisesti kutsutaan "aktiivihiileksi".
Aivan erillisenä jo mainituista stabiilisuudesta, toistet-tavuudesta ja nopeista vasteajoista nyt kyseessä olevien 4 92221 materiaalien erityisenä lisäetuna on se, että niitä voidaan käyttää NADH-konsentraatioiden seuraamiseen suhteellisen alhaisilla potentiaaleilla, esim. alueella 0-600 mV tai jopa negatiivisilla potentiaaleilla suhteessa standardi Ag/AgCl-referenssielektrodiin, esim. 750 mV:iin ja suurempaan, joka tarvitaan NADH-konsentraatioiden seuraamiseen lasihiili- tai grafiittielektrodeja käyttämällä. Keksinnön elektrodeille on siten luonteenomaista suhteellisen pieni taustavirta ja sen vuoksi parantunut herkkyys. Elektrodeille on myös luonteenomaista niiden pieni vaste mahdollisille häiritseville aineille, kuten virtsahapolle, jota biologisissa tai kliinisissä näytteissä säännöllisesti on läsnä.
Tämän keksinnön mukaisesti käytetyt suositellut elektrodi-substraatit ovat itse asiassa kaupallisesti saatavia materiaaleja, joita myy Prototech Company, Newton Highlands, Massachusetts, ja joita tähän asti on käytetty sähkökata-lyyttisinä kaasudiffuusioelektrodeina polttokennoissa. Tällaisten materiaalien valmistusta on kuvattu yksityiskohtaisesti US-patenteissa 4,044,193, 4,166,143, 4,293,396 ja 4,478,696, joista yksityiskohtaiset tiedot on löydettävissä. Yleisesti ottaen kuitenkin kolloidista platinaa, jonka hiukkaskoko on alueella 15-25 Ängströmiä (1,5-2,5 nm), adsorboidaan jauhemaisen hiilen (hiukkaskoko 50-300 Ängströmiä/5-30 nm) pinnalle muodostamalla platinasooli in situ jauhemaisen hiilen läsnäollessa, joka toimii soolin kiteytymisaineena. Platinoidut hiilipartikkelit valetaan sitten sähköä johtavalle tukirakenteelle, esim. sähköä johtavalle hiilipaperille käyttämällä synteettistä hartsi-: sideainetta, suositeltavasti fluorattua hiilivetyhartsia, ja erityisesti polytetrafluorietyleeniä. Vaihtoehtoisesti voidaan kolloidisen platinan sijasta käyttää hiukkaskoko-alueeltaan vastaavaa platina- tai palladiumoksidia ja adsorboida se samalla tavalla hiili- tai grafiittipartikke-leihin.
5 92221 US-patentissa 4,293,396 kuvatussa vaihtoehdossa platinoidut hiilipartikkelit imeytetään esimuodostettuun hiilikan-kaaseen ja sidotaan siihen hiilifluorihartsia, suositelta-vasti polytetrafluorietyleeniä, käyttämällä. On kuitenkin selvää, ettei tämä keksintö rajoitu Prototechin materiaalien käyttämiseen, vaan sen piiriin kuuluvat myös muut vastaavanlaiset substraattimateriaalit, jotka käsittävät huokoisen hartsisidotun kerroksen platinoituja tai palla-doituja tai muuta jalometallia sisältäviä aktiivihiili-tai -grafiittipartikkeleita.
Vaikka suositellut platinoitujen tai palladoitujen hiili-tai grafiittipartikkelien sitomiseen käytetyt hartsiside-aineet ovat hydrofobisia hiilifluorihartseja, erityisesti polytetrafluorietyleeniä, myös muita sopivia luonnon tai synteettisiä hartsisideaineita voidaan käyttää, esimerkkeinä polyetyylimetakrylaatti, polyvinyyliasetaatti, poly-vinyylikloridi, polykarbonaatit, poly(4-metyylipenteeni-1) polyisopreeni, polykloropreeni, poly(1,3-butadieeni), silikonikumi ja gelatiini.
Sideaineen ja jalometallia sisältävien aktiivihiili- tai -grafiittipartikkelien väliset suhteelliset määrät voivat olla 10-75% sideainetta ja 90-25% aktiivihiiltä tai -grafiittia, suositeltavasti 20-50% sideainetta ja vastaavasti 80-50% akttivihiiltä tai -grafiittia, painosta laskettuna. Jalometallin, esim. platinan tai palladiumin tai niiden vastaavien oksidien tai kullan määrä aktiivihiili-tai -grafiittipartikkeleilla voi olla 1-10% laskettuna aktiivihiilen tai -grafiitin ja sideaineen kokonaispainosta, suositeltavasti 2-8%, suositeltavimmin 4-6%.
Sen sijaan, että hartsi/platinoitu tai palladoitu aktiivi-hiilijauhe valettaisiin suoraan sopivan tukirakenteen pinnalle, esim. suoraan sähköä johtavan hiilipaperin pinnalle, voidaan sideaineen ja platinoidun tai palladoidun hii- 6 92221 lijauheen seos suspensoida sopivaan inerttiin väliaineeseen ja levittää substraatin pinnalle silkkipainotekniikalla ja siten muodostaa ohut kalvo hartsisidottuja platinoituja tai palladoituja hiilipartikkeleja substraatin pinnalle.
NADH:n suoran kvantitatiivisen mittauksen liuoksessa lisäksi voidaan tämän keksinnön elektrodeja ja menetelmää käyttää sen NADH:n kvantitatiiviseen määritykseen, joka on muodostunut tai kulunut in situ esimerkiksi entsyymin ja sen kofaktorin välisessä entsymaattisessa reaktiossa. Tällaisia reaktiota ovat esimerkiksi pyruvaatin muutos lak-taatiksi laktaattidehydrogenaasilla, ts. reaktio laktaattidehydrogenaasi
pyruvaatti + NADH -> laktaatti + NAD
jota reaktiota voidaan seurata NADH-konsentraation laskusta; ja glukoosin hapetus glukonolaktoniksi reaktiolla glukoosi
β-D-glukoosi + NAD -> D-glukonolaktoni + NADH
dehydrogenaasi jota voidaan seurata NADH-konsentraation kasvusta reaktion edistyessä. Tätä varten keksinnön mukaisesti käytetyissä platinoiduissa tai palladoiduissa aktiivielektrodeissa voi olla entsyymi kuten laktaattidehydrogenaasi tai glukoosi-dehydrogenaasi mukana hartsisidotussa hiilikerroksessa tai immobilisoituna sille jollakin sopivalla alalla tunnetulla ; entsyymi-immobilisointitekniikalla, kuten esimerkiksi EP- hakemuksessa 0 247 850 on kuvattu.
Tämän suoritusmuodon lisämuunnoksena keksinnön tuloksena on myös kertakäyttöinen entsyymielektrodi ja menetelmä, joissa entsyymielektrodi sisältää sekä immobilisoidun ent- • 7 92221 syymin että myös sopivan kofaktorin tälle entsyymille, tapauksesta riippuen NAD:n tai NADH:n, jolloin entsyymi-elektrodi kykenee vastaamaan amperometrisesti entsyymin aktiivisuuteen, mikä määritetään NADH-konsentraation muutoksena, ollessaan kosketuksessa näytteen kanssa, esim. kliinisen tai biologisen näytteen, joka sisältää tälle entsyymille relevantin substraatin, riippumatta siitä, sisältääkö näyte vaadittavan kofaktorin, koska se on elektrodissa itsessään. NAD- tai NADH-kofaktori voidaan lisätä elektrodiin millä tahansa sopivalla tavalla, kuten imeyttämällä sopivalla NAD:n tai NADH:n liuoksella ja kuivaamalla .
Kuten alalla on myös hyvin tunnettua, elektrodimateriaalin pinta voidaan jättää suojaamatta tai suojata huokoisella membraanilla, kuten polykarbonaattikalvolla, jonka huokoskoko on esim. noin 0,03 /um. Myös muita sopivia membraani-materiaaleja voidaan käyttää.
Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin oheisiin piirustuksiin liittyen, joissa:
Kuva 1 on kaaviomainen leikkauskuvanto modifioidusta Rank Brothers-sähkökemiallisesta kennosta, jota käytetään testaamaan keksinnön mukaisten aktiivihiilielektrodien NADH-vastetta;
Kuva 2 esittää elektrodin vastetta peräkkäisiin NADH-lisäyksiin kennoon kun käytetään tämän keksinnön mukaista platinoitua hiilipaperielektrodia (PCP);
Kuva 3 esittää PCP-elektrodin vastetta NADH:lie eri pusku-roimispotentiaaleissa (poising potentials) verrattuna Ag/AgCl-referenssi-elektrodiin;
Kuva 4 esittää elektrodin vastetta palorypälehapolle lak-.· taattidehydrogenaasin (LDH) läsnäollessa; 8 92221
Kuva 5 esittää elektrodin vastetta asetaldehydille alkoho-lidehydrogenaasin (ADH) läsnäollessa;
Kuvan 6 käyrä esittää platinoitujen hiilipaperielektrodien vastetta NADH-konsentraatiolle tämän keksinnön mukaisesti;
Kuva 7 esittää erään kokeen tuloksia elektrodin vasteesta palorypälehapolle;
Kuva 8 esittää elektrodin vastetta NADHrlle, jota muodostetaan in situ glukoosin entsymaattisella hapetuksella glukoosidehydrogenaasia käyttämällä;
Kuva 9 esittää vastaavanlaista vastekäyrää platinaoksidia sisältävällä elektrodilla; ja
Kuva 10 esittää vastekäyrää palladoidulle aktiivihiili-elektrodille.
Seuraavissa esimerkeissä testattiin erilaisten platinoitujen tai palladoitujen hiilipaperielektrodien (PCP) vastetta NADH:lie modifioidussa Rank- happielektrodijärjestelmässä (Rank Brothers, Bottisham, Cambridge), joka on esi-tettu oheisissa piirustuksissa (kuva l). Modifioitu Rank-kennojärjestelmä käsittää kaksiosaisen kennon, jossa on pohja (1) ja rengasvaippa (3), joka sulkee sisäänsä vesi-kammion (h), jonka läpi voidaan kierrättää vettä kennon lämpötilan säätämiseksi, jolloin nämä kaksi osaa on kiinnitetty toisiinsa kierreholkilla (2). Pohjan (l) keskellä on platinakontaktinappi (d), jolle on asetettu paperie-lektrodimateriaalia oleva testikiekko (a), jota pidetään paikallaan platinakontaktilla kumisilla O-rengastiivis-teillä (e) ja (f) kun kennon kaksi osaa kytketään yhteen.
Kennon, joka tietysti sisältää NADH:a sisältävää testi-liuosta, yläpäähän on työnnetty tulppa (4), jota kannattaa 9 92221 säädettävä kaulus (g), ja johon on asennettu platinavasta-elektrodi (b) ja Ag/AgCl-referenssielektrodi (c). Testit suoritettiin työelektrodilla, joka puskuroitiin eri potentiaaleissa alueella 100-600 mv suhteessa Ag/AgCl-elektro-diin. Testejä suoritettiin myös EP-hakemuksen 0 247 850 kuvassa 16 esitetyssä kaksielektrodisessa kennossa, joka mainitussa hakemuksessa on yksityiskohtaisesti kuvattu. Kaksielektrodisen kennon suoritusmuodossa elektrodimateri-aalia pidetään platinakontaktinappia vasten kennon pohjassa käyttämällä polykarbonaattimembraania (huokoskoko 0,03 /um), jolle NADH:a sisältävä näyte tuodaan. Platinakontak-tia ympäröi kennon pohjalla, mutta eristekauluksella siitä erotettuna, renkaanmuotoinen Ag/AgCl-referenssielektrodi. Elektrodikenno polaroidaan eri potentiaaleilla suhteessa Ag/AgCl-elektrodiin ja antovirtaa seurataan eri potentiaaleilla.
Keksintöä havainnollistetaan vielä seuraavilla esimerkeillä, joissa elektrodimateriaali on platinoitua hiilipaperia (PCP), toimittaj a Prototech Company, Newton Highlands, Massachusetts, ja toimittajan suunnittelema kaasudiffuu-sioelektrodiksi. PCP-elektrodimateriaali valmistetaan US-patentin 4,044,193 mukaisesti platinoimalla ensin hiili-jauhepartikkeleita (Vulcan XC-72, nimellishiukkaskoko 30 nm) hapettavalla kompleksisen platinasulfiittihapon hajottamisella hiilijauheen läsnäollessa H202:ta käyttämällä siten saostaen kolloidista platinaa, hiukkaskoko 1,5-2,5 nm, hiilijauhepartikkelien pinnalle. Platinoinnin jälkeen platinoitu hiilijauhe sitten valetaan ja sidotaan kaupallisen, grafitoidun sähköä johtavan hiilipaperin pinnalle : käyttäen sideaineena noin 50% platinoidun hiilijauheen painosta laskettuna polytetrafluorietyleeniä. Saadun platinoidun hiilipaperielektrodimateriaalin paksuus on alueella 0,1-0,5 mm ja platinamäärä 0,24 mg.cm-2. Seuraavia testejä varten (esimerkit 1-3) hiilipaperielektrodimateri-aali leikattiin halkaisijaltaan 5 mm:n kiekoiksi ja asen- 10 92221 nettiin oheisten piirustusten kuvassa l esitetyn kennojär-jestelmän platinoidulle työelektrodille. Näytteelle altistunut hiilipaperielektrodin todellinen pinta-ala on kussakin tapauksessa noin 0,16 cm2.
Saadut tulokset ovat seuraavat: ESIMERKKI 1 NADH:n sähkökemiallinen hapettuminen platinoidulla hiili-paperilla (PCP) Käyttäen potentiostaattista standarditekniikkaa lisättiin 20 mM NADH-liuosta tris/HCL pH 9 puskurissa kennoon, joka sisälsi 2 ml 0,1 M pH 7 fosfaatti/1 M KCl puskuriliuosta. Platinoitu hiilipaperielektrodi (PCP) puskuroitiin eri potentiaaleissa Ag/AgCl-referenssielektrodin suhteen. Vasta-elektrodi oli platinaa. Saatiin stabiilit virtatasot (kuva 2), jotka olivat verrannollisia NADH-konsentraatioon (taulukko 1 j a kuva 3).
Taulukko 1
Platinoidun hlilipaperin virtavaste NADH:lie eri puskuroimispotentiaaleissa NADH-konsentraatio/mM Antovirta /UA jännitteellä 100 mV 300 mV 600 mV 0,95 7 15 28 1,8 13 25 53 2,7 - 32 73 4,0 38 42 113 6,6 - 52 183 10,0 60 - - li 11 92221 ESIMERKKI 2 NADH-elektrodijärjestelmän vaste palorypälehapolle lak-taattldehydroqenaasln (LDH) läsnäollessa Käytettiin samanlaista kennoa, joka sisälsi 12,5 mM NADH ja 10 mM palorypälehappoa 2 ml:ssa pH 7 fosfaatti/KCl puskuria 25°C:ssa. Työ-, vasta- ja referenssielektrodit olivat kuten esimerkissä 1. Työelektrodi puskuroitiin 400 mV:ssa ja saatiin 170 /uA:n vakiosignaali taustan yläpuolella. Kun lisättiin 120 yksikköä LDH (härän sydän Type XV), virta laski alkunopeudella 92 /uA/min (kuva 4) osoittaen, että pyruvaatin entsymaattista muutosta laktaatiksi voidaan tehokkaasti seurata elektrodiin sähkökemiallisesti kytketyn NADH:n vaikutuksen kautta.
ESIMERKKI 3 NADH-elektrodijärjestelmän vaste asetaldehydille alkoholi-dehydroqenaasin (ADH) läsnäollessa PCP-elektrodilla Käytettiin kennoa, joka sisälsi 3 mM NADH ja 35 mM asetaldehydiä 2 mlrssa pH 9 tris/HCl puskuria 25eC:ssa. Työ-, vasta- ja referenssielektrodit olivat kuten esimerkissä 1. Työelektrodi puskuroitiin 400 mV:ssa ja saatiin 40 /uA:n vakiosignaali taustan yläpuolella. Kun lisättiin 2 yksikköä ADH (härän maksa), virta laski alkunopeudella 130 /UA/min (kuva 5) osoittaen, että asetaldehydin entsymaattista muutosta etanoliksi voidaan tehokkaasti seurata elektrodiin sähkökemiallisesti kytketyn NADH:n vaikutuksen kautta.
Seuraavissa esimerkeissä käytettiin joko kahden elektrodin kennoa tai kolmen elektrodin kennojärjestelyä. Kolmen elektrodin kenno oli kuten tässä kuvaan l liittyen kuvattiin. Kahden elektrodin kenno oli rakenteeltaan samanlai- 12 92221 nen kuin EP-hakemuksen O 247 850 kuvassa 16 esitetty, johon julkaisuun viitataan lisäyksityiskohtien suhteen.
ESIMERKKI 4 (kuva 6)
Tiedot kerättiin käyttämällä kaksielektrodirakennetta, joka polaroitiin 200 mV:ssa. Puskurina käytettiin 16 mmol/L NaH2P04, 53 mmol/L Na2HP04, 52 mmol/L NaCl, 1,5 mmol/L etyleenidiamiinitetraetikkahappoa, pH 7,4. Kun tällä puskurilla oli saavutettu stabiili taustavirta, puskuri pyyhittiin pois membraanista ja korvattiin NADH-näytteillä samassa puskurissa. Huippuvirta merkittiin muistiin. Kuva 6 esittää vasteet platinoidulla hiilipaperielektrodilla, jollaisia on kaupallisesti saatavilla Prototech Companyltä, ja jotka muodostuvat hartsisidotuista platinoiduista hiilipartikkeleista, jotka on saostettu sähköä johtavalle hiilipaperitausta-arkille, jolloin hartsisidottu platinoitu hiilikerros sisältää painosta laskettuna 50% polytet-rafluorietyleeniä, 45% hienojakeista hiiltä (Vulcan XC72) ja 5% hiilijauheelle esiadsorptoitua kolloidista platinaa. Taustavirran minimoimiseksi elektrodille adsorboitiin yön yli 5 mg/ml proteiiniliuosta (glukoosioksidaasi) ennen NADH-mittauksia. On huomattava, että glukoosioksidaasi on vain yksi esimerkki sopivista proteiineista.
ESIMERKKI 5 (kuva 7)
Tämä havainnollistaa keksinnön käyttökelpoisuutta NADH:a hyödyntävien entsyymisubstraattien mittaukseen. Käytettiin edellä kuvattua kolmielektrodikennoa, mutta se varustettiin magneettisella sekoitussauvalla. Työelektrodi oli platinoitua hiilipaperia kuten esimerkissä 4, mutta elektrodille immobilisoitiin L-laktaattidehydrogenaasia (EC
1.1.1.27 härän sydämestä) karbodi-imidikytkennällä, kts. EP-A-0 247 850, mutta käyttämällä laktaattidehydrogenaasin 1 mg/ml liuosta (Sigma Chemicals, type XV, 500 yksikköä/mg
II
• 13 92221 proteiinia). Alussa kenno sisälsi 12,5 mmol/L NADH puskurissa 0,1 mol/L fosfaattia/1 mol/L KC1, pH 7. Polarointi-potentiaali oli 350 mV. Laitetta voitiin käyttää seuraamaan NADH:n kulutusta, kun kennoon lisättiin tasamääriä palorypälehappoa, kuten kuvasta nähdään.
ESIMERKKI 6 (kuva 8)
Toistettiin esimerkki 5 paitsi että immobilisoitu laktaat-tidehydrogenaasi korvattiin glukoosidehydrogenaasilla (EC 1.1.1.47, Bacillus spp, toimittaja Sigma, 100-300 U/mg proteiinia), joka immobilisoitiin elektrodille samalla tavalla. Kun laktaattidehydrogenaasia käytetään NADH-kulutusta seuraamalla mittaamaan palorypälehappoa
pyruvaatti + NADH -> laktaatti + NAD
käytetään glukoosidehydrogenaasia NADH:n muodostusta seuraamalla mittaamaan glukoosia:
β-D-glukoosi + NAD -> D-glukonolaktoni + NADH
Kenno sisälsi 0,1 mol/L fosfaattia/0,1 mol/L KCl/2,4 mmol/L NAD, pH 7.
ESIMERKKI 7 (kuva 9)
Esimerkissä 4 kuvatulla menettelyllä mitattiin platinaok-sidia sisältävän hiilielektrodin virta 200 mV:ssa (Ag/AgCl-referenssielektrodin suhteen) kaksielektrodiken-nossa erilaisissa NADH-konsentraatioissa, jolloin saatiin olennaisesti lineaarinen vaste, joka vastaa platinoiduilla hiilipaperielektrodeilla saatua. Tässä tapauksessa elekt-rodimateriaali muodostuu kerroksesta hartsisidottuja (polytetrafluorietyleeni) hiilipartikkeleita (Vulcan XC72), jolloin hiilijauhepartikkeleille on esiadsorboitu 5 « 14 92221 paino% (laskettuna hartsisidottujen partikkelien kokonaispainosta) platinaoksidia; ja sideainetta on 50 paino% sekä hiiltä 45 paino%, ja nämä on sidottu sähköä johtavan Toray (tavaramerkki) hiilipaperin pinnalle.
ESIMERKKI 8 (kuva 10)
Mitattiin jälleen esimerkissä 4 kuvatulla menettelyllä palladoidun hiilipaperielektrodin virta 200 mV:ssa (Ag/AgCl:n suhteen) kaksielektrodikennorakennetta käyttäen eri NADH-konsentraatioissa. Vaste on jälleen olennaisesti lineaarinen (kuva 10). Elektrodimateriaali on kuten esimerkissä 7 on kuvattu, paitsi että hartsisidotut hiili-partikkelit sisältävät 5 paino% esiadsorboitua hienoja-keista palladiumia.
Edelliset esimerkit osoittavat elektrodimateriaaleilla saatavan nopean ja toistettavan NADH:n hapettumisen. Nämä vasteet eroavat merkittävästi niistä, jotka useimmilla muilla elektrodimateriaaleilla saadaan, kuten nähdään vertailukelpoisista kokeista, joissa käytetään platina-, lasihiili- tai grafiittielektrodimateriaaleja, jotka (harvoin poikkeuksin) yleensä ovat hitaita, suhteellisen epäherkkiä, ja joilla toistettavuus on paljon huonompi. Käyttämiemme platinoitujen tai palladoitujen hiilielektro-dien tehokkuus näyttää johtuvan niiden erityisen heterogeenisesta rakenteesta ja sen yhteensopivuudesta biologisten molekyylien, kuten NADH:n ja entsyymien kanssa. NADH:n hapettuminen etenee myös tehokkaasti entsyymien ja substraattien läsnäollessa, ja sitä voidaan käyttää perustana nopeille NADH-kytketyille entsymaattisille analyyseille. Edellisistä esimerkeistä käy selväksi mahdollisuus pyru-vaatin (LDH:ta käyttäen) ja asetaldehydin (ADH:ta käyttäen) tehokkaaseen analyysiin, mutta hyvin suuri määrä vastaavia analyysejä on myös suoritettavissa muita entsyymejä ja substraatteja käyttämällä.
15 92221
Vaikka keksintöä on tässä kuvattu liittyen yksinomaan NADH:n määritykseen liuoksessa, voidaan fosforyloitu 1,4-dihydronikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NADPH), ts. fosforyloitu NADH, määrittää täsmälleen samalla tekniikalla. Koska NADPH (tai NADP) lisäksi on kofaktori valitussa ryhmässä entsyymikatalysoituja reaktioita NADH:n (tai NAD:n) sijasta, tämän keksinnön tekniikka mahdollistaa tällaisten reaktioiden seuraamisen täsmälleen samalla tavalla, ts. määrittämällä amperometrisesti joko NADPH:n kulutus tai tuotanto liuoksessa. Siten aina kun tässä asiakirjassa on puhuttu NADHrsta tai NADista, on tarkoitettu myös niiden fosforyloituja johdannaisia ellei asiayhteydestä muuta ilmene.
Claims (10)
1. Menetelmä 1,4-dihydronikotiiniamidiadeniinidinukleotidin (NADH) kvantitatiiviseksi määrittämiseksi liuoksessa, jossa menetelmässä NADH:a sisältävä liuos saatetaan kosketukseen aktiivihiilielektrodin kanssa ja aktiivihiilielektrodi pidetään säädetyssä kiinteässä potentiaalissa, joka voi aikaansaada NADH:n hapettumisen elektrodin pinnalla, ja mitataan hiilielektrodin antovirta, tunnettu siitä, että menetelmässä käytetään jalometallia sisältävää aktiivihiili-elektrodia, joka käsittää aktiivihiili- tai -grafiittipar-tikkelien huokoisen, heterogeenisen, hartsisidotun kerroksen, jossa aktiivihiili- tai -grafiittipartikkeleille on esiadsorboitu hienojakeista jalometallia tai vastaavia oksideja, ja ne on sidottu toisiinsa luonnon tai synteettisellä hartsisideaineella.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hartsisideaine on hiilifluorihartsi, mieluimmin polytetrafluorietyleeni.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hartsisidotut jalometallia sisältävät hiili- tai grafiittihiukkaset on muodostettu hartsisidotuksi pintakerrokseksi alla olevalle sähköä johtavalle tukielimel-le.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sähköä johtava tukielin on sähköä johtava hiili-paperikerros, johon jalometallia sisältävät hiili- tai gra-fiittipartikkelit on sidottu pintakerrokseksi.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiili- tai grafiittipartikkelit ovat esiplatinoituja tai esipalladoituja partikkeleita, joiden hiukkaskoko on alueella 5-30 nm ja joissa on hienojakeis- 17 92221 ta, kolloidista platinaa tai palladiumia esiadsorboituna grafiitti- tai hiilipartikkeleille, jolloin kolloidisten platina- tai palladiumhiukkasten hiukkaskoko on alueella 1,5-2,5 nm.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sitä käytetään seuraamaan NADH:n tuotantoa tai kulutusta entsymaattisessa reaktiossa entsyymin ja sen substraatin välillä, jossa joko NADH tai NAD on mukana kofaktorina, ja jossa käytetään jalometallia sisältävää hiilielektrodia, jolle tai johon entsyymi on lisätty tai immobilisoitu, ja jossa elektrodia käytetään seuraamaan entsyymin aktiivisuutta NADH-konsentraation muutoksen kautta, kun elektrodi on kosketuksessa entsyymisubstraatin sisältävän näytteen kanssa ja joko NAD:n tai NADH:n läsnäollessa kofaktorina, joka kuuluu entsyymin ja sen substraatin väliseen reaktioon.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytetään jalometallia sisältävää elektrodia, jolle tai johon entsyymi on lisätty tai immobilisoitu yhdessä NADH tai NAD kofaktorin kanssa, tapauksesta riippuen, jolloin NADH tai NAD kofaktori näin lisätään näytteeseen elektrodin kautta.
8. Patenttivaatimuksen 7 menetelmässä käytettäväksi tarkoitettu kertakäyttöinen entsyymielektrodi, tunnettu siitä, että se muodostuu aktiivihiilielektrodista, joka käsittää tai sisältää aktiivihiili- tai -grafiittipartikkelien huokoisen, hartsisidotun, heterogeenisen kerroksen, jonka aktiivihiili- tai -grafiittipartikkeleille on esiadsorboitu hienojakeista jalometallia tai vastaavaa oksidia, ja partikkelit on sidottu toisiinsa synteettisellä hydrofobisella hartsisideaineella, jolloin hartsisidottuun kerrokseen tai kerrokselle on immobilisoitu entsyymiä yhdessä NAD:n tai NADH:n kanssa entsyymin kofaktorina, elektrodin vastatessa 18 92221 amperometrisesti entsyymin aktiivisuuteen sen substraatin ja NAD:n tai NADH:n, tapauksesta riippuen, läsnäollessa.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen kertakäyttöinen entsyymi-elektrodi, tunnettu siitä, että aktiivihiilielektro-diin kuuluu huokoinen, hartsisidottu, heterogeeninen pintakerros, jossa on esiplatinoituja tai esipalladoituja aktiivihiili- tai -grafiittipartikkeleita, jotka on sidottu hii-lifluorihartsilla, ja jota tukee alla oleva tukielin, ja johon tai jolle entsyymi ja kofaktori on immobilisoitu.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen kertakäyttöinen entsyy-mielektrodi, tunnettu siitä, että esiplatinoitujen tai esipalladoitujen aktiivihiili- tai grafiittipartikkelien hartsisidotun kerroksen alla oleva tukielin muodostuu sähköä johtavasta hiilipaperista. Il ie 92221
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8710472 | 1987-05-01 | ||
| GB878710472A GB8710472D0 (en) | 1987-05-01 | 1987-05-01 | Amperometric method |
| PCT/GB1988/000338 WO1988008447A1 (en) | 1987-05-01 | 1988-04-29 | Amperometric method for the quantitative determination of 1,4-dihydronicotinamide adenine dinucleotide (nadh) in solution |
| GB8800338 | 1988-04-29 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI886050A FI886050A (fi) | 1988-12-30 |
| FI92221B true FI92221B (fi) | 1994-06-30 |
| FI92221C FI92221C (fi) | 1994-10-10 |
Family
ID=10616757
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI886050A FI92221C (fi) | 1987-05-01 | 1988-12-30 | Amperometrinen menetelmä 1,4-dihydronikotiiniamidiadeniinidinukleotidin (NADH) kvantitatiiviseksi määrittämiseksi liuoksessa |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5122456A (fi) |
| EP (2) | EP0289345A1 (fi) |
| JP (2) | JPH01503409A (fi) |
| KR (1) | KR960001501B1 (fi) |
| AU (2) | AU1686188A (fi) |
| CA (1) | CA1304127C (fi) |
| DE (1) | DE3882078T2 (fi) |
| DK (1) | DK169559B1 (fi) |
| ES (1) | ES2058271T3 (fi) |
| FI (1) | FI92221C (fi) |
| GB (3) | GB8710472D0 (fi) |
| HU (1) | HU205625B (fi) |
| IE (1) | IE60238B1 (fi) |
| IL (2) | IL86223A (fi) |
| MX (1) | MX167769B (fi) |
| NO (1) | NO179953C (fi) |
| RU (1) | RU1806187C (fi) |
| WO (2) | WO1988008446A1 (fi) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8710472D0 (en) * | 1987-05-01 | 1987-06-03 | Cambridge Life Sciences | Amperometric method |
| GB8817997D0 (en) * | 1988-07-28 | 1988-09-01 | Cambridge Life Sciences | Enzyme electrodes & improvements in manufacture thereof |
| DE3932247A1 (de) * | 1989-09-27 | 1991-04-04 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Elektrodenmaterial, elektroden, verfahren zur herstellung und verwendung der elektrode |
| TW279133B (fi) * | 1990-12-13 | 1996-06-21 | Elan Med Tech | |
| AT397513B (de) * | 1992-12-15 | 1994-04-25 | Avl Verbrennungskraft Messtech | Amperometrische enzymelektrode |
| US5429735A (en) * | 1994-06-27 | 1995-07-04 | Miles Inc. | Method of making and amperometric electrodes |
| IE72524B1 (en) * | 1994-11-04 | 1997-04-23 | Elan Med Tech | Analyte-controlled liquid delivery device and analyte monitor |
| DE4442253A1 (de) * | 1994-11-28 | 1996-05-30 | Bayer Corp N D Ges D Staates I | Elektrochemischer Enzymbiosensor |
| US6413410B1 (en) | 1996-06-19 | 2002-07-02 | Lifescan, Inc. | Electrochemical cell |
| FR2743575B1 (fr) * | 1996-01-17 | 1998-03-13 | Univ Toulouse | Procede perfectionne de modification en surface d'une electrode pour la realisation d'un reaction electrochimique et electrodes obtenues |
| DE69730612T2 (de) | 1996-11-07 | 2005-01-27 | Cambridge Sensors Ltd., Godmanchester | Elektroden und ihre verwendung in assays |
| WO1998058250A2 (en) | 1997-06-16 | 1998-12-23 | Elan Corporation, Plc | Methods of calibrating and testing a sensor for in vivo measurement of an analyte and devices for use in such methods |
| KR100491316B1 (ko) * | 2002-05-29 | 2005-05-24 | 삼성엔지니어링 주식회사 | 망간이 고정된 흑연 또는 뉴트랄 레드가 결합된 흑연을포함하는 ｎａｄ(ｐ)+ 또는 ｎａｄ(ｐ)ｈ의 직접 환원또는 산화용 전극 |
| ES2441361T3 (es) | 2007-09-18 | 2014-02-04 | Ultizyme International Ltd. | Electrodo enzimático |
| JP5362406B2 (ja) * | 2009-03-25 | 2013-12-11 | 三洋電機株式会社 | 燃料電池 |
| JP5930810B2 (ja) | 2011-04-26 | 2016-06-08 | アークレイ株式会社 | 分析用具 |
| US9660240B2 (en) * | 2011-07-07 | 2017-05-23 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Secondary battery including separator containing electroconductive porous layer sandwiched between electroconductive material-free porous layers |
| WO2020148414A1 (en) | 2019-01-18 | 2020-07-23 | Frieslandcampina Nederland B.V. | Shaped cheese product |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4044193A (en) * | 1971-06-16 | 1977-08-23 | Prototech Company | Finely particulated colloidal platinum compound and sol for producing the same, and method of preparation of fuel cell electrodes and the like employing the same |
| SU593439A1 (ru) * | 1975-08-04 | 1980-10-07 | Ордена Трудового Красного Знамени Институт Химических Наук Ан Казахской Сср | Способ получени электропроводных фермент-ковакторных систем |
| US4166143A (en) * | 1977-01-24 | 1979-08-28 | Prototech Company | Control of the interaction of novel platinum-on-carbon electrocatalysts with fluorinated hydrocarbon resins in the preparation of fuel cell electrodes |
| US4321123A (en) * | 1978-04-21 | 1982-03-23 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Coenzyme immobilized electrode |
| JPS5816695B2 (ja) * | 1978-04-24 | 1983-04-01 | 松下電器産業株式会社 | 酵素電極 |
| JPS584982B2 (ja) * | 1978-10-31 | 1983-01-28 | 松下電器産業株式会社 | 酵素電極 |
| US4293396A (en) * | 1979-09-27 | 1981-10-06 | Prototech Company | Thin carbon-cloth-based electrocatalytic gas diffusion electrodes, and electrochemical cells comprising the same |
| US4478696A (en) * | 1982-07-21 | 1984-10-23 | Prototech Company | Ionizable reducing and oxidizing gaseous supply means and process for catalytic barriers and electrodes |
| GB8606824D0 (en) * | 1986-03-19 | 1986-04-23 | Univ Strathclyde | Biochemical detector |
| GB8612861D0 (en) * | 1986-05-27 | 1986-07-02 | Cambridge Life Sciences | Immobilised enzyme biosensors |
| GB8710472D0 (en) * | 1987-05-01 | 1987-06-03 | Cambridge Life Sciences | Amperometric method |
-
1987
- 1987-05-01 GB GB878710472A patent/GB8710472D0/en active Pending
-
1988
- 1988-04-28 IL IL86223A patent/IL86223A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-04-28 IL IL86222A patent/IL86222A0/xx unknown
- 1988-04-28 IE IE127488A patent/IE60238B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-29 JP JP63503839A patent/JPH01503409A/ja active Pending
- 1988-04-29 AU AU16861/88A patent/AU1686188A/en not_active Abandoned
- 1988-04-29 JP JP63503840A patent/JP2528956B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 KR KR1019880701786A patent/KR960001501B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-04-29 HU HU883273A patent/HU205625B/hu unknown
- 1988-04-29 GB GB8810180A patent/GB2204415B/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 ES ES88303921T patent/ES2058271T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 EP EP88303922A patent/EP0289345A1/en not_active Withdrawn
- 1988-04-29 AU AU16862/88A patent/AU612366B2/en not_active Expired
- 1988-04-29 GB GB8810181A patent/GB2204698B/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 EP EP88303921A patent/EP0289344B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 US US07/295,035 patent/US5122456A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-29 WO PCT/GB1988/000337 patent/WO1988008446A1/en unknown
- 1988-04-29 WO PCT/GB1988/000338 patent/WO1988008447A1/en active IP Right Grant
- 1988-04-29 DE DE88303921T patent/DE3882078T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-02 MX MX011347A patent/MX167769B/es unknown
- 1988-05-02 CA CA000565696A patent/CA1304127C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-30 RU SU884613363A patent/RU1806187C/ru active
- 1988-12-30 NO NO885836A patent/NO179953C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-12-30 FI FI886050A patent/FI92221C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-12-30 DK DK731988A patent/DK169559B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI92221B (fi) | Amperometrinen menetelmä 1,4-dihydronikotiiniamidiadeniinidinukleotidin (NADH) kvantitatiiviseksi määrittämiseksi liuoksessa | |
| FI88515B (fi) | Enzymelektrod | |
| US4356074A (en) | Substrate specific galactose oxidase enzyme electrodes | |
| EP0352925B1 (en) | Enzyme electrodes and improvements in the manufacture thereof | |
| JPH0777511A (ja) | ガス測定用バイオセンサー及びその製造方法 | |
| Razumiene et al. | Direct bioelectrocatalysis at carbon electrodes modified with quinohemoprotein alcohol dehydrogenase from Gluconobacter sp. 33 | |
| JPS6239900B2 (fi) | ||
| Bardeletti et al. | Amperometric enzyme electrodes for substrate and enzyme activity determinations | |
| Yabuki et al. | d‐Fructose sensing electrode based on electron transfer of d‐fructose dehydrogenase at colloidal gold‐enzyme modified electrode | |
| Jiang et al. | Amperometric ethanol biosensor based on integration of alcohol dehydrogenase with Meldola's blue/ordered mesoporous carbon electrode | |
| Wollenberger et al. | Quinoprotein glucose dehydrogenase modified carbon paste electrode for the detection of phenolic compounds | |
| CA1109374A (en) | Stabilization of activated galactose oxidase enzyme | |
| US5378332A (en) | Amperometric flow injection analysis biosensor for glucose based on graphite paste modified with tetracyanoquinodimethane | |
| Loughran et al. | Amperometric detection of histamine at a quinoprotein dehydrogenase enzyme electrode | |
| Kulys | Amperometric enzyme electrodes in analytical chemistry | |
| Lima Filho et al. | An amperometric flow injection analysis enzyme sensor for sucrose using a tetracyanoquinodimethane modified graphite paste electrode | |
| Yao et al. | Electroanalytical properties of aldehyde biosensors with a hybrid-membrane composed of an enzyme film and a redox Os-polymer film | |
| Wang et al. | Amplified biosensing of alcohol based on biocatalytic accumulation of the mediator | |
| Botrè et al. | Determination of L-glutamate and L-glutamine in pharmaceutical formulations by amperometric L-glutamate oxidase based enzyme sensors | |
| JP2004069582A (ja) | バイオセンサ | |
| JPS6346377B2 (fi) | ||
| Mizutani et al. | Highly-Sensitive Measurement of Dihydroxyphenols Using Carbon Felt Electrode Impregnated with Fructose Dehydrogenase-Containing Solution. | |
| CA2512380A1 (en) | Cholesterol enzyme electrode | |
| MIZUTANI et al. | Amperometric measurement of creatine kinase activity using an ADP-sensing bienzyme electrode | |
| Scheller et al. | Electro-Enzymatic Studies of the Interfacial Behaviour of Proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: CAMBRIDGE LIFE SCIENCES PLC |
|
| MA | Patent expired |