SU593439A1 - Способ получени электропроводных фермент-ковакторных систем - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к способу получени  электропроводных фермент-ко- факторных систем, которые могут найти применение в ферментативных электро химических реакторах, ТОПЛИВНЬЕХ элементах и индикаторных электродах. Известен р д способов получени  иммобилизованных коферментов. Такие системы используютс  в основном дл  целей аминной хроматографии. Известен, в частности способ получени  кофермекта никотинамидадениндшуклеотида (HA/f) ковалентно св занного с полиэтиленом С Это водорастворимое производное, обладающее коферментной активностью со сво бодной и св занной с матрицей дегидрогеназой (кофермент может быть восстановлен до НАДИ). Ковалентно св занное восстановленное производное НАДН) в свою очередь может быть окислено с участием лактатдегидрогеназы . Однако полученные до последнего времени продукты иммобилизации коферментов на нерастворимых и растворимых неэлектропровоцнь1х полимерах и продуктах неорганической природы непригодны дл  использовани  их в ферментативных электрохимических реакторах, топливных элементах и индикаторных электродах, вследствие их неспособности обеспечить электропроводность иммобилизованной системы . С целью получени  ферменткофакторных систем, обладающих проводниковыми свойствами и способных обеспечить перенос зар да с иммобилизованных кофакторов на электропроводный материал матрицы, а также с целью разработки способа удалени  с электропроводной основы отработанных неактивных веществ и нанесени  на нее новых активных компонентов в предлагаемом способе сорбцию кофактора производ т на различные электропроводные материалы (графит, окисленный графит, металлы, карбохромы ). Замена инактивированных в процессе длительной работы кофактора и фермента на новые осуществл етс  посредстBOM десорбции в услови х, отличных от тех, в которых работает система - ферментиммобилизованный кофермент.

Предлагают способ получени  электропроводных ферменткофакторных систем путем адсорбции кофакторов - никотинамидадениндинуклеотиаа в окисленной (НАД) или восстановленной (НАДН) форме , никотинамидапениндннуклеотидфосфат в окисленной (НАДФ) или восстановленной (НАДФН) формах или флавинаденин .динуклеотида в окисленной (ФАД) или восстановленной (ФАДН) формах - на различные электропроводные материалы - графит, окисленный графит,- металлы , карбохромы, с последующим контактированием полученной системы с раствором , содержащим соответствук цие субстраты и ферменты.

Возможность получени  фермент-ко- . факторных систем на различных электропроводных материалах проверена на системе; окисленный графит - НАД алкогольдегидрогеназа . Дл  этого кофермент НАД сорбируют из водного 0,015 М буферного раство15а фосфора . кали  с рН 7,7 на гранулированный графит , который предварительно обрабатывают кип щей концентрированной азотной кислотой в течение 6 ч. Получен-. на  таким образом ферменткофермент- на  система прочно удерживаетс  на электропроводном метериале - окисленном графите. Система работает в течение 250 ч в услови х работы системы фермент-кофактор, при этом не наблюдаетс  заметной инакт1тации активных компонентов, В случае потери активности системы, например, во времени , осуществл ют ее десорбцию водноспиртовой смесью (3:1) при рН Ю с последующей иммобилизацией активных компонентов.

Пример I. Из исходного раствора восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДНд) с концентрацией О,005 моль/л в буферном 0,0 15 М растворе фосфата кали  с рН 7,7 берут аликвоту, содержшцую 26О 10 г -НАДН в 2 мл буферного раствора (количество вз того дл  сорбции НАДН провер ют спектрофотометрическим методом при 340 ммк в 1 см кювете, учитьта , что коэ44ициент светопоглощени  дл  НАДН, 6,2). Приготовленный раствор кофермента приливают к 0,1 г гранулиро ваннотх) гранита, преовзрительно окисленного кип щей концентрированной азотной кислотой в течение 6 ч. Сорбцию кофермента провод т при 5С в течение 1 ч и периодическом перемешивании. После сорбции графит отдел ют от раствора и последний спектрофотометрируют. По разности исходных и конечных количеств НАДНа зпредел ют величину сорбции. Дл  окисленного графита она соответствует 62%. Слабо св занный с сорбентом НАДН отмывают буферным раствором.

Количественное опрецеление иммобилизированного на графите НАДН осуществл ют по цингиарин-сериокислотной методике C2j. Дл  этого готов т раствор , содержащий следующие компоненты: Oj 15 ммоль/мп буфера фосфата кали  и рН 7,7, 5О мкмоль/мл этанола, 17 мкмоль/мл лактальдегица и 0,16 мг/ мл алкоголь дегидро ген азы (все компоненты реакционной смеси смешивают

при О С). 0,2 мл полученной смеси приливают в пробирки: со стандартными растворами, содержащими известное количество , , и с 0,1 г графита с сорбированным НАДН2 . Реакционные смеси инкубируют в термостате при 37 С в течение 45 мин, после чего графит отдел ют от раствора, ферментативную реакцию останавливают добавлением I мл концентрированной серной кислоты

в выделенный и стандартные растворы. Растворы пцательно перемешивают и снова инкубируют при 70 С в течение 10 мин. Затем реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и

при тщательном перемешивании добавл ют 40 мкл свежеприготовленного раствора нингидрина (3% нингидрина и 5% бисульфита натри ). Раствор оставл ют сто ть при комнатной темпе-ратуре в течение вО мин, затем в

смесь приливают еще 1 мл концейтри- .рованной серной кислоты и оставл ют сто ть при комнатной температуре в течение 5 мин. Оптическую плотность

раствора замер ют при 595 ммк. Количество сорбированного кофермента определ ют по калибровочной кривой в зависимости от величины оптической плотности. Получают количественное

значение сорбированного НАДН , про вл ющего физиологическую активность ь иммобилизованном состо нии. Оно равно 74% от общего количества кофермента , сорбированного на графит. 55 Многократные опыты по определению активности иммобилизованного на окисленную поверхность графита кофермента аают стабильное дают стабильные результаты. При м е р 2. К 100 мг карбохром прилршают 2,5 мл 0,002 М раствора КАДФН, соцержащего 0,015 М буферный раствор фосфата кали  с рН . Количественную оценку содержани  НАДФН осуществл ют спектрофотомётрическим методом при 340 ммк в 1 см кварцевой кювете. Коэффициент светопоглощени  дл  НАДФН равен Ез4о 6,3- 10 . Сорбцию провод т в течение 2,5 ч при 5 С , раствор затем отдел ют центрифугированием и спектрофотометрируют, По разности исходных и конечных количеств НАДФН определ ют величину сорбции . На карбохроме сорбци  НАДФН составл ет 4,8 мг на 1 г сорбента Много кратное промывание сорбента 0,0 15 М буферным раствором с рН 7,8и последую щее спектрофотометрирование промывных вод свидетельствует о стабильности иммобилизованной системы. Сорбцию коферментов НАДН И ФАД н карбохроме провод т аналогичным путем Разница лишь в том, что дл  ФАД в качестве буферного раствора используют 0,1 М раствор фосфата кали  с рН 7,0, Коэффициент светопоглощени  дл  ФАД 25,3 - 10 , Сорбци  ФАД на карбохроме составл ла-1,2 мг/г, НАДН3 ,1 .мг/г. Пример 3, К 10О мг окисленного графита приливают 2,5 мл О,ОО32 М раствора ФАД, содержащего 0,1 М буферный раствор фосфата кали  с рН 7, Количество ФАД определ ют спектрофото метрически по максимуму поглощени  в области 260 ммк. Анализ выполн ют в 1 см кварцевой кювете, 25,3 -10 . Сорбцию провод т в течение 2,5 ч при 5 С, затем раствор фильтруют :центрифугированием. По количеству ФАД до и после сорбции суд т о ее величине. На 1 г окисленного графита сорбируегс  2,1 мг ФАД, Промывание сорбента 0,1 М буферным раствором с рН 7,0 и последующий анализ промывных эоц свидетельствует о стабильности полученной системы. Аналогично провод т сорбцию НАДФН на окисленном графите. Дл  этого исполь зуют О,О15 Мфосфатный буферный раствор с рН 7,8, Количественную оценку сорбции осуществл ют спектрофотометрич 9 ки по максимуму поглощени  при 340 ммк. Esf4o- 10 . Найдено, чтосорбци  НАДФН на окисленном г рафите составл ет 7,8 мг на I г сорбента. П р и м е р 4. 2,5 мл О,, раствора НАДФН Б 0,015 М раствора фосфата кали  с рН 7,8 приливают к 1ОО мг платиновой черни. Сорбцию провод т fe течение 2,5 ч при С. Затем лорошок отдел ют от раствора дентриф ггнрованием Раствор спектрофотометрирутот и определ ют количество сорбированного НАДФН, На платиновой черни сор- . бируютс  4,4 мг НАДФН на 1 г сорбента . Многократное промывание буфернымраствором сорбента с иммобилизованным НАДФН показывает стабильность системы , Аналогично провод т сорбцию коферментов НАДН и ФАД на платиновой черни. Величина сорбции НАДН 3,6 мг/г, ФАД 2,6 мг/г. Сорбци  рассматриваемых коферментов на графите незначительна ( в пределах 0,1-О,5 мг на I г),- Восстановленные и окисленные формы коферментов сорбируютс  одинаково, П р и м е р 5. С целью доказательства способности фермент-кофакторной системы обеспечивать перенос зар да на электропроводный материал матрицы использован биологический топливный элемент, в котором ЭДС возникает за счет сопр женной ферментативной окислительно-восстановительной реакции. Перенос зар да в элементе достигаетс  за счет того, что в качестве катализатора используетс  иммобилизованный на электропроводной основе ферк ент-кофа торный комплекс. В этом случае фермент и его кофактор  вл5иотс  частью электрода, на котором происходит непосредственный перенос зар да с материала электрода в активные центры ферментов, На фиг, I приведена схема реконструированной НАД-вависимой ферментатиЬнрй системы, где Е и иммобилизованные ферменты, АН и В - продукты окис, лени  и восставовлениЯ5-на фиг. 2 - механизм работы двухэлектродной системы, построенной по указанному принципу на фиг. 3 - схема топливного элемента. Чтобы исключить возможность протекаи  побочных процессов, используетс  симетрична  система из эквивалентных пс уэлементов с одним и тем же НАД-зависимым ферментом и фоновым электролитом . В качестве модельной ферментативной системы выбрана алкогольцегицрогеназа (АДГ) в сочетании с никотинамидадениндинуклеотидом (НАД). Ферменткофакторна  система получена иммобилизацией на электропроводной матрице. В качестве электролита используют О,О15 М фосфатный буфер с рН 7,7 на фоне 0,5 М раствора хлорида натри . Электро химические исследовани  провод т в .микро чейках, изготовленных из полиметилметакрилата и фторопласта. В одном из полуэлементов проходит окислетаге спирта цо ацетальцегида, в другом восстановление лактальдегида до 1,2 пропандиола . В результате электрохимического сопр жени  указанных процессов в системе возникает ЭДС. При замыкании полуэлементов через нагрузку в системе генерируетс  устойчивый ток. Биологический топливный элемент, работающий по предлагаемому способу, в котором используетс  иммобилизованна  на электропроводном носителе фермент-кофакторна  система, имеет р д преимуществ; исключаетс  стади  диффузии компонентов в объем.- раствора, а также перенос кофактора между электродом и ферментом, лимитирующие окислительно-восстановительную реак-. цию;обеспечиваете  эффективный перенос зар аа с кофермента на матрицу электрода; по вл етс  возможность распространени  этого принципа на многие ферменткофакторные системы, что позвол ет использовать в топливных элементах самые разнообразные субстраты в качестве топлива и окислител .

Топливный элемент состоит из симметричных эквивалентных камер А и Б. Графитовый электропроводный корпус I каме заполн етс  гранулированным окисленным гра4итом 2 с сорбированной ферменткофакторной системой. В цел х эффектнаной подачи продуктов в зону реакции и удалени  отработанных веществ провод т рециркул5щию растворов в камерах А и Б. Рециркул цию субстратов осуществл ю с помощью перестальтического насоса 3.

Электрическа  схема топливного эле мента состоит из электролитического мотика 4, заполненного сефадексом в 0,0 15 М буферном растворе фосфата кали  с рН 7,7 и содержащим 0,5 М

раствор хлорида натриа Дл  эффективного сн ти  зар да к омедненной снаружи поверхности 5 графитового корпуса I топливного элемента лрипа н контакт 6.

Дл  контрол  тока .и напр жени , возникающего в результате ферментативных окислительно-восстановительных .процессов, используютс  микроамперметр

7и милливольтметр 8.

В качестве модели выбрана НАД-зависима  фермент-кофакторна  система. Она создаетс  сорбцией НАДНд на окисленном графите в растворе 0,О15 М буферного раствора фосфата кали  с рН 7,7 и последующей иммобилизацией ферментаалкогольдегидрогеназы (АДГ),

8предлагаемой системе фермент АДГ участвует как в окислении этилового спита до аце та льде гида, так и в восстановлении лактальдегида в 1,2-пропанциол. Камера А биологического топливного элемента , в которой идет окисление спирта по схеме

СН5 СН 2.

CHj СНО + 2Н , содержит 1 М раствор этилового спирта в О,015 М фосфатном буферном растворе с рН 7,7 на фоне 0,5 М раствора хлорида натри . Спирт, окисл  сь , отдает .два электрона, которые посредством фермента по сопр женной

иммобиЛИЗированной алектропроводной цепи включающей кофактор, перенос тс  камеру Б4.

НАДН-2еНАД + Н , (камера А - генераци  восстановленной формы кофактора)

ie

НАД + Н

.-НАДН, (камера Б - генераци  окисленной формы кофактора) и затем принимают участие в восстановлении лактальцегида в 1,2пропандиол СН, СН (ОН) СН +

. CHgCH (ОН) СНдО

В камере Б используетс  0,03 М раствор лактальдегида в фосфатном буферном растворе на фоне 0,5 М хлорида натри .

Опыты показьтают, что реконструированна  ферментативна .система может эксплуатироватьс  в течение длительного времени без потери каталитической %ктивности . Увеличение скорости рециркул ции субстратов приводит к значительному воэростанию тока, что обусловлено интенсификацией транспорта субстрата к ферментативной системе.

Фор .мул а изобретени 

1, Способ получени  электропроводных фер мент-кофакторных систем, о т л и ч аю .щ и и с   тем, что производ т адсорбvjfao кофакторов икотинамидааенинаинуклеотида в окисленной или восстановленной 959 1юрмё, никотинамицацекинаинуклеотйафосфата в окисленной или восстановленной форме или фпавинадениндикухлеотнда в окисленной или восстановленной форме на электропроводный материал - матрицу, с последующим контактированием полученной системы с раствором, содержащим соответствующие субстраты и ферменты. 2. Способ по п. I, о т л и ч а ющ и и с   тем, что в качестве электропроводных материалов используют графкт , окисленный грабит, металлы, кар- бохромы. Источи (ОС и информации, прин тые во внимание при экспертизе t.I.R., P.D MnitE,M.DEiEe j, B ochiw.biOpfiss.AStOi,1972, 286, 260268 . ,2..c.L.WeocEBev, N.K.GUPtoi, AnatficaE Biochemists 1971. 43, 343.

Фаг. 2

Claims (2)

1. Формула изобретения

   1. Способ получения электропроводных фер мент-кофак торных систем, отличающийся тем, что производят адсорбцию кофакторов-никотинамидаденинцинуклеотида в окисленной или восстановленной форме, никотин ами дадениндинуклеотй цфосфата в окисленной или восстановленной форме или флавинадениндинуклеотида в окисленной или восстановленной форме на электропроводный материал — матрицу, с последующим контактированием полученной системы с раствором, содержащим соответствующие субстраты и ферменты.
2. 2. Способ поп. 1, о т д и ч a tout и й с я тем, что в качестве электро проводных материалов используют грабит, окисленный грабит, металлы, кар— бохромы.