JPH01503409A - 溶液中の１，４‐ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎａｄｈ）の定量のためのアンペア測定的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 溶液中の１．４−ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ） の定量の１；めのアンペア測定的方法本発明は、溶液中の１．４−ジヒドロニコ チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の定量のためのアンペア測定的 方法に関する。

ＮＡＤＨおよびその酸化された相手ＮＡＤは、多数の酵素を触媒とするレドック ス反応におけるコファクターである。ある場合において、酵素の基質は、コファ クターＮＡＤ８よび適当なオキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼの存在下に酸化 されて溶液中においてＮＡＤＨを生成する：他の場合において、酵素の基質はコ ファクターＮＡＤＨの存在下に還元されて溶液中においてＮＡＤを生成する。多 くの場合において、ＮＡＤＨ濃度の決定は、基質濃度のインジケーターとして、 あるいはＮＡＤＨ（またはＮＡＤ）を含む酵素反応の過程を追跡する手段として 使用することができる。

溶液中のＮＡＤＨの濃度は比色的に測定することができるが、比色法は概して不 利であることが知られている。電気化学的方法はより一層不利であるが、ＮＡＤ Ｈを電気化学的に決定する試みはこれまで非常に大きい程度に成功して来た。例 えば、ＮＡＤＨの濃度はアンペア測定的アッセイによって決定することができる ことが知られており、ここでＮＡＤＨは電極において固定し、制御された、電位 において酸化され、適当な条件下に通る電流はＮＡＤＨの濃度に比例する。不都 合なことには、ＮＡＤＨの電気化学的酸化は高い電位を必要とし、モしてＮＡＤ Ｈは一般に電極表面においてきれいに酸化されない；例えば、多くの場合におい て、電極の表面は表面のフィルムの形成によって急速によごれ、これは電気化学 的応答の大きさおよび速度に影響を及ぼす：１．モイロウクス（Ｍｏｉｒｏｕｘ ）およびＰ、ｐ、ｘルビング（Ｅ　１　ｖ　ｉ　ｎ　ｇ）　、ジャーナル・オブ ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ　−Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、）（１９８０）上０２．６５３３−６５３８、およびり、Ｇ。

ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｍ、Ｄ。リアン（Ｒｙ　ａ　ｎ）およびＧ。

Ｓ、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａ　ｌ 　ｙ、Ｃｈｅｍ、）（１９８６）５８．４２Ｒ０これらの問題を回避するために 多くの試みがなされてきている。例えば、導電性有機塩類の層で被覆した変性電 極を使用することが提案された：Ｊ、Ｊ、クリス（Ｋｕ１７Ｓ）、バイオセンサ ーズ（Ｂ　ｉ　ｏ　ｓ　ｅ　ｎ５ｏｒｓ）（１９８６）２．３−１３゜あるいは 、吸着されたレドックス仲介物質、例えば、メルドラ（Ｍｅｌｄｏｒａ）のブル ーを使用して、酸化反応をいっそう効果的に電極に結合することおよび／まｊ； は酸化電位を低下することが提案された：Ｌ、ゴートン（Ｇｏｒｔｏｎ）ら、ジ ャーナル・エレクトロアナリティカル・ケミストリー（Ｊ、Ｅｌｅｃ、ｔｒｏａ ｎａｌｙｔ、ｃｈｅｍ、）（１９８４）、上旦土、１０３−２０゜多の提案にお いて、レドックス仲介物質は遊離溶液（ｆｒｅｅ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）中で使用 されて来た。例えば、メトキシフェナジンメトサルフェートは変性熱分解グラフ ァイト電極とともに使用されて来た：Ｙ。

キムテ（Ｋｉｍｕｒａ）およびに、ニヒ（Ｎ　１　ｈ　ｉ）　、アナリティカル ・サイエンシズ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）（１９８５）、１ ．２７１−４゜他の実験はパラジウム、グラファイトおよびガラス状炭素の電極 を使用して実施されて来たが、なおまだ、迅速であると同時に再現性があるＮＡ ＤＨを決定する電気化学的方法はまだ開発されて来ていない。

本発明によれば、ＮＡＤ）Ｉは、すぐれたアンペア測定的応答をもって、ＮＡＤ Ｈを含有する緩衝液および酵素、酵素の基質およびＮＡＤＨを含有する溶液の両 者の中において、活性化炭素電極を使用して、きれいに酸化できることが発見さ れ、前記活性化炭素電極は、天然樹脂または合成樹脂の結合剤、好ましくは合成 の疎水性の結合剤、例えば、フルオロカーボン樹脂、最も好ましくはポリテトラ フルオロエチレンで結合された炭素まＩ；はグラファイトの粒子を含有する、貴 金属の不均質樹脂結合層からなる。活性化された炭素またはグラファイトの粒子 の樹脂結合層は、自己支持性であるが、通常支持部材、好ましくは導電性支持部 材、好ましくは活性化炭素またはグラファイトの粒子が表面層として結合される 導電性炭素紙によって支持されるか、あるいは前記炭素またはグラファイトの粒 子は炭素繊維のウェブ、好ましくは導電性ウェブ中に含浸される。

本発明に従って使用する好ましい酵素電極支持体は、事実、マサツセッツ州ニュ ートン・ハイランズのプロチク・カンパニー（ＰｒｏｔｅｃｈＣｏｍｐａｎｙ） から入手可能である。広い細部において、これらは、導電性支持構造体、例えば 、導電性炭素紙上に、合成樹脂結合剤、好ましくはフッ化炭化水素樹脂、ことに ポリテトラフルオロエチレンヲ使用して成形された粉末状活性化された炭素また はグラファイトの粒子（粒子サイズ５０〜３００オングストローム＝５〜３０ｎ ｍ）からなる。

別法において、活性化された炭素またはグラファイトの粒子を予＠成形した多孔 質炭素クロス中に含浸させ、そしてフルオロカーボン樹脂、好ましくはポリテト ラフルオロエチレンを使用してその中に結合する。

しかしながら、本発明はプロチク材料の使用に限定されず、活性化された炭素ま たはグラファイトの粒子および天然樹脂または合成樹脂、好ましくは疎水性樹脂 結合剤の多孔質樹脂結合層からなる、他の同様な支持体材料を包含する。

ここで、用語「活性化」炭素、「活性化」グラファイトは、約３０ｍ’／ｇを越 える、好ましくは少なくとも約５０ｍ’／ｇ、最も好ましくは少な（とも約２０ ０ｍ”／ｇ、例えば、２００−１８００ｍ２／ｇの範囲の表面積を有する、高度 に多孔質の、高い表面積の炭素およびグラファイト材料を言及する。このような 高い表面積の材料は、炭素またはグラファイトの粉末を水蒸気またはＣＯ２中で 熱処理して得られ、このような処理は炭素またはグラファイトの粒子の有効表面 積を通常２００〜１８００ｍ”／ｇの範囲の値に実質的に増加するために有効で ある。ここで使用する活性化炭素は、３ｎｍ程度に小さく０．５ｍｍ程度に大き い範囲、すなわち、極端に微細な粒子サイズから比較的粗い粒子の範囲の粒子サ イズを有する。しかしながら、炭素またはグラファイトの粉末は３〜５００ｎｍ 、最も好ましくは５〜１１００ｎの粒子サイズ′を有する。

活性化炭素まｔ；はグラファイトの粒子を結合するために使用する好ましい樹脂 結合剤は疎水性樹脂、例えば、フルオロカーボン樹脂、特にポリテトラフルオロ エチレンであるが、他の適当な天然樹脂または合成樹脂の結合剤、例えば、ポリ エチルメチルアクリレート、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネー ト、ポリ（４−メチルペンテン−１）ポリイソプレン、ポリクロロプレン、ポイ リ（１，３−ブタジェン）、シリコーンゴムおよびゼラチンを使用できる。

結合剤対活性化された炭素まＩ；はグラファイトの粒子の重量比率は、１０〜７ ５％の結合剤および９０〜２５％の活性化された炭素またはグラファイト、好ま しくは２０〜５０％の結合剤および、相応して、８０〜５０％の活性化されｌ； 炭素またはグラファイトの範囲であることができる。

樹脂／活性化炭素粉末を適当な支持体上に直接、例えば、導電性炭素粒子の表面 上に直接取り付ける代わりに、結合剤および活性化炭素粉末の混合物を適当な不 活性媒質中に懸濁させ、そして支持体の表面にスクリー印刷技術によって適用し 、これによって支持体の表面上に樹脂結合された活性化炭素粒子の薄いフィルム を形成することができる。

溶液中のＮＡＤ’Ｈの直接の定量的測定と同様によく、本発明の電極および方法 は、その場で発生または消費されるＮＡＤＨの定量的測定において、例えば、酵 素およびそのコファクターとの間の酵素の反応において使用することができる。

このような反応は、例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼによるピルベートのラ クテートへの転化、すなわち、反応ラクテートデヒドロゲナーゼ ピルベート十ＮＡＤＨ ラクテート＋ＮＡＤ （この反応はＮＡＤＨの濃度の減少によって監視することができる）および反応 Ｄ−グルコラクトン十ＮＡＤＨ （これは反応が進行するにつれてＮＡＤＨの濃度の増加によって監視することが できる）によるグルコースのグルコノラクトンへの酸化を包含する。この目的に 、本発明に従って使用する活性化炭素電極は、この分野において知られている酵 素の固定化技術によっておよび、例えば、欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）０　２４７ 　８５０号に教示されているように、樹脂結合炭素層中に組み込まれるか、ある いはその上に固定化されｔ；酵素、例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼまたは グルコースデヒドロゲナーゼを有することができる。

この概念のそれ以上の変法において、本発明は、また、１回限りの使い捨て酵素 電極および方法を包含し、ここで酵素電極それ自体は固定化された酵素のみなら ず、かつまｔ；その酵素のための適当なコファクター、場合に応じてＮＡＤまた はＮＡＤＨからなり、こうして酵素電極は、その酵素のための関連する基質含有 する試料、例えば、臨床的まＩ；は生物学的試料と接触したとき、必要なコファ クターが電極それ自体によって供給されるので、試料がそのコファクターを含有 するかどうかに無関係に、ＮＡＤＨの濃度の変化によって決定されるように、酵 素の活性にアンペア測定的応答する能力をもつ。ＮＡＤまｌ；はＮＡＤＨのコフ ァクターは、電極中に、任意の適当な方法において、例えば、ＮＡＤまたはＮＡ ＤＨのいずれかの溶液による含浸および乾燥によって、組み込むことができる。

この分野においてよく知られているように、電極材料の表面は、多孔質膜、例え ば、約０．０３μｍの孔大きさを有するポリカーボネートフィルムによって保護 するか、あるいは保護しないことができる。他の適当な膜材料を、まＩ；、使用 できる。

本発明を、さらに、添付図面を参照して説明する。

第１図は、本発明による活性化炭素電極のＮＡＤＨ応答を試験するために使用す る電気化学的セルの電極アセンブリーの線図的断面図である。

第２図、第３図および第４図は、本発明による異なる活性化炭素紙を使用するＮ ＡＤＨの種々の濃度に対する電極の応答を示す。

第１図を参照すると、ＮＡＤＨに対する活性化炭素電極の応答を試験するために 電気化学的セルの電極アセンブリーは、白金の接触ボタンＢおよびそれを取り囲 む参照／反対電極Ｃからなり、それらは絶縁スリーブＧによって分離されている 。「０」リングＢ上に取り付けられた多孔質ポリカーボネート膜（０，０３μｍ ）を使用して、試験ディスクＥ（炭素紙の電極材料）を白金接触上に保持する。

開いた試料の室Ｆは、試料を膜上に嫡々配置することを可能とする。電極のセル はＡｇ／ＡｇＣ１参照電極に関して種々の電位で成極させ、そして電流はポテン シオスタットＡで監視した。

得られＩ；結果を下においてさらに詳述する。

叉裏男 前述の電気化学的セルを使用し、そしてプロチク・カンパニーによって供給され る活性化炭素紙の電極材料を１．５ｍｍに切断しそして白金接触Ｂ上に配置し、 電流出力を０〜２００ｍＶにおいて釣り合わせた電極で種々のＮＡＤＨの濃度に おいて測定した。活性化炭素紙の電極材料は、導電性炭素支持紙［トウレイ（Ｔ ｏｒａｙ）支持紙］の表面に結合された、活性化炭素粉末（５０重量％）（Ｖｕ ｌｃａｎ　ＸＣ７２、公称粒子サイズ３０ｎｍ、表面積はぼ２３０ｍ”／ｇ）お よびポリテトラフルオロエチレン結合剤（５０重量％）の多孔質層からなる。安 定なバックグラウンドの電流を得るための最初の実験において、電極材料は１６ ミリモル／ＱのＮ　ａ　２　ＨＰ　Ｏイ５３ミリモル／ＱのＮａ２ＨＰＯａ、５ ２ミリモル／ＱのＮ　ａ　Ｃ１％　１．５ミリモル／Ｑのエチレンジアミン四酢 酸、ｐＨ７，４、を含有する緩衝液に暴露する。いったん安定なバックグラウン ドの電流が得られたとき、緩衝液を膜の表面からぬぐい取り、そして同一緩衝液 中のＮＡＤＨの試料で置換した。ピーク電流を記録し、そして第２図に表し、こ の第２図は試料中のＮＡＤＨの濃度に対してプロットしｔ；出力電流（μＡ／ｃ ｍりを示す。

他の同様な樹脂結合した炭素電極は、同様に、溶液中のＮＡＤＨに対するそれら の応答について試験し、そして結果は次のとおりである。この場合において、欧 州特許出願（ＥＰ−Ａ）０　２４７　８５０号の第１図に示すような３つの電極 のセル立体的配置を使用し、そして活性化炭素紙の電極は、そのまま、すなわち 、保護用膜を使用しないで使用した。測定はＡｇ／ＡｇＣ＋に対して２００ｍＶ において１．０ミリモル／ＱのＮＡＤＨの濃度において行った。

ＸＣ−７２２３０５０２’ｌＯ ２Ｖｕｌｃａｎ ＸＣ−７２２３０３０１７５ ３Ｖｕｌｃａｎ ＸＣ−７２２３０７０３１０ ４Ｖｕｌｃａｎ ＸＣ−７２＊　８１　３５　１５０ ５　ブラック・バール　１８００　５０　４００６　ブラック・バール　２３０ 　３５　２００７　シャウニガン アセチレンブラック （ＳＡＢ）　３５　１７０ ８　ＳＡＢ＊　５０　３５　２４０ ９　ケトジエンブラック　１ｏｏｏ　ｓｏ　３１０＊　２７００℃において熱処 理後。

上に表示した炭素製品は、次によって供給されＩ；：カポット（Ｃａｂｏｔ）： Ｖｕｌｃａｎ　ＸＣ−７２およびブラック・バール（Ｂｌａｃｋ　Ｐｅａｒｌ） 。

テキサス・グル７（Ｔｅｘａｓ　Ｇｕｌｆ）：シャウニガン（Ｓｈａｗｉｎｉｇ ａｎ）　アセチレンブラック　ＳＡＢ。

それ以上の実験を、また、種々のＮＡＤＨの濃度を使用して、樹脂結合した活性 化炭素電極（ブラック・バール、２７００℃において熱処理；表面積２３０ｍ” ／ｇ；ポリテトラフルオロエチレン結合剤３５％）。

ＮＡＤＨの濃度に対して実質的に直線の応答が第３図に示すように得られる。

スクリーン印刷技術を例示するため、活性化炭素電極を製造するため、２００ｇ の活性化炭素粉末（Ｖｕ　１ｅａｎ　ＸＣ−７２）を水性ゼラチン溶液（２０％ ｗ　／　ｖ　）中に３７℃において混合することによって水性ペーストを調製し た。次いで、このペーストを薄いフィルムとして１片の導電性炭素紙（トウレイ 支持紙）上に広げ、そして放置して乾燥させた。乾燥しｔ；とき、活性化炭素電 極材料を１．５ｍｍのディスクに切断し、そして前述の２つの電極のセルの立体 的配置においてＮＡＤＨに対する応答について、それぞれＯｍＶおよび２００ｍ Ｖにおいて釣り合わせた電極を使用して試験した。ＮＡＤＨの濃度に対して電極 の実質的に直線の応答は第４図に示される。

上の実施例は、迅速なかつ再現性あるＮＡＤＨの酸化を生成する！こめに電極材 料を使用することを立証する。これらの応答は、一般に反応の鈍い、比較的不感 受性であり、そして非常に再現性に劣る（稀な例外を伴う）白金、ガラス状炭素 、またはグラファイトの電極材料を使用する匹敵する実験において立証されるよ うに、はとんどの他の電極材料によって与えるものに対して顕著な対照をなす。

われわれが使用した白金化まｔ；はパラジウム化された炭素電極の有効性は、そ れらの特定の不均質構造およびその生物学的分子、例えば、ＮＡＤＨおよび酵素 との適合性の結果であるように思われる。ＮＡＤＨの酸化は、また、酵素および 基質の存在下に効率的に進行し、そして迅速なＮＡＤＨ結合酵素的アッセイのた めの基準として使用することができる。

本発明を主として溶液中のＮＡＤＨの決定を参照して説明して来たが、リン酸化 １．４−ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＰＨ）、すな わち、リン酸化ＮＡＤＨを正確に同一の技術によって決定することができる。そ のうえ、ＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＰ）はＮＡＤＨ（またはＮＡＤ）よりむしろ 酵素を触媒とする反応の選択した群におけるコファクターであるので、本発明の 技術は、正確に同一の方法において、すなわち、溶液中のＮＡＤＰＨの消費まｔ ；は生成のいずれかをアンペア測定的に決定することによって監視することを可 能とする。

こうして、ＮＡＤＨまたはＮＡＤについてのすべての言及は、特記しない限り、 リン酸化誘導体を包含するものと解釈すべきである。

ＮＡＤ）Ｉミリモル／ｌ ＮＡＤＨミリモル／２ ＮＡ［ｌＨミリモル／２ 国際調査報告 国際調査報告 ＧＥＩ　８８００３３７ ＳＡ　２２０４８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＮＡＤＨ含有溶液を活性化炭素電極と接触させ、前記電極表面においてＮＡ ＤＨの酸化を起こすために有効な制御された固定電位に前記炭素電極を維持し、 そして前記炭素電極からの電流出力を測定することからなり、ここで活性化炭素 電極を使用し、前記活性化炭素電極は天然樹脂または合成樹脂の結合剤と一緒に 結合された活性化された炭素またはグラファイトの粒子の多孔質、不均質の樹脂 結合層からなることを特徴とする、溶液中の１，４−ジヒドロニコチンアミドア デニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を定量する方法。 ２、前記活性化された炭素またはグラファイトの粒子はフルオロカーボン樹脂で 一緒に結合されている請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記フルオロカーボン樹脂はポリテトラフルオロエチレンである請求の範囲 第２項記載の方法。 ４、前記樹脂結合活性化炭素またはグラファイト粒子は、下に横たわる支持部材 上に樹脂結合表面層として形成されている請求の範囲第１〜３項のいずれかに記 載の方法。 ５、前記支持部材は導電性である請求の範囲第４項記載の方法。 ６、前記導電性支持部材は導電性炭素紙の層であり、これに前記活性化炭素また はグラファイト粒子が表面層として結合されている請求の範囲第５項記載の方法 。 ７、前記樹脂結合活性化炭素またはグラファイト粒子は炭素繊維のウェブ中に含 浸されかつそれによって支持されている請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載 の方法。 ８、前記活性化された炭素またはグラファイトの粒子は５〜１００ｎｍの範囲の 粒子サイズを有する請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法。 ９、酵素とその基質との間の反応においてコファクターとしてＮＡＤＨまたはＮ ＡＤのいずれかを含むＮＡＤＨの生成または消費を監視すとき適用する、請求の 範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法。 １０、前記酵素をその上または中に組み込むかあるいは固定化して有する活性化 炭素電極を使用し、そして前記電極はＮＡＤＨ濃度の変化によって酵素の活性を 監視するために使用し、このとき前記酵素とその基質との間の反応に含まれるコ ファクターとしてＮＡＤまたはＮＡＤＨのいずれかの存在下に酵素基質を含有す る試料と前記電極を接触させる、請求の範囲第９項記数の方法。 １１、適当ならば、ＮＡＤＨまたはＮＡＤコファクターと組み合わせて、前記酵 素をその上にまたはその中に組み込むかあるいは固定化して有する、活性化電極 を使用し、こうしてＮＡＤＨまたはＮＡＤコファクターは電極を経て試料中の導 入される請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、活性化炭素電極からなり、前記電極は天然樹脂または合成樹脂の結合剤と 一緒に結合された活性化された炭素またはグラファイトの粒子の多孔質樹脂結合 不均質層から成るかあるいはなり、前記活性化された炭素またはグラファイトの 粒子の樹脂結合層はその上にまたはその中に組み込むかあるいは固定化された酵 素を前記酵素のコフアクターとしてＮＡＤまたはＮＡＤＨと組み合わせて有し、 前記電極は、前記酵素の基質の存在下に、および場合に応じて、前記ＮＡＤまた はＮＡＤＨの存在下に、前記酵素の活性にアンペア測定的に応答する、請求の範 囲第１１項記載の方法において使用するための１回限りの使い捨て酵素電極。