JP3056221B2

JP3056221B2 - 酵素電極およびその製造方法

Info

Publication number: JP3056221B2
Application number: JP1194433A
Authority: JP
Inventors: ウイリアム・ヘンリイ・マレン
Original assignee: ケンブリツジ・ライフ・サイエンシーズ・ピーエルシー
Priority date: 1988-07-28
Filing date: 1989-07-28
Publication date: 2000-06-26
Anticipated expiration: 2015-06-26
Also published as: DK171603B1; US5160418A; EP0352925A2; IL90983A; CA1311522C; IE892451L; NO893019L; GB8915605D0; FI893542A0; FI96517C; IE60578B1; KR910002519A; DK371489D0; NO300144B1; RU1836428C; DE68920223T2; FI96517B; AU3821689A; EP0352925A3; DK371489A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、酵素電極およびその製造における改良に関
する。

本発明は、要約すれば、次の通りである：好ましくは
活性化炭素またはグラファイトの粉末上に予備吸着され
た、懸濁液から導電性支持体上に付着され、そして酵素
および必要に応じて水溶性または水分散性の結合剤と混
合された、微細な白金族金属または酸化物の均一な均質
な層から本質的に成る酵素電極が開示される。好ましく
は、酵素電極は、支持体を酵素、微細な白金族金属、お
よび、存在する場合、炭素またはグラファイトの粉末お
よび結合剤の懸濁液で被覆し、そして酵素が失活される
温度より低い温度において乾燥することによって製造さ
れる。

国際特許出願第PCT/GB87/003765号（国際公開第WO87/
07295号において、酵素の触媒活性に対して、そのそれ
ぞれの基質の存在下に、アンペア測定的に応答すること
ができる酵素電極が開示されており、この電極は樹脂結
合した炭素またはグラファイトの粒子の多孔質層から成
るか、あるいはからなる、導電性支持部材の表面に固定
化または吸着されており、前記粒子は個々の粒子と、緊
密に混合、またはそれらの表面上に付着または吸着させ
て、微細な白金族金属または酸化物を有し、結合されて
前記層を形成し、これにより多孔質支持体層を形成し、
この上に前記酵素が吸着または固定化されており、そし
て樹脂結合した炭素またはグラファイトの粒子の実質的
に均質な層からなり、前記白金族金属は前記層全体に実
質的に均一に分散している。好ましい支持体材料は、コ
ロイド状白金をその表面上に吸着して有し、そして、結
合剤として、合成樹脂、好ましくはポリテトラフルオロ
エチレンを使用して、炭素紙の支持体上へ結合された、
白金化炭素粉末粒子からなる、樹脂結合白金化炭素紙電
極である。好ましい酵素電極は、支持体の表面上に吸着
または固定化されたグルコースオキシダーゼからなるグ
ルコースオキシダーゼ電極である。

国際特許出願第PCT/GB88/00868号（国際公開第WO89/0
3871号）において、同様な酵素電極が記載されている
が、樹脂結合炭素またはグラファイトの粒子上に予備吸
着された元素状白金族金属でななく、酸化物、例えば、
PtOを使用している。

その中に記載されているように、酵素電極のための好
ましい支持体材料は、従来各燃料電池においてガス拡散
電極として使用されてきており、そしてザ・プロトテク
・カンパニー（The Pritotec Company、米国、ニュー
トンハイランズ）から商業的に入手可能な、樹脂結合白
金化（または白金酸化物含有）炭素材料である。本質的
にこのような材料は、樹脂結合剤として、比較的高い融
点の疎水性フルオロカーボン樹脂、好ましくはポリテト
ラフルオロエチレンを含有する。このような樹脂結合剤
白金化炭素のガス拡散電極材料の製造は、米国特許（US
−Ａ）4,044,193号、米国特許（US−Ａ）4,166,143号、
米国特許（US−Ａ）4,293,396号および米国特許（US−
Ａ）4,478,696号に記載されている。別であるが、同様
なガス拡散電極材料、ことに酵素電極のための導電性支
持体材料として国際特許公開第WO87/07295号に従い適当
なものは、また、米国特許（US−Ａ）4,229,490号に記
載されている。一般に、このような電極材料は、白金ま
たはパラジウム、または他の白金族金属のコロイド大き
さの粒子を炭素またはグラファイトの微細粒子上に付着
させ、白金化またはパラジウム化炭素またはグラファイ
トの粒子をフルオロカーボン樹脂、好ましくはポリテト
ラフルオロエチレンと配合し、そしてこの混合物を導電
性支持体、好ましくは導電性炭素紙上に、またはフィラ
メントの炭素繊維のウェブ上に取り付けることによって
製造される。同様な手順は酸化物含有材料に適用され
る。

国際公開第WO87/07295号および国際公開第WO89/03871
号に従い酵素電極として使用するため、適当な酵素、例
えば、グルコースオキシダーゼ、または酵素の混合物
を、前述のように、樹脂結合白金化またはパラジウム化
（以後、これらの用語は、特記しない限り、一般的意味
において、元素状白金族金属および対応する酸化物を包
含するために使用する）炭素またはグラファイトの粒子
の多孔質表面層からなる、予備形成したウェブ上に固定
化または吸着される。示したように、固定化された酵素
は、単に、樹脂結合剤白金化またはパラジウム化粒子の
多孔質層の表面上に吸着するか、あるいは、例えば、よ
く確立された酵素固定化技術、例えば、カーボジイジド
またはカルボニイルジイミダゾール試薬を使用する共有
結合、1,6−ジヒドロ−3,4−ジフルオロベンゼンを使用
する共有結合により、またはグルタルアルデヒドを使用
する架橋により、それに共有的に結合することができ
る。すべての場合において、酵素または酵素混合物は、
加熱および圧力の適用により、導電性支持体上に成形さ
れた、樹脂結合白金化またはパラジウム化炭素またはグ
ラファイトの粒子の多孔質層からなる、予備成形された
導電性支持体上に固定化または吸着される。微細な白金
族金属の代わりに、対応する酸化物、例えば、白金また
はパラジウムの酸化物を使用することができる。

ここで認められるべき関連する背景の先行技術の例
は、次の通りである：イアニエロ（Ianiello）ら（1982）、Analyt.Chem.5
4、1098−1101、これはグルコースオキシダーゼおよび
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼをグラファイト電極に塩化シ
アヌル酸法により共有結合する、仲介なし（mediatorle
ss）センサーを記載している。

松下電気株式会社（Matsusita Electric Appliance
Comapny）、特開昭56−16447号は、結合剤として、10
重量部までのフルオロカーボン樹脂結合剤、例えば、ポ
リテトラフルオロエチレンを含有し、そして、薄い（１
μｍより小さい）白金フィルムが、その上に蒸着または
電解的に付着された、導電性ベースからなる酵素電極を
開示している。酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ
は導電性ベースの白金化表面上に固定化されており、こ
の発明は白金上へ酵素を直接固定化する問題を克服した
と述べている；および松下電気株式会社（Matsusita Electrical Industr
ial Co.Ltd.）（中村ら）、米国特許第4,392,933号
は、オキシド−リダクターゼ酵素、例えば、グルコース
オキシダーゼ、および金属酸化物、例えば、ルテニウム
酸化物、からなる固定化酵素電極を開示しており、これ
はレドックス反応を行うことができ、酵素、酵素および
金属酸化物に結合されており、金属酸化物それ自体は電
子コレクターおよび導体を形成するか、あるいは電子コ
レクターまたは導体、例えば、グラファイト中に混入さ
れている。グラファイトを電子コレクターおよび導体と
して使用するとき、粉末の形態の反応性金属酸化物、例
えば、RuO₂およびグラファイト粉末は粉末の圧縮物また
はディスクにプレス成形され、そしてその上に酵素、例
えば、グルコースオキシダーゼがグラファイト表面への
架橋により、例えば、グルタルアルデヒドを使用して固
定化される。

酵素電極を製造する上の方法は、すべて本質的に２段
階の方法であり、そして、しばしば成形した圧縮物を焼
結して結合剤を融合することを必要とする条件下に、グ
ラファイトまたは炭素のベースを予備成形することを必
要とし、この結合剤は、示したように、従来高い融点の
疎水性合成樹脂、好ましくはフルオロカーボン樹脂、例
えば、ポリテトラフルオロエチレンであった。

このような方法は、しかしながら、高い体積の大量生
産技術を利用できず、その結果、このような先行技術の
酵素電極は高価になる傾向がある。したがって、このよ
うな電極を簡単な、好ましくは１工程の大量生産の技術
により製造し、１回限りの使い捨て酵素電極、すなわ
ち、１回使用して廃棄することができる酵素電極を製造
できる程度に、製造コストを低くすることが望ましい。
このような１回限りの使い捨て酵素電極は、種々の医学
的試験および診断のために大量に要求されている。

本発明によれば、白金化またはパラジウム化された
（または他の白金族金属）炭素またはグラファイトの粒
子上に固定化または吸着された酵素または酵素混合物か
らなる酵素電極の製造において、高い温度の結合剤（す
なわち、高融点のフルオロカーボン樹脂または疎水性樹
脂、好ましくはポリテトラフルオロエチレン）を省略す
るか、あるいは低い温度の、好ましくは水溶性または水
分散性の結合剤、例えば、ゼラチン、すなわち、室温に
おいて活性化することができ、かつ高い温度の焼結を必
要としない結合剤と置換することができることが発見さ
れた。

これは酵素電極の製造を大きく促進する。なぜなら、
今回、酵素または酵素混合物を白金化またはパラジウム
化（または他の白金族金属含有）炭素またはグラファイ
トの粒子と、必要に応じて結合剤を含有する、液状懸濁
媒質、例えば、水中で予備混合し、これにより酵素、白
金化またはパラジウム化微細な炭素またはグラファイ
ト、および、必要に応じて結合剤の懸濁液を形成し、次
いでその懸濁液を、例えば、スクリーン印刷により、導
電性支持体の表面上に薄いフィルムとして付着し、その
後被覆した支持体を乾燥して、酵素、白金化またはパラ
ジウム化微細な炭素またはグラファイト、および、必要
に応じて結合剤、の実質的に均質なブレンドからなる薄
いフィルムをその上に付着することが可能であるからで
ある。スクリーン印刷技術は、とくに、高度に高価的な
かつ高度に感受性の酵素電極材料の高い体積の生産を可
能とする。

そればかりでなく、また、微細な炭素またはグラファ
イトの存在は電子コレクターおよび導体として作用する
ために好ましいが、事実、それは省略することができ、
そして機能的酵素電極は、非常に簡単に、微細な白金族
金属、または対応する酸化物、酵素および必要に応じて
低温の、好ましくは水溶性の結合剤の懸濁液を、導電性
トラック、例えば、炭素トラック、または他の適当な導
電性支持体、例えば、導電性炭素紙のシート上に付着さ
せ、そして乾燥してその上に、微細な白金族金属または
酸化物、酵素および、使用する場合、結合剤からなる均
一な層を実質的に均質な分散体として付着することによ
り、得ることができることが発見された。

したがって、本発明の第１の面によれば、基底支持体
の表面上に導電性層として付着された、微細な白金族金
属または酸化物および１種または２種以上の酵素の実質
的に均質な混合物からなる酵素電極を製造する方法であ
って、前記電極の前記含有層がそれぞれの酵素基質と接
触するとき、前記電極は前記酵素の活性に対してアンペ
ア測定的に応答し、前記方法は、液状懸濁媒質中に懸濁
した微細な白金族金属または酸化物および前記酵素から
なる実質的に均一な懸濁液を形成し、その懸濁液を支持
部材の表面上に付着させ、そして付着した懸濁液を酵素
の失活温度より低い温度において乾燥し、これにより微
細な白金族金属または酸化物および前記酵素を実質的に
均一な均質な被覆層として支持体の表面上に付着させ
る、ことを特徴とする酵素電極を製造する方法が提供さ
れる。

第２面によれば、基底支持部材の表面上に導電性表面
層として付着された、微細な白金族金属または酸化物お
よび１種または２種以上の酵素の実質的に均質な混合物
からなる酵素電極であって、前記層は、また、微細な白
金族金属または酸化物の粒子および１種または２種以上
の酵素のための結合剤を含有し、前記結合剤は前記微細
な白金族金属または酸化物の粒子および１種または２種
以上の酵素を、前記酵素の失活温度越えない温度におい
て、前記支持体へ結合した、凝着性、凝集性の層に結合
するために有効な材料からなる、ことを特徴とする、酵
素電極が提供される。

上の方法において、被覆した支持体の乾燥は、酵素の
実質的な失活が起こる温度より低い温度、好ましくは室
温において実施する。

本発明の別の方法において、電極は、まず、必要に応
じて微細な炭素またはグラファイト上に予備吸着する
か、あるいはそれと混合して、微細な白金族金属または
酸化物を、結合剤を使用するか、あるいは全く使用しな
いで、導電性支持体の表面上に、同様な方法で、すなわ
ち、懸濁媒質、好ましくは水性媒質中の、必要に応じて
微細な炭素またはグラファイト上に予備吸着するか、あ
るいはそれと混合して、微細な白金族金属または酸化物
からなる液状懸濁液で被覆し、次いで乾燥することによ
って、形成することができる。その後、乾燥した層を酵
素、および必要に応じて結合剤または追加の結合剤から
なる第２溶液で含浸し、これにより酵素を付着した微細
な白金族金属または酸化物含有層または他の白金族金属
または酸化物含有層中に分散させ、次いで最終製品を乾
燥する。

白金族金属を微細な元素の形態で使用する代わりに、
対応する酸化物、例えば、白金またはパラジウムの酸化
物を使用することができる。こうして、白金化またはパ
ラジウム化した材料についてのここにおける言及は、特
記しない限り、対応する酸化物含有材料を包含するもの
として解釈されるべきである。

なおさらに驚くべきことには、本発明の他の面に従
い、また既に示したように、フルオロカーボン樹脂結合
剤を省略するか、あるいは低温の、好ましくは水溶性ま
たは水分散性の結合剤で置換することができ、微細な炭
素またはグラファイトを同様によく省略することができ
ることが分かった。こうして、ここで、導電性炭素紙上
に、あるいは導電性炭素トラック上に、付着された、結
合剤の助けを借りるか、あるいは借りないで、酵素また
は酵素混合物、および微細な白金族金属、または対応す
る酸化物から単に成る酵素電極を製造することができ
る。酵素の適合性に従い、他の導電性支持体を使用する
ことができる。固定過電位において酵素基質と接触した
とき、このような電極は広い濃度範囲にわたって基質濃
度に直接比例する電流出力で、すぐれたアンペア測定的
応答を示す。このような酵素電極、およびここに記載す
る他のものは、それゆえ、広い範囲の用途において、と
くに医学および獣医学の分野において、酵素基質、例え
ば、グルコース、乳酸塩、コレステロールの濃度の測定
のため、広い範囲の医学的および診断的資料について、
バイオセンサー有用である。

本発明の方法の面に従い、スクリーン印刷以外の種々
の他の印刷または被覆技術を使用して、必要に応じて微
細な炭素またはグラファイト上に予備吸着して、微細な
白金族金属または酸化物を、必要に応じて追加の結合剤
を使用して、導電性支持体の表面上に適用することがで
きる。伝統的被覆技術、例えば、ドクターブレードまた
はローラー塗布によるほかに、酵素および微細な白金族
金属または酸化物含有混合物は支持体の表面上に、既知
の印刷技術、例えば、インキ印刷またあはタンポ（tamp
o）印刷により印刷することができる。

本発明のなお他の方法において、最初に、例えば、ス
クリーン印刷により導電性支持体の表面上に、必要に応
じて微細な炭素またはグラファイト上に予備吸着した、
微細な白金族金属または酸化物の、必要に応じて低温の
結合剤（すなわち、粒子を凝着性の層で支持体の表面上
に、結合剤を溶融または焼結しないで結合することがで
きる結合剤）と混合した、薄いフィルムを付着させ、次
いでその付着した層を酵素または酵素の混合物で含浸す
ることによって、酵素電極を調製することができる。

本発明の好ましい面に従い使用する好ましい微細な炭
素またはグラファイト材料は、元素状白金族金属、例え
ば、白金、パラジウム、イリジウムまたはロジウム、お
よび好ましくは白金またはロジウムの微細な粒子を、炭
素粒子の表面に吸着するか、あるいはそれと混合してを
有する、微細な活性化炭素およびグラファイトの粒子で
あるが、対応する酸化物、例えば、白金酸化物、パラジ
ウム酸化物およびロジウム酸化物を代わりに使用するこ
とができる。それゆえ、用語「白金化」および「パラジ
ウム化」はここで使用するとき、特記しない限り、酸化
物を包含することを意図する。また、ここにおいて、用
語「活性化」炭素および「活性化」グラファイトは、例
えば、炭素またはグラファイトの粉末を水蒸気またはCO
₂中で熱処理して、技術的に一般に「活性炭」と呼ばれ
る高い表面積の生成物を生成することによって得られ
る、高度に多孔質の高い表面積の炭素またはグラファイ
トの材料を意味する。このような活性化材料の表面積
は、10m²/g以上であり、典型的には200〜600m²/gの範囲
であろう。粒子サイズは臨界的でないが、３〜150nmの
範囲の粒子サイズを有する炭素またはグラファイトの粉
末は好ましく、より好ましくは３〜50nmである。

炭素粉末上に吸着される白金族金属または酸化物の量
は、炭素の重量に基づいて0.1〜20重量％、好ましくは
0.5〜５重量％である。しかしながら、これらの限界は
実際にはむしろ臨界的である；約0.1重量％より少ない
と、出力信号は、過度に感度の高い測定装置による以
外、測定すためには低すぎるレベルに低下する。約20重
量％以上では、白金族金属の配合は非経済的となり、応
答または感度の増加から見た追加の利益はほとんど得ら
れないであろう。好ましくは、白金族金属または酸化物
の粒子は1nm〜20μｍの範囲の粒子サイズを有し、そし
て最も好ましくは１〜4nmの範囲のコロイドの大きさで
ある。

結合剤を本発明の酵素電極において使用する場合、適
当な低い温度の（すなわち、加熱して結合剤を溶融しな
いで、室温において白金化またはパラジウム化炭素また
はグラファイトの粉末／酵素混合物を結合することがで
きる）結合剤を使用することができる。水溶性または水
分散性の材料、およびことにヒドロキシエチルセルロー
スまたはゼラチンは好ましいが、他の適当な結合剤は次
のものを包含する：澱粉およびセルロースの誘導体、例
えば、澱粉アセテート、セルロースアセテート、セルロ
ースアセテートブチレート、およびエチルセルロース、
および水溶性の合成および半合成ポリマー、例えば、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン。結合剤の
使用量は、酵素および白金化またはパラジウム化炭素粉
末の合計の乾燥重量に基づいて、５〜100％、好ましく
は20〜50％である。

ここに記載する酵素電極は仲介なし（mediatorless）
として分類することができるが、電子仲介体、例えば、
フェロセンを、必要に応じて、使用する懸濁液中に混入
して電極を形成することができる。

白金化またはパラジウム化炭素粉末および酵素の混合
物は好ましくは水中に懸濁させ、次いでそれを導電性支
持体に、例えば、スクリーン印刷により適用するが、他
の適当な液体、例えば、有機液体、例えば、シクロヘキ
サンまたはジクロロメタンを懸濁媒質として使用するこ
とができる。導電性支持体上に付着させるとき、被覆厚
さは５〜500μｍの範囲であることができる。

酵素の配合量は使用する特定酵素または酵素混合物に
依存して広く変化するであろう。グルコースオキシダー
ゼの場合において、10〜500μg/cm²電極表面の配合量は
満足すべきものであることが分かり、100〜2000μm/cm²
は好ましい。

導電性支持体として、種々の異なる材料、例えば、白
金または他の導電性金属のストリップ、導電性合成ポリ
マーのフィルムを使用することができるが、最も好まし
くは、支持体として、導電性炭素紙または炭素トラッ
ク、すなわち、非導電性支持体上に付着した炭素粒子の
線、例えば、商業的に入手可能なものを使用する。

通常、しかし必然的でないが、酵素電極の表面は適当
な多孔質の、例えば、ポリカーボネートの膜またはスク
リーンの適用により物理的に保護することができ、これ
は、もちろん、決定すべき酵素基質（グルコース）によ
り透過可能でなくてはならない。このような膜は、多
少、センサーの応答時間の増加において不利であるが、
それにもかかわらず、このような膜を用いてさえ、本発
明のセンサーは、従来の酵素電極に匹敵する、そして、
多くの場合において、すぐれる応答時間が可能である。

既に示したように、本発明は、とくにグルコースオキ
シダーゼ電極、すなわち、固定化酵素がグルコースオキ
シダーゼである電極に関するが、他のオキシドリダクタ
ーゼを使用することができるが、常に同等の効果がえら
れるとはかぎらない。これは必ずしも酵素の固有の無効
によるのでなく、他の因子による。例えば、ウリカーゼ
を使用する尿酸の決定において、尿酸基質それ自体はベ
ース電極において電気化学的酸化を行い、こうして酵素
からの効果を大きくマスキングする。しかしながら、他
の適当なオキシドリダクターゼはラクトースオキシダー
ゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼおよび他の過酸化物生成性酵素ならびに固定化酵
素の組み合わせ、例えば、非オキシダーゼおよびオキシ
ダーゼの組み合わせを包含し、前者は問題の基質に作用
してオキシダーゼのための酸化可能な基質を生成し、後
者は酸化可能な生成物に作用して、問題の基質の過度に
比例する測定可能な電流を生成する。１つのこのような
組み合わせは、ガラクトシダーゼおよびグルコースオキ
シダーゼ（ラクトースの定量のため）、またはベータ−
グルカン解重合酵素、ベータ−グルコシダーゼおよびグ
ルコースオキシダーゼ（ベータ−グルカンの決定のた
め）である。

他のタイプのセンサーの用途は、前駆体の反応におい
て問題の一次基質と相互作用する酵素または非酵素の使
用を包含し、得られる生成物は本発明に従う酵素電極の
ための基質として作用する物質を含む。このような前駆
体の段階の多くの例は、免疫化学的反応において見いだ
され、そして本発明による酵素電極を利用するセンサー
の構成においてこのような反応を使用する方法は当業者
にとって明らかであろう。

しかしながら、本発明による電極の主な用途は、試
料、ことに臨床的試料、例えば、血液、血清、血漿、
尿、汗、涙、および唾液中の酸化可能な基質、ことにグ
ルコースの検出および／または定量的測定のためのバイ
オセンサーとして有用であろう。

他の可能な、非臨床的用途は、次のものを包含する：（ａ）発酵んの監視、（ｂ）工業的プロセスの制御、（ｃ）環境の監視、例えば、液体および気体の流出およ
び汚染の抑制、（ｄ）食物の試験、（ｅ）獣医学の用途、とくに上に示唆した臨床的用途に
関係する用途。

本発明による酵素電極材料を組み込んだバイオセンサ
ーまたは他のセンサーが、他の構造的要素、電気リード
線、ことに非導電性（絶縁）支持体またはプローブなど
を含むすることができるかぎり、構成ににおけるこのよ
うな要素は普通のものであり、そして詳述する必要がな
いであろう。電極材料との電気的接触は多くの方法にお
いて、例えば、電極材料を導電性接触体またはターミナ
ル、例えば、白金または他の適当な導体のそれらと面対
面の接触で取り付けることによって行うことができる。

使用において、本発明の酵素電極の電流出力は、酵素
基質を含有する試料の存在下に、この分野において既に
よく確立された手順に従い、固定電位において測定す
る。一般に、電流出力は銀／塩化銀の参照電極に関して
200〜600mVの範囲であろう。このような測定を行うとき
使用するために適当な２および３電極セルの２つの実施
例は、国際特許公開第WO87/07295号に例示および詳述さ
れており、これは既に参照した。

本発明を次の実施例により説明する。ここで、第１図
〜第17図の添付図面を参照し、これらは本発明により構
成された種々の酵素電極からの電流出力を示す。

実施例１ほぼ10重量％の白金を含有する白金化炭素粉末［ザ・
プロテク・カンパニー（The Protec Company、米国マ
サチュセッツ州ニュートンハイランド）から入手可能で
ある（Vulcan XC−72炭素粉末、公称粒子サイズ30nm、
粒子サイズ範囲1.5〜2.5nmのコロイド状白金をその上に
吸着してを有する）の200mgを400μのリン酸塩緩衝液
（NaH₂PO₄、２ミリモル／;Na₂HPO₄、16ミリモル／;
NaCl、100ミリモル／;K₂H₂（EDTA）₂H₂O、１ミリモル
／;pH7.4）中に懸濁させることによってグルコースオ
キシダーゼ酵素電極を調製した。次いで、この懸濁液に
40mgのグルコースオキシダーゼを添加した。この懸濁液
を撹拌し、そして室温において１時間放置した。

放置後、懸濁液を手により導電性炭素紙のシート（To
ray支持紙）の表面上に広げ、そして室温において放置
して乾燥させた。

乾燥したとき、酵素電極材料を1.5mmのディスクに切
り、そして第16図をを参照して国際特許公開第WO87/072
95号に記載されているように２電気化学的セルにおいて
400mV対Ag/AgClにおいてグルコースに対するその応答に
ついて試験した。

グルコースの種々の濃度に対する電極からの電流出力
（μＡ）を、添付図面の第１図に示す。得られた結果は
２つの顕著な効果を示し、第１に電極の応答は０〜30ミ
リモル／グルコースの範囲にわたって実質的に直線で
あり、そして第２にそれらの結果は「酸素に富んだ」雰
囲気を準備するという拘束なしに得られる。期待される
先行技術の国際特許公開第WO87/07295号に従い、従来、
例えば、２〜５ミリモル／のグルコース濃度の制限さ
れた範囲にわたってのみ直線性を得ることが可能であっ
た（Yao T.、Analytica Chimica Acta 148,27−33
（1983））。他の先行技術は、グルコース電極の応答性
の直線性は、酸素の自由な拡散が可能であるとき、増加
することを教示している（Lobel E.およびRishpon
J.、Analytical Chemistry 53、51−33（1981））。
この教示は国際特許公開第WO87/07295号において支持さ
れており、ここで酸素に対して高い親和性または溶解性
を有する結合剤が使用されている。対照的に、本発明
は、結合剤が存在しなくてさえ、非常に広い範囲のグル
コース濃度にわたって応答の直線性を提供する。

実施例２実施例１を反復したが、ジョンソン・マッセイ・ケミ
カルス（Johson Matthey Chemicals、英国ロイスト
ン）から入手し、そして「プロセス触媒（process cat
alyst）」CH15959/01として供給される微細な白金化グ
ラファイト（５％Pt）をVulcan XC−72の代わりに使用
した。本質的に同様な線状の電極の応答が得られる、第
２図参照。

実施例３実施例２を反復する、すなわち、ションソン・マッセ
イ・ケミカルス（Johson Matthey Chemicals）から入
手した微細な白金化グラファイト（５％Pt）を使用し
て、酵素/Ptグラファイト電極を形成した。しかしなが
ら、この場合において、37℃に冷却した水中のゼラチン
の20％w/v溶液を2:1の容量比で懸濁液に添加した。

このゼラチン含有ペーストをToray支持紙上に広げ、
室温において乾燥後得られた電極は、より頑丈である
が、再びグルコースに対して実質的に線状の応答を示
す、第３図参照。

実施例４ 45mgの白金化炭素粉末［Vulcan XC−72、10重量％の
吸着されたコロイド状白金を含有する；ザ・プロテク・
カンパニー（The Protec Company）、米国サマチュセ
ッツ州］、0.1モルのKCl中のヒドロキシエチルセルロー
スの10％溶液の10mg中に懸濁した5mgのグルコースオキ
シダーゼから、水性ペーストを調製した。このペースト
を予備湿潤した炭素紙（Toray支持紙）上に手により広
げ、そして乾燥させた。

乾燥した電極材料から1.5mmのディスクを切り、そし
て記載したように２−電極セルにおいて400mV対Ag/AgCl
の電位でグルコースに対するそれらの応答について試験
した。

電流出力を種々のグルコース濃度において測定し、そ
して結果を第４図に示す。応答は０〜30ミリモル／の
グルコース濃度範囲にわたって本質的に線状である。

実施例５および６実施例４の手順を反復したが、それぞれ１％および0.
2％の白金を含有する白金化炭素粉末（Vulcan XC−7
2）を使用した。電極材料の電流出力を同一条件下に測
定し、そして結果を第５図および第６図に示す。第５図
は、０〜30ミリモル／の範囲全体にわたるグルコース
濃度に対する同様な直線の応答を示す。白金の量が減少
する（0.2％）と、実質的な程度の直線性が示される
が、その範囲は０〜20ミリモル／に減少する。

実施例７ 0.5mgのグルコースオキシダーゼを使用して、実施例
４を反復した。同一条件下に測定した電極材料からの電
流出力を第７図に示す。０〜20ミリモル／のグルコー
ス濃度にわたる直線性が得られる。

実施例８実施例４を反復するが、10重量％のコロイド状白金酸
化物をそのうえに吸着して有する、45mgの炭素粉末（Vu
lcan XC−72）を白金金属の代わりに使用した。

電極材料の1.5mmのディスクを、前と同一条件下に、
すなわち、２−電極セルにおいて400mV対Ag/AgClの電位
で種々のグルコース濃度に対する応答について試験し
た。種々のグルコース濃度において測定した電流出力を
第８図に示す。

実施例９ 400mgの活性炭粉末（Vulcan XC−72）、0.1モルのKC
l中の100mgのヒドロキシエチルセルロース（10％）中の
5mgのグルコースオキシダーゼを混合することによって
ペーストを調製した。

このペーストを手によりToray支持紙上に塗り付け、
そして乾燥させた。

1.5mmのディスクを乾燥した電極材料から切り、そし
て前と同一の条件下にグルコースに対する応答について
試験した。

電極は０〜30ミリモル／の全濃度範囲にわたってグ
ルコースに対する直線の応答を示す。

実施例10 実施例４を反復するが、グルコースオキシダーゼの代
わりに5mgのラクトースオキシダーゼEC1.1.3.2を使用し
た。

乾燥した電極材料の1.5mmのディスクを、前のように
同一条件下に乳酸塩に対する、それらの応答について試
験した:2−電極セルにおいて400mV対Ag/AgClの電位。

第10図に示すように、電流出力は０〜20ミリモル／
の範囲の乳酸塩濃度にわたって乳酸塩濃度とともに実質
的に直線で変化する。

実施例11 5mgの白金黒、5mgのグルコースオキシダーゼを0.1モ
ルのKCl中の10％のヒドロキシエチルセルロースの100mg
中に懸濁することによって、炭素を含まない酵素電極を
調製した。

この懸濁液を手によりToray支持紙上に塗り付け、そ
して乾燥した。

乾燥した電極材料の1.5mmのディスクを、前のように
種々のグルコース濃度に対して、電極の応答、電流出
力、について試験した。結果は第11図に示されており、
そして０〜20ミリモル／の範囲におけるグルコース濃
度にわたって実質的に直線性を示す。

実施例12 実施例４におけるのと同一の一般的手順に従うが、そ
れぞれイリジウムおよびロジウムの微細なコロイド状粒
子の１重量％（炭素の重量に基づく）を吸着して有する
活性炭粒子（Vulcan XC−72）を白金化炭素粉末の代わ
りに使用し、そして0.1モルのKClの代わりにリン酸塩緩
衝液（懸濁媒質の詳細については実施例１を参照）を使
用して、炭素紙支持紙上にヒドロキシエチルセルロース
で結合されたロジウムまたはイリジウム含有グラファイ
ト粒子およびグルコースオキシダーゼの均質な層から成
るグルコースオキシダーゼ電極を調製した。1.5mmのデ
ィスクに切断したこのような電極材料の、400mV対Ag/Ag
Cl参照電極の電位における、０〜40ミリモル／の範囲
の基質（グルコース）濃度に対する、応答（μＡ）を、
それぞれ、第12図および第13図に示す（第12図、イリジ
ウム；第13図、ロジウム）。再び、実質的に直線の応答
が得られる。イリジウムを使用して得られた高いレベル
の応答はとくに注意すべきである。

実施例13 8mgのコレステロールオキシダーゼ（約16μ/mg）を、
リン酸塩緩衝液（NaH₂PO₄、1.6ミリモル／;Na₂HPO₄、
5.3ミリモル／;NaCl、52ミリモル／;EDTA、0.15ミ
リモル／;pH7.4）中の５％のヒドロキシエチルセルロ
ース溶液の150μと溶解するまで混合した。72mgの微
細な白金化グラファイト（５％Pt）を添加し、そして混
合してペーストを形成した。

導電性炭素紙（Toray）を２週間リン酸塩緩衝液（NaH
₂PO₄、２ミリモル／;Na₂HPO₄、16ミリモル／;NaC
l、100ミリモル／;EDTA、１ミリモル／；トリトンX
100界面活性剤、0.1％v/v;pH7.4）中にソーキングし、
吸い取り乾燥し、そしてコレステロールオキシダーゼ／
白金化グラファイト／ヒドロキシエチルセルロース（HE
C）ペーストを手によりその上に均一に広げた。得られ
るペースト電極を室温において２時間そして30℃におい
て30分間乾燥した。貯蔵寿命を改良するために、次いで
電極を５％w/vスクロース溶液中に２分間浸漬し、そし
て20℃において１時間乾燥した。

乾燥したとき、ペースト電極を1.5mmのディスクに切
断し、そして＋350mV対Ag/AgClの電位において２−電位
セルでコレステロールに対する応答について試験し、ペ
ースト電極は0.05μのポリカーボネート（Nucleopore）
膜により保護した。試験のため、標準のコレステロール
溶液を、リン酸塩緩衝液（リン酸塩、１ミリモル／;N
aCl、100ミリモル／;EDTA、１ミリモル／、pH7.4）
中の22％の水溶性β−シクロデキストリン（Molecuso
l）中の６ミリモルのコレステロール原液から、標準濃
度0.5、１、２、４および６ミリモル／を生ずるよう
に希釈して調製した。

電流出力（μＡ）は第14図にしめされており、そして
０〜６ミリモル／の範囲におけるコレステロール濃度
に対する本質的に直線の応答を示す。

実施例14 本発明による酵素電極を、非水性系を使用して次のよ
うにして調製した。

次のようにして、非結合剤系において10mgの量のグル
コースオキシダーゼおよび40mgの量の白金化グラファイ
ト粉末（５％Pt）を使用して、ペースト懸濁液を調製し
た：（ａ）400μの10％w/vのシクロヘキサノン中の酢酸セ
ルロース；（ｂ）600μの５％w/vのジクロロメタン中の酢酸酪酸
セルロース；（ｃ）400μの５％w/vのシクロヘキサノン中のエチル
セルロース。

混合後、ペーストを導電性炭素（Toray）支持紙上に
広げ、そして室温において放置して乾燥させた。

乾燥したとき、1.5mmのディスクを塗布した支持紙か
ら切断し、そして２−電極セルで340mV対Ag/AgClの電位
においてグルコースに対する応答について試験した。電
極材料を金の使用電極上に取り付け、そして0.03μのポ
リカーボネート（Nuclepore）膜により所定位置に保持
した。リン酸塩緩衝液（NaH₂PO₄、２ミリモル／;Na₂H
PO₄、16ミリモル／;NaCl、100ミリモル／;EDTA、１
ミリモル／;pH7.4）中に０、2.5、５、10および20ミ
リモル／のグルコースを含有する、標準のグルコース
溶液を使用した。各場合において、セルからの電流出力
（μＡ）を次のように第15図〜第17図にグラフで示す。

第15図、シクロヘキサノン中の酢酸セルロース；第16図、ジクロロメタン中の酢酸酪酸セルロース；第17図、シクロヘキサノン中のエチルセルロース。

これらの図面は、非水性系および別の低温結合剤を使
用する本発明の実施可能性を実証する。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、基底支持体の表面上に導電性層として付着された、
微細な白金族金属または酸化物および１種または２種以
上の酵素の実質的に均質な混合物からなる酵素電極を製
造する方法であって、前記電極の前記酵素含有層がそれ
ぞれの酵素基質と接触するとき、前記電極は前記酵素の
活性に対してアンペア測定的に応答し、前記方法は、液
状懸濁媒質中に懸濁した微細な白金族金属または酸化物
および前記酵素からなる実質的に均一な懸濁液を形成
し、その懸濁液を支持部材の表面上に付着させ、そして
付着した懸濁液を酵素の失活温度より低い温度において
乾燥し、これにより微細な白金族金属または酸化物およ
び前記酵素を実質的に均一な均質な被覆層として支持体
の表面上に付着させる、ことを特徴とする酵素電極を製
造する方法。

２、懸濁液は、また、微細な炭素またはグラファイトの
粒子を含有する、上記第１項記載の方法。

３、微細な白金族金属または酸化物の粒子を微細な炭素
またはグラファイトの粒子の表面上に予備吸着させる、
上記第２項記載の方法。

４、微細な炭素またはグラファイトの粒子は３〜150nm
の範囲の粒子サイズを有し、そしてその上に予備吸着さ
れた微細な白金族金属または酸化物は１〜4nmの範囲の
粒子サイズを有する、上記第３項記載の方法。

５、懸濁液は、また、微細な白金族金属または酸化物お
よび１種または２種以上の酵素および、存在する場合、
微細な炭素またはグラファイトの混合物のための低温の
結合剤を含有し、前記低温の結合剤は粒子および酵素を
一緒に結合して凝着性の酵素含有層を支持体の表面上
に、前記１種または２種以上の酵素の失活温度を越えな
い温度において形成するために有効である、上記第１〜
４項のいずれかに記載の方法。

６、液状懸濁媒質は水性媒質である、上記第１〜５項の
いずれかに記載の方法。

７、結合剤はゼラチンまたはヒドロキシエチルセルロー
スである、上記第５および６項記載の方法。

８、懸濁液は印刷法により支持部材の表面に適用する、
上記第１〜７項のいずれかに記載の方法。

９、懸濁液はスクリーン印刷により支持部材へ適用す
る、上記第８項記載の方法。

10、支持部材はそれ自体導電性である、上記第１〜９項
のいずれかに記載の方法。

11、導電性支持体は導電性炭素紙または炭素トラックで
ある、上記第10項記載の方法。

12、微細な白金族金属の成分は微細な白金またはロジウ
ムである、上記第１〜11項のいずれかに記載の方法。

13、使用する酵素は、グルコースオキシダーゼ、ラクト
ースオキシダーゼまたはコレステロールオキシダーゼで
ある、上記第１〜12項のいずれかに記載の方法。

14、支持部材上に最初に付着される微細な懸濁液は、単
に、前記微細な白金族金属または酸化物、および前記微
細な炭素またはグラファイトおよび、存在する場合、前
記結合剤の懸濁液からなり、そして酵素は、支持部材上
への付着後、引き続いて微細粒子の付着した層を酵素含
有溶液で含浸し、そして再乾燥することによって、その
層中に導入される、上記第１〜13項のいずれかに記載の
方法。

15、基底支持部材の表面上に導電性表面層として付着さ
れた、微細な白金族金属または酸化物および１種または
２種以上の酵素の実質的に均質な混合物からなる酵素電
極であって、前記層は、また、微細な白金族金属または
酸化物の粒子および１種または２種以上の酵素のための
結合剤を含有し、前記結合剤は前記微細な白金族金属ま
たは酸化物の粒子および１種または２種以上の酵素を、
前記酵素の失活温度越えない温度において、前記支持体
へ結合した、凝着性、凝集性の層に結合するために有効
な材料からなる、ことを特徴とする、酵素電極。

16、結合剤は水溶性または水分散性である、上記第15項
記載の酵素電極。

17、結合剤はゼラチンまたはヒドロキシエチルセルロー
スである、上記第16項記載の酵素電極。

18、酵素はそれ自体微細な白金族金属または酸化物のた
めの結合剤として作用する、上記第15項記載の酵素電
極。

19、酵素含有層は、また、微細な炭素またはグラファイ
トの粒子を含有する、上記第15〜18項のいずれかに記載
の酵素電極。

20、前記微細な白金族金属または酸化物の粒子は炭素ま
たはグラファイトの粒子の使用上に予備吸着されてい
る、上記第19項記載の酵素電極。

21、炭素またはグラファイトの粒子は３〜150nmの範囲
の粒子サイズを有し、そして予備吸着した白金族金属ま
たは酸化物の粒子は１〜4nmの範囲の粒子サイズを有す
る、上記第20項記載の酵素電極。

22、酵素含有層は基底支持部材の表面上に印刷されてい
る、上記第15〜22項のいずれかに記載の酵素電極。

23、酵素含有層は支持部材の表面上にスクリーン印刷さ
れている、上記第22項記載の酵素電極。

24、基底支持部材はそれ自体導電性である、上記第15〜
25項のいずれかに記載の酵素電極。

25、支持部材は導電性炭素紙または炭素トラックのシー
トからなる、上記第24項記載の酵素電極。

26、酵素含有層は、白金族金属の成分として、微細な白
金またはロジウムを含有する、上記第15〜25項のいずれ
かに記載の酵素電極。

27、酵素含有層は、前記酵素として、グルコースオキシ
ダーゼ、ラクトースオキシダーゼまたはコレステロール
オキシダーゼを含有する、上記第15〜26項のいずれかに
記載の酵素電極。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第17図は、本発明に従い構成した種々の酵素電
極からの電流出力を示す。

フロントページの続き (56)参考文献特開昭55−12975（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／8447（ＷＯ，Ａ１) 国際公開89／3871（ＷＯ，Ａ１) 国際公開87／7295（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 27/327

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】基底支持体表面に導電性層として付着され
た微細な白金族金属または白金族金属酸化物の実質的に
均一な混合物を含み、かつ該導電層に固定された１種ま
たは２種以上の酵素を含む酵素電極であって、対応する
酵素基質と接触すると該酵素の活性に対してアンペロメ
トリー的に応答する酵素電極の製造方法において、液体懸濁媒質中に懸濁された前記微細な白金族金属また
は白金族酸化物と前記酵素を含有する実質的に均一な懸
濁液を形成し、基底支持体部材の表面に前記懸濁液を堆
積させ、そして堆積した懸濁液を酵素の失活温度を下ま
わる温度で乾燥することにより、前記支持体部材の表面
に実質的に均一もしくは均質な被覆層として前記微細な
白金族金属または白金族金属酸化物と前記酵素を付着さ
せることを特徴とする酵素電極の製造方法。
【請求項２】基底支持体部材の表面上に導電性表面層と
して付着された、微細な白金族金属または白金族金属酸
化物および１種または２種以上の酵素の実質的に均質な
混合物を含んでなる酵素電極であって、前記表面層が、
さらに、微細な白金族金属または白金族金属酸化物の粒
子および１種または２種以上の酵素のための結合剤も含
有し、前記結合剤は前記酵素の失活温度を越えない温度
において、前記支持体へ結合した、凝着性、凝集性の層
内で前記微細な白金族金属または白金族金属酸化物の粒
子および１種または２種以上の酵素を結合するのに有効
な材料からなることを特徴とする、酵素電極。