NO300144B1 - Fremgangsmåte ved fremstilling av enzymelektroder - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av enzymelektroder som angitt i krav l's ingress, hvor fremgangsmåtens særtrekk går frem av kravets karak-teriserende del.

I international patentsøknad nr. PCT/GB87/00365 (interna-sjonalt publiaksjonsnummer 087/07295) er det beskrevet enzymelektroder som er i stand til å reagere amperometrisk på enzymets katalytiske aktivitet i nærvær av dets respektive substrat og som omfatter et porøst lag av resinbundne karbon- eller grafittpartikler enzymimmobilisert eller adsorbert på overflaten av et elektrisk ledende støttemate-riale, hvilke karbon- eller grafittpartikler har intimt blandet med seg eller avleiret eller adsorbert på overflaten av seg, et finfordelt metall av platinagruppen for derved å danne et porøst substratlag hvorpå enzymet blir adsorbert eller immobilisert, og som omfatter et i hovedsak homogent lag av resinbundne karbon- eller grafittpartikler, hvor platinagruppe-metallet er dispergert i hovedsak regelmessig gjennom laget. De foretrukne substratmaterialer er resinbundne platiniserte karbonpapirelektroder omfattende platiniserte karbonpulverpartikler med kollodialt platina adsorbert på overflaten av partiklene og bundet til et karbonpapirsubstrat ved å bruke et syntetisk resin, foretrukket polytetrafluoretylen som bindemiddel. De foretrukne enzymelektroder er glukoseoksydase-elektroder som består av glukoseoksydase adsorbert eller immobilisert på overflaten av substratet.

I internasjonal søknad nr. PCT/GB88/00868 (internasjonal publikasjon nr. WO 89/03871) er det beskrevet lignende enzymelektroder, men slike som bruker oksydene, f.eks. Pto,

i stedet for et elementaært platinagruppemetall, preadsorbert på de resinbundne karbon- eller grafittpartikler.

Som beskrevet deri, er de foretrukne substratmaterialer for slike enzymelektroder resinbundne platiniserte (eller platinaoksydinneholdende) karbonmaterialer som hittil er brukt som gassdiffusjons-elektroder i brenselsceller og som er kommersielt tilgjengelige fra The Prototech Company, Newton Highlands, U.S.A. I hovedsak inneholder slike materialer som resinbindemiddel et hydrofobt fluorkarbonresin med høyt smeltepunkt, fortrinnsvis polytetrafluoretylen.

Fremstillingen av slike resinbundne platiniserte karbongass-diffusjonselektrode-materialer er beskrevet i US-A 4.044.193, US-A 4.166.143, US-A 4.293.396 og

US-A 4.478.696. Alternative, men lignende gassdiffusjons-elektrode-materialer , som er like godt egnet i henhold til angivelsene i internasjoneal patentbublikasjon WO 87/07295 som de elektrisk ledende substratmaterialer for enzymelektroder, er også beskrevet i US-A 4.229.490. Generelt blir slike elektrodematerialer fremstilt ved å avleire partikler av kollodial størrelse av platina eller palladium eller andre platinagruppemetaller på finoppdelte partikler av karbon eller grafitt og å blande de platiniserte eller palladiserte karbon- eller grafittpartikler med et fluorkarbonresin, fortrinnsvis polytetrafluoretylen, og støpe blandingen til et elektrisk ledende støttemateriale, fortrinnsvis et elektrisk ledende karbonpapir eller til en filamentøs fiberkarbonnetting. Lignende fremgangsmåter angår de oksydinneholdende materialer.

For bruk som en enzymelektrode i henhold til angivelsene i internasjonal publikasjon WO 87/07295 og WO 89/03871 blir det passende enzym, f.eks. glukose oksydase, eller blanding av enzymer immobilisert eller adsorbert på overflaten av en på forhånd dannet netting bestående av et porøst over-flatelag av resinbundne platiniserte eller palladiserte (disse uttrykk blir nedenfor brukt i generisk sammenheng og innbefatter de tilsvarende oksyder såvel som de elementære platinagruppemetaller, med mindre sammenhengen krever noe annet) karbon-eller grafittpartikler, som beskrevet ovenfor. Som angitt, kan det immobiliserte enzym enkelt adsorberes på overflaten av det porøse lag av resinbundne platiniserte eller palladiserte karbonpartikler, eller det kan være kovalent bundet til dette, f.eks. ved å bruke veletablerte enzymimmobiliseringsteknikker, såsom f.eks. kovalent binding med et karbodiimid eller karbonyldiimidazol-reagens, kovalent binding med 1,6-dinitro-3,4-difluorbenzen, eller ved kryssbinding med glutaraldehyd. I alle tilfeller blir enzymet eller enzymblandingen immobilisert eller adsorbert på et på forhånd dannet elektrisk ledende substrat, omfattende et porøst lag ev resinbundne, platiniserte eller palladiserte karbon- eller grafittpartikler støpt på et elektrisk ledende substrat eller ved påføring ved varme eller trykk. I stedet for det finfordelte platinagruppemetall kan de tilsvarende oksyder, f.eks. platina- eller palladiumoksyd, brukes.

Blant annen relevant bakgrunnsteknikk som her skal nevnes, er: Ianello et al. (1982) Analyt. Chem. 54, 1098-1101, beskriver en mediatorfri sensorer hvor glukose oksydase og L-aminosyre-oksydase er kovalent bundet til en grafitt-elektrode ved cyanurkloridmetoden;

Matsushita Electric Appliance Industry Company, ubehandlet japansk patentpublikasjon nr. 56-16447, beskriver en

enzymelektrode omfattende en elektrisk ledende base av støpt grafitt inneholdende opptil 10 vektdeler av et fluorkarbon-resinbindemiddel, f.eks. polytetrafluoretylen som bindemiddel, og hvorpå det er anbrakt ved dampfaseavleiring eller elektrolytisk en tynn (mindre enn ljim) film av platina. Enzymet, f.eks. glukoseoksydase, er immobilisert på den platiniserte overflate av den elektrisk ledende base, og oppfinnelsen hevdes å overvinne problemene ved å immobili-sere et enzym direkte på platina; og

Matsushita Electrical Industrial Co. Ltd. (Nakamura et al), US patent nr. 4.392.933, beskriver en immobi-

lisert enzymelektrode omfattende et oksido-reduktaseenzym, f.eks. glukose oksydase og et metalloksyd, f.eks. ruthenium-

oksyd, som er i stand til å gå inn i redox-reaksjon koblet til enzymet, hvor enzymet og metalloksydet eller metalioksydet alene i seg selv danner en elektronoppsamler og -leder eller er innbefattet i et elektronoppsamler- og leder-materiale, såsom grafitt. Når grafitt brukes som elektronoppsamler og leder, blir det reaktive metalloksyd, f.eks. Ru02 i pulverform og graf ittpulver, pressformet til en pulverblokk eller -skive og hvorpå enzymet, f.eks. glukose oksydase, immobliseres ved kryssbinding til grafittover-flaten, f.eks. med glutaraldehyd.

De ovenfor angitte fremgangsmåter for å danne en enzymelektrode er alle i hovedsak totrinnsmetoder og krever pre-forming av grafitt- eller karbonbasen, ofte under betingelser som krever sintring av pressformen for å fusere bindemidlet, som, slik som angitt, tidligere har vært et hydrofobt syntetisk resin med høyt smeltepunkt, fortrinnsvis et fluorkarbonresin, såsom polytetrafluoretylen.

Slike metoder kan imidlertid ikke anvendes ved masseproduk-sjonsteknikker med store volumer, og som resultat av dette har tidligere enzymelektroder hatt en tendens til å være dyre. Det er følgelig ønskelig å fremstille slike elektroder med en enkel, fortrinnsvis éntrinns masseproduk-sjonsteknikk som ville føre til lavere produksjonsomkost-ninger, selv i den grad at den er i stand til å danne engangs enzymelektroder, dvs. som kan brukes kun én gang og så kastes. Slike engangs enzymelektroder ville det være stort behov for i mange medisinske tester og diagnoser.

I henhold til foreliggende oppfinnelse har det blitt oppdaget at ved fremstillingen av enzymelektroder bestående av et enzym eller blanding av enzymer immobilisert eller adsorbert på et løst lag av resinbundne platiniserte eller palladiserte (eller annet platinagruppemetall) karbon- eller grafittpartikler, kan høytemperaturbindemidlet (dvs. fluorkarbonet eller annet hydrofobt resin med høyt smeltepunkt, fortrinnsvis polytetrafluoretylen) enten sløyfes fullstendig eller erstattes med et lavtemperatur, fortrinnsvis vannoppløselig eller vanndispergerbart bindemiddel, såsom gelatin, dvs. et bindemiddel som kan aktiveres ved romtemperatur og ikke krever høytemperatursintring.

Dette letter i stor grad fremstillingen av enzymelektroden, siden det nå er mulig på forhånd å blande enzymet eller blandingen av enzymer med de platiniserte eller palladiserte (eller annen platinagruppemetall-inneholdende) karbon- eller grafittpartikler i et flytende suspensjonsmedium, f.eks. i vann, og som valgfritt innholder bindemidlet, for derved å danne en suspensjon av enzym, platinisert eller palladisert karbon eller grafitt, og eventuelt et bindemiddel. Denne suspensjon avleires f.eks. ved en skjerm-trykketeknikk, som en tynn film på overflaten av et elektrisk ledende substrat, og deretter tørkes det belagte substrat, for derved å avleire på dette en tynn film som omfatter en i hovedsak homogen blanding av enzym, platinisert eller palladisert finfordelt karbon eller grafitt, og, om tilstede, bindemidlet. Skjermtrykketeknikken tillater spesielt høyvolum-produksjon av et meget effektivt og høysensitivt enzym-elektrodemateriale.

Det har i tillegg til dette blitt oppdaget at selv om

tilstedeværelsen av finfordelt karbon eller grafitt er foretrukket for å virke som en elektronoppsamler og -leder, kan det faktisk sløyfes, og at funksjonelle enzymelektroder kan erholdes meget enkelt ved å avleire en suspensjon av finfordelt platinagruppemetall eller et tilsvarende oksyd, emzym og valgfritt et lavtemperatur, fortrinnsvis vannoppløselig

bindemiddel på et elektrisk ledende spor, f.eks. et karbonspor eller annet egnet elektrisk ledende substrat, såsom et ark av elektrisk ledende karbonpapir, og tørke til avleiring på dette et uniformt lag bestående av det finfordelte platinagruppe-metall eller -oksyd, enzymet, og, om benyttet bindemidlet som en i hovedsak homogen dispersjon.

I henhold til et første aspekt av foreliggende oppfinnelse er det følgelig fremskaffet en fremgangsmåte ved fremstilling av enzymelektroder som omfatter en i hovedsak homogen blanding av et finfordelt platinagruppemetall eller -oksyd og en eller flere enzymer avleiret som et elektrisk ledende lag på overflaten av et underliggende støttemateriale, hvor elektroden kan reagere amperometrisk på aktiviteten av enzymet når enzymet innholdt på et lag på elektroden er i kontakt med sitt respektive enzymsubstrat, hvor fremgangsmåten består i å danne en i hovedsak uniform suspensjon omfattende det finfordelte platinagruppemetall eller -oksyd og enzymet(ene) suspendert i et flytende suspensjonsmedium, avleire denne suspensjon på overflaten av støttematerialet og tørke den avleirede suspensjon ved en temperatur under deaktiveringstemperaturen for enzymet, for derved å avsette det finfordelte platinagruppemetall eller -oksyd og nevnte enzym(er) som et i hovedsak uniformt homogent dekkende lag på overflaten av støttematerialet.

I henhold til et annet aspekt er det fremskaffet en fremgangsmåte for fremstilling av enzymelektrode som omfatter en i hovedsak homogen blanding av et finfordelt platinagruppemetall eller -oksyd og en eller flere enzymer avleiret som et elektrisk ledende over-flatelag på overflaten av et underliggende støttemateriale, hvor laget også inneholder et bindemiddel for partiklene av finfordelt platinagruppemetall eller -oksyd og nevnte enzym(er), hvor bindemidlet består av et materiale som kan binde de finfordelte platingruppemetall- eller oksydpar-tikler og nevnte enzym(er) til et sammenhengende vedheftende lag bundet til støttematerialet ved en temperatur som ikke overskrider deaktiveringstemperaturen til enzymet(ene).

Ved ovenfor nevnte fremgangsmåte er det underforstått at tørkingen av det pålagte substrat utføres ved en temperatur under den hvor det foregår noen vesentlig deaktivering av enzymet, og fortrinnsvis ved romtemperatur.

I en alternativ femgangsmåte i henhold til oppfinnelsen kan elektroden bli dannet ved først å avleire det finfordelte platinagruppemetall eller oksyd, eventuelt preabsorbert på eller blandet med det finfordelte karbon eller grafitt, med eller uten hele eller noe av bindemidlet, om anvendt, på overflaten av det elektrisk ledende substrat på en lignende måte, dvs. ved påføring av en flytende suspensjon omfattende finfordelt platinagruppemetall eller -oksyd, eventuelt preabsorbert på eller blandet med finfordelte karbon- eller grafittpartikler i et suspensjonsmedium, fortrinnsvis et vandig medium, og derpå tørking. Deretter blir det tørkede lag impregnert med en andre oppløsning omfattende enzymet og eventuelt det ytterligere bindemiddel, for derved å dispergere enzymet i det pålagte finfordelte platina- eller platinaoksydinneholdende eller annet platinagrupemetall-eller oksydinneholdende lag, fulgt av ny tørking av det endelige produkt.

I stedet for å bruke platinagruppemetall i finfordelt elementær form, kan de tilsvarende oksyder brukes, såsom platina eller palladiumoksyd. Såles skal alle referanser heri til platinisert eller palladisert materiale bli ansett som innbefattende et tilsvarende oksydinneholdende materiale, med mindre sammenhengen krever noe annet.

Enda mere overraskende er det i henhold til et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse,og som allerede indikert, blitt funnet at ikke bare kan fluorkarbonresin-bindemidlet bli fjernet eller erstattet av et lavtemperatur-, fortrinnsvis vannoppløselig eller vanndispergerbart bindemiddel, men det finfordelte karbon eller grafitt kan også bli fjernet. Således kan enzymelektroder nå fremstilles, som ganske enkelt består av en blanding av enzymer eller blanding av enzymer og et finfordelt platinagruppemetall eller tilsvarende metalloksyd avleiret med eller uten hjelp av et bindemiddel på overflaten av et elektrisk ledende karbonpapir eller på et elektrisk ledende karbonspor. Underkas-tet kompatibilitet med enzymet, kan andre elektrisk ledende substrater brukes. I kontakt med enzymsubstratet ved et fast overpotensiale, viser slike elektroder god amperometrisk respons med en strømutføring som er direkte proposjonal til substratkonsentrasjonen over et bredt konsentrasjonsområde. Slike enzymelektroder og andre heri beskrevet, er følgelig anvendelige som biosensorer ved et stor antall anvendelser, spesielt i området medisinsk og veterinær diagnose for måling av enzymsubstratkonsentrasjoner, f.eks. glukose-, laktat- og kolesterolkonsentrasjoner, i et bredt område av medisinske og kliniske prøver.

I henhold til fremgangsmåteaspektene av foreliggende oppfinnelse kan et antall andre trykke- eller belegningstek-nikker brukes ved siden av skjermtrykking for tilføring av enzymblandingen, finfordelt platinagruppemetall eller-oksyd, eventuelt adsorbert på overflaten av finfordelte partikler av karbon eller grafitt og eventuelt ineholdende et ytterligere bindemiddel, til overflaten av det elektrisk ledende støttemateriale. Ved siden av tradisjonelle belegningstek-nikker, f.eks. med skalpell eller rullebelegning, kan enzymet og finfordelte platinagruppemetall- eller oksydinneholdende blandinger bli trykket på overflaten av støttema-terialet med slike kjente trykketeknikker som blekkstansing eller "tampo"-trykking.

Ved enda en annen fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan enzymelektrodene bli fremstilt ved i utgangspunktet å avleire f.eks. ved skjermtrykking på overflaten av et elektrisk ledende støttemateriale, en tynn film av finfordelte partikler av et platinagruppemetall eller metalloksyd, valgfritt adsorbert på overflaten av finfordelt karbon eller grafitt, og eventuelt i blanding med et lavtemperatur bindemiddel, et bindemiddel som er i stand til å binde partiklene til et sammenhengende lag på overflaten av støttematerialet uten fusering eller sintring av bindemidlet og etterfølgende å impregnere dette avleirede lag med enzymet eller blanding av enzymer.

Selv om de foretrukne finfordelte karbon- og grafittmateria-ler brukt i henhold til de foretrukne aspekter av oppfinnelsen er finfordelte aktiverte karbon- og grafittpartikler med finfordelte partikler av et elementært platinagruppe-metall, f.eks. platina, palladium, iridium eller rhodium,

og spesielt platina eller rhodium, adsorbert på overflaten av karbonpartiklene eller i blanding med disse, kan de tilsvarende oksyder, f.eks. platinaoksyd, palladiumoksyd,

og rhodiumoksyd brukes i stedet. Således er uttrykkene "platinisert" og "palladisert" som brukt heri tenkt å innbefatte oksydene, med mindre sammenhengen krever noe annet. Heri refererer også uttrykkene "aktivert" karbon og "aktivert" grafitt til høyporøse karbon- og grafittmateria-ler med stor overflate erholdt f.eks. ved varmebehandling av karbon- eller grafittpulver i damp eller C02 for å gi et produkt med stort overflateareale angitt i faget som "aktivert karbon". Overflatearealet av slike aktiverte materialer kan ligge på fra 10 m<2>/g og oppover, og vil typisk være i området 200 - 600 m<2>/g. Partikkelstørrelsen er ikke kritisk, men karbon- eller grafittpulveret med en partikkelstørrelse i området 3 - 150 nm er foretrukket, mere foretrukket 3 - 50 nm.

Mengden av platinagruppemetall eller -oksyd adsorbert på karbonpulveret vil generelt være tilstrekkelig til å gi platinagruppemetall-påføringer i området 0,1 - 20 vekt%, baset på vekten av karbon, fortrinnsvis fra 0,5-5 vekt%. Grensene er imidlertid praktiske heller enn kritiske. Under ca 0,1% faller utgangssignalet til et nivå som praktisk uttrykt er for lavt til å bli målt, bortsett fra med ekstra sensitive måleapparater. Over ca. 20% blir påføring av palladiumgruppe-metall uøkonomisk, med liten ytterligere forbedring, f.eks. i øket respons eller følsomhet. Fortrinnsvis har platinagruppemetallet eller oksydpartiklene en partikkelstørrelse i området 1 nm til 20 jjm, og mest foretrukket er en kollodialstørrelse i området 1-4 nm.

Når et bindemiddel er brukt i enzymelektrodene fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan ethvert egnet lavtemperatur (dvs. som er i stand til å binde den platiniserte eller palladiserte karbon- eller grafittpulver/enzymblanding ved romtemperatur uten varming for å fusere bindemiddel)-bindemiddel bli brukt. Foretrukket er spesielt hydroksyetylcellulose eller gelatin, men egnede bindemidler innbefatter vannoppløselig og vanndispergerbar stivelse og cellulosederivater, f.eks. stivelsesacetat, celluloseacetat, celluloseacetatbutyrat og etylcellulose og andre vannoppløselige syntetiske og semi-syntetiske polymere, f.eks. polyvinylalkoholog polyvinyl-pyrolidon. Mengdene av bindemiddel som blir brukt, kan ligge i området fra 5 til 100 % på tørrvekts-basis, basert på den kombinerte vekt av enzym og platisnisert eller palladisert karbonpulver, fortrinnsvis fra 20 til 50%.

Selv om enzymelektrodene beskrevet heri kan bli klassifisert som mediatorfri, kan en elektronoverføringsmediator, såsom ferrosen, om ønsket innbefattes i suspensjonen brukt for å danne elektroden.

Selv om blandingen av platinisert eller palladisert karbonpulver og enzym fortrinnsvis er suspendert i vann før påføringen derav til det elektrisk ledende substrat, f.eks. ved skjermtrykking, kan andre egnede væsker innbefattende organiske oppløsningsmidler, f.eks. cykloheksanon eller diklormetan brukes som suspensjonsmedium. Når det avleires på det elektrisk ledende substrat, kan beleggtykkelsen ligge i området fra 5 til 500 um.

Enzymbelegg vil variere meget, avhengig av det spesielle enzym eller den anvendte enzymblanding. I tilfeller med glukoseoksydasehar belegg på fra 10 til 5000 ;jg/cm2 elektrodeoverflate blitt funnet tilfredsstillende, 100 til 2000 jjg/cm<2> er foretrukket.

Som det elektrisk ledende substrat kan et antall forskjellige materialer brukes, f.eks. en platina- eller annen elektrisk ledende metallstrimmel, elektrisk ledende syntetisk polymerfilm, men mest foretrukket blir det som substrat brukt et elektrisk ledende karbonpapir eller karbonspor, dvs. en linje av karbonpartikler avleiret på et ikke-ledende støttemateriale, som er kommersielt tilgjen-gelig i faget.

Vanligvis, men ikke nødvendigvis, vil overflaten av enzymelektroden bli fysisk beskyttet ved påføring av en egnet porøs, f. eks. polykarbonatmembran eller - belegg» som selvfølgelig må være permeabel for emzymsubstratet (glukose) som skal bestemmes. Slike membraner er noe ufordelaktige, da de øker responstiden for sensoren, men ikke desto mindre er foreliggende sensorer, selv med en slik membran, i stand til responstider som er sammenlignbare med,

og i mange tilfeller vesentlig bedre enn, konvensjonelle enzymelektroder.

Som allerede nevnt, angår oppfinnelsen spesielt glukoseok-sydaseelektroder, dvs. hvor det immobilisete enzym er en glukoseoksydase, men det vil være klart at andre oksidoreduktaser kan brukes, om enn ikke alltid med tilsvarende effekt. Dette er ikke nødvendigvis grunnet noen iboende ineffektivitet av enzymet, men andre faktorer. For eksempel, ved bestemmelsen av urinsyre ved å bruke irucase, undergår urinsyresubstratet i seg selv elektrokjemisk oksydasjon ved baseelektroden, og maskerer således for en stor del enhver effekt av enzymet. Imidlertid innbefatter andre egnede oksidoreduktaser laktat oksydase, galaktose oksydase, kolesterol oksydase og andre peroksyddannende enzymer, såvel som kombinasjoner av immobliserte enzymer, innbefattende kombinasjoner av en ikke-oksydase og en oksydase, hvor den første virker på et substrat av interesse for å danne et oksyderbart substrat for oksydasen, og hvor sistnevnte virker på det oksyderbare produkt for å danne en målbar strøm som er proposjonal med konsentrasjonen av substratet av interesse. En slik kombinasjon er kombinasjonen av p<->galaktosidase og glukose oksydase (for kvantitativ bestemmelse av laktose eller kombinasjonen av 3-glukan depolymeriserende enzym, e-glukosidase og gluose oksydase (for bestemmelsen av P-glukaner).

Andre typer av sensoranvendelse innbefatter bruken av enzymatiske eller ikke-enzymatiske reagenser eller prosesser som innvirker på et primært substrat av interesse i en precursorreaksjon, hvor det resulterende produkt omfatter en substans som i sin tur virker som et substrat for en enzymelektrode ifølge foreliggende oppfinnelse. Mange eksempler på slike precursortrinn vil vil bli funnet i området immunokjemiske reaksjoner, og fremgangsmåter for bruk av slike reaksjoner i dannelsen av sensorer som anvender enzymelektroder i henhold til foreliggende oppfinnelse, vil være innlysende for fagmannen.

Hovedanvendelsen av elektrodene ifølge foreliggende oppfinnelse vil imidlertid være som biosensorer for påvisning og/eller kvantitativ måling av et oksyderbart substrat, spesielt glukose, i en prøve, spesielt en klinisk prøve, såsom blod, serum, plasma, urin, svette, tårer og spytt.

Andre mulige ikke-kliniske anvendelser innbefatter:

(a) fermenteringsovervåkning,

(b) industriell prosesskontroll,

(c) miljømessig overvåkning, f.eks. utslipps- og

forurensningskontroll av væsker og gasser,

(d) matvareundersøkelse,

(e) veterinær anvendelse, spesielt anvendelse som gjelder de kliniske anvendelser antydet ovenfor.

Idet bio- og andre sensorer som innbefatter et enzym-elektrodemateriale i henhold til foreliggende oppfin-

nelse kan omfatte andre strukturelle elementer, elektriske ledere, elektriske ikke-ledende (isolerende) støttematerialer eller sonder osv., er slike elementer i sin oppbygning konvensjonelle, og behøver ikke beskrives i detalj.

Elektrisk kontakt med elektrodematerialet kan utføres på mange måter, f.eks.ved å montere elektrodematerialet i flate-mot-flate kontakt med en elektrisk ledende kontakt eller terminal, f.eks. av platina eller annen egnet leder.

I bruk vil utgangsstrømmen fra enzymelektroden ifølge foreliggende oppfinnelse i nærvær av en prøve inneholdende enzymsubstrat bli målt ved et fast potensiale i henhold til fremgangsmåtene som allerede er veletablert i faget. Generelt sagt vil strømutføring bli målt ved et fast potensiale i området 200 - 600 mV under referanse til en sølv/sølvklorid referanseelektrode. To eksempler på egnede to- og treelektrodeceller for bruk ved slike målinger er illustrert og beskrevet i detalj i Internasjonal publikasjon nr. WO 87/07295, som det allerede har blitt referert til.

Oppfinnelsen er illustrert ved de følgende eksempler, hvor det er referert til de medfølgende tegninger, hvor figurene 1 til 17 illustrerer strømutgangen fra forskjellige enzymelektroder konstruert i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

En glukose-oksydase-elektrode ble fremstilt ved å suspendere 200 mg platinisert karbonpulver inneholdende ca. 10 vekt% platina, og som kan erholdes fra The Prototech Company, Newton Highlands, Massachusetts (Vulcan XC-72 karbonpulver, nominell partikkelstørrelse 30 nm med kollodialt platina, partikkelstørrelsesområde 1,5 til 2,5 nm adsorbert på dette) i 400 pl fosfatbuffer (NaH2P04 2mmol/l, Na2HP04 16 mmol/1, NaCl 100 mmol/1, K2H2(EDTA)2H20 1 mmol/l:pH 7,4). Til suspensjonen ble det så tilsatt 40 mg glukose oksydase. Suspensjonen ble omrørt og fikk stå i én time ved romtemperatur .

Deretter ble suspensjonen spredt ut for hånd som en tynn film på overflaten av et ark av elektrisk ledende karbonpapir (Toray backing paper) og fikk tørke ved romtemperatur. Når det var tørt, ble enzymelektrodematerialet skåret i 1,5 mm skiver og testet for sin reaksjon mot glukose ved 400 mV mot Ag/AgCl i to elektrokjemiske celler som beskrevet i WO 87/07295 under henvisning til figur 16.

Strømutgangen (uA) fra elektroden overfor forskjellige kon-sentrasjoner av glukose er vist i figur 1 av de medfølgende tegninger. De erholdte resultater viser to bemerkelsesver-dige effekter: For det første at elektroderesponsen i hovedsak er lineær over hele området fra 0 til 30 mmol/1 glukose, og for det andre at disse resultater er erholdt uten noe bindemiddel for å gi en "oksygenrik" atmosfære. I henhold til tidligere teknikk, unntatt WO 87/07295, har det tidligere kun vært mulig å erholde linearitet over et begrenset område av glukosekonsentrasjoner, dvs. 2-5 mmol/1 (Yao T., Analytica Chimica Acta 148, 27-33 (1983)). Ytterligere tidligere teknikk angir at lineariteten til glukoseelektrodenes respons øker når fri diffusjon av oksygen er tillatt (Lobel E. og Risphon J., Analytical Chemistry 53, 51-53 (1981)), hvilken angivelse er støttet i WO 87/07295, hvor et bindemiddel med en høy affinitet eller oppløselighet for oksygen blir brukt. I motsetning til dette gir foreliggende oppfinnelse linearitet av en respons over et meget bredere område av glukosekonsentrasjoner, selv når intet bindemiddel er tilstede.

Eksempel 2

Eksempel 1 ble gjentatt, men ved å bruke finfordelt platinisert grafitt (5% Pt) erholdt fra Johnson Matthey Chemicals, Royston, England, og forhandlet av disse som en "prosess-katalysator" CH15959/01, i stedet for det platiniserte Vulcan XC-72. En i hovedsak lignede lineær elektroderespons erholdes, se figur 2.

Eksempel 3

Eksempel 2 ble gjentatt, dvs. ved å bruke det finfordelte platiniserte grafitt (5% Pt) fra Johnson Matthey for å danne enzym/Pt grafittsuspensjonen. I dette tilfellet ble imidlertid en 20% w/v-oppløsning av gelatin i vann avkjølt til 37"C tilsatt suspensjonen ved et volumforhold på 2:1.

Den resulterende elektrode erholdt ved å spre den gelatin-inneholdende pasta på Toray backing-papiret ga etter tørking ved romtemperatur et mer robust produkt, men som igjen viste en i hovedsak lineær respons overfor glukose, se figur 3.

Eksempel 4

En vandig pasta ble fremstilt fra 45 mg platinisert karbonpulver (Vulcan XC-72, inneholdende 10 vekt% adsorbert kollodialt platina; The Prototech Company, Massachusetts), 5 mg glukose oksydase suspendert i 100 mg av en 10% oppløs-ning av hydroksyetylcellulose i 0,1 M KC1.

Pastaen ble for hånd lagt på på forhånd fuktet karbonpapir (Toray backing paper) og fikk tørke.

1,5 mm skiver ble skåret fra det tørkede eklektrodema-teriale og undersøkt for sin respons overfor glukose i en to-elektrodecelle som beskrevet og ved et potensiale på 400 mV mot Ag/AgCl.

Strømutgangen ble målt ved forskjellige glukosekonsentrasjoner og resultatene er vist i figur 4. Responsen er i hovedsak lineær over et glukosekonsentrasjonsområde på fra 0 til 30 mmol/1.

Eksempler 5 oa 6

Fremgangsmåten fra eksempel 4 ble gjentatt, men med platinisert karbonpulver (Vulcan XC-72) inneholdende henholdsvis 1% og 0,2% platina. Strømutganger fra elektrodematerialene ble målt under samme betingelser, og resultatene er vist i figurene 5 og 6. Figur 5 viser en lignende lineær respons mot glukosekonsentrasjoner over et helt område fra 0 til 3 0 mmol/1. Den reduserte mengde platia (0,2%) viser en vesentlig grad av linearitet, men over et redusert konsentrasjonsområde fra 0 til 20 mmol/1.

Eksempel 7

Eksempel 4 ble gjentatt, men det ble brukt 0,5 mg glukose oksydase. Strømutgangen fra elektrodematerialet målt under de samme betingelser er vist i figur 7. Linearitet erholdes over glukosekonsentrasjoner fra 0 til 20 mmol/1.

Eksempel 8

Eksempel 4 ble gjentatt, men det ble brukt 45 mg karbonpulver (Vulcan XC-72) inneholdende 10 vekt% kollodialt platinaoksyd adsorbert på dette i stedet for platinametall.

1,5 mm skiver av elektrodematerialet ble undersøkt for sin respons overfor forskjellige glukosekonsentrasjoner under samme betingelser som tidligere, dvs. i en to-elektrodecelle ved et potensiale på 400 mV mot Ag/AgCl.

Strømutløpet målt ved forskjellige glukosekonsentrasjoner er vist i figur 8.

Eksempel 9

Det ble fremstilt en pasta ved å blande 5 mg platinasvart, 400 mg aktivert karbonpulver (Vulcan XC-7s) og 5 mg glukose oksydase i 100 mg hydroksyetylcellulose (10%) i 0,1 M KC1.

Pastaen ble smurt for hånd på 'Toray backing papir" og fikk tørke.

1,5 mm skiver ble skåret fra det tørkede elektrodemateriale og undersøkt for sin respons overfor glukose under samme betingelser som tidligere.

Elektroden viser en lineær respons overfor glukose over hele konsentrasjonsområdet fra 0 til 30 mmol/1.

Eksempel 10

Eksempel 4 ble gjentatt, men det ble brukt 5 mg laktat oksydase EC 1.1.3.2 i stedet for glukose-oksydase.

1,5 mm skiver av det tørkede elektrodemateriale ble under-

søkt for sin respons overfor laktat under samme betingelser som tidligere: 2-elektrodecelle ved 400 mV mot Ag/AgCl.

Som vist i figur 10, varierer strømuttaket i hovedsak lineært med laktatkonsentrasjonen over laktatkonsen-trasjoner i området fra 0 til 20 mmol/1.

Eksempel 11

En karbonfri enzymelektrode ble fremstilt ved å suspendere 5 mg platinasvart, 5 mg glukose oksydase i 100 mg 10%, hydroksyetylcellulose i 0,1M KCl.

Suspensjonen ble smurt for hånd på "Toray backing papir"og tørket.

1,5 mm skiver av det tørkede elektrodemateriale ble undersøkt som tidligere for elektroderespons og strømutfø-ring, overfor forskjellige glukosekonsentrasjoner. Resultatene er vist i figur 11, og viser i hovedsak en lineær respons over glukosekonsentrasjoner i området 0 til 20 mmol/1.

Eksempel 12

Ifølge samme generelle fremgangsmåte som i eksempel 4,

men ved å bruke aktiverte karbonpartikler (Vulcan XC-72) med 1 vekt% (basert på vekten av karbonet) adsorbert på dette, henholdsvis av finfordelte kollodiale partikler av

iridium og rhodium i stedet for det platiniserte karbonpulver og ved å bruke en fosfatbuffer (eksempel 1 for detaljer om suspensjonsmediet) i stedet for 0,1 M KCl, ble glukoseoksydase-elektroder fremstilt som besto av et homogent lag av rhodium- eller iridiumbelagte grafittpartikler og glukose oksydase bundet med hydroksyetylcellulose på et karbonpapir-støttelag. Responsen i mikroampére av slikt elektrodemateriale skåret i 1,5 mm skiver overfor substrat(glukose)-konsentrasjoner i området 0 til 40 mmol/1 ved 400 mV mot en Ag/AgCl referanseelektode er vist henholdsvis i figurene 12 og 13 (figur 12 iridium, figur 13 rhodium). Igjen erholdes 1 hovedsak en lineær respons. Det høye responsnivå erholdt med rhodium bør spesielt bemerkes.

Eksempel 13

8 mg kolesterol oksidase (ca. 16 p/mg) ble blandet med 150 pl av 5% w/v hydroksyetylcellulose-oppløsning i en fosfatbuffer (NaH2 P04 1,6 mmol/1; Na2HP04 5,3 mmol/1; NaCl 52 mmol/1; EDTA 0,15 mmol/1; pH 7,4) inntil den var oppløst. 72 mg finfordelt platinisert grafitt (5%) ble tilsatt og blandet for å danne en pasta.

Elektrisk ledende karbonpapir (Toray) trukket i 2 uker i en fosfatbuffer ( NaH2P04 2 mmol; Na2HP04 15 mmol/1; NaCl 100 mmol/1; EDTA 1 mmol/1; Triton xlOO surfaktant 0,1% v/v; pH 7,4) ble tørket tørt og kolesteroloksydase/platinisert grafitt/HEC-pasta ble spredt jevnt på dette for hånd. Den resulterende pastaelektrode ble tørket ved romtemperatur i 2 timer og ved 30°C i 30 min. For å forbedre oppbevarings-tiden ble elektroden så dyppet i 5% w/v sukroseoppløsning i 2 minutter og tørket ved 20°C i 1 time.

Når den var tørr, ble pastaelektroden skåret i 1,5 mm skiver og undersøkt for respons overfor kolesterol i en to-elektrodecelle ved et potensiale på +340 mV mot Ag/AgCl, hvor pastaelektroden er beskyttet av en 0,05pm polykarbonat(Nucleopore)membran. For undersøkelse ble standard kolesteroloppløsninger fremstilt fra 6 mM kolesterolstam-løsning i 22% vannoppløselig e-cyklodekstrin (Molecusol) i fosfatbuffer (fosfat 1 mmol/1; NaCl 100 mmol/1; EDTA 1 mmol/1; pH 7,4) ved fortynningsgrader for å gi standardkon-sentrasjoner på 0.5, 1, 2, 4 og 6 mmol/1.

Strømutgangen i pA er vist i figur 14 og viser i hovedsak en lineær respons overfor kolesterolkonsentrasjoner i området 0 til 6 mmol/1.

Eksempel 14

Enzymelektroder ble fremstilt i henhold til oppfinnelsen ved

å bruke ikke-vandige systemer som følger.

Pastasuspensjoner ble fremstilt ved å bruke 10 mg mengder av glukose oksydase og 40 mg mengder av platinisert grafittpulver (5% Pt) i ikke-vandige bindesystenmer som følger: a) 400 pl 10% w/v celluloseacetat i cykloheksanon, b) 600 pl 5% w/v celluloseacetatbutyrat i diklormetan, c) 400 pl 5% w/v etylcellulose i cykloheksanon.

Etter blanding ble pastaene spedt ut på elektrisk ledende

karbon (Toray) støttepapir og fikk tørke ved romtemperatur.

Når de var tørre, ble skiver med 1,5 mm i diameter skåret fra det belagte størrepapir og undersøkt for sin respons overfor glukose i en to-elektrodecelle ved 340 mV mot Ag/AgCl. Elektrodematerialet ble montert på en arbeids-elektrode av gull og holdt i posisjon på denne av en 0,03 pm polykarbonat (Nuclepore) membran. Standard glukoseopp-løsninger ble brukt inneholdende 0, 2.5, 5, 10 og 2 0 mmol/1 glukose i en fosfatbuffer inneholdende NaH2P04 2 mmol/1; Na2HP04 16 mmol/1; NaCl 100 mmol/1; EDTA 1 mmol/1; pH 7,4. I hvert tilfelle erstrømutføringen i pA fra cellen illustrert grafisk i figurene 15 til 17 som følger:

Figur 15: Celluloseacetat i cykloheksanon,

figur 16: Celluloseacetatbutyrat i diklormetan,

figur 17: Etylcellulose i cykloheksanon.

Disse figurer viser muligheten for å utføre oppfinnelsen ved å bruke ikke-vandige systemer og alternative lavtemperatur bindemidler.

Claims (16)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av enzymelektroder av en type omfattende et elektrisk ledende, porøst, koherent lag av finfordelte karbon- eller grafitt-partikler med finfordelte partikler av et platina-gruppe-metall eller av et platina-gruppe metalloksyd uniformt dispergert gjennom dette lag idet elektroden har ett eller flere enzymer immobilisert på seg og i kontakt med nevnte finfordelte partikler av platina-gruppe-metallet eller platina-gruppe metalloksydet, hvor nevnte elektrode kan reagere amperometrisk på aktiviteten av de(t) immobiliserte enzym(er) når den er i kontakt med et substrat for dette enzym, karakterisert ved trinnene: (a) å danne en i hovedsak uniform suspensjon inneholdende nevnte finfordelte karbon- eller grafitt-partikler, nevnte finfordelte partikler av et platina-gruppe-metall eller platina-gruppe metalloksyd samt et bindemiddel i suspensjon i et flytende suspensjonsmedium; (b) tørke den avleirede suspensjon for derved å deponere nevnte karbon- eller grafitt-partikler og nevnte platina-gruppe-metall eller -oksyd som en i hovedsak uniform blanding på overflaten av nevnte støttemateriale og bundet sammen til et koherent, i hovedsak homogent, porøst, elektrisk ledende lag på overflaten av støttematerialet via nevnte bindemiddel; og (c) inkorporere nevnte enzym(er) i nevnte lag, hvor det er forutsatt at, når nevnte enzymer er et enzym som krever som en kofaktor NAD, NADH, NADP eller NADPH, og elektroden er amperometrisk påvirkbar overfor aktiviteten av dette enzym i nærvær av et substrat for dette enzym og i nærvær av ko-faktoren, er bindemiddelet inneholdt i den flytende suspensjon benyttet i trinn a) er forskjellig fra gelatin.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor forbeholdet ikke gjelder, karakterisert ved at nevnte enzym (er) er inkorporert i nevnte koherente, i hovedsak homogene, porøse, elektrisk ledende lag, ved å tilsette enzymet(ene) til nevnte suspensjon inneholdende nevnte karbon- eller grafitt-partikler, nevnte platina-grupe-metall eller - metalloksyd samt nevnte bindemiddel, hvor nevnte bindemiddel er et materiale som er forskjellig fra enzymet i seg selv, og som er et materiale som er effektivt til å binde nevnte partikler i et koherent lag ved en temperatur under deaktiverings-temperaturen til enzymet, i suspensjon i nevnte flytende suspensjonsmedium, for derved samtidig å deponere på overflaten av nevnte støttemateriale en uniform blanding inneholdende nevnte enzym(er), nevnte karbon- eller grafitt-partikler, nevnte finfordelte platina-gruppe-metall eller -metalloksyd samt nevnte bindemiddel, idet det avleirede lag deretter blir tørket ved en temperatur som er under deaktiveringstemperaturen for de avleirede enzymer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor forbeholdet gjelder, karakterisert ved at enzymet(ene) blir inkorporert i nevnte koherente, i hovedsak homologe, porøse, elektrisk ledende lag ved å impregnere dette lag, etter deponeringen derav på overflaten av støtte-materialet, med nevnte enzym eller enzymer inneholdt i et væskesuspensjonsmedium og på nytt tørke nevnte lag ved en temperatur som er under deaktiveringstemperaturen for enzymet(ene) for derved å avleire nevnte enzym(er) i nevnte lag.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor forbeholdet ikke gjelder, karakterisert ved at det avleirede lag av karbon- eller grafitt-partikler og finfordelte partikler av platina-gruppe-metall eller -metalloksyd, hvor enzymet (ene) i seg selv virker som bindemiddel for disse partikler, idet enzymet(ene) , i dette tilfelle, er inkorporert i nevnte suspensjon som bindemiddel, og laget av karbon- eller grafitt-partikler, det finfordelte platina-gruppe-metall eller -metalloksyd og nevnte enzym(er) blir tørket, etter deponering på overflaten av det underliggende støttemateriale, ved en temperatur under deaktiveringstemperaturen til enzymet(ene).

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, hvor forbeholdet henholdsvis gjelder eller ikke gjelder, karakterisert ved at de finfordelte partikler av platina-gruppe-metall eller platina-gruppe-metalloksyd blir preadsorbert på i og for seg kjent måte på overflaten av karbon- eller grafitt-partiklene før inkorporeringen derav i nevnte suspensjon.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at de finfordelte karbon- eller grafitt-partikler har en partikkelstørrelse i området 3 til 15 nm og platina-gruppe-metall- eller - metalloksydpartiklene har en partikkelstørrelse i området 1 til 4 nm.

7. Fremgangsmåte ved fremstilling av en enzymelektrode bestående i hovedsak av et tynt, elektrisk ledende lag av finfordelte partikler av et platina-gruppe-metall eller av et platina-gruppe metalloksyd bundet til overflaten av et underliggende støttemateriale, og omfattende et eller flere enzymer(er) immobilisert i eller på nevnte lag, hvor nevnte elektrode er aperometrisk reagerende på aktiviteten av enzymet (ene) når elektroden er i kontakt med det passende enzymsubstrat, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter: (a) å danne en suspensjon av det finfordelte platina-gruppe-metall eller platina-gruppe metalloksyd i et flytende suspensjonsmedium inneholdende et bindemiddel for nevnte partikler hvor nevnte bindemiddel er et materiale som er effektivt til å binde nevnte partikler til et koherent, porøst lag på overflaten av det underliggende støttemateriale ved en temperatur under deaktiverings-temperaturen til enzymet; (b) avsette nevnte suspensjon som en tynn film på overflaten av et underliggende støttemateriale; (c) tørke den avsatte suspensjon for derved å avleire på overflaten av støttematerialet et tynt, porøst, elektrisk ledende, koherent lag omfattende nevnte platina-gruppe-metall eller -metalloksyd-partikler og nevnte bindemiddel og (d) inkorporere enzymet eller enzymene i dette lag.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at enzymet eller enzymene initielt blir inkorporert i nevnte suspensjon sammen med nevnte finfordelte platina-gruppe-metall eller -metalloksyd og eventuelt et ytterligere bindemiddel for de finfordelte partikler av platina-gruppe-metall eller - metalloksyd, hvor nevnte ytterligere bindemiddel er et materiale som er effektivt til å binde nevnte partikler til et koherent lag ved en temperatur under deaktiverings-temperaturen av enzymet, og hvor den avleirede film inneholdende det finfordelte platina-gruppe-metall eller - metalloksyd, enzymet(ene) og, om tilstede, det ytterligere bindemiddel, blir tørket ved en temperatur som er under deaktiveringstemperaturen til enzymet for derved å danne på overflaten av støttematerialet et lag av finfordelte partikler av platinametall eller -metalloksyd inneholdende enzymet(ene), og som er bundet sammen med bindemiddelet og/eller av enzymet i seg selv.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 6, karakterisert ved at det flytende suspensjonsmedium er et vandig medium, og bindemiddelet er et vann-dispergerbart eller vannoppløselig materiale, og er forskjellige fra enzymet i seg selv, hvor bindemiddelet er forskjellig fra gelatin, i samsvar med forbeholdet angitt i krav 1, hvor suspensjonen er en suspensjon inneholdende finfordelte partikler av karbon eller grafitt, og enzymet er et slikt som trenger NAD, NADH, NADP eller NADPH som en ko-faktor.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at det flytende suspensjonsmedium er et vandig medium, og bindemiddelet er et vanndispergerbart eller vannoppløselig materiale, og er forskjellig fra enzymet i seg selv.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9 eller 10, karakterisert ved at det vannopp løs elige bindemiddel er hydroksyetylcellulose.

12. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 11, karakterisert ved at suspensjonen blir påført på overflaten av det underliggende støttemateriale ved "screen printing".

13. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 12, karakterisert ved at det underliggende støttematerialelag i seg selv er elektrisk ledende.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved det underliggende støttematerialelag er et ark av elektrisk ledende karbonpapir eller en karbonbane.

15. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 14, karakterisert ved at enzymet som benyttes er glukoseoksydase, en kolesterol oksydase eller laktatoksydase.

16. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 15, karakterisert ved at nevnte finfordelte platinagruppe metallpartikler er finfordelte partikler av elementært platina.