DK171603B1 - Enzymelektroder og fremgangsmåde til fremstilling af sådanne elektroder - Google Patents

Description

i DK 171603 B1

Den foreliggende opfindelse angår enzymelektroder og fremgangsmåder til fremstilling deraf.

I international patentansøgning nr. PCT/GB87/00365 (international publikation nr. WO 87/07295) beskrives enzymelektroder, der er i stand 5 til at reagere amperometrisk på den katalytiske aktivitet af et enzym i nærvær af dets respektive substrat, hvilke enzymelektroder omfatter et enzym, der er immobil i seret eller adsorberet på overfladen af et elektrisk ledende støtteorgan bestående af eller omfattende et porøst lag af harpiksbundne carbon- eller grafitpartikler, hvilke partikler i intim 10 blanding dermed eller aflejret eller adsorberet på overfladen af de individuelle partikler før binding til dannelse af nævnte lag indeholder et fi ndelt platingruppemetal til dannelse af et porøst substratlag, på hvilket enzymet er adsorberet eller immobil i seret og omfattende et i det væsentlige homogent lag af harpiksbundne carbon- eller grafitpartikler, 15 idet platingruppemetallet er fordelt i det væsentlige ensartet gennem laget. De foretrukne substratmaterialer er harpiksbundne piatini serede carbonpapirelektroder omfattende platiniserede carbonpulverparti kl er med kolloidalt platin adsorberet på overfladen af partiklerne og bundet til et carbonpapirsubstrat under anvendelse af en syntetisk harpiks, for-20 trinsvis polytetrafluorethylen, som bindemiddel. De foretrukne enzymelektroder er glucoseoxidaseelektroder omfattende glucoseoxidase adsorberet eller immobil i seret på overfladen af substratet.

I international ansøgning nr. PCT/GB88/00868 (international publikation nr. WO 87/03871) beskrives lignende enzymelektroder, men under 25 anvendelse af oxider, fx. PtO, frem for et elementært platingruppemetal præadsorberet på de harpiksbundne carbon- eller grafitpartikler.

Som beskrevet i sidstnævnte ansøgning er de foretrukne substratmaterialer for disse enzymelektroder harpiksbundne, platiniserede (eller platinoxidholdige) carbonmaterialer, der hidtil er blevet anvendt som 30 gasdiffusionselektroder i brændselsceller og kommercielt kan opnås fra The Prototech Company, Newton Highlands, USA. I det væsentlige indeholder sådanne materialer som harpiksbindemiddel en hydrofob flaorcarbonhar-piks med relativt højt smeltepunkt, fortrinsvis polytetrafluorethylen.

Fremstillingen af sådanne harpiksbundne platiniserede carbongas-35 diffussionselektrodematerialer er beskrevet i US-A-4.044.193, US-A-4.166.143, US-A-4.293.396 og US-A-4.478.696. Alternative, men lignende gasdiffusionselektordematerialer, der ifølge international publikation 2 DK 171603 B1 nr. W0/87/07295 er lige egnede som elektrisk ledende substratmaterialer til enzymelektroder, er også beskrevet i US-A-4.229.490. I store træk fremstilles sådanne elektrodematerialer ved aflejring af kolloidale partikler af platin eller palladium eller andre platingruppemetaller på 5 findelte partikler af carbon eller grafit, blanding af de platiniserede eller palladiserede carbon- eller grafitpartikler med en fluorcarbonhar-piks, fortrinsvis polytetrafluorethylen, og formning af blandingen på et elektrisk ledende støtteorgan, fortrinsvis elektrisk ledende carbonpa-pir, eller på et filamentøst carbonfibervæv. Lignende fremgangsmåder an-10 vendes til de oxidholdige materialer.

Til anvendelse som enzymelektrode ifølge de internationale publikationer nr. WO 87/07295 og nr. WO 89/03871 immobiliseres eller adsorbe-res et passende enzym, fx. glucoseoxidase, eller en blanding af enzymer, på overfladen af et præformet væv omfattende et porøst overfladelag af 15 harpiksbundne platiniserede eller palladiserede (disse betegnelser anvendes i det følgende i generisk betydning for at omfatte de tilsvarende oxider samt de elementære platingruppemetaller, medmindre andet fremgår af sammenhængen) carbon- eller grafitpartikler som beskrevet ovenfor.

Som anført kan det immobil i serede enzym simpelthen være adsorberet på 20 overfladen af det porøse lag af harpiksbundne, platiniserede eller palladiserede carbonpartikler eller det kan være covalent bundet dertil, fx. under anvendelse af veletablerede enzymimmobiliseringsteknikker såsom fx. ved covalent binding med et carbondiimid- eller carbonyldiimida-zolreagens, covalent binding med l,6-dinitro-3,4-difluorbenzen eller 25 tværbinding med glutaraldehyd. I alle tilfælde immobiliseres eller ad-sorberes enzymet eller enzymblandingen på et præformet elektrisk ledende substrat omfattende et porøst lag af harpiksbundne platiniserede eller palladiserede carbon- eller grafitpartikler, der formes på et elektrisk ledende substrat ved anvendelse af varme og tryk. I stedet for det fin-30 delte platingruppemetal kan der anvendes de tilsvarende oxider, fx. platin- eller palladiumoxid.

Andre kendte teknikker, der er relevante i forbindelse med den foreliggende opfindelse, er følgende:

Ianiello et al (1982) Analyt. Chem. 54, 1098-1101, der beskriver 35 sensorer uden mediator, hvori glucoseoxidase og L-aminosyreoxidase er covalent bundet til en grafitelektrode ved cyanursyrechlormetoden,

Matsushita Electric Appliance Industry Company, ueksamineret of- 3 DK 171603 B1 fentiiggjort japansk patentansøgning nr. 56-16447, der omhandler en enzymelektrode omfattende en elektrisk ledende base af formet grafit indeholdende op til 10 vægtdele af et fluorcarbonharpiksbindemiddel, fx. po-lytetrafluorethylen, som bindemiddel, og hvorpå der ved dampfaseaflej-5 ring eller elektrolytisk er aflejret en tynd (mindre end 1 μπι) platinfilm. Enzymet, fx. glucoseoxidase, immobiliseres på den platiniserede overflade af den elektrisk ledende base, hvorved opfindelsen påstås at overvinde problemet med at immobilisere et enzym direkte på platin, og Matsushita Electrical Industrial Co. Ltd. (Nakamura et al), US-pa-10 tentskrift nr. 4.392.953, der omhandler en immobil i seret enzymelektrode omfattende et oxidoreduktaseenzym, fx. glucoseoxidase, og et metaloxid, fx. rutheniumoxid, der er i stand til at indgå i redox-reaktionen koblet til enzymet, enzymet og metaloxidet, idet selve metaloxidet enten i sig selv danner en elektronkollektor og -leder eller er inkorporeret i et 15 elektronkollektor og -ledermateriale såsom grafit. Når grafit anvendes som elektronkollektor og -leder formes det reaktive metaloxid, fx. i pulverform og grafitpulver, under tryk til en kompakt pulvermasse eller skive, hvorpå enzymet, fx. glucoseoxidase, immobiliseres ved tværbinding til grafitoverfladen, fx. med glutaraldehyd.

20 Alle de ovenfor beskrevne fremgangsmåder til fremstilling af en enzymelektrode er i princippet totri ns-metoder og kræver præformning af grafit- eller carbonbærer, ofte under betingelser, der kræver sintring af den formede kompakte masse for at sammensmelte bindemidlet, der som nævnt hidtil har været en hydrofob syntetisk harpiks med højt smelte-25 punkt, fortrinsvis en fluorcarbonharpiks såsom polytetrafluorethylen.

Sådanne fremgangsmåder er imidlertid ikke egnede til masseproduktionsteknikker, hvilket er grunden til, at sådanne kendte enzymelektroder har en tendens til at være kostbare. Derfor ville det være ønskeligt at fremstille sådanne elektroder ved en enkel, fortrinsvis et-trins, 30 massefremstillingsteknik, hvilket vil føre til lavere fremstillingsomkostninger, endog i en sådan grad, at det vil være muligt at fremstille éngangs-enzymelektroder, dvs. elektroder, der kun anvendes £n gang og derefter kasseres. Sådanne éngangsenzymelektroder ville være efterspurgt til mange forskellige medicinske tests og diagnoser.

35 I en intervenerende ansøgning, som er publiceret efter den fore liggende prioritetsdato, under det internationale publikationsnummer W0 88/09447 (EP-A-0 289 344) beskrives en fremgangsmåde til kvantitativ be- 4 DK 171603 B1 stemmel se af NADH eller NAOPH i opløsning under anvendelse af enzymelektroder af den type, der er beskrevet i EP-A-0 247 850, og indeholdende som det immobil i serende enzym et enzym, der kræver NAD, NADH, NADP eller NAPH som en cofaktor. Endvidere beskrives enzymelektroder af den type, 5 der er beskrevet i EP-A-0 247 850, som indeholder et enzym, der kræver NAD, NADH, NADP eller NADPH som en cofaktor, og som også indeholder co-faktoren samt enzymet, hvilke enzymelektroder er nyttige til bestemmelse af substraterne af det pågældende enzym via reaktion af enzymet med substratet i nærvær af cofaktoren tilsat reaktionsmediet ved hjælp af selve 10 elektroden. Det er også kort omtalt, at de pågældende elektroder, som skal anvendes til bestemmelse af NADH eller NADPH i opløsning i overensstemmelse med den pågældende opfindelse, og som det immobil i serede enzym benytter et enzym, der kræver NADH, NADH, NADP eller NADPH som en cofaktor, og som også indeholder den pågældende cofaktor sammen med enzymet, 15 kan a) anvende gelatine som et bindemiddel for de nævnte elektroder i stedet for polytetrafluorethylen, og b) at sådanne elektroder i almindelighed, men uden specifik reference til gelatine som bindemidlet, kan fremstilles ved en skabelontrykningsproces.

Under hensyntagen hertil strækker den foreliggende opfindelse sig 20 ikke til fremstillingen af enzymelektroder ved hjælp af fremgangsmåden ifølge denne opfindelse, og hvor der anvendes et enzym, som kræver NAD, NADH, NADP eller NADPH som en cofaktor, hvilket enzym immobiliseres på et harpiksbundet lag af carbon eller grafit blandet med et platingrup-pemetal eller platingruppemetaloxid, og hvor gelatine anvendes som bin-25 demidlet, hvilke elektroder kan anvendes til de formål, der er beskrevet i den tidligere ansøgning, nemlig bestemmelse af NADH eller NADPH i opløsning.

Under denne forudsætning og i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse har det vist sig, at højtemperaturbindemidl et (dvs. fluor-30 carbonharpikser med højt smeltepunkt eller andre hydrofobe harpikser, fortrinsvis polytetrafluormethylen) ved fremstillingen af enzymelektroder omfattende et enzym eller en blanding af enzymer immobiliseret eller adsorberet på et porøst lag af harpiksbundne piatiniserede eller palla-diserede (eller andre platingruppemetalholdige) carbon- eller grafitpar-35 tikler, enten helt kan udelades eller erstattes af et lavtemperatur-bin-demiddel, der fortrinsvis er vandopløseligt eller vanddispergerbart såsom gelatine, dvs. et bindemiddel, som kan aktiveres ved stuetemperatur 5 DK 171603 B1 og som ikke kræver højtemperatur-sintring.

Dette letter betydeligt fremstillingen af enzymelektoden, da det nu er muligt at forblande enzymet eller blandingen af enzymer med de platiniserede eller palladiserede (eller andre platingruppemetalholdige) 5 carbon- eller grafitpartikler i et flydende suspensionsmedium, fx. i vand, der eventuelt indeholder bindemidlet, til dannelse af en suspension af enzym, platiniseret eller palladiseret findelt carbon eller grafit og eventuelt et bindemiddel, hvorefter denne suspension, fx. ved en skabelontrykningsteknik, aflejres som en tynd film på overfladen af et 10 elektrisk ledende substrat efterfulgt af tørring af det derved belagte substrat til aflejring af en tynd film derpå, der omfatter en i det væsentlige homogen blanding af enzym, platiniseret eller palladiseret findelt carbon eller grafit og, hvis et sådant er til stede, bindemidlet. Specielt muliggør skabelontryktekniken masseproduktion af et højeffek-15 tivt og højfølsomt enzymelektrodemateriale.

Udover dette har det også vist sig, at selvom der fortrinsvis anvendes findelt carbon eller grafit som elektronkollektor og -leder, kan de faktisk undværes, og at funktionelle enzymelektroder kan opnås ganske enkelt ved aflejring af en suspension af findelt platingruppemetal eller 20 et tilsvarende oxid, enzym og eventuelt et lavtemperatur-bindemiddel, der fortrinsvis er vandopløseligt, på et elektrisk ledende spor, fx. et carbonspor, eller på et andet egnet elektrisk ledende substrat såsom et ark af elektrisk ledende carbonpapir, og tørring til aflejring af et ensartet lag derpå omfattende det findelte platingruppemetal eller 25 -oxid, enzymet, og, hvis et sådant anvendes, bindemidlet som en i det væsentlige homogen dispersion.

Ifølge et første aspekt af opfindelsen tilvejebringes således en fremgangsmåde til fremstilling af enzymelektroder omfattende en i det væsentlige homogen blanding af et findelt platingruppemetal eller -oxid 30 og et eller flere enzymer aflejret som et elektrisk ledende lag på overfladen af et underliggende støtteorgan, hvor elektroden reagerer ampero-metrisk på enzymets aktivitet, når enzymet, der indeholder et lag af elektroden, er i kontakt med det respektive enzymsubstrat, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man danner en i det væsentlige ensartet suspen-35 sion omfattende det findelte platingruppemetal eller -oxid og enzymet eller enzymerne suspenderet i et flydende suspensionsmedium, aflejrer suspensionen på overfladen af støtteorganet og tørrer den aflejrede sus- 6 DK 171603 B1 pension ved en temperatur under enzymets deaktiveringstemperatur til aflejring af det findelte platingruppemetal eller -oxid og enzymet eller enzymerne som et i det væsentlige ensartet, homogent belægningslag på støtteorganets overflade.

5 Ifølge et andet aspekt af opfindelsen tilvejebringes en enzymelek trode omfattende en i det væsentlige homogen blanding af et fi ndelt platingruppemetal- eller oxid og et eller flere enzymer aflejret som et elektrisk ledende overfladelag på overfladen af et underliggende støtteorgan, hvilket lag også indeholder et bindemiddel for partiklerne af 10 findelt platingruppemetal eller -oxid og enzymet eller enzymerne, hvori bindemidlet omfatter et materiale, der er effektivt til binding af de findelte platingruppemetal- eller oxidpartikler og enzymet eller enzymerne til et kohærent, kohæsivt lag bundet til støtteorganet ved en temperatur, der ikke overstiger enzymets eller enzymernes deaktiveringstem-15 peratur.

Ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde siger det sig selv, at tørring af det overtrukne substrat udføres ved en temperatur, der ligger under den temperatur, ved hvilken der optræder nogen væsentlig grad af deaktivering af enzymet, og fortrinsvis ved stuetemperatur.

20 Ved en alternativ fremgangsmåde ifølge opfindelsen kan elektroden dannes ved først at aflejre det findelte platingruppemetal eller -oxid, der eventuelt er præadsorberet på eller blandet med fi ndelt carbon eller grafit, med eller uden alt bindemidlet eller en del deraf, hvis et sådant anvendes, på overfladen af det elektrisk ledende substrat på lig-25 nende måde, dvs. ved belægning med en flydende suspension omfattende findelt platingruppemetal- eller oxid, der eventuelt er præadsorberet på eller blandet med findelte carbon- eller grafitpartikler, i et suspensionsmedium, fortrinsvis et vandigt medium, efterfulgt af tørring. Derefter imprægneres det tørrede lag med en anden opløsning, der omfat-30 ter enzymet og eventuelt bindemidlet, eller yderligere bindemiddel, til dispergering af enzymet i det aflejrede findelte platin- eller palladiumoxid eller andet platingruppemetal- eller oxidholdige lag, hvorefter slutproduktet tørres igen.

I stedet for at anvende platingruppemetallet i fi ndelt elementær 35 form kan der anvendes de tilsvarende oxider såsom platin- eller palladiumoxid. Således skal alle henvisninger til platiniseret eller palladi-seret materiale i det foreliggende forstås således, at de omfatter et 7 DK 171603 B1 tilsvarende oxidholdigt materiale, medmindre andet fremgår af sammenhængen.

Et andet aspekt af opfindelsen har, som allerede antydet, endnu mere overraskende vist, at ikke kun fluorcarbonharpiksbindemidlet kan 5 undværes eller erstattes med et lavtemperatur-bindemiddel, der fortrinsvis er vandopløseligt eller vanddispergerbart, men at også det findelte carbon eller grafit kan undværes. Således kan der nu fremstilles enzymelektroder, der ganske enkelt består af en blanding af et enzym eller en blanding af flere enzymer og et findelt platingruppemetal eller tilsva-10 rende metaloxider, der med eller uden hjælp af et bindemiddel aflejres på overfladen af et elektrisk ledende carbonpapir eller på et elektrisk ledende carbonspor. Andre elektrisk ledende substrater kan anvendes under forudsætning af, at de er kompatible med enzymet. Når sådanne elektroder er i kontakt med enzymsubstrat ved et fast overpotential, udviser 15 de god amperometrisk respons over for en strømafgivelse, der er direkte proportional med substratkoncentrationen over et bredt koncentrationsområde. Sådanne enzymelektroder og andre i det foreliggende beskrevne elektroder er således nyttige som biosensorer til mange forskellige anvendelser, især til medicinske og veterinære diagnoseteknikker til må-20 ling af enzymsubstratkoncentrationer, fx. glucose-, lactat- eller cholesterol koncentrationer, i mange forskellige medicinske og kliniske prøver.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der ud over skabelontrykning anvendes forskellige andre tryknings- eller belægningsteknikker 25 til påføring af blandingen af enzym og findelt platingruppemetal eller -oxid eventuelt adsorberet på overfladen af findelte carbon- eller grafitpartikler og eventuelt indeholdende et yderligere bindemiddel, på overfladen af det elektrisk ledende støtteorgan. Ud over traditionelle belægningsteknikker, fx. ved rakel- eller valsepåføring, kan blandinger-30 ne, der indeholder enzym og findelt platingruppemetal- eller oxid, trykkes på støtteorganets overflade ved kendte trykningsteknikker såsom trykfarveplotting eller tampo-trykning.

Ved endnu en fremgangsmåde ifølge opfindelsen kan enzymelektroderne fremstilles ved indledningsvis aflejring, fx. ved skabel ontrykning, 35 af en tynd film af findelte partikler af et platingruppemetal- eller metaloxid, der eventuelt er adsorberet på overfladen af findelt carbon eller grafit, og eventuelt i blanding med et lavtemperaturbindemiddel, et 8 DK 171603 B1 bindemiddel, der kan binde partiklerne til et kohærent lag på overfladen af støtteorganet uden sammensmeltning eller sintring af bindemidlet på overfladen af et elektrisk ledende støtteorgan, og efterfølgende imprægnering af det aflejrede lag med enzymet eller blandingen af enzymer.

5 Selvom de foretrukne findelte carbon- eller grafitmaterialer, der anvendes ifølge de foretrukne aspekter af opfindelsen, er findelte aktiverede carbon- og grafitpartikler, der har findelte partikler af et elementært platingruppemetal, fx. platin, palladium, iridium eller rhodium, og fortrinsvis platin eller rhodium, adsorberet på overfladen af carbon-10 partiklerne eller blandet med disse, kan der i stedet for anvendes de tilsvarende oxider, fx. platinoxid, palladiumoxid og rhodiumoxid. Derfor skal udtrykkene "piatiniseret" og "palladi seret" som anvendt i det foreliggende også omfatte oxiderne, medmindre andet fremgår af sammenhængen. Desuden henviser de i det foreliggende anvendte udtryk "aktiveret" car-15 bon og "aktiveret" grafit til stærkt porøse carbon- og grafitmaterialer med stort overfladeareal, der fx. er opnået ved varmebehandling af carbon- eller grafitpulver i damp eller CO2 til opnåelse af et produkt med stort overfladeareal, der inden for teknikken sædvanligvis betegnes som "aktiveret carbon". Overfladearealet af sådanne aktiverede materialer 20 kan være i området fra 102/g og opefter og vil typisk være i området fra 200 til 600 m2/g. Partikelstørrelsen er ikke kritisk, men carbon-eller grafitpulvere med en partikelstørrelse i området fra 3 til 150 nm er foretrukket, mere foretrukket 3 til 50 nm.

Mængden af platingruppemetal eller -oxid, der adsorberes på car-25 bonpulveret, vil sædvanligvis være tilstrækkelig til opnåelse af platingruppemetal ladn i nger i området fra 0,1 til 20 vægt-% baseret på vægten af carbon, og fortrinsvis fra 0,5 til 5 vægt-%. Disse grænser er imidlertid mere af praktisk end af kritisk betydning. Under ca. 0,1% falder udgangssignalet til et niveau, der i praksis er for lavt til at kunne 30 måles, undtagen med ekstremt følsomme måleapparater. Over ca. 20% bliver platingruppemetalladningen uøkonomisk, med små yderligere forbedringer med hensyn til forøget reaktivitet eller følsomhed. Fortrinsvis har platingruppemetal- eller oxidpartiklerne en partikelstørrelse i området fra 1 nm til 20 μιη, og mest foretrukket har de kolloidal størrelse i området 35 fra 1 til 4 nm.

Når der anvendes bindemiddel i enzymelektroderne ifølge opfindelsen, kan et hvilket som helst egnet lavtemperatur- (dvs. i stand til at 9 DK 171603 B1 binde den platiniserede eller palladiserede carbon- eller grafi tpul ver/-enzymblånding ved stuetemperatur uden opvarmning til sammensmeltning af bindemidlet) bindemiddel anvendes. Foretrukket er vandopløselige eller vanddispergerbare materialer, og især hydroxyethylcellulose eller gela-5 tine, men andre egnede bindemidler er bl.a. stivelse og cellulosederivater, fx. stivelseacetat, celluloseacetat, celluloseacetatbutyrat og ethylcellulose, og vandopløselige syntetiske og halvsyntetiske polymerer, fx. polyvinyl al kohol og polyvinylpyrolidon. Mængden af anvendt bindemiddel kan være i området fra 5 til 100% på tør vægtbasis, baseret på 10 den samlede vægt af enzym og platiniseret eller palladiseret carbonpul-ver, fortrinsvis fra 20 til 50%.

Selvom de i det foreliggende beskrevne enzymelektroder kan klassificeres som værende uden mediator kan en elektronoverførselsmediator såsom ferrocen om ønsket inkorporeres i suspensionen, der anvendes til 15 dannelse af elektroden.

Selvom blandingen af platiniseret eller palladiseret carbonpulver og enzym fortrinsvis suspenderes i vand før dens anbringelse på det elektrisk ledende substrat, fx. ved skabelontrykning, kan andre egnede væsker, herunder organiske opløsningsmidler, fx. cyclohexanon eller di-20 chlormethan, anvendes som suspensionsmedium. Ved aflejring på det elektrisk ledende substrat kan belægningstykkelsen være i området fra 5 til 500 μιη.

Enzymladninger vil være vidt forskellige i afhængighed af det specielle enzym eller den specielle enzymblanding, der anvendes. I tilfælde 25 af glucoseoxidase har ladninger fra 10 til 5000 pg/cm2 elektrodeoverflade vist sig at være tilfredsstillende, med 100 til 2000 øg/cm2 som foretrukket.

Som elektrisk ledende substrat kan anvendes mange forskellige materialer, fx. platin- eller andre elektrisk ledende metalstrimler og 30 elektrisk ledende syntetiske polymerfilm, men mest foretrukket anvendes som substrat et elektrisk ledende carbonpapir eller carbonspor, fx. en linie af carbonpartikler aflejret på et ikke-ledende støtteorgan af den inden for teknikken kommercielt tilgængelige type.

Sædvanligvis, men ikke nødvendigvis, vil enzymelektrodens overfla-35 de være beskyttet fysisk ved anbringelse af en egnet porøs membran eller et net, fx. af polycarbonat, der naturligvis skal være permeabel(t) for enzymsubstratet (glucose), der skal bestemmes. Sådanne membraner har en 10 DK 171603 B1 lille ulempe, idet de forøger sensorens reaktionstid, men selv med en sådan membran kan sensorerne ifølge opfindelsen alligevel præstere reaktionstider, der kan sammenlignes med og i mange tilfælde er væsentligt bedre end konventionelle enzymelektroders.

5 Som allerede nævnt angår den foreliggende opfindelse især glucose- oxidaseelektroder, dvs. elektroder, hvori det immobil i serede enzym er en glucoseoxidase, men det vil være åbenlyst, at andre oxidoreduktaser kan anvendes, omendskønt ikke altid med ækvivalent virkning. Dette skyldes ikke nødvendigvis nogen iboende ineffektivitet af enzymet, men andre 10 faktorer. For eksempel undergår ved bestemmelse af urinsyre under anvendelse af uricase selve urinsyresubstratet elektrokemisk oxidation ved basiselektroden, hvilket i høj grad tilslører en mulig virkning af enzymet. Imidlertid omfatter andre egnede oxidoreduktaser lactatoxidase, ga-lactoseoxidase, cholesteroloxidase og andre peroxid-producerende enzymer 15 samt kombinationer af immobil i serede enzymer, herunder kombinationer af en non-oxidase og en oxidase, hvor førstnævnte indvirker således på et af interesse værende substrat, at der frembringes et oxiderbart substrat for oxidasen, og sidstnævnte indvirker på det oxiderbare produkt, så der frembringes en målelig strøm, der er proportional med koncentrationen af 20 det af interesse værende substrat. En sådan kombination er kombinationen af beta-galactosidase og glucoseoxidase (til kvantitativ bestemmelse af lactose), eller kombinationen af et beta-glucandepolymeri serende enzym, beta-glucosidase og glucoseoxidase (til bestemmelse af beta-glucaner).

Blandt andre sensoranvendelser er anvendelse af enzymatiske og ik-25 ke-enzymatiske reagenser eller processer, der vekselvirker med et af interesse værende primært substrat i en prækursorreaktion, hvor det resulterende produkt omfatter en substans, der på sin side virker som et substrat for en enzymelektrode ifølge opfindelsen. Mange eksempler på sådanne prækursortrin vil kunne findes inden for området, immunokemiske 30 reaktioner, og fremgangsmåder til anvendelse af sådanne reaktioner ved opbygning af sensorer, der anvender enzymelektroder ifølge opfindelsen, vil være åbenlyse for fagmanden.

Det primære anvendelsesområde for elektroderne ifølge opfindelsen vil imidlertid være som biosensorer til påvisning og/eller kvantitativ 35 måling af et oxiderbart substrat, især glucose, i en prøve, især en klinisk prøve såsom blod, serum, plasma, urin, sved, tårer og spyt.

Andre mulige, ikke kliniske anvendelser omfatter: 11 DK 171603 B1 (a) fermentationsovervågning, (b) kontrol af industrielle processer, (c) miljøovervågning, fx. affluent- og forureningskontrol af væsker og gasser, 5 (d) testning af fødevarer, og (e) veterinære anvendelser, især anvendelser i forbindelse med de ovenfor foreslåede kliniske anvendelser.

For så vidt som biosensorer og andre sensorer, der indeholder et enzymelektrodemateriale ifølge opfindelsen, kan omfatte andre struktu-10 relle elementer, elektriske ledere, elektrisk ikke-ledende (isolerende) støtteorganer eller sonder, etc., er sådanne elementer i konstruktionen konventionelle og kræver ingen detaljeret beskrivelse. Elektrisk kontakt med elektrodematerialet kan tilvejebringes på mange måde, fx. ved montering af elektrodematerialet i umiddelbar kontakt med en elektrisk leden-15 de kontakt eller terminal, fx. af platin eller en anden egnet leder.

Under brug vil strømafgivelsen fra enzymelektroderne ifølge opfindelsen i nærvær af en prøve indeholdende enzymsubstrat blive målt ved et fast potential i overensstemmelse med fremgangsmåder, der allerede er veletablerede inden for teknikken. Generelt vil strømafgivelser blive 20 målt ved et fast potential i området fra 200 til 600 mV med en sølv/-sølvchlorid-referenceelektrode som reference. To eksempler på egnede 2-og 3-elektrodeelementer til anvendelse ved udførelsen af sådanne målinger er belyst og beskrevet mere detaljeret i international patentpublikation nr. W0 87/07295, hvortil der allerede er henvist.

25 På tegningen viser fig. 1 strømafgivelsen fra en enzymelektrode fremstillet ifølge eksempel 1, fig. 2 strømafgivelsen fra en elektrode ifølge eksempel 2, fig. 3 strømafgivelsen fra en elektrode ifølge eksempel 3, 30 fig. 4 strømafgivelsen fra en elektrode ifølge eksempel 4, fig. 5 strømafgivelsen fra en elektrode ifølge eksempel 5, fig. 6 strømafgivelsen fra en elektrode ifølge eksempel 6, fig. 7 strømafgivelsen fra en elektrode ifølge eksempel 7, fig. 8 strømafgivelsen fra en elektrode ifølge eksempel 8, 35 fig. 9 strømafgivelsen fra en elektrode ifølge eksempel 9, fig. 10 strømafgivelsen fra en elektrode ifølge eksempel 10, fig. 11 strømafgivelsen fra en elektrode ifølge eksempel 11, 12 DK 171603 B1 fig. 12 strømafgivelsen fra en elektrode fremstillet ifølge eksempel 12 med iridium, fig. 13 strømafgivelsen fra en elektrode fremstillet ifølge eksempel 12 med rhodium, 5 fig. 14 strømafgivelsen fra en elektrode fremstillet ifølge eksem pel 13, fig. 15, 16 og 17 strømafgivelsen fra en elektrode fremstillet ifølge eksempel 14 med henholdsvis celluloseacetat i cyclohexanon, celluloseacetatbutyrat i dichlormethan og 10 ethylcellulose i cyclohexanon.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler under henvisning til tegningen.

Eksempel 1 15 En glucoseoxidaseelektrode fremstilledes ved at suspendere 200 mg platiniseret carbonpulver indeholdende ca. 10 vægt-% platin, hvilket pulver kan opnås fra The Prototech Company, Newton Highlands, Massachusetts ("Vulcan XC-72"-carbonpulver, nominel partikelstørrelse 30 nm, med kolloidalt platin, partikelstørrelse i området fra 1,5 til 2,5 nm, ad-20 sorberet derpå) i 400 μ1 fosfatpuffer (NaHgPO^, 2 mmol/1, Na2HP04, 16 mmol/1, NaCl, 100 mmol/1, K2H2(EDTA)2H20, 1 mmol/1: pH 7,4). Til suspensionen sattes dernæst 40 mg glucoseoxidase. Suspensionen omrørtes og henstod i en time ved stuetemperatur.

Efter henstand spredtes suspensionen manuelt som en tynd film på 25 overfladen af et ark elektrisk ledende carbonpapir ("Toray"- grundpapir) og henstilledes til tørring ved stuetemperatur.

Når enzymelektrodematerial et var tørt blev der udskåret 1,5 mm skiver, der testedes for reaktion på glucose ved 400 mV over for Ag/AgCl i et elektrokemisk 2-elektrodeelement som beskrevet i WO 87/07295 under 30 henvisning til fig. 16.

Strømafgivelsen (μΑ) fra elektroden i forhold til forskellige glu-cosekoncentrationer er vist i fig. 1 på tegningen. De opnåede resultater viser to bemærkelsesværdige virkninger, for det første, at elektrodens reaktion i det væsentlige er lineær i hele området fra 0 til 30 mmol/1 35 glucose, og for det andet, at disse resultater opnås uden noget bindemiddel til tilvejebringelse af en "oxygen-rig" atmosfære. Ifølge den kendte teknik, med undtagelse af W0 87/07295, har det tidligere kun væ- 13 DK 171603 B1 ret muligt at opnå linearitet i et begrænset glucosekoncentrationsområ-de, fx. 2 til 5 mmol/1 (T. Yao, Analytica Chimica Acta 148, 27-33 (1983)). Anden kendt teknik beskriver, at lineariteten af reaktionen af glucoseelektroder forøges, når der tillades fri diffusion af oxygen (E.

5 Lobel og J. Rishpon, Analytical Chemistry 53, 51-53 (1981)), hvilket støttes af WO 87/07295, hvor der anvendes et bindemiddel med høj affinitet eller opløselighed for oxygen. I modsætning hertil tilvejebringer den foreliggende opfindelse linearitet af en reaktion over et meget større glucosekoncentationsområde, selv i fravær af bindemiddel.

10

Eksempel 2

Eksempel 1 gentoges, men under anvendelse af findelt platiniseret grafit (5% Pt) opnået fra Johnson Matthey Chemicals, Royston, UK under betegnelsen "process catalyst CH15959/01", i stedet for platiniseret 15 "Vulcan XC-72". Der opnås i det væsentlige samme lineære elektronreaktion, se fig. 2.

Eksempel 3

Eksempel 2 gentoges, dvs. under anvendelse af den findelte plati-20 niserede grafit (5% Pt) opnået fra Johnson Matthey, til dannelse af en-zym/Pt-grafi tsuspension. I dette eksempel sattes imidlertid en til 37°C afkølet 20 vægt/vol.-% opløsning af gelatine i vand til suspensionen i et volumenforhold på 2:1.

Den resulterende elektrode, opnået ved udspredning af den gelati-25 neholdige pasta på Toray-grundpapiret gav efter tørring ved stuetemperatur et mere robust produkt, der imidlertid igen udviste en i det væsentlige lineær reaktion på glucose, se fig. 3.

Eksempel 4 30 En vandig pasta fremstilledes ud fra 45 mg platiniseret carbonpul- ver ("Vulcan XC-72", indeholdende 10 vægt-% adsorberet kolloidalt platin, The Prototech Company, Massachusetts), 5 mg glucoseoxidase suspenderet i 100 mg 10% opløsning af hydroxyethylcellulose i 0,1 M KC1. Pastaen påførtes manuelt på forud fugtet carbonpapir (Toray-grundpapir) og 35 fik lov til at tørre.

Fra det tørrede elektrodemateriale blev udskåret 1,5 mm skiver, der testedes for deres reaktion på glucose i et 2-elektrodeelement som 14 DK 171603 B1 beskrevet og ved et potential på 400 mV over for Ag/AgCl.

Strømafgivelsen måltes ved forskellige glucosekoncentrationer, og resultaterne er vist i fig. 4. Reaktionen er i det væsentlige lineær i et glucosekoncentrationsområde fra 0 til 30 mmol/1.

5

Eksempel 5 og 6

Fremgangsmåden i eksempel 4 gentoges, men med platiniseret carbon-pulver ("Vulcan XC-72") indeholdende hhv. 1% og 0,2% platin. Strømafgivelser fra elektrodematerialerne måltes under samme betingelser, og re-10 sultaterne er vist i fig. 5 og 6. Fig. 5 viser en lignende lineær reaktion på glucosekoncentrationer over hele området fra 0 til 30 mmol/1.

Den reducerede mængde platin (0,2%) viser en væsentlig grad af linearitet, men over et reduceret koncentrationsområde fra 0 til 20 mmol/1.

15 Eksempel 7

Eksempel 4 gentoges, men under anvendelse af 0,5 mg glucoseoxida-se. Strømafgivelsen fra elektrodematerialet, målt under samme betingelser, er vist i fig. 7. Linearitet opnås over glucosekoncentrationer fra 0 til 20 mmol/1.

20

Eksempel 8

Eksempel 4 gentoges, men under anvendelse af 45 mg carbonpulver ("Vulcan XC-72") indeholdende 10 vægt-% kolloidalt platinoxid adsorberet derpå i stedet for platinmetal.

25 1,5 mm skiver af elektrodematerialet testedes for deres reaktion på forskellige glucosekoncentrationer under samme betingelser som ovenfor, dvs. i et 2-elektrodeelement ved et potential på 400 mV over for Ag/AgCl. Den ved forskellige glucosekoncentrationer målte strømafgivelse er vist i fig. 8.

30

Eksempel 9

En pasta fremstilledes ved blanding af 5 mg platin-blåck, 400 mg aktiveret carbonpulver ("Vulcan XC-72") og 5 mg glucoseoxidase i 100 mg hydroxyethylcellulose (10%) i 0,1 M KC1.

35 Pastaen smurtes manuelt på Toray-grundpapir og fik lov til at tør re.

Af det tørrede elektrodemateriale blev udskåret 1,5 mm skiver, der 15 DK 171603 B1 testedes for deres reaktion på glucose under samme betingelser som oven for.

Elektroden udviser en lineær reaktion på glucose over hele koncentrationsområdet fra O til 30 mmol/1.

5

Eksempel 10

Eksempel 4 gentoges, men under anvendelse af 5 mg lactatoxidase "EC 1.1.3.2" i stedet for glucoseoxidase.

1.5 mm skiver af det tørrede elektrodemateriale testedes for deres 10 reaktion på lactat under samme betingelser som tidligere beskrevet, dvs.

2-elektrodeelement ved 400 mV over for AG/AgCl.

Som vist i fig. 10 varierer strømafgivelsen i det væsentlige lineært med lactatkoncentrationen over et lactatkoncentrationsområde fra 0 til 20 mmol/1.

15

Eksempel 11

En carbonfri enzymelektrode fremstilledes ved suspendering af 5 mg platin-black og 5 mg glucoseoxidase i 100 mg 10% hydroxyethylcellulose i 0,1 M KC1.

20 Suspensionen smurtes manuelt på Toray-grundpapir og tørredes.

1.5 mm skiver af det tørrede elektrodemateriale testedes som ovenfor beskrevet for elektrodereaktion, strømafgivelse, på forskellige glu-cosekoncentrationer. Resultaterne er vist i fig. 11 og viser en -i det væsentlige lineær reaktion over for glucosekoncentrationer i området fra 25 0 til 20 mmol/1.

Eksempel 12

Ved at følge samme almene fremgangsmåde som i eksempel 4, men under anvendelse af aktiverede carbonpartikler ("Vulcan XC-72") med 1 vægt-30 % (baseret på vægten af carbon) findelte kolloidale partikler af hhv. iridium og rhodium adsorberet derpå i stedet for det platiniserede car-bonpulver, og under anvendelse af en fosfatpuffer (se eksempel 1 for detaljer vedrørende suspensionsmediet) i stedet for 0,1 M KC1, fremstilledes glucoseoxidaseelektroder bestående af et homogent lag af rhodium-35 eller iridiumholdige grafitpartikler og glucoseoxidase bundet til et lag af carbongrundpapir med hydroxyethylcullulose. Reaktionen i μΑ af et sådant elektrodemateriale, skåret i 1,5 mm skiver, på substrat- (glucose) 16 DK 171603 B1 koncentrationer i området fra O til 40 mmol/1 ved 400 mV over for en Ag/AgCl-referenceelektrode er vist i hhv. fig. 12 og 13 (fig. 12, iridium, fig. 13, rhodium). Igen opnås en i det væsentlige lineær reaktion.

Bemærk specielt det høje reaktionsniveau, der opnås med rhodium.

5

Eksempel 13 8 mg cholesterol oxidase (~16 μ/mg) blandedes med 150 μΐ 5 vægt/-vol.-% hydroxyethylcelluloseopløsning i fosfatpuffer (NaH2P04 1,6 mmol/1, Na2HP04 5,3 mmol/1, NaCl 52 mmol/1, EDTA 0,15 mmol/1, pH 7,4) 10 indtil opløsning. 72 mg findelt platiniseret grafit (5% Pt) tilsattes, og der blandedes til dannelse af en pasta.

Elektrisk ledende carbonpapir (Toray), der var blevet iblødsat i 2 uger i fosfatpuffer (NaH2P04 2 mmol/1, Na2HP04 16 mmol/1, NaCl 100 mmol/1, EDTA 1 mmol/1, "Triton X100" overfladeaktivt middel 0,1 vol./-15 vol-%, pH 7,4) duppedes tør, og cholesteroloxidase/platini seret grafit/-HEC-pastaen blev manuelt udspredt jævnt derpå. Den resulterende pastaelektrode tørredes ved stuetemperatur i 2 timer og ved 30°C i 30 minutter. Til forøgelse af 1 agerholdbarheden dyppedes elektroden dernæst i to minutter i 5 vægt/vol.-% saccharoseopløsning og tørredes ved 20°C i 20 1 time.

Når pastaelektroden var tør, blev den udskåret i 1,5 mm skiver, der testedes for reaktion på cholesterol i et 2-elektrodeelement ved et potential på +340 mV over for Ag/AgCl, idet pastaelektroden beskyttedes af en 0,05 μ polycarbonat- (Nucleopore) membran. Til testning fremstil -25 ledes standard-cholesterol opløsninger ud fra 6 mM cholesterol forrådsopløsning i 22% vandopløselig Ø-cyclodextrin ("Molecusol") i fosfatpuffer (fosfat 1 mmol/1, NaCl 100 mmol/1, EDTA 1 mmol/1, pH 7,4) i fortyndingsforhold, der gav standardkoncentrationer på 0,5, 1, 2, 4 og 6 mmol/1.

Strømafgivelsen i μΑ er vist i fig. 14 og viser en i det væsentli-30 ge lineær reaktion på cholesterolkoncentrationer i området fra 0 til 6 mmol/1.

Eksempel 14

Enzymelektroder ifølge opfindelsen fremstilledes under anvendelse 35 af ikke-vandige systemer som følger.

Pastasuspensioner fremstilledes under anvendelse af 10 mg mængder af glucoseoxidase og 40 mg mængder af platiniseret graftipulver (5% Pt) 17 DK 171603 B1 i ikke-vandige bindemiddel systemer som følger: (a) 400 /il 10% vægt/vol. celluloseacetat i cyclohexanon, (b) 600 /il 5% vægt/vol. celluloseacetatbutyrat i dichlormethan, (c) 400 μΐ 5% vægt/vol. ethyl cel lul ose i cyclohexanon.

5 Efter blanding udspredtes pastaerne på elektrisk ledende carbon- (Toray) grundpapir og henstod til tørring ved stuetemperatur.

Efter tørring blev der af det belagte grundpapir udskåret 1,5 mm skiver, der testedes for deres reaktion på glucose i et 2-elektrodeele-ment ved 340 mV over for Ag/AgCl. Elektrodematerialet monteredes på en 10 guldarbejdselektrode og holdtes i position derpå med en 0,03 /im polycar-bonat- ("Nuclepore") membran. Der anvendtes standardgiucoseopløsninger indeholdende 0, 2,5, 5, 10 og 20 mmol/1 glucose i en fosfatpuffer indeholdende NaH2P04 2mmol/l, Na2HP04 16 mmol/1, NaCl 100 mmol/1, EDTA 1 mmol/1, pH 7,4. I hvert tilfælde er stømafgivelsen i μΑ fra elementet 15 illustreret grafisk i fig. 15 til 17 som følger:

Fig. 15: celluloseacetat i cyclohexanon,

Fig. 16: celluloseacetatbutyrat i dichlormethan,

Fig. 17: ethyl cellul ose i cyclohexanon.

Disse figurer viser, at det er muligt at udøve opfindelsen under 20 anvendelse af ikke-vandige systemer og alternativt lavtemperaturbinde-midler.

Claims (30)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af enzymelektroder af den type, som omfatter et elektrisk ledende, porøst, sammenhængende lag af parti - 5 kier af findelt carbon eller grafit, som har findelte partikler af et platingruppemetal eller af et platingruppemetaloxid ensartet fordelt gennem dette lag, hvilken elektrode har ét eller flere enzymer immobil i -serede derpå og i kontakt med partiklerne af findelt carbon eller grafit, og med de findelte partikler af platingruppemetal eller -oxid, hvor 10 elektroden reagerer amperometrisk på aktiviteten af det eller de immobi-1 i serede enzymer, når enzymet er i kontakt med et substrat fra det pågældende enzym, KENDETEGNET ved de trin, at man a) danner en i det væsentlige ensartet suspension indeholdende partiklerne af findelt carbon eller grafit, de findelte partikler af et 15 platingruppemetal eller -oxid samt et bindemiddel i suspension i et flydende suspensionsmedium, b) aflejrer suspensionen som en tynd film på overfladen af et underliggende støtteorgan, c) tørrer den aflejrede suspension for derved at aflejre parti- 20 kierne af carbon eller grafit, og platingruppemetallet eller -oxidet som en i det væsentlige ensartet blanding på overfladen af støtteorganet og bundet sammen til et sammenhængende, i det væsentlige homogent, porøst, elektrisk ledende lag på overfladen af støtteorganet ved hjælp åf bindemidlet, og 25 d) inkorporerer enzymet eller enzymerne i laget under den forud sætning, at når enzymet er et enzym, der som en cofaktor kræver NAD, NADH, NADP eller NADPH, idet elektroden reagerer amperometrisk på aktiviteten af enzymet i nærvær af et substrat fra det pågældende enzym og i nærvær af cofaktoren, det i det flydende suspensionsmedium anvendt i 30 trin a) indeholdte bindemiddel er forskelligt fra gelatine.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den nævnte forudsætning ikke gælder, KENDETEGNET ved, at enzymet eller enzymerne inkorporeres i det sammenhængende, i det væsentlige homogene, porøse, elektrisk ledende lag 35 ved, at man sætter enzymet eller enzymerne til suspensionen indeholdende partiklerne af carbon eller grafit, det findelte platingruppemetal eller -metaloxid og bindemidlet, hvilket bindemiddel er et fra selve enzymet DK 171603 B1 forskelligt materiale, og et materiale, som er effektivt til at binde partiklerne i et sammenhængende lag ved en temperatur under enzymets deaktiveringstemperatur, i suspension i det flydende suspensionsmedium, for herved samtidig på støtteorganets overflade at aflejre en ensartet 5 blanding indeholdende enzymet eller enzymerne, partiklerne af carbon eller grafit, det findelte platingruppemetal eller -metaloxid og bindemidlet, hvorefter det aflejrede lag tørres ved en temperatur, som er under det eller de aflejrede enzymers aktiveringstemperatur.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor forudsætningen gælder, KENDETEGNET ved, at enzymet eller enzymerne inkorporeres i det sammenhængende, i det væsentlige homogene, porøse, elektrisk ledende lag ved, at man imprægnerer laget, efter aflejringen deraf på støtteorganets overflade, med enzymet eller enzymerne indeholdt i et flydende suspensionsmedium, 15 og gentørrer laget ved en temperatur, som er under enzymets eller enzymernes deaktiveringstemperatur for herved at aflejre enzymet eller enzymerne i laget.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor forudsætningen ikke gælder, KEN-20 DETEGNET ved, at i det aflejrede lag af partikler af carbon eller grafit og findelte partikler af platingruppemetal eller -metaloxid, selve enzymet eller enzymerne virker som bindemiddel for de pågældende partikler, i hvilket tilfælde enzymet eller enzymerne inkorporeres i suspensionen som bindemidlet, og laget af partikler af carbon eller grafit, det fin-25 delte platingruppemetal eller -metaloxid og enzymet eller enzymerne tørres, efter aflejring på overfladen af det underliggende støtteorgan, ved en temperatur, som er under enzymets eller enzymernes deaktiveringstemperatur.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, hvor forudsætningen alt efter omstændighederne gælder eller ikke gælder, KENDETEGNET ved, at de findelte partikler af platingruppemetal-eller platingruppemetal oxid præadsorberes på kendt måde på overfladen af carbon-eller grafitpartiklerne før inkorporeringen deraf i suspensionen. 35

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at de findelte carbon- eller grafitpartikler har en partikelstørrelse i intervallet 3-15 DK 171603 B1 nm, og at partiklerne af platingruppemetallet eller -metaloxidet har en partikelstørrelse i intervallet 1-4 nm.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en enzymelektrode bestående i 5 det væsentlige af et tyndt, elektrisk ledende lag af findelte partikler af et platingruppemetal eller af et platingruppemetaloxid bundet til overfladen af et underliggende støtteorgan og omfattende et eller flere enzymer, som er immobil i serede i eller på laget, hvilken elektrode reagerer amperometrisk på aktiviteten af enzymet eller enzymerne, når 10 elektroden er i kontakt med det passende enzymsubstrat, KENDETEGNET ved, at fremgangsmåden omfatter, at man a) danner en suspension af det findelte platingruppemetal eller platingruppemetaloxid i et flydende suspensionsmedium indeholdende et bindemiddel for partiklerne, hvilket bindemiddel er et materiale, som er 15 effektivt til at binde partiklerne i et sammenhængende, porøst lag på overfladen af det underliggende støtteorgan ved en temperatur under enzymets deaktiveringstemperatur, b) aflejrer suspensionen som en tynd film på overfladen af et underliggende støtteorgan, 20 c) tørrer den aflejrede suspension for derved på overfladen af støtteorganet at aflejre et tyndt, porøst, elektrisk ledende, sammenhængende lag bestående af partiklerne af platingruppemetallet eller -metaloxidet og bindemidlet, og d) inkorporerer enzymet eller enzymerne i det pågældende lag. 25

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at enzymet eller enzymerne indledningsvis inkorporeres i suspensionen sammen med det findelte platingruppemetal eller platingruppemetaloxid og eventuelt et yderligere bindemiddel for de findelte partikler af platingruppemetal 30 eller -metaloxid, hvilket yderligere bindemiddel er et materiale, der er effektivt til at binde partiklerne i et sammenhængende lag ved en temperatur under enzymets deaktiveringstemperatur, og hvor den aflejrede film indeholdende det findelte platingruppemetal eller -metaloxid, enzymet eller enzymerne og, hvis det er til stede, det eventuelle bindemiddel 35 tørres ved en temperatur under enzymets deaktiveringstemperatur for derved på overfladen af støtteorganet at danne et lag af findelte partikler af platinmetal eller -metaloxid indeholdende enzymet eller enzymerne og DK 171603 B1 bundet sammen af bindemidlet og/eller selve enzymet.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, KENDETEGNET ved, at det flydende suspensionsmedium er et vandigt medium, og 5 at bindemidlet er et vanddispergerbart eller vandopløseligt materiale og er forskelligt fra selve enzymet, hvor bindemidlet er forskelligt fra gelatine, når i overensstemmelse med forudsætningen i krav 1 suspensionen er en suspension indeholdende findelte partikler af carbon eller grafit, og enzymet er et, som kræver NAD, NADH, NADP eller NADPH som en 10 cofaktor.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, KENDETEGNET ved, at det flydende suspensionsmedium er et vandigt medium, og at bindemidlet er et vanddispergerbart eller vandopløseligt materiale og er forskelligt fra 15 selve enzymet.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9 eller 10, KENDETEGNET ved, at det vandopløselige bindemiddel er hydroxyethylcellulose.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11, KENDETEGNET ved, at suspensionen påføres overfladen af det underliggende støtteorgan ved skabelontrykning.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12, KENDE-25 TEGNET ved, at det underliggende støtteorgan i sig selv er elektrisk ledende.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, KENDETEGNET ved, at det underliggende støttelag er et ark af elektrisk ledende carbonpapir eller et carbon- 30 spor.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-14, KENDETEGNET ved, at det anvendte enzym er en glukoseoxidas, en cholesterol-oxidase eller lactatoxidase. 35

16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-15, KENDETEGNET ved, at partiklerne af fi ndelt platingruppemetal er findelte par- DK 171603 B1 tikler af elementær platin.

17. Enzymelektrode omfattende en i det væsentlige homogen blanding af et fi ndelt platingruppemetal eller platingruppemetaloxid og et eller 5 flere enzymer aflejret som et elektrisk ledende overfladelag på overfladen af et underliggende støtteorgan, hvilket lag også indeholder et bindemiddel for partiklerne af findelt platingruppemetal eller -metaloxid og enzymet eller enzymerne samt eventuelt findelte partikler af carbon eller grafit, hvor bindemidlet omfatter et materiale, der er effektivt 10 til at binde partiklerne af findelt platingruppemetal eller -oxid og enzymet eller enzymerne i et sammenhængende, kohæsivt lag bundet til støtteorganet ved en temperatur, der ikke overstiger enzymets eller enzymernes deaktiveringstemperatur, under den forudsætning at, når enzymet eller ét af enzymerne er et enzym, der kræver NAD, NADH, NADP eller NADPH 15 som en cofaktor, og når enzymet er indeholdt i et sammenhængende lag indeholdende findelte partikler af carbon eller grafit, er bindemidlet forskelligt fra gelatine.

18. Enzymelektrode ifølge krav 17, hvor bindemidlet er vandopløseligt 20 eller vanddispergerbart, hvilket bindemiddel er forskelligt fra gelatine, når i overensstemmelse med forudsætningen enzymet er et, der kræver NAD, NADH, NADP eller NADPH som en cofaktor.

19. Enzymelektrode ifølge krav 18, hvor bindemidlet er hydroxyethyl-25 cellulose.

20. Enzymelektrode ifølge krav 17, hvor selve enzymet virker som bindemidlet.

21. Enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 17-20, hvor det enzymholdige lag også indeholder partiklerne af findelt carbon eller grafit.

22. Enzymelektrode ifølge krav 21, hvor de findelte partikler af pla-35 tingruppemetal eller -oxid er præadsorberede på overfladen af carbon-eller grafitpartiklerne. DK 171603 B1

23. Enzymelektrode ifølge krav 22, hvor carbon- eller grafitpartiklerne har en partikelstørrelse i intervallet 3-150 nm, og de præadsorberede partikler af platingruppemetal eller -oxid har en størrelse i intervallet 1-4 nm. 5

24. Enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 17-24, hvor det enzymholdige lag er trykt på overfladen af det underliggende støtteorgan.

25. Enzymelektrode ifølge krav 24, hvor det enzymholdige lag er skabelontrykt på overfladen af støtteorganet.

26. Enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 17-25, hvor det underliggende støtteorgan i sig selv er elektrisk ledende. 15

27. Enzymelektrode ifølge krav 26, hvor støtteorganet omfatter et ark af elektriske ledende carbonpapir eller carbonspor.

28. Enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 17-27, hvor 20 det enzymholdige lag som platingruppemetalkomponenten indeholder findelt platin eller rhodium.

29. Enzymelektrode ifølge et hvilket som helst af kravene 17-28, hvor det enzymholdige lag som enzym indeholder glukoseoxidase, lactatoxidase 25 eller cholesteroloxidase.

30 35