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ALLGEMEINER STAND DER
TECHNIK
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Die
Erfindung betrifft allgemein eine ionenselektive Elektrode des Polymermembrantyps
und insbesondere eine ionenselektive Elektrode des Polymermembrantyps,
die für
das Überwachen
von polyionischen Makromolekülen
wie Heparin geeignet ist.
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Ionenselektive
Elektroden vom Polymermembrantyp werden heute routinemäßig in im
Handel erhältlichen
biomedizinischen Instrumenten zum genauen Messen der Spiegel klinisch
wichtiger kleiner Ionen wie beispielsweise Ca++,
Na+, K+, Li+, H+ und Cl– in
unverdünntem
Vollblut verwendet. Typischerweise umfassen diese ionenselektiven
Elektroden ein stark weichgemachtes Polymermatrixmaterial mit einem
sich darin befindlichen Ionenaustauschermaterial oder Ionenkomplexbildner.
Bei dem Ionenaustauschermaterial kann es sich um ein quartäres Ammoniumsalz
wie beispielsweise Tridodecylmethylammoniumchlorid (TDMAC) handeln.
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Vinylchlorid
(PVC) ist ein häufig
anzutreffendes polymeres Membranmatrixmaterial, das im Stand der Technik
der Festkörper-
oder Flüssigmembranelektroden
für das
Erfassen kleiner Ionen verwendet wird (man vergleiche beispielsweise
die US-Patentschrift
Nr. 4,861,455 oder Hartman et al., „Chloride-Selective Liquid-Membrane
Electrodes Based on Lipophilic Methyl-Tri-N-Alkyl-Ammonium Compounds
and Their Applicability to Blond Serum Measurements, (chloridselektive
Flüssigmembranelektroden
auf der Basis von lipophilen Methyltri-N-alkylammonium-Verbindungen und
ihre Anwendbarkeit auf Blutserummessungen)", Mikrochimica Acta (Wein), 1978 II
235-246).
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Anstrengungen, ähnliche
Sensoren, einschließlich
Biosensoren auf Immunbasis, für
das Erfassen großer
Biomoleküle
wie Proteine oder Arzneimittel zu entwickeln, sind bisher nicht
erfolgreich gewesen. Eines der schwierigsten Probleme ist dabei
das Identifizieren geeigneter Komplexbildner und von Membranchemien
gewesen, die signifikante, spezifische und reversible elektrochemische
Reaktionen auf den erwünschten
Analyten hin ergeben. Selbst wenn ein spezifischer Komplexbildner
für ein
makromolekulares Biomolekül
identifiziert wird, bleibt es fraglich, ob die Wechselwirkung mit
dem makromolekularen Ion stark genug ist, die ziemlich geringe Mobilität eines
großen
Ions zu bezwingen, um eine signifikante elektrochemische Reaktion
zu erzeugen. Theoretisch wird die Empfindlichkeit und Selektivität einer
ionenselektiven Elektrodenmembran sowohl von der Mobilität des Analytenions
als auch der Stärke
der Wechselwirkung zwischen dem Ionenkomplexbildner und dem Analytenion
bestimmt. Außerdem
können
starke Störungen,
die von einer hohen Konzentration kleiner Ionen wie Chloridionen
in einer Blutprobe herrühren,
die Reaktion der Membran bestimmen.
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Ein
Analyt von besonderer klinischer Signifikanz ist das Heparin, ein
polyanionisches Makromolekül. Heparin
ist das Antikoagulanz-Arzneimittel, das bei chirurgischen Vorgängen und
bei außerhalb
des Körpers durchgeführten Therapien
und für
das Verhindern von Thromboembolien auf einen chirurgischen Eingriff
oder die Entbindung hin allgemein verwendet wird. Heparin ist eine
Gruppe von polydispersen (Molmasse im Bereich von 5.000 bis 30.000
Dalton) geradkettigen, anionischen Mucopolysacchariden, die Glykosaminoglykane genannt
werden, die eine durchschnittliche Molmasse von 15.000 Dalton aufweisen.
Glykosaminoglykane sind Copolymere sulfatierter (SO3 –)
und unsulfatierter Uron-/Iduronsäuren,
die mit Glukosaminresten alternieren.
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Die
stärkste
Nebenwirkung der Heparinverabreichung ist Bluten. In der Tat hat
eine Umfrage durch das Boston Collaborative Drug Surveillance Program
(collaborative Arzneimittelüberwachungsprogramm
von Boston) bezüglich
mit Arzneimitteln verbundenen Todesfällen unter stationär behandelten
Patienten ans Licht gebracht, dass Heparin das Arzneimittel ist,
das für
eine Mehrzahl an durch Arzneimittel hervorgerufene Todesfälle bei
relativ gesunden Patienten verantwortlich ist. Angesichts dieses
Morbiditätspotentials
besteht ein starker Bedarf für
Mittel zum kontinuierlichen und genauen Messen von Heparinspiegeln
im Blutstrom während chirurgischer
Eingriffe. Leider gibt es zur Zeit keine Methode, die zum direkten
und schnellen Bestimmen der physiologischen Heparinspiegel geeignet
ist. Die zur Zeit zur Verfügung
stehenden Heparinassays, wie beispielsweise die aktivierte Blutgerinnungszeit,
basieren alle auf der Blutgerinnungszeit. Des Weiteren sind Assays
des Stands der Technik für Heparin
nicht spezifisch und mangeln an Schnelle, Genauigkeit, Konsistenz und
einer definierten Biochemie. Des Weiteren ist, da Heparinassays
auf der Basis der Blutgerinnungszeit den Blutheparinspiegel nicht
direkt messen können,
die Rolle von Heparin bei den assoziierten Blutungskomplikationen
und dem Mechanismus des „Heparin-Holmes"-Phänomens niemals
identifiziert worden. Es besteht daher ein Bedarf für ein Mittel
für das
direkte Messen der Heparinspiegel im Blut sowohl in der klinischen
Praxis als auch in der medizinischen Forschung.
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Das
quartäre
Ammoniumsalz TDMAC ist dafür
bekannt, dass es sich an Heparin bindet oder damit einen Komplex
bildet. In der Tat ist es im Stand der Technik der Medizin allgemein
bekannt, gegen Thrombose resistente Biomaterialien durch Heparinisieren
der Oberfläche
eines mit TDMAC beschichteten oder imprägnierten Polymers herzustellen.
TDMAC hat eine signifikante strukturelle Ähnlichkeit mit Polybrene, einem
synthetischen polyquartären
Ammoniumsalz, das als eines der potentesten Heparinantagonisten
angesehen wird, gemeinsam. Obwohl TDMAC bei herkömmlichen Membranelektroden
für das
Erfassen kleiner Ionen als Anionenaustauschermaterial verwendet
worden ist, gibt es im Stand der Technik absolut keinen Vorschlag
dafür, dass
Makromoleküle
wie Heparin direkt mit TDMAC-dotierten PVC- oder Siliconkautschukmembranen
erfasst werden könnten.
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Ma
S et al., „ELECTROCHEMICAL
SENSOR FOR HEPARIN: FURTHER CHARACTERIZATION AND BIOANALYTICAL APPLICATIONS" (Elektrochemischer
Sensor für
Heparin: weitere Charakterisierung und bioanalytische Anwendungen);
Analytical Chemistry, Band 65, Nr. 15, Seite 2078-2084, 1993-08-01
offenbart eine Versuchssensoranordnung für das schnelle Prüfen von
Membranen, die für
das Abtasten von Heparin verwendet werden sollen. Der elektrochemische
Sensor umfasst eine polymere Membran, die mit lipophilen quartären Ammoniumsalzen
dotiert ist und durch Lösen
der Membrankomponenten in THF und Zugeben der Lösung zu einem Glasring auf
einem Glasobjektträger
zubereitet wird.
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Es
ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, einen elektrochemischen
Sensor für
ionische Makromoleküle
wie Heparin bereitzustellen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, einen elektrochemischen
Sensor für
das direkte Messen von Heparin in Vollblut oder Plasma bereitzustellen.
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Es
ist auch eine Aufgabe dieser Erfindung, einen elektrochemischen
Sensor für
das direkte Messen von Heparin in Vollblut oder Plasma bereitzustellen,
der über
den zu erwarteten klinisch relevanten Konzentrationsbereich genau
ist.
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Es
ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, einen elektrochemischen
Sensor für
das direkte Messen von Heparin in Vollblut oder Plasma bereitzustellen,
der ausreichende dynamische Reaktionscharakteristiken aufweist,
d.h. auf eine Änderung
der Ionenkonzentration schnell anspricht und sofort auf die Basislinie
zurückkehrt,
so dass er für
das kontinuierliche in Wvo-Überwachen
geeignet ist.
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Außerdem ist
es eine Aufgabe dieser Erfindung, eine polymere Membranelektrode
bereitzustellen, die eine spezifische Selektivität für Heparinmakromoleküle selbst
in Gegenwart von Cl– und anderen anionischen Verunreinigungen
aufweist.
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KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Die
obigen und anderen Aufgaben werden durch diese Erfindung, wie sie
in den anhängenden
Ansprüchen
definiert wird, gelöst.
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Es
hat sich erwiesen, dass PVC oder Siliconkautschuk auf Heparin eine
potentiometrische Reaktion ergibt, wenn es als Polymermatrixmaterial
der erfindungsgemäßen Anionenaustauschermembran
verwendet wird. Obwohl die hier angegebenen Beispiele hauptsächlich auf
Rezepturen ausgerichtet sind, bei denen PVC als das polymere Matrixmaterial
verwendet wird, sollte man sich spezifisch im Klaren darüber sein,
dass andere filmbildende, hydrophobe Polymere geeignete Matrixmaterialien
sind. Verschiedene polymere Materialien des Typs, der bei Elektrodenmembranen
verwendet wird, können
verwendet werden, einschließlich
synthetische und natürlich
polymere Materialien wie Polymere und Copolymere ethylenisch ungesättigter
Monomere wie Polyethylene, Poly(1,2-butadiene) und dergleichen;
Polykondensationspolymere wie Polyester, Polyamide, Polyurethane
usw. Derartige verschiedene Polymere umfassen spezifisch, ohne Einschränkung, Polyurethane,
Cellulosetriacetat und Polyvinylalkohol-/Poly(vinylchlorid)-Copolymer.
Für körperinvasive
Anwendungen sollte das polymere Matrixmaterial biokompatibel sein.
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Bei
einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen
kann/können
ein oder mehrere Weichmacher wahlweise in der Membranzusammensetzung
verwendet werden, um die Homogenität der Mischung beizubehalten.
Ein besonders bevorzugter Weichmacher ist Dioctylsebacat (DOS).
Jedoch sind andere Weichmacher zum Zubereiten von erfindungsgemäßen Anionenaustauschermembranen
geeignet. Derartige andere Weichmacher umfassen ohne Einschränkung Isopropylpalmitat,
Isopropylisostearat, Diisooctylphthalat und die anderen in Tabelle
II unten angegebenen Weichmacher. Beim Auswählen eines Weichmachers für die polymere Membran
ist es wichtig, dass der Weichmacher mit dein polymeren Matrixmaterial
verträglich
ist. Eine Unverträglichkeit
macht sich beispielsweise als Ausschwitzen des Weichmachers während des
Aushärtens
bemerkbar.
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Das
Anionenaustauschermaterial, wie es in den hier anhängenden
Ansprüchen
beschrieben ist, ist bevorzugt ein quartäres Ammoniumsalz. Bei besonders
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung sind die quartären
Ammoniumsalze, die zu optimalen Ergebnissen geführt haben, TDMAC und Aliquat
336 (Trioctylmethylammoniumchlorid). Andere quartäre Ammoniumsalze,
die eine potentiometrische Reaktion hervorrufen, umfassen ohne Einschränkung Trimethylphenylammoniumchlorid,
Dimethyldioctadecylammoniumbromid, Tetramethylammonium, Polybrene
und die anderen quartären
Ammoniumsalze, die in Tabelle III unten angegeben sind. Außer quartären Ammoniumsalzen
können
quartäre
Phosphoniumsalze oder quartäre
Arsoniumsalze bei der praktischen Ausführung der Erfindung verwendet
werden.
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Die
Selektivität
und Empfindlichkeit werden von den Gehalten der polymeren Membranen
beeinflusst. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist eine potentiometrische
Reaktion auf Heparin bei Membranen beobachtet worden, die 30 – 70 Gew.-%
polymeres Matrixmaterial, 30-70 Gew.-% Weichmacher und 0,1-12 Gew.-% quartäres Ammoniumsalz
umfassen. Besonders bevorzugte Ausführungsformen umfassen ca. 65
Gew.-% PVC, ca. 33 Gew.-% DOS und 1,4 – 2,0 Gew.-% TDMAC.
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Bei
gewissen bevorzugten Ausführungsformen
wird die Anionenaustauschermembran als homogene Lösung des
polymeren Matrixmaterials, Weichmachers und Anionenaustauschermaterials
in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran
(THF) oder Dimethylformamid (DMF), das für das Gießen zu einem dünnen Film
geeignet ist, zubereitet. Dünner
Me Film kann für
das Montieren auf einen Elektrodenkörper, wie weiter unten beschrieben
werden wird, zurechtgeschnitten werden. Typischerweise liegt die
Membrandicke im Bereich von ca. 100 μm bis 300 μm, bevorzugt 200 μm.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNG
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Das
Verständnis
der Erfindung wird durch Lesen der folgenden genauen Beschreibung
in Verbindung mit der beiliegenden Zeichnung erleichtert, wobei
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1 eine
schematische Darstellung eines Systems zum Messen einer Analytenlösung mit
einer heparinselektiven polymeren Membranelektrode ist.
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2 eine
schematische Darstellung der Grenzfläche zwischen der heparinselektiven
polymeren Membran und der Lösung
während
des Arbeitens mit der heparinselektiven polymeren Membranelektrode
aus 1 ist;
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3 eine
graphische Darstellung der Reaktionscharakteristiken einer heparinselektiven
Elektrode auf Cl–-Ionen (Linie A) und
Heparin (Linie B) über
ihren jeweiligen physiologischen Konzentrationsbereich ist. Die
Potentialänderung
(ΔE) in mV
vom Originalzellenpotential wird gegen den Logarithmus der Konzentration der
Analyten in klinischen Aktivitätseinheiten
pro ml (E/ml) aufgetragen.
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4 ist
eine graphische Darstellung der Reaktionscharakteristiken einer
heparinselektiven Elektrode auf Heparin in mit Zitrat versetzten,
frischen, menschlichen Plasmaproben.
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5 eine
graphische Darstellung der Reaktionscharakteristiken einer heparinselektiven
Elektrode auf unverdünnte
menschliche Blutproben.
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6 ist
eine vereinfachte schematische Seitenansicht, die beim Beschreiben
eines Siebdruckverfahrens für
das Bilden einer ionenselektiven Membran nützlich ist; und
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7 ist
eine vereinfachte schematische Darstellung einer Festkörper-Mikroelektrode,
die erfindungsgemäß konstruiert
ist.
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Ein
Verständnis
der Erfindung kann unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele
spezifischer Ausführungsformen
verbessert werden.
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Beispiel 1:
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Bei
einer besonders bevorzugten spezifischen Ausführungsform wird eine heparinselektive
polymere Membran zubereitet, die folgendes umfasst:
1,5 Gewichtsprozent
TDMAC;
65,7 Gewichtsprozent PVC und
32,8 Gewichtsprozent
Dioctylsebacat (DOS).
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Eine
polymere Gießlösung wird
durch Lösen
von 132 mg PVC; 66 mg DOS und 3 – 4 mg TDMAC in ca. 1,5 ml
THF-Lösungsmittel
zubereitet. Die Lösung
wird in einen Glasring (Innendurchmesser = 22 mm) auf einem Glasobjektträger gegossen.
Man lässt
das Lösungsmittel
verdampfen, beispielsweise über
Nacht, unter Bildung eines dünnen
Films einer Dicke von ca. 200 μm.
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1 ist
eine schematische Darstellung eines Systems für das Messen einer Analytenlösung mit
einer heparinselektiven polymeren Membranelektrode 10.
Eine dünne
heparinselektive Polymermembran 15 wird auf die Spitze
eines herkömmlichen
Philips ISW-561 Elektrodenkörpers 16 (von
Glasblaserei Moller, Zürich, Schweiz
erhältlich)
montiert. Der Elektrodenkörper 16 umfasst
ein Gehäuse 14 für das Halten
einer Bezugslösung 17,
in diesem Falle von 0,015 M NaCl, und eine Ag/AgCl-Elektrode 18,
die in die Bezugslösung 17 eingebracht
und durch den Draht 12 elektrisch an das Potentiometer 11 und
die Bezugselektrode 20, in diesem Falle eine Ag/AgCl-Kreuzungsbezugselektrode,
angeschlossen ist.
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Mit
Bezug auf 1 wurde eine potentiometrische
Reaktion eines Analyten in der Probelösung 13, die in einem
Probengefäß 19 enthalten
ist, mit Bezug auf die äußere Ag/AgCl-Kreuzbezugselektrode 20 bei
Raumtemperatur (ca. 22 °C)
gemessen. Die Probelösung 13 wurde
mit einem Magnetrührerstab 21 während allen Versuchen
gerührt.
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Die
heparinselektive Polymermembran 15 dient als Grenzfläche zwischen
der Probelösung 13 und
der Bezugslösung 17. 2 ist
eine schematische Darstellung der Grenzfläche zwischen der heparinselektiven polymeren
Membran und der Lösung
während
des Arbeitens mit der heparinselektiven polymeren Membranelektrode
aus 1.
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3 ist
eine graphische Darstellung der Reaktionscharakteristiken einer
heparinselektiven Elektrode (wie in Beispiel 1) auf Cl–-Ionen
und Heparin über
ihren jeweiligen physiologischen Konzentrationsbereich. ΔE stellt
die Potentialänderung
(d.h. das Zellpotential) in mV mit Bezug auf die absolute Potentialablesung
in 0,12 NaCl (d.h. ohne zugesetztes Heparin oder Ändern der
Chloridkonzentration) dar. ΔE
wird gegen den Logarithmus der Konzentration der Analyten in E/ml
aufgezeichnet. Die Daten wurden doppelt von zwei verschiedenen Elektroden
erhalten und als ± – Mittelwert-Standardabweichung
(SD) aufgezeichnet. Mit Bezug auf 3 ist die
Linie (A) die Reaktion auf Lösungen
von NaCl in Konzentrationen im Bereich von 0,09 bis 0,12 M (als „⎕" angegebene Datenpunkte)
und die Linie (B) ist die Reaktion auf wässrige Lösungen von Heparin und 0,12
M NaCl (als „o" angegebene Datenpunkte).
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Trotz
des Vorliegens eines hohen Niveaus an Chloridionen (0,12 M) in der
Probe, wies die heparinselektive Elektrode eine Empfindlichkeit
gegen sehr geringe Niveaus von Heparin in der wässrigen Lösung auf. Ein linearer Bereich,
der den Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1,0 E/ml Heparin deckt,
ist in 3, Linie (B) beobachtbar. Mit 30 – 40 Gew.-%
Weichmacher formulierte Membranen weisen eine selektive potentiometrische
Reaktion auf das stark sulfatierte Heparinmakromolekül mit Bezug
auf das Chlorid über
ihren jeweiligen physiologischen Konzentrationsbereiche auf. Die
Elektrode erfasst selbst in Gegenwart von 0,12 M Chlorid geringe
Mengen von Heparin (0,2 – 1,0
E/ml).
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Keine
Reaktion wurde dann auf Heparin beobachtet, wenn eine dünne Dialysemembran
(Molmassengrenze = 12.000 Dalton) über die Außenfläche der Polymermembran zum
Blockieren der Heparin-TDMAC-Wechselwirkung aufgebracht wurde. Des
weiteren wurde durch Zusetzen von Protamin zu einer Heparinprobe
das Potential der Elektrode sofort in eine positivere Richtung verschoben.
Protamin ist ein klinisch verwendeter Heparinantagonist, der Heparin
durch elektrostatische Wechselwirkung bindet und dadurch die Aktivität von freiem
Heparin in der Lösung
reduziert. Diese Beobachtungen zeigen, dass die heparinselektive Elektrode
direkt auf Heparinmakromoleküle
und nicht auf geringe ionische Verunreinigungen, die in den Heparinproben
vorliegen können,
reagiert.
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4 ist
eine graphische Darstellung der Reaktionscharakteristiken einer
heparinselektiven Elektrode auf Heparin in mit Zitrat versetzten
frischen menschlichen Plasmaproben. Die Potentialänderung ΔE in mV wird
gegen den Logarithmus der Heparinkonzentration in E/ml aufgezeichnet.
Die Aufzeichnung in 4 weist einen linearen Zusammenhang
(r2 = 0,99) zwischen der Spannungsänderung
und dem Logarithmus der Heparinkonzentration über den untersuchten Konzentrationsbereich
(1,0 bis 9,8 E/ml) auf. Die Heparinspiegel, auf die man bei den
meisten chirurgischen Vorgängen
trifft, liegen innerhalb des Bereichs von 1,0 bis 8.0 E/ml. So ist
die Empfindlichkeit der heparinselektiven Elektrode für klinische
Zwecke ausreichend.
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Die
Reaktion der heparinselektiven Elektrode auf eine umfangreiche Reihe
damit verbundener Molekularspezies wurde gemessenen und die Ergebnisse
sind in Tabelle I aufgezeigt. Derartige damit verbundene Spezies
umfassen die Glykosaminoglykananaloge Dermantinsulfat (Derm-S),
Chondroitinsulfat A (Chon-A) und Hyaluronsäure (Hya). Andere geprüfte Spezies
bestanden aus einem stark sulfatierten anionischen Polymer, Poly(vinylsulft)
(PVS) und sulfatierten und nichtsulfatierten Glykosaminresten (wichtige
Monosaccharidbausteine von Heparin). Alle geprüften Verbindungen wurden in
0,12 M NaCl-Lösung
in der gleichen Konzentration (12 μm/ml) zubereitet. Für Heparin
ist 12 μg/ml
ungefähr
einer klinischen E/ml-Aktivität
von 1,2 äquivalent.
Wenn nichts anderes angegeben wird, so befanden sich Verbindungen
in ihrer Natriumsalzform.
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TABELLE
I POTENTIOMETRISCHE
REAKTION DES HEPARINSENSORS AUF VERSCHIEDENE VERBINDUNGEN HIN.
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Mit
Bezug auf Tabelle I war die potentiometrische Reaktion auf Heparin
der Reaktion überlegen,
die auf die anderen Spezies mit reduzierter Reaktion auf andere
Glyosaminoglykananaloge beobachtet wurde, in direkter Korrelation
zu dem Sulfatgehalt dieser Verbindungen. Jedoch stellte die Elektrode
keine messbare Reaktion auf PVC zur Schau trotz der Tatsache, dass
PVC bis zu 62 Gew.-% Sulfat enthält.
Desgleichen ergaben keine der Glukosaminreste erfassbare potentiometrische
Signale. Obwohl man nicht durch irgendeine Theorie gebunden sein
möchte,
ist die bevorzugte Extraktion von Heparin auf sulfatierte Glukosaminreste
eventuell der Fähigkeit
von Heparin zuzuschreiben, gleichzeitig mit einer großen Anzahl
von immobilien positiv geladenen Tridodecylammoniumstellen in der
hydrophoben Membran (2) in Wechselwirkung zu treten,
während
der Mangel an Reaktion auf PVS der ziemlich hydrophilen Natur von
PVS zuzuschreiben ist, die seine Extraktion durch die hydrophobe
organische Membran verbietet. Frühere
Studien mit Membranelektroden auf der Basis von Ionenaustauschern
haben nahegelegt, dass der Reaktionsmechanismus die Extraktion des
Substrats in die organische Membranphase und die gleichzeitige Ionenpaarung
des Substrats an den Stellen des Komplexmittels involviert. Die
Gleichgewichtskonstante bei der Ionenaustauscherextraktion scheint
die beobachtete Elektrodenselektivität zu bestimmen.
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Beispiel 2:
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Die
potentiometrische Reaktion auf Heparin bei verschiedenen heparinselektiven
Polymermembranzusammensetzungen, die mit verschiedenen Weichmachern
weichgemacht sind, sind in Tabelle II unten zusammengefasst. Die
Zusammensetzungen von Tabelle II umfassen grundsätzlich 66 mg PVC, ca. 132 mg Weichmacher
und 6 mg Aliquat 336 als quartäres
Ammoniumsalz. Die Gewichtsprozente der verschiedenen Komponenten
sind in Klammern in der Tabelle angegeben. Die Potentialreaktion
ist in der Tabelle als ΔE
(mV) zwischen einer wässrigen
0,15 M NaCl-Lösung
und 6.9 E/ml Heparin in einer wässrigen
Lösung
von 0,15 M NaCl gezeigt.
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TABELLE II
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Potentiometrische
Reaktion auf Heparin und Zusammensetzungen von Membranen, die aus
66 mg PVC, 132 mg Weichmacher und 6 mg Aliquat 336 bestehen.
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Tabelle
II zeigt, dass signifikante potentiometrische Reaktionen in PVC-Membranen,
die mit verschiedenen Weichmachern weichgemacht sind, erreicht werden
können.
Besonders ausgezeichnete Reaktionen wurden bei den Membranen (i),
(o) und (p) beobachtet.
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Beispiel 3:
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Die
potentiometrische Reaktion verschiedener heparinselektiver Polymermembranzusammensetzungen,
die mit verschiedenen quartären
Ammoniumsalzen dotiert sind, sind in Tabelle III unten zusammengefasst.
Die Zusammensetzungen in Tabelle III umfassten prinzipiell 66 mg
PVC, ca. 132 mg DOS und 6 mg quartäres Ammoniumsalz. Die Gewichtsprozentsätze der
verschiedenen Komponenten in der dabei entstehenden Membran sind
in Klammern in der Tabelle angegeben. Die potentielle Reaktion ist
in der Tabelle als ΔE
(mV) zwischen einer wässrigen
0,15 M NaCl-Lösung
und 6,9 E/ml Heparin in einer wässrigen
Lösung
von 0,15 M NaCl gezeigt. Die Tabelle III zeigt, dass signifikante
potentiometrische Reaktionen mit verschiedenen quartären Ammoniumsalzen
erreicht werden können.
Eine ausgezeichnete Reaktion wird mit den Membranen (j) und (k)
erreicht.
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Tabelle III
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Potentiometrische
Reaktion auf Heparin und Zusammensetzungen von Membranen, die aus
66 mg PVC, ca. 132 mg DOS und 6 mg quaternärem Ammoniumsalz bestehen.
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Beispiel 4:
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Eine
heparinselektive Polymembranelektrode wurde in Proben, die menschliches
Vollblut umfassen, geprüft.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt, bei der es sich um
eine graphische Darstellung der Reaktionscharakteristiken der heparinselektiven
Elektrode auf Proben von unverdünntem
menschlichem Blut, das verschiedene Heparinspiegel enthält, handelt.
Das Potential in mV ist als Funktion der Zeit aufgezeichnet. Zu
Vergleichszwecken wird eine 15 minütige Erhöhung auf dem Diagramm aufgezeichnet.
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Die
Proben, die durch die Buchstaben (a) bis (i) angegeben sind, wurden
als klinische Proben von einem Patienten erhalten. Eine Menge Vollblut
wurde von dem Patienten abgenommen und in Proben ohne Heparin (a)
und Heparin mit verschiedenen zugegebenen Mengen (b) bis (g) geteilt.
Daraufhin wurde Heparin dem Patienten verabreicht und eine zweite
Probe (h) für
die klinische Beurteilung der Heparinkonzentration des Bluts unter
Zuhilfename der heparinselektiven Polymermembranelektrode abgezogen.
Als nächstes
wurde Protamin dem Patienten zum Neutralisieren des Heparins verabreicht
und eine dritte Probe (i) entzogen. Die Probeninhalte sind wie folgt
zusammengefasst:
- (a) Vollblut, kein Heparin
- (b) Vollblut, Heparinkonzentration von 1,00 E/ml
- (c) Vollblut, Heparinkonzentration von 1,58 E/ml
- (d) Vollblut, Heparinkonzentration von 2,51 E/ml
- (e) Vollblut, Heparinkonzentration von 3,98 E/ml
- (f) Vollblut, Heparinkonzentration von 6,31 E/ml
- (g) Vollblut, Heparinkonzentration von 10 E/ml
- (h) Vollblut, Heparinkonzentration unbekannt
- (i) Vollblut, Protamin-neutralisiert, verbleibende Heparinkonzentration
unbekannt
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Mit
Bezug auf 5 ist die Elektrodenreaktion
auf Heparin in den Proben (h) und (i) innerhalb von weniger als
1 Minute stabil. Schätzungen
auf der Basis der Gerinnungszeit des tatsächlichen Heparingehalts der Proben
(h) und (i) korrelieren gut mit der Heparinkonzentration, die durch
Verwendung der Elektrode mit einer vorkonstruierten Kalibrierungskurve
bestimmt worden ist.
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Die
Auswaschzeit oder die Zeit, die erforderlich ist, bis das Signal
zur Basislinie zurückkehrt,
unter Zuhilfenahme einer 2 M NaCl-Lösung zum Dissoziieren des Heparins,
das an die Elektodenoberfläche
gebunden ist, betrug weniger als 5 Minuten bei den in 5 aufgezeichneten
Ergebnissen. Kürzere
Auswaschzeiten sind bei NaCl-Lösungen höherer Konzentration
möglich.
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6 ist
eine vereinfachte schematische Darstellung eines Siliciumwafers,
auf dem eine polymere Membran 110 angebracht ist. In der
Praxis der Erfindung ist die polymere Membran 110, wie
hier beschrieben, ionenselektiv.
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In
der Praxis der Erfindung wird eine Maske 120 auf den Siliciumwafer 100 installiert.
Die Maske weist eine Öffnung 113 auf,
in die das polymere Membranmaterial als abgesetzt gezeigt ist. Die
Maske 120 kann aus Edelstahlmaschendraht gebildet sein,
der mit einer photoreaktiven Emulsion (nicht gezeigt) beschichtet
ist. Als Alternative kann die Maske als Metallfolienschablone ausgebildet
sein. Bei einer anderen Ausführungsform
ist die Maske mit den erwünschten
Merkmalen für
das Membrandrucken bemustert.
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Ein
Siebdrucker (nicht gezeigt) bringt die Membranpaste gleichmäßig auf,
wobei der Überschuss
derselben als Paste 150 angezeigt ist, und reiht die Paste
mit einem Gummiquetscher 160, der die Paste durch die Öffnung 113 und
auf den Siliciumwafer 100 drückt, der als Substrat funktioniert.
Der Gummiquetscher 160 wird bei dieser Ausführungsform
in die Richtung des in der Figur gezeigten Pfeils bewegt.
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Wie
aus dieser Figur zu sehen ist, reagiert die Dicke der polymeren
Membran 110 auf die Dicke der Maske 120. Bei erfindungsgemäßen Ausführungsformen
kann die Maske eine Dicke von ca. 25 Mikron bis 250 Mikron aufweisen.
Ein moderner, optisch ausgerichteter Siebdrucker, wie beispielsweise
Modell LS-15TV, das im Handel von New Long Seimitsu Kogyo Company
erhältlich
ist, erlaubt das Ausrichten und die Reproduzierbarkeit auf ca. ± 5 Mikron.
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Die
Siebdruckmethode des Herstellens erfindungsgemäßer ionenselektiver Festkörpersensoren,
erlegt rheologische Einschränkungen
auf das Membranmaterial auf. Lösungsmittel
und Zusatzmittel (nicht gezeigt) werden zum Bilden der Membranpaste,
wie beispielsweise Paste 150, verwendet, die eine geeignete Viskosität und Thixotropie
aufweist, um eine gute Musterdefinition zu erzielen.
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Die
Konstruktion und Konfiguration des Siliciumchip ist in 7 gezeigt.
Die Polymermembran-Gießlösung wurde
durch Zusetzen von 1,5 Gew.-% TDMAC direkt zu einer gelösten Siliciumkautschuklösung, ohne Zusatz
eines Weichmachers, hergestellt. Nach dem Reinigen der Oberfläche des
Siliciumchip mit Isopropylalkohol in einem Ultraschallbad für ca. 20
Minuten wurde die Polymermembran-Gießlösung auf die Oberfläche der
Silberepoxidstelle aufgegeben. Der Oberflächenbereich des Silberoxidfeststoffkontakts
betrug 0,41 mm2, während der Bereich der Membran
ca. 4,9 mm2 bei einer Dicke von ca. 150 μm betrug.
Die elektromotorische Kraft des Festkörperheparinsensors wurde in
einer 0,12 M NaCl-Lösung
durch Zugabe verschiedener Konzentrationen von Heparin überwacht.
Vorläufige
Daten haben die Möglichkeit
dieser Ausführungsform
demonstriert.
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Weitere
Studien zeigen, dass die Heparinsensorelektrode durch Spülen der
Sensormembran mit 1 – 2
M NaCl-Lösung
regeneriert werden kann. Es ist daher möglich, die Elektrode in einer
einfachen Durchflussanordnung zu verwenden, wie diejenige, die in
den meisten zur Zeit erhältlichen
Ionenanalysatoren verwendet wird, wo eine automatische Spülmöglichkeit
zur kontinuierlichen Regenerierung des Sensors eingebaut werden
kann.
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Bei
einer alternativen Ausführungsform
wird ein als Massenfabrikat hergestellter, wegwerfbarer Festkörperheparinsensor
für eine
einzige Anwendung durch Siebdrucken einer Siliconkautschukpolymermembran hergestellt,
die die entsprechende Menge TDMAC (d.h. ca. 1,5 Gew.-%) auf der
Oberfläche
eines vorher schon konstruierten mikroelektronischen Siliciumchip
der Größe 1 cm × 1 cm × 0,5 mm
enthält.
Die elektrochemische Reaktion auf Heparin hin wurde in einer Lösung geprüft, die
0,12 M NaCl enthielt und eine gute Korrelation zu den vorhergesagten
Ergebnissen aufwies.
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7 ist
eine vereinfachte schematische Darstellung einer Festkörpermikroelektrode 200,
die durch das erfindungsgemäße Siebdrucksystem
mit einer mit dem Kommunikationsnetzwerkkoppler kompatiblen Technologie
hergestellt wurde. Es wird gezeigt, dass die Festkörpermikroelektrode 200 ein
Siliciumsubstrat 210 mit einer Schicht Siliciumdioxid 220 darauf
aufweist. Eine Aluminiumelektrode 230 wird auf der Siliciumdioxidschicht
aufgebracht und eine Schicht Siliciumnitrid 250 wird über der
Aluminiumelektrode und der Siliciumdioxidschicht angeordnet. Ein
Siebdruckverfahren, das demjenigen, das dem oben mit Bezug auf 6 beschriebenen ähnlich ist,
wurde zum Herstellen eines Silberepoxidkontakts 260 verwendet.
Das Epoxid kann vom Typ sein, der im Allgemeinen unter dem Handelsnamen
Epotek H20E erhältlich
ist. Außerdem
wurde eine Membran auf Siliciumkautschukbasis 270 ebenfalls
mit Hilfe des Siebdruckverfahrens hergestellt und so angeordnet,
dass sie über
dem festen Silberepoxykontakt lag. So ist die Siebdrucktechnologie
auf die Herstellung der Kontakte und Membranen anwendbar.
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Es
ist äußerst wünschenswert,
dass die ioneneselektive Membran 270 von einem Typ sein
sollte, der gut an Materialien auf Siliciumbasis wie die Siliciumnitridschicht 250 anhaften
kann. Ein derartiges Anhängen reduziert
die Wahrscheinlichkeit, dass Elektrolytennebenanschlüsse hinter
der Membran gebildet werden, was die Festkörpermikroelektrode funktionsunfähig macht.
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Der
erfindungsgemäße heparinselektive
Polymermembransensor ergibt eine schnelle und verlässliche
potentiometrische Reaktion auf Heparin. Die dynamische Reaktionszeit
beträgt
weniger als 1 Minute bei klinisch wichtigen Heparinkonzentrationen
in unverdünnten
menschlichen Plasma- oder Blutproben. Die Rückkehr zur Basislinienpotentialzeit
beträgt
weniger als 5 Minuten. So ist der heparinselektive Polymermembranensensor
zur Verwendung als einmaligem wegwerfbarem Gerät oder als permamenterer Sensor
innerhalb eines Systems auf Instrumentbasis geeignet, wobei die
Reaktion auf das heparinisierte Blut durch Spülen mit einer hochkonzentrierten
Salzlösung
zwischen einzelnen Probemessungen umgekehrt werden kann. Bei gewissen
Ausführungsformen
kann der heparinselektive Polymermembranensensor für das kontinuierliche
in-vivo Abtasten adaptiert werden.
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Obwohl
die Erfindung als spezifische Ausführungsformen und Anwendungen
beschrieben worden ist, können
mit dem Stand der Technik vertraute Fachleute im Lichte dieser Lehre
zusätzliche
Ausführungsformen erzeugen,
ohne den Umfang der beanspruchten Erfindung zu überschreiten. Dementsprechend
ist zu verstehen, dass die Zeichnung und Beschreibung bei dieser
Offenbarung zum Erleichtern des Verständnisses der Erfindung geboten
werden und nicht als den Umfang derselben begrenzend ausgelegt werden
sollten.
