CN102235995B

CN102235995B - 一种测定酶活性的聚合物液膜电位传感器及其检测方法

Info

Publication number: CN102235995B
Application number: CN201010174365.8A
Authority: CN
Inventors: 秦伟; 王学伟; 丁家旺
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2010-05-07
Filing date: 2010-05-07
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2030-05-07
Also published as: CN102235995A

Abstract

本发明涉及传感器，具体地说是一种测定酶活性的聚合物液膜电位传感器及其检测方法。电位测定仪通过导线分别连接内参比电极和外参比电极，内参比电极插入盛有内充液的工作电极内，工作电极和外参比电极插入盛有检测液检测池中，工作电极为固定有聚合物敏感膜的电极载体，检测池中设有具有溶液扰动作用的动力装置。测定方法为通过电位测定仪测定酶促反应前后工作电极底部的聚合物敏感膜上的电位变化，根据电位变化信号通过标准工作曲线测得酶活性浓度。本发明通用性强、选择性好、灵敏度高、成本低廉，同时适合复杂基质条件下的检测。

Description

一种测定酶活性的聚合物液膜电位传感器及其检测方法

技术领域

本发明涉及传感器，具体地说是一种测定酶活性的聚合物液膜电位传感器及其检测方法。

背景技术

作为高效生物催化剂，酶广泛分布于自然界中，发挥着重要生理作用，加之在免疫分析等领域的应用，酶活性的测定是分析科学领域的重要课题。现有的酶检测技术主要包括电流分析、光度分析、荧光分析、化学发光分析、质量分析、表面等离子体共振分析等，但这些方法或者成本过高，或者对样品颜色、浊度等要求苛刻，或者对震动等测定环境敏感，为克服上述问题，发展更高效的酶活性测定方法十分必要。

聚合物液膜离子选择性电极是一种成本低廉、操作简单的电位检测方法。在已报道的该类电极在酶活性检测的应用中，利用的是敏感膜对反应终止后的某种特定产物产生能斯特电位响应。需要指出的是，该类方法中，检测在反应终止后单独进行，故无法捕捉到反应过程中的瞬态中间产物的电位信号；敏感膜在测定前被某种终产物离子活化，故难以实现对多种产物离子的共同检测。受此限制，聚合物液膜离子选择性电极成功检测的酶物种十分有限，特别是对过氧化物酶等重要免疫相关酶类的高灵敏检测亟待实现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通用性强、灵敏度高、成本低廉的测定酶活性的聚合物液膜电位传感器及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种测定酶活性的聚合物液膜电位传感器，包括工作电极、外参比电极、内参比电极和电位测定仪，电位测定仪通过导线分别连接内参比电极和外参比电极，内参比电极插入盛有内充液的工作电极内，工作电极和外参比电极插入盛有检测液的检测池中，工作电极为固定有聚合物敏感膜的电极载体，检测池中设有具有扰动溶液作用的动力装置。

所述敏感膜为将聚合物基体材料、增塑剂和离子交换剂，按质量百分比20-80∶20-80∶0.1-10混合后溶入到四氢呋喃中，搅均后在室温下放置6-48h，待四氢呋喃挥发完全后即得到聚合物敏感膜。所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻-硝基苯辛醚、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；离子交换剂为三-十二烷基甲基氯化铵、三-十四烷基甲基氯化铵、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸盐或硼酸盐。所述动力装置为磁性搅拌子、旋转圆盘电极、注射泵或喷壁式电极。

检测方法：将通过电位测定仪连接的工作电极和外参比电极插入含有待测酶的检测液中，检测液中加入引发酶促反应的底物待电位稳定后，测定电位测定仪上引发酶促反应前后聚合物敏感膜上的电位变化，根据电位变化信号通过标准工作曲线测得酶活性浓度。

检测方法：待测酶液中加入底物待终止酶促反应后，将酶促反应液加入到检测液中，通过连接的工作电极和外参比电极的电位测定仪测定引发酶促反应前后聚合物敏感膜上的电位变化，根据电位变化信号通过标准工作曲线测得酶活性浓度。

所述待测酶液中加入底物甲，待电位稳定后加入引发酶促反应的底物乙，并测定电位测定仪上引发酶促反应前后聚合物敏感膜上的电位变化，根据电位变化信号通过标准工作曲线测得酶活性浓度。

所述待测酶液可为氧化还原酶、转移酶、水解酶、具有相似催化性能的模拟酶或无机催化剂。所述氧化还原酶为辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶、漆酶、胆红素氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶；所述转移酶为糖苷酶；所述水解酶为蛋白酶或糖苷酶；所述具有相似催化性能的模拟酶为聚乙二醇-血红素；所述无机催化剂为四氧化三铁纳米颗粒或富勒烯。

所述对于氧化还原酶的检测，所述底物甲可为苯胺、联苯胺、四甲基联苯胺、邻联茴香胺、二氨基联苯胺、对茴香胺、间茴香胺、邻茴香胺、甲苯胺、氯苯胺、氟苯胺、二甲基联苯胺、4，4’-亚甲基双邻氯苯胺、对氨基偶氮苯、萘胺、硝基萘胺、对乙氧基苯胺、邻苯二胺、间苯二胺、对苯二胺、N-苯基对苯二胺、联大茴香胺、邻联甲苯胺、三甲基苯胺、氨基苯甲酸、氨基比林、氨基安替吡啉、氨基芴，苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、对苯氧基苯酚、对羟基联苯、甲氧基苯酚、甲基苯酚、氯苯酚、二甲基苯酚、二氯苯酚、对羟基苯甲酸、氯萘酚、抗坏血酸、多巴胺、对叔丁基儿茶酚、对乙酰氨基酚、酪氨酸、咖啡酸、儿茶酚、儿茶酚紫、铬黑T、酸性铬蓝K、偶氮染料、隐性亮绿、溴邻苯三酚；所述底物乙可为过氧化氢、过氧化甲基、过氧化乙基或氧气；所述底物乙可为二糖衍生物、松柏醇或氨基酸衍生物；所述对于转移酶、水解酶、具有相似催化性能的模拟酶或无机催化剂检测时，底物为二糖衍生物、松柏醇或氨基酸衍生物。

所述敏感膜为将聚合物基体材料、增塑剂和离子交换剂，按质量百分比20-80∶20-80∶0.1-10混合后溶入到四氢呋喃中，搅均后在室温下放置6-48h，待四氢呋喃挥发完全后即得到聚合物敏感膜；将所得敏感膜固定于电极载体上后活化电极，基于阳离子交换剂的聚合物敏感膜使用前用钠离子离子活化，能对阳离子产生电位响应，基于阴离子交换剂的聚合物敏感膜使用前用氯离子活化，能对阴离子产生电位响应；所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻-硝基苯辛醚、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；离子交换剂为三-十二烷基甲基氯化铵、三-十四烷基甲基氯化铵、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸盐或硼酸盐。所述内充液或检测液为电解质溶液，内充液可以为常规缓冲溶液，检测液可为水相缓冲液或水相缓冲液与有机溶剂的混合液。

检测原理为：酶促反应产生的中间产物和/或终产物具有与底物不同的电荷数和亲脂性，故能在离子交换剂膜电极上引起与酶活性相关的电位变化。以过氧化物酶-苯胺类或苯酚类芳香族氢供体-过氧化氢体系为例，苯胺类或苯酚类化合物在测定条件下主要以非离子形式存在，只能引起微弱的电位响应，在过氧化物酶的催化下，过氧化氢氧化苯胺类或苯酚类化合物，生成芳香类自由基离子、芳香类电荷转移复合物离子、芳香类寡聚离子、芳香类聚离子等产物离子。对于苯胺类化合物，产物为阳离子，可在阳离子交换剂掺杂的聚合物膜电极(钠离子活化)上引发显著电位上升；对于苯酚类化合物，产物为阴离子，可在阴离子交换剂掺杂的聚合物膜电极(氯离子活化)上引发显著电位下降。过氧化氢和氢供体的量一定时，电位上升量或下降量与过氧化物酶的活性相关，故可实现对过氧化物酶的检测。

本发明所具有的优点：

本发明中酶促反应与电位检测同时进行，离子交换剂掺杂的聚合物液膜同时检测包括自由基离子等瞬态产物在内的多种产物离子。

本发明的优点在于：

1.本发明突破了聚合物膜离子选择电极只能检测某一种特定酶促反应产物，且必须是稳态产物的限制，首次实现了对反应中瞬态产物的检测和多种产物离子的共同检测。大大扩展了离子选择性电极可测生物酶的范围。特别是对过氧化物酶的高效测定对发展酶联免疫电位分析具有重要意义。

2.本发明传感器通用性强，特别是底物十分丰富，易于根据不同需求做出选择。其中部分底物对过氧化物酶检测灵敏度很高，检出限可达10-6U/mL。

3.本发明传感器抗干扰能力强，既不受待测液颜色、浊度等因素的干扰；又对样品中的基质离子(如0.12M钠离子)有好的选择性。故特别适于复杂基质中的检测分析。

4.本传感器制备简单、操作方便，且因不需要特别的离子载体，成本低廉。同时，一次性使用的传感器避免了再生过程引起的测试性能改变，保证了良好的重现性。

5.本发明中酶促反应与电位检测同时进行，离子交换剂掺杂的聚合物液膜同时检测包括自由基离子等瞬态产物在内的多种产物离子。

附图说明

图1为本发明实施例传感器示意图。

图2为本发明实施例以苯胺为底物时，对不同活性浓度辣根过氧化物酶的电位响应。

图3为本发明实施例以苯胺为底物时，对不同活性浓度的辣根过氧化物酶的标准工作曲线。

图4为本发明实施例以苯酚为底物时，对不同活性浓度辣根过氧化物酶的电位响应。

图5为本发明实施例以苯酚为底物时，对不同活性浓度的辣根过氧化物酶的标准工作曲线。

具体实施方式

实施例1

电位传感器，包括工作电极1、外参比电极2、内参比电极3和电位测定仪4，电位测定仪4通过导线分别连接内参比电极3和外参比电极4，内参比电极3插入盛有内充液8的工作电极1内，工作电极1和外参比电极2插入盛有检测液6的检测池5中，工作电极1为固定有聚合物敏感膜7的电极载体，检测池5中设有具有搅拌作用的磁性搅拌子9，检测池底配套有磁力搅拌器以转动磁力搅拌子。固定有聚合物敏感膜7的电极载体为聚氯乙烯管。

检测方法：

以苯胺作为底物，待测酶为辣根过氧化物酶，

a.以阳离子交换剂二壬基萘磺酸掺杂的聚合物膜为工作电极敏感膜，银-氯化银电极为内外参比电极，内参比电极与电化学工作站CHI760D的工作电极接头连接，外参比电极与参比电极接头连接(参见图1)，选择“开路电位-时间”技术测定电位值。

工作电极敏感膜的制备：按照质量百分数1％∶49.5％∶49.5％将二壬基萘磺酸、聚氯乙烯、邻-硝基苯辛醚共345mg的混合物溶解于到3.5mL四氢呋喃溶液中，室温下在平底玻璃环(内径为3.6cm)中放置，约8h后四氢呋喃蒸发完毕，即得到均匀的聚合物敏感膜。

固定有聚合物敏感膜的电极载体工作电极的制备：将上述所得聚合物敏感膜用打孔器打取直径约0.7cm的聚合物敏感膜，并通过四氢呋喃将打取的膜固定于聚氯乙烯管底部。电极使用前在50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4，钠离子浓度为0.12mol/L)中活化约8h，每个电极只使用一次。

即活化时基于阳离子交换剂的聚合物敏感膜使用前用钠离子离子活化，能对阳离子产生电位响应；基于阴离子交换剂的聚合物敏感膜使用前用氯离子活化，能对阴离子产生电位响应。

聚氯乙烯管内部充有50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4，钠离子浓度为0.12mol/L)。检测液为50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝5.4，钠离子浓度为0.12mol/L)。

b.搅拌条件下，向4mL检测液加入80μL 0.1M苯胺(最终浓度2mM)，等电位值稳定后，加入不同浓度的辣根过氧化物酶溶液，而后加入4μL1MH₂O₂(最终浓度1mM)引发反应，记录引发氧化反应后300s的电位增量。用四个相同的电极在相同条件下分别测定最终浓度为0.001U/mL、0.01U/mL、0.1U/mL和1U/mL的辣根过氧化物酶引发的电位增加值(参见图2)，由于对于苯胺化合物，产物为阳离子，可在阳离子交换剂掺杂的聚合物膜电极(钠离子活化)上引发显著电位上升，并且能引起点位上升的化合物包括苯胺自由基阳离子、苯胺寡聚物离子和苯胺聚合物离子；同时其在搅拌条件能保证产物离子从检测溶液到聚合物液膜间的传质过程，进而保证电位信号的产生。并作出电位增加值对酶浓度的标准工作曲线(参见图3)。

c.将未知浓度辣根过氧化物酶的待测样品加入到检测液中，而后0.1M苯胺，待电位稳定后加入1M H₂O₂引发氧化反应，记录300s内的电位增量，而后根据标准曲线求得酶活性。

实施例2

与实施例1不同之处在于：

以苯酚为底物，待测酶为辣根过氧化物酶。

a.以阴离子交换剂三-十二烷基甲基氯化铵掺杂的聚合物膜为工作电极敏感膜，银-氯化银电极为内外参比电极，内参比电极与电化学工作站CHI760D的工作电极接头连接，外参比电极与参比电极接头连接，选择“开路电位-时间”技术测定电位值。

工作电极的制备为：按照质量百分数1.5％∶66％∶32.5％将三-十二烷基甲基氯化铵、聚氯乙烯、癸二酸二辛酯共345mg溶解于到3.5mL四氢呋喃溶液中，室温下在平底玻璃环(内径为3.6cm)中放置，约8h后四氢呋喃蒸发完毕，即得到均匀的聚合物敏感膜。用打孔器打取直径约0.7cm的该聚合物膜，并通过四氢呋喃将打取的膜固定于聚氯乙烯管底部。电极使用前在50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)中活化约8h，每个电极只使用一次。

聚氯乙烯管内部充有50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)。检测液为50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)。

b.在搅拌条件下，向4mL检测液加入80μL0.1M苯酚(最终浓度2mM)，等电位值稳定后，加入4μL1M H₂O₂(最终浓度1mM)，然后加入不同浓度的辣根过氧化物酶溶液.记录引发氧化反应后120s的电位减小值。用五个相同的电极在相同条件下分别测定最终浓度为0.0005U/mL、0.001U/mL、0.01U/mL、0.1U/mL和1U/mL的辣根过氧化物酶引发的电位减小值，由于对于苯酚类化合物，产物为阴离子，可在阴离子交换剂掺杂的聚合物膜电极(氯离子活化)上引发显著电位下降。其中能引起电位下降的产物包括苯酚寡聚物离子和苯酚聚合物离子。同时其在搅拌条件能保证产物离子从检测溶液到聚合物液膜间的传质过程，进而保证电位信号的产生。(参见图4)，并作出电位减小值对酶浓度的标准工作曲线(参见图5)。

c.将未知浓度辣根过氧化物酶的待测样品加入到检测液中，而后0.1M苯酚，待电位稳定后加入1M H₂O₂引发氧化反应，记录120s内的电位减小值，而后根据标准曲线求得酶活性。

实施例3

与实施例1不同之处在于：

以，3′，5，5′-四甲基联苯胺为底物，待测酶为辣根过氧化物酶。

传感器中，将固定有聚合物敏感膜的聚乙烯管套到旋转圆盘电极的电极头上，内参比电极为与旋转圆盘电极的参比电极接口相连。

旋转圆盘电极转速调至5000rpm后，向1mL检测液加入20μL0.1M3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(最终浓度2mM)，等电位值稳定后，加入1μL1M H₂O₂(最终浓度1mM)，然后加入不同浓度的辣根过氧化物酶溶液，记录引发氧化反应后300s的电位增量。用六个相同的电极在相同条件下分别测定最终浓度为10^-6U/mL、10^-5U/mL、10^-4U/mL、0.001U/mL、0.01U/mL和0.1U/mL的辣根过氧化物酶引发的电位增加值，并作出电位增加值对酶浓度的标准工作曲线，未知酶样品的活性可根据标准工作曲线获得。其中引起电位增加的产物包括3，3′，5，5′-四甲基联苯胺自由基阳离子、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺-3，3′，5，5′-四甲基联苯亚胺电荷转移复合体阳离子和3，3′，5，5′-四甲基联苯亚胺阳离子。

实施例4

与实施例1不同之处在于：

以对苯二酚为底物，待测酶为漆酶。

工作电极敏感膜的制备：按照质量百分数1.5％∶66％∶32.5％将三-十四烷基甲基氯化铵、聚丁基丙烯酸酯、二-2-乙基己基癸酯共345mg溶解于到3.5mL四氢呋喃溶液中，室温下在平底玻璃环(内径为3.6cm)中放置，约8h后四氢呋喃蒸发完毕，即得到均匀的聚合物敏感膜。

在空气条件下，待测酶液中加入对苯二酚，酶促反应进行5s-4h后通过液氮冷却终止反应，而后将反应液转移到检测缓冲液中，同时用传感器检测加入反应液前后工作电极上的敏感膜的电位变化，通过该信号得到辣根过氧化物酶的量。

实施例5

与实施例1不同之处在于：

工作电极敏感膜的制备：按照质量百分数1.5％∶66％∶32.5％将三-十二烷基甲基氯化铵、聚丙烯酸丁酯、癸二酸二丁酯共345mg溶解于到3.5mL四氢呋喃溶液中，室温下在平底玻璃环(内径为3.6cm)中放置，约8h后四氢呋喃蒸发完毕，即得到均匀的聚合物敏感膜。

以含有磺酸基的二糖衍生物为底物，进行糖苷酶的检测。

将通过电位测定仪连接的黏附有阴离子交换剂的敏感膜的工作电极和外参比电极插入含有待测的糖苷酶液的检测液中，其中糖苷酶为透明质酸酶、纤维素酶或几丁质酶，检测液中加入引发酶促反应的二糖衍生物(其中二糖衍生物为软骨二糖)，(待电位稳定后，测定电位测定仪上反应前后聚合物敏感膜上的电位变化，根据电位变化信号通过标准工作曲线测得酶活性浓度。

实施例6

与实施例1不同之处在于：

工作电极敏感膜的制备：按照质量百分数0.5％∶30％∶69.5％将三-十二烷基甲基氯化铵、聚醚酰亚胺、邻-硝基苯辛醚共175mg溶解于到2.5mL四氢呋喃溶液中，室温下在平底玻璃环(内径为3.6cm)中放置，约8h后四氢呋喃蒸发完毕，即得到均匀的聚合物敏感膜。

以含有酚羟基的氨基酸衍生物为底物，进行蛋白酶的检测。

将通过电位测定仪连接的黏附有阴离子交换剂的敏感膜的工作电极和外参比电极插入含有待测的蛋白酶液的检测液中，其中蛋白酶为木瓜酶、凤梨酵素或胰蛋白酶，检测液中加入引发酶促反应的含酚羟基的氨基酸衍生物(其中苯酚基团的氨基酸为对羟基亚甲基氨基酸乙酯)，待电位稳定后，测定电位测定仪上反应前后聚合物敏感膜上的电位变化，根据电位变化信号通过标准工作曲线测得酶活性浓度。

实施例7

与实施例1不同之处在于：

工作电极敏感膜的制备：按照质量百分数5％∶47.5％∶47.5％将三-十四烷基甲基氯化铵、聚氯乙烯、邻-硝基苯辛醚共345mg溶解于到3.5mL四氢呋喃溶液中，室温下在平底玻璃环(内径为3.6cm)中放置，约8h后四氢呋喃蒸发完毕，即得到均匀的聚合物敏感膜。

以松柏醇和氧气为底物，进行氧化酵素或漆酶的检测。

将通过电位测定仪连接的黏附有阴离子交换剂的敏感膜的工作电极和外参比电极插入含有待测的氧化酵素或漆酶的磷酸盐缓冲液与二氧六环的混合检测液(体积比为1∶1)中，检测液中加入引发酶促反应的底物松柏醇待电位稳定后，记录电位测定仪上反应前后聚合物敏感膜上的电位变化，根据电位变化信号通过标准工作曲线测得酶活性浓度。

所述电解质溶液包括内充液(固体电极除外)和检测液。内充液可以是常规缓冲溶液等电解质溶液，检测液可以是水相缓冲液，也可以是水相缓冲液与有机溶剂的混合液。

本发明检测仪器为电位测定仪，电极包括工作电极、内参比电极和外参比电极，工作电极为基于离子交换剂的聚合物液膜电极。电极、电位测定仪与检测液组成检测回路，检测液连有动力装置以扰动溶液，达到促进检测液与聚合物膜间的物质传递的目的。同时本发明中酶促反应产生的中间产物和/或终产物具有与底物不同的电荷数和亲脂性，能在离子交换剂膜上引起与酶活性相关的电位变化，实现酶活性测定。

Claims

1.一种测定酶活性的聚合物液膜电位传感器的检测方法，其特征在于：将通过电位测定仪连接的工作电极和外参比电极插入含有待测酶的检测液中，检测液中加入引发酶促反应的底物后，产生中间产物，测定电位测定仪上引发酶促反应，即产生中间产物前后聚合物敏感膜上的电位变化，根据电位变化信号通过标准工作曲线测得酶活性浓度；

所述敏感膜为将聚合物基体材料、增塑剂和离子交换剂混合后溶入到四氢呋喃中，搅均后在室温下放置6-48h，待四氢呋喃挥发完全后即得到聚合物敏感膜；

所述聚合物基体材料、增塑剂和离子交换剂的质量百分比为49.5∶49.5∶1、66∶32.5∶1.5、30∶69.5∶0.5或47.5∶47.5∶5。

2.按权利要求1所述测定酶活性的聚合物液膜电位传感器的检测方法，其特征在于：所述待测酶液可为氧化还原酶、转移酶、水解酶、具有相似催化性能的模拟酶或无机催化剂的溶液。

3.按权利要求2所述测定酶活性的聚合物液膜电位传感器的检测方法，其特征在于：所述氧化还原酶为辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶、漆酶、胆红素氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶；所述转移酶为糖苷酶；所述水解酶为蛋白酶或糖苷酶；所述具有相似催化性能的模拟酶为聚乙二醇-血红素；所述无机催化剂为四氧化三铁纳米颗粒或富勒烯。

4.按权利要求2所述测定酶活性的聚合物液膜电位传感器的检测方法，其特征在于：所述氧化还原酶、其模拟酶或无机催化剂的检测，所述底物甲可为苯胺、联苯胺、四甲基联苯胺、邻联茴香胺、二氨基联苯胺、对茴香胺、间茴香胺、邻茴香胺、甲苯胺、氯苯胺、氟苯胺、二甲基联苯胺、4，4’-亚甲基双邻氯苯胺、对氨基偶氮苯、萘胺、硝基萘胺、对乙氧基苯胺、邻苯二胺、间苯二胺、对苯二胺、N-苯基对苯二胺、联大茴香胺、邻联甲苯胺、三甲基苯胺、氨基苯甲酸、氨基比林、氨基安替吡啉、氨基芴，苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、对苯氧基苯酚、对羟基联苯、甲氧基苯酚、甲基苯酚、氯苯酚、二甲基苯酚、二氯苯酚、对羟基苯甲酸、氯萘酚、抗坏血酸、多巴胺、对叔丁基儿茶酚、对乙酰氨基酚、酪氨酸、咖啡酸、儿茶酚、儿茶酚紫、铬黑T、酸性铬蓝K、偶氮染料、隐性亮绿、溴邻苯三酚；所述底物乙可为过氧化氢、过氧化甲基、过氧化乙基或氧气；所述转移酶或水解酶的检测，底物可为二糖衍生物、松柏醇或氨基酸衍生物。

5.按权利要求1所述测定酶活性的聚合物液膜电位传感器的检测方法，其特征在于：所述敏感膜为将聚合物基体材料、增塑剂和离子交换剂混合后溶入到四氢呋喃中，搅均后在室温下放置6-48h，待四氢呋喃挥发完全后即得到聚合物敏感膜；将所得敏感膜固定于电极载体上后活化电极，基于阳离子交换剂的聚合物敏感膜使用前用钠离子活化，能对阳离子产生电位响应，基于阴离子交换剂的聚合物敏感膜使用前用氯离子活化，能对阴离子产生电位响应；所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻-硝基苯辛醚、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；离子交换剂为三-十二烷基甲基氯化铵、三-十四烷基甲基氯化铵、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸盐或硼酸盐；

6.按权利要求1所述测定酶活性的聚合物液膜电位传感器的检测方法，其特征在于：内充液或检测液为电解质溶液，内充液为常规缓冲溶液，检测液为水相缓冲液或水相缓冲液与有机溶剂的混合液。

7.按权利要求1所述测定酶活性的聚合物液膜电位传感器的检测方法，其特征在于：所述聚合物液膜电位传感器，包括工作电极(1)、外参比电极(2)、内参比电极(3)和电位测定仪(4)，其特征在于：电位测定仪(4)通过导线分别连接内参比电极(3)和外参比电极(2)，内参比电极(3)插入盛有内充液(8)的工作电极(1)内，工作电极(1)和外参比电极(2)插入盛有检测液(6)的检测池(5)中，工作电极(1)为固定有聚合物敏感膜(7)的电极载体，检测池(5)中设有具有扰动溶液作用的动力装置(9)。

8.按权利要求7所述测定酶活性的聚合物液膜电位传感器的检测方法，其特征在于：所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻-硝基苯辛醚、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；离子交换剂为三-十二烷基甲基氯化铵、三-十四烷基甲基氯化铵、二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸盐或硼酸盐。

9.按权利要求7所述测定酶活性的聚合物液膜电位传感器的检测方法，其特征在于：所述动力装置为磁性搅拌子、旋转圆盘电极、注射泵或喷壁式电极。