CN101149383B

CN101149383B - 一种检测禽流感病毒抗体的装置及检测方法

Info

Publication number: CN101149383B
Application number: CN2007100715447A
Authority: CN
Inventors: 赵广英; 吴淑春
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Qingdao Santong Wanfu Food Technology Co ltd; Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2007-09-30
Filing date: 2007-09-30
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2027-09-30
Also published as: CN101149383A

Abstract

本发明公开了一种准确、快速、灵敏、特异性高且经济的检测禽流感病毒抗体的装置。本发明装置包括免疫传感器、酶标二抗反应体系、电解池和数据采集与处理系统；免疫传感器包括印刷在绝缘基板上的工作电极、参比电极和辅助电极所构成的电极系统；电解池包括检测底液、搅拌器和温控器；数据采集与处理系统包括电化学工作站、计算机和软件系统；免疫传感器通过导线与电化学工作站相连；免疫传感器的工作电极为碳电极，其上涂布有包埋禽流感病毒抗原的金胶感应膜。本发明还公开了一种使用该装置检测禽流感病毒抗体的方法。

Description

一种检测禽流感病毒抗体的装置及检测方法

技术领域

本发明涉及禽流感病毒抗体快速检测技术领域，特别是基于抗原抗体反应检测禽流感病毒抗体的电化学传感器及检测方法。

背景技术

禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)是源于禽类，能在极短的时间内造成大量禽畜死亡，并可致人类死亡的烈性传染病毒。近几年来，很多国家和地区相继爆发了高致病性禽流感，不但给相关产业造成巨大的经济损失，也严重威胁到人类健康与安全。

在禽流感疫情检测、患病诊断、宰前检疫、免疫效果检测中，禽流感病毒抗体快速检测是较为常用的方法之一。

目前，禽流感病毒抗体的检测主要有以下方法：血凝和血凝抑制试验(HA/HI)、琼脂凝胶扩散试验(AGP)，免疫荧光技术(IFTr)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶免疫测定(EIA)技术等。

血凝和血凝抑制试验操作过程繁琐，易出现假阳性；琼脂免疫扩散试验方法取材方便，操作简单，但检测时间长，敏感度低；免疫荧光技术和酶联免疫吸附试验都需要特殊的仪器设备，检测过程复杂、费用高、检测时间长，并且易出现假阳性。

因此，建立一种准确、灵敏、快速、特异性高且经济的检测禽流感病毒抗体的方法显得尤为重要。

在病毒抗体检测领域中，免疫传感器因其快速、简便、灵敏受到越来越广泛的应用。免疫传感器是在传感界面固定抗原或抗体，通过测量由抗原、抗体特异性结合引起的物理、化学信号的变化，对样品中抗原或抗体进行定性或定量判定。

抗原-抗体结合前后可导致多种信号的改变，如重量、光学、热学、电化学等。电化学分析具有能现场检测，不受样品颜色、浊度的影响，样品可以不经处理，无需分离，所用仪器设备相对简单等优点，使得电化学免疫传感检测成为一种使用较为广泛的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、快速、灵敏、特异性高且经济的检测禽流感病毒抗体的装置及检测方法。

本发明的装置是基于抗原抗体反应检测禽流感病毒抗体的电化学检测装置，具有准确、快速、灵敏、特异性高等优点，并且价格低，适用于基层或现场检测。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种检测禽流感病毒抗体的装置，包括免疫传感器、酶标二抗反应体系、电解池和数据采集与处理系统；免疫传感器包括印刷在绝缘基板上的工作电极、参比电极和辅助电极所构成的电极系统；电解池包括检测底液、搅拌器和温控器；数据采集与处理系统包括电化学工作站、计算机和软件系统；免疫传感器通过导线与电化学工作站相连，其特征在于免疫传感器的工作电极为碳电极，其上涂布有包埋禽流感病毒抗原的金胶感应膜。

本发明装置的免疫传感器中，电极系统通过丝网印刷方法印在绝缘基板上，辅助电极为石墨电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极以碳电极为支持电极，其上涂布有包埋禽流感病毒抗原的金胶感应膜。工作电极可以是多个，能同时检测多份样品。

工作电极上包埋的禽流感病毒抗原可以是H5N1型禽流感病毒抗原或其它禽流感病毒抗原。

包埋禽流感病毒抗原的金胶感应膜的膜材料可以是壳聚糖、醋酸纤维素、PVB、Nafion、明胶或琼脂糖中的一种或者它们的混合物。

酶标二抗可以是标记辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶或尿素水解酶的兔抗鸡IgG抗体。

本发明还包括一种使用上述装置检测禽流感病毒抗体的方法，包括以下步骤：

1)将待测样本滴于本发明装置的免疫传感器工作电极表面，20℃孵育10分钟；

2)将免疫传感器置于酶标二抗溶液中，30℃孵育30分钟；

3)将免疫传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含有0.4mmol/LH₂O₂的1mmol/L硫堇(Thionine，俗称劳氏紫)醋酸盐缓冲液，PH值为7.0；

4)设定适宜的扫描参数，对工作电极施加电压，检测辅助电极与工作电极间的电流值；

5)将上述测定获得的电流信息输入数据采集与处理系统；

6)处理信息结果输出。

检测样本为禽类血清。采集得到的血清样本在2℃～8℃条件下保存不应超过24小时；若需长期保存，应在-70℃条件下。并应尽量避免反复冻融(最多冻融3次)。

本发明中检测方法原理：在电化学反应体系中，酶催化底物H₂O₂生成相应的酶促反应物H₂O，酶由还原态变为氧化态；此时氧化态的酶催化电子媒介体硫堇由还原态变为氧化态，而酶自身则由氧化态变为还原态；氧化态的电子媒介体在电极表面得到电子后又变为还原态，同时产生响应电流。

采用常用的循环伏安法(Cyclic voltammetry，CV)和差分脉冲法(differentialpulse potentiometry，DPV)作为免疫传感器表征和定性判定的方法。

当被检测血清中含有禽流感病毒抗体时，抗体与固定在工作电极上、附着于胶体金颗粒表面的禽流感病毒抗原发生反应，生成抗原抗体复合物。酶标二抗随后与病毒抗体结合；将免疫传感器放置在电解池中时，酶标二抗的酶能够催化硫堇和H₂O₂反应，使还原电流较免疫反应前增大。根据响应电流曲线峰值的变化即可判断待测物是否含有禽流感病毒抗体。

本发明中检测禽流感病毒抗体的免疫传感器，将免疫技术与电化学检测相结合，是一种电流型的酶免疫传感器。它将酶的化学放大功能与免疫传感器的特异性相结合，融合二者的优点，使其同时具备免疫反应的特异性和电化学分析的灵敏性，能准确地进行低含量物质的检测。

本发明的检测方法是一种新的快速检测禽流感病毒抗体的方法，具有灵敏、快速、特异性高等优点，并且价格低，适用于基层和活体及现场检测。

为进一步说明本发明特点和效果，以下结合附图对发明作进一步描述。

附图说明

图1是本发明装置的免疫传感器一种实施方式的正面示意图；

图2是传感器在不同阶段于电解池检测底液中的电流响应曲线；

其中，1--橡胶树脂板；2--工作电极；3--辅助电极；4--参比电极。

具体实施方式

实施例1：本发明检测禽流感病毒抗体的装置，由免疫传感器、酶标二抗反应体系、电解池和数据采集与处理系统组成。

免疫传感器包括工作电极2、参比电极4和辅助电极3，各电极采用丝网印刷方法印在橡胶树脂板1上，辅助电极3为石墨电极，参比电极4为Ag/AgCl电极，工作电极2以碳电极为支持电极，其上涂布有包埋H5N1型禽流感病毒抗原的壳聚糖金胶膜；

酶标二抗反应体系为标记辣根过氧化物酶的兔抗鸡IgG抗体稀释液；

电解池包括检测底液、搅拌器和温控器。检测底液为含有0.4mmol/LH₂O₂的1mmol/L硫堇醋酸盐缓冲液，PH值为7.0；

数据采集与处理系统包括电化学工作站、计算机和软件系统。

免疫传感器通过导线与电化学工作站相连，电化学工作站将电流信号传送至计算机。

免疫传感器的制备：

1)采用丝网印刷在橡胶树脂板1上印刷出如图1所示的参比电极4、辅助电极3和工作电极2的支持电极。辅助电极为石墨电极，参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极的支持电极为碳电极。工作电极为4个，两边对称排列；

2)制备壳聚糖金胶溶液：在10mL烧杯中加入3mL 1％的壳聚糖溶液，磁力搅拌下加入1mL 1％四氯金酸(HAuCl4)，加热至70℃，并保持恒温2小时。溶液颜色逐渐变为酒红色，制得壳聚糖金胶溶液。将壳聚糖金胶溶液在4℃下保存备用。

3)将壳聚糖金胶溶液与H5N1型禽流感病毒抗原溶液充分混合；混合液4℃放置12小时；取3μL混合液滴涂于工作电极2表面，并于室温下放置3～4小时，使之干燥成膜；

4)将干燥后的免疫电极置于含0.2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中搅拌洗涤1小时，以封闭电极表面的非特异性吸附位点。制得的免疫电极于4℃，pH 7.4 PBS溶液中保存备用。

实施例2：检测禽流感病毒抗体的方法

1)样本采集和处理

取禽类血液，离心分离得血清，稀释备用。

2)将待测样本滴于本发明免疫传感器的工作电极2表面，20℃下孵育10分钟，使样本中的禽流感病毒抗体与免疫传感器工作电极2上附着于胶体金颗粒表面的病毒抗原产生抗原抗体特异性反应。用PBS-T洗涤免疫传感器三次，再用二次蒸馏水清洗；

3)将免疫传感器放入电解池，电解池的检测底液为含有0.4mmol/L H₂O₂的1mmol/L硫堇醋酸盐缓冲液，PH值为7.0。

4)设定扫描速率为0.1V/s，对工作电极施加电压，测得辅助电极与工作电极间的电流值Ip1；测定完毕，取出免疫传感器。

5)再将免疫传感器置于标记辣根过氧化物酶的兔抗鸡IgG抗体溶液中，30℃孵育30分钟后，用PBS-T洗液洗涤免疫传感器三次，再用二次蒸馏水清洗；

6)将免疫传感器放入电解池，电解池的检测底液为含有0.4mmol/L H₂O₂的1mmol/L硫堇醋酸盐缓冲液，PH值为7.0。

7)设定扫描速率为0.1V/s，对工作电极施加电压，测得辅助电极与工作电极间的电流值Ip2；

8)将上述测定获得的电流信息输入数据采集与处理系统；采用常用的循环伏安法和差分脉冲法作为免疫电极表征和定性判定的方法。

9)处理信息结果输出。

为了更好的说明检测结果，将同一传感器在不同阶段置于电解池检测底液中(0.4mmol/L H₂O₂+1.0mmol/L硫堇+0.1mol/L pH7.0醋酸缓冲溶液)检测响应电流，以比较同一免疫传感器在不同阶段产生的响应电流变化。

如图2所示，为本发明装置的免疫传感器在不同阶段的电流响应曲线图。

其中曲线a为裸丝网印刷电极在检测底液中的电流响应曲线。裸丝网印刷电极出现的是一对稳定的硫堇氧化还原峰。

曲线b为免疫传感器在检测底液中的电流响应曲线。其氧化还原峰信号有所增强，可能由于钠米金颗粒的信号放大作用所致。

曲线c为经过牛血清白蛋白封闭后的免疫传感器在检测底液中的电流响应曲线。曲线中的氧化还原峰几乎没有变化。

曲线d为免疫传感器与检测样本孵育后在检测底液中的电流响应曲线。曲线中的氧化还原峰也几乎没有变化。

曲线e为免疫传感器与检测样本孵育后，又与酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体)发生反应的免疫传感器在检测底液中的电流响应曲线。可以看出，氧化还原峰电流明显增强，表明免疫电极上的禽流感病毒抗原与检测样本中的病毒抗体发生了特异性免疫反应，生成抗原抗体复合物。抗原抗体复合物进一步结合标记辣根过氧化物酶的兔抗鸡IgG抗体；辣根过氧化物酶引发电催化过程，催化硫堇和H₂O₂反应，使氧化还原峰电流明显增大。

以K＝(Ip2-Ip1)/Ip1×100％(即免疫传感器与酶标二抗反应前后的催化电流的增大率)作为判断被测血清中是否含有禽流感抗体的依据。当K≥30％时为阳性，表示被测样本中含有AIV抗体；当20％＜K＜30％为可疑样品，需作进一步确证；当K＜20％时为阴性，表示被测样本中不含AIV抗体。

本实施例中，K＝(7.092uA-4.286 uA)/4.286uA×100％＝65.47％，＞30％，表明被测样本中含有AIV抗体。

当然，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。

Claims

1.一种用于非诊断目的的检测禽流感病毒抗体的方法，包括以下步骤：

1)待测样本滴于免疫传感器的工作电极表面，20℃孵育10分钟；所述免疫传感器包括印刷在绝缘基板上的工作电极、参比电极和辅助电极所构成的电极系统；其中，免疫传感器的工作电极为碳电极，其上涂布有包埋H5N1型禽流感抗原的金胶感应膜，辅助电极为石墨电极，参比电极为Ag/AgCl电极；

2)免疫传感器置于酶标二抗溶液中，30℃孵育30分钟；所述酶标二抗为标记辣根过氧化物酶的兔抗鸡IgG抗体；

3)免疫传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含有0.4mmol/LH₂O₂的1mmol/L硫堇醋酸盐缓冲液，pH值为7.0；

4)设定扫描速率为0.1V/s，对工作电极施加电压，检测辅助电极与工作电极间的电流值；

5)测定获得的电流信息输入数据采集与处理系统；所述数据采集与处理系统包括电化学工作站、计算机和软件系统；免疫传感器通过导线与电化学工作站相连，电化学工作站将电流信号传送至计算机；

6)信息处理结果输出。

2.如权利要求1所述的检测禽流感病毒抗体的方法，其特征在于数据采集与处理系统采用循环伏安法和差分脉冲法作为免疫电极表征和定性判定的方法。