CN107091872B - 一种基于铂/碳化硅纳米材料的生物传感器及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于铂/碳化硅纳米材料的生物传感器及其应用，属于电化学检测技术邻域。本发明按以下步骤实施：首先，以SiC、Glucost、ethanol、APTES、H2PtCl6、EDTA、NaOH、NaBH4、吡啶和柠檬酸钠为起始原料，分别采用水热的方法制备SiC‑NH2纳米材料以及采用常温还原的方法制备Pt NP@SiC‑NH2纳米复合材料；其次，用壳聚糖(CS)固定乙酰胆碱酯酶采用物理吸附将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定在Pt NP@SiC‑NH2修饰的玻碳电极表面构建成电化学生物传感器。本发明的传感器在检测甲基对硫磷农药和西维因农药中的应用。本发明的有益效果在于：通过采用电化学与酶传感结合技术，成功实现了对甲基对硫磷和西维因两种农药的高灵敏检测，检测方法简单、样品用量少、响应快速、灵敏度高、稳定性好。

Description

一种基于铂/碳化硅纳米材料的生物传感器及其应用
技术邻域
基于电化学技术与固定化酶的结合过程，本发明涉及一种基于铂/碳化硅纳米材料的生物传感器的构建，属于电化学检测技术邻域。
背景技术
现代社会农药被广泛作为杀虫剂使用来一方面可以起到防治虫害的作用，另一方面它可以增加产量、保证收成，提高农民生活水平的作用。也因此出现了因不同种类农药大量使用引发的对公众健康、环境和现代农业中的食品安全问题。因此，为了提高和保障食品质量和生命安全，对农药残留的高灵敏检测成为了研究者们广泛关注的热点。目前，对于农药残留的检测常采用并且较成熟的方法主要有：GC、HPLC、GC-MC联用技术、毛细管电泳(CE)、免疫分析、电化学传感器和生物传感器等，它们已被广泛的应用到农药残留检测的实际工作中。但由于这些技术都有仪器昂贵、仪器操作复杂、仪器笨重、检测时间长、样品的前处理过程复杂、测量结果的重现性差、稳定性差。因此，构建操作简便、分析检测快速、高灵敏和高稳定的农药残留检测方法，有效的解决由农药残留超标导致的卫生食品安全和环境污染迫在眉睫。
电化学分析传感器是目前的分析定量检测技术的最核心和最可靠的技术，其占有非常突出的地位，此传感器的优点如下：仪器操作简单、成本低、灵敏度高、仪器自动化程度高、样品用量少、分析检测时间快，以此同时其检测信号转换为直观易读的浓度值，便于非专业人士使用，目前已被广泛应用于环境科学、药物学以及食品科学等领域。此外，固定化酶的方法也被引用到农药残留的检测中，为农药残留的检测提供了更具参考的价值，其突出的优点主要表现在：实验过程操作简单、选择性好、专一性高、检测响应快。
铂纳米粒子负载氨基化碳化硅纳米材料目前还没有被引用到很多与化学相关的领域，它属于一种新型的氨基化纳米复合材料。此材料的制备是基于铂纳米粒子属于贵金属纳米材料，其尺寸较小具有较好的电催化活性、大的比表面积、良好的生物相容性和良好的导电性。碳化硅中Si-C间通过sp3杂化共价结合，Si-C键能很强，使SiC具有诸多优良性质，如耐磨、机械强度高、硬度大、化学性质稳定、耐腐蚀、热稳定性、耐高温、背景电流小、干扰小、优良的半导体材料，因此碳化硅具有很大的应用价值，在光学、电学、机械等许多领域广泛应用，它是理想的载体材料。因此，将铂纳米粒子负载到氨基化碳化硅上，制备的此纳米复合材料具有更强的电催化活性，并且可以首次通过此种材料来固定乙酰胆碱酯酶进而用来定量检测甲基对硫磷和西维因等两种农药，达到对农药检测所要求的灵敏度高、选择性好、检测时间短等需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电催化活性高、灵敏度高、选择性好、检测时间短且有助于乙酰胆碱酯酶的固定的基于铂纳米粒子负载氨基化碳化硅的纳米复合材料电化学生物传感器及其应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：基于铂纳米粒子负载氨基化碳化硅纳米复合材料的乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器的制备，它包括以下步骤：首先，以SiC、Glucost、ethanol、APTES、H2PtCl6、EDTA、NaOH、NaBH4、吡啶和柠檬酸钠为起始原料，分别采用水热的方法制备SiC-NH2纳米材料以及采用常温还原的方法制备Pt NP@SiC-NH2纳米复合材料；其次，用壳聚糖(CS)固定乙酰胆碱酯酶采用物理吸附将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定在Pt NP@SiC-NH2修饰的玻碳电极表面，基于Pt NP@SiC-NH2良好的电化学性能，构建成电化学生物传感器应用于对甲基对硫磷和西维因等两种农药的快速、灵敏检测，其构建过程与检测机理：
乙酰胆碱酯酶催化底物硫代乙酰胆碱水解，生成产物硫代胆碱和醋酸。硫代胆碱在特定电位下易被氧化，产生电流。在底物浓度一定的条件下，电流信号大小与生物传感器的催化响应有关。在有农药存在条件下，农药与乙酰胆碱酯酶的活性内羟基结合，生成对硫代乙酰胆碱无催化活性的磷酰化乙酰胆碱酯酶。乙酰胆碱酯酶对底物的催化活性受到农药的抑制，产生的硫代胆碱浓度下降，电流减小.随着农药浓度的增加，其对酶电极的抑制率增加，根据下式计算百分抑制率:
(1)式中，I p,control是指乙酰胆碱酯酶传感器对一定浓度的硫代乙酰胆碱产生的稳态电流，I p,exp是指乙酰胆碱酯酶传感器经农药抑制后对同一浓度硫代乙酰胆碱产生的稳态电流，通过比较酶抑制前后的电流信号即氧化峰大小，实现对对甲基对硫磷和西维因等两种农药的定量检测。
本发明的具体的技术解决方案如下：
(1)Pt NP@SiC-NH2纳米复合材料的制备
①SiC-NH2纳米材料的制备
首先，100mg SiC溶于40mL的超纯水中，100mg葡萄糖溶于40mL的超纯水中,分别超声分散均匀后，转移到100mL的不锈钢高压反应釜中于180℃反应8小时，冷却至室温，用乙醇离心洗三次；然后，加入40mL乙醇和1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌12小时过夜，用乙醇离心洗三次，冷冻干燥样品即得到SiC-NH2纳米材料。
②Pt NP@SiC-NH2复合材料的制备
首先，取2.0mg制得的SiC-NH2材料，加入到2.0mL 0.45mM H2PtCl6的溶液中；其次，加入5.0mL吡啶和1.0mL 0.01M柠檬酸钠到混合溶液中超声10分钟；最后，加入1.0mL 0.01MNaBH4溶液常温搅拌10h，之后12000rpm离心20分钟，用水洗三次，定容至10mg/mL，即得到PtNP@SiC-NH2复合材料。(一)Pt NP@SiC-NH2纳米复合材料的制备
(2)玻碳电极表面预处理
将直径为3mm的玻碳电极Glassy carbon electrode(GCE)用1.0μm，0.3μm，0.05μm的Al2O3粉来抛光处理，依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗，放置于空气中自然干燥，然后在pH＝7.4的PBS溶液中于+1.75V恒电位下扫描300s，再于+0.3V～+1.25V和+0.3V～－1.3V之间循环扫描多次，待电流稳定后，用二次水冲洗电极并在空气中自然干燥备用。
(3)电化学生物传感界面的构建
(a)取1.0mL Pt NP@SiC-NH2复合材料加入20μL 5％的Nafion溶液；
(b)取6uL有5％Nafion溶液的Pt NP@SiC-NH2悬浮液滴涂于预先处理好的玻碳电极表面，放在室温下干燥，即得到Pt NP@SiC-NH2修饰玻碳电极，记为Pt NP@SiC-NH2/GCE；
(c)待Pt NP@SiC-NH2修饰的玻碳电极干后再接着在电极表面滴涂4.5μL的乙酰胆碱酯酶(AChE)和壳聚糖(CS)的混合物，其中乙酰胆碱酯酶为3μL和壳聚糖为1.5μL，于冰箱中4℃环境下干燥过夜，即得到AChE-CS/Pt NP@SiC-NH2/GCE；
(4)对甲基对硫磷和呋喃丹等农药标准品进行检测，建立标准曲线
把AChE-CS/Pt NP@SiC-NH2/GCE作为工作电极，饱和甘汞电极(saturatedcalomel electrode)作为参比电极，铂电极(platinum wire electrode)作为对电极将工作电极置于含有不同浓度甲基对硫磷和西维因在PBS(0.1mol/L pH＝7.4)中抑制4min循环伏安扫描多次，待背景电流稳定后，在2mM的巯基乙酰胆碱(ATCl)溶液中25℃下温育10min，记录它们各自所产生的循环伏安图，根据电流值随农药的不同浓度呈规律的变化，绘制标准曲线并确定农药的最佳线性范围和检测限。
本发明的有益效果在于：
1、本发明分别利用水热的方法制备了SiC-NH2纳米材料和利用常温还原方法制备了Pt NP@SiC-NH2纳米复合材料，其具有优异的电催化活性、生物相容性和化学稳定性。
2、本发明所构建的电化学生物传感器，成功实现了对甲基对硫磷和西维因等两种农药的高灵敏检测，其中该传感器对甲基对硫磷农药检测的线性范围为(10-12)mol/L～(10-8)mol/L，其检出限为(5.52×10-13)mol/L；对西维因农药检测的线性范围为(10-12)mol/L～(10-8)mol/L，其检出限为(5.65×10-13)mol/L。
3、本发明基于农药对酶修饰电极的抑制作用，实现了电化学检测农药残留的目的，该方法操作简便，样品用量少、检测快速、检测限低、线性范围宽和灵敏度高，适用于农药残留的分析与检测。
附图说明
图1为几种不同材料在0.1M(PBS＝7.4)和0.5mM ATCl中的循环伏安图(CV图)，其电流响应如图所示：
a.NF/AChE-CS/GCE b.NF/AChE-CS/SiC-NH2/GCE c.NF/AChE-CS/Pt NP/GCEd.NF/AChE-CS/Pt NP@SiC-NH2/GCE；
图2为电化学生物传感器电极NF/AChE-CS/Pt NP@SiC-NH2/GCE应用于不同浓度的ATCl检测的标准曲线。
图3为电化学生物传感器电极NF/AChE-CS/Pt NP@SiC-NH2/GCE应用于检测不同浓度甲基对硫磷农药的标准曲线；
图4为电化学生物传感器电极NF/AChE-CS/Pt NP@SiC-NH2/GCE应用于检测不同浓度西维因农药的标准曲线。
具体实施方式
实施例一：
首先，100mg SiC溶于40mL的超纯水中，100mg葡萄糖溶于40mL的超纯水中,分别超声分散均匀后，转移到100mL的不锈钢高压反应釜中于180℃反应8小时，冷却至室温，用乙醇离心洗三次；然后，加入40mL乙醇和1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌12小时过夜，用乙醇离心洗三次，冷冻干燥样品即得到SiC-NH2纳米材料。取2.0mg制得的SiC-NH2材料，加入到2.0mL 0.45mM H2PtCl6的溶液中，加入5.0mL吡啶和1.0mL 0.01M柠檬酸钠到混合溶液中超声10分钟，最后，加入1.0mL 0.01M NaBH4溶液常温搅拌10h，之后12000rpm离心20分钟，用水洗三次，定容至10mg/mL，即得到Pt NP@SiC-NH2复合材料。
首先，取1.0mL Pt NP@SiC-NH2复合材料加入20μL 5％的Nafion溶液；其次，取6uL有5％Nafion溶液的Pt NP@SiC-NH2悬浮液滴涂于预先处理好的玻碳电极表面，放在室温下干燥，即得到Pt NP@SiC-NH2修饰玻碳电极，记为Pt NP@SiC-NH2/GCE；最后，在已干的Pt NP@SiC-NH2修饰的玻碳电极表面滴涂4.5μL乙酰胆碱酯酶(AChE)和壳聚糖(CS)混合物，在4℃环境中干燥过夜，即得到AChE-CS/Pt NP@SiC-NH2/GCE；
先在用PBS(0.1mol/L pH＝7.4)配成的不同浓度的巯基乙酰胆碱ATCl溶液中用循环伏安扫描多次，记录所产生的循环伏安图(如图1所示)，建立标准曲线(如图2所示)；后选用10-12mol/L～10-8mol/L浓度范围的甲基对硫磷农药在PBS(0.1mol/L pH＝7.4)中用循环伏安扫描多次，待背景电流稳定后，在2mM的巯基乙酰胆碱ATCl溶液中室温下温育15min，建立标准曲线(如图3所示)，确定该电化学生物传感器的检出限为5.52×10-13mol/L。
实施例二：
首先，100mg SiC溶于40mL的超纯水中，100mg葡萄糖溶于40mL的超纯水中,分别超声分散均匀后，转移到100mL的不锈钢高压反应釜中于180℃反应8小时，冷却至室温，用乙醇离心洗三次；然后，加入40mL乙醇和1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌12小时过夜，用乙醇离心洗三次，冷冻干燥样品即得到SiC-NH2纳米材料。取2.0mg制得的SiC-NH2材料，加入到2.0mL 0.45mM H2PtCl6的溶液中，加入5.0mL吡啶和1.0mL 0.01M柠檬酸钠到混合溶液中超声10分钟，最后，加入1.0mL 0.01M NaBH4溶液常温搅拌10h，之后12000rpm离心20分钟，用水洗三次，定容至10mg/mL，即得到Pt NP@SiC-NH2复合材料。
首先，取1.0mL Pt NP@SiC-NH2复合材料加入20μL 5％的Nafion溶液；其次，取6uL有5％Nafion溶液的Pt NP@SiC-NH2悬浮液滴涂于预先处理好的玻碳电极表面，放在室温下干燥，即得到Pt NP@SiC-NH2修饰玻碳电极，记为Pt NP@SiC-NH2/GCE；最后，在已干的Pt NP@SiC-NH2修饰的玻碳电极表面滴涂4.5μL乙酰胆碱酯酶(AChE)和壳聚糖(CS)混合物，在4℃环境中干燥过夜，即得到AChE-CS/Pt NP@SiC-NH2/GCE；
先在用PBS(0.1mol/L pH＝7.4)配成的不同浓度的巯基乙酰胆碱ATCl溶液中用循环伏安扫描多次，记录所产生的循环伏安图(如图1所示)，建立标准曲线(如图2所示)；后选用10-12mol/L～10-8mol/L浓度范围的西维因农药在PBS(0.1mol/L pH＝7.4)中用循环伏安扫描多次，待背景电流稳定后，在2mM的巯基乙酰胆碱ATCl溶液中室温下温育15min，建立标准曲线(如图4所示)，确定该电化学生物传感器的检出限为5.65×10-13mol/L。

Claims (2)

1.一种基于铂/碳化硅纳米材料的生物传感器，其特征在于该生物传感器经由如下过程构建得到：
(一)Pt NP@SiC-NH2纳米复合材料的制备
①SiC-NH2纳米材料的制备
首先，100mg SiC溶于40mL的超纯水中，100mg葡萄糖溶于40mL的超纯水中,分别超声分散均匀后，转移到100mL的不锈钢高压反应釜中于180℃反应8小时，冷却至室温，用乙醇离心洗三次；然后，加入40mL乙醇和1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌12小时过夜，用乙醇离心洗三次，冷冻干燥样品即得到SiC-NH2纳米材料；
②Pt NP@SiC-NH2复合材料的制备
首先，取2.0mg①制得的SiC-NH2材料，加入到2.0mL 0.45mM H2PtCl6的溶液中；其次，加入5.0mL吡啶和1.0mL 0.01M柠檬酸钠到混合溶液中超声10分钟；最后，加入1.0mL 0.01MNaBH4溶液常温搅拌10h，之后12000rpm离心20分钟，用水洗三次，定容至10mg/mL，即得到PtNP@SiC-NH2复合材料；
(二)玻碳电极表面预处理
将直径为3mm的玻碳电极Glassy carbon electrode用1.0μm，0.3μm，0.05μm的Al2O3粉来抛光处理，依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗，放置于空气中自然干燥，然后在pH＝7.4的PBS溶液中于+1.75V恒电位下扫描300s，再于+0.3V～+1.25V和+0.3V～－1.3V之间循环扫描多次，待电流稳定后，用二次水冲洗电极并在空气中自然干燥备用；
(三)电化学生物传感界面的构建
(a)取1.0mL Pt NP@SiC-NH2复合材料加入20μL 5％的Nafion溶液；
(b)取6μL有5％Nafion溶液的Pt NP@SiC-NH2悬浮液滴涂于预先处理好的玻碳电极表面，放在室温下干燥，即得到Pt NP@SiC-NH2修饰玻碳电极，记为Pt NP@SiC-NH2/GCE；
(c)待Pt NP@SiC-NH2修饰的玻碳电极干后再接着在电极表面滴涂4.5μL的乙酰胆碱酯酶和壳聚糖的混合物，其中乙酰胆碱酯酶为3μL和壳聚糖为1.5μL，于冰箱中4℃环境下干燥过夜，即得到乙酰胆碱酯酶-壳聚糖/Pt NP@SiC-NH2/玻碳电极。
2.根据权利要求1所述的基于铂/碳化硅纳米材料的生物传感器在检测甲基对硫磷农药和西维因农药中的应用。
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