DE102016118319A1

DE102016118319A1 - Biosensor zum Nachweis von Organophosphor- und Carbamatverbindungen

Info

Publication number: DE102016118319A1
Application number: DE102016118319.9A
Authority: DE
Inventors: Felix Alois Plamper; Olga Mergel; Arjan Gelissen; Michael Noyong; Ulrich Simon; Walter Richtering; Larisa Sigolaeva; Snezhana Gladyr; Dmitry Pergushov; Ilya Kurochkin
Original assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Current assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date: 2016-09-28
Filing date: 2016-09-28
Publication date: 2018-03-29

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Biosensor zur Ermittlung des Vorliegens einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung, umfassend ein enzymatisches Reaktionssystem umfassend wenigstens ein Enzym und ein Substrat für das Enzym, wobei die Organophosphor- oder Carbamatverbindung das Enzym inhibiert, wobei das enzymatische Reaktionssystem wenigstens Butyrylcholinesterase umfasst, die aus einer Lösung mit einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–10 M bis ≤ 9 × 10^–7 M heraus in einem Mikrogel ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer immobilisiert ist, und wobei das enzymatische Reaktionssystem Butyrylcholinesterase und als Substrat Butyrylthiocholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–7 M bis ≤ 10 mM umfasst, oder Butyrylcholinesterase und Cholinoxidase und als Substrat Butyrylcholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–5 M bis ≤ 10 mM umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet des Nachweises gefährlicher Chemikalien wie Pestizide. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen Biosensor zum Nachweis von Organophosphor- und Carbamatverbindungen.
Organophosphorverbindungen zählen seit dem Verbot der chlorhaltigen Insektizide zu den landwirtschaftlich am häufigsten verwendeten Insektiziden. Dies zeigt sich auch darin, dass Organophosphorverbindungen zu den am häufigsten detektierten Pestiziden gehören. Organophosphorverbindungen sind nicht nur für Insekten, sondern für viele Organismen, einschließlich des Menschen, stark toxisch. Die toxische Wirkung beruht auf der Hemmung bzw. Inhibition der Acetylcholinesterase (AChE), wodurch es zu einer Anreicherung des Neurotransmitters Acetylcholin in Gehirn, autonomen Nervensystem und motorischen Endplatten kommt, was zu einem Dauerreizzustand führt, der sich in Krampfzuständen, Atemlähmung und einer Verlangsamung der Herztätigkeit äußern kann. Aufgrund der vielfältigen Risiken bei der Aufnahme dieser Pestizide insbesondere durch Säuglinge und Kleinkinder wurden in der EU sehr niedrige Grenzwerte für Pestizidrückstände in Nahrungsmitteln festgesetzt. Speziell für Säuglinge und Kleinkinder gelten für Pflanzenschutzmittel-Rückstände beispielsweise Grenzwerte von 0,01 mg/kg. Die Entwicklung hochempfindlicher Methoden zur Detektion von Cholinesterase-Inhibitoren wie Organophosphorverbindungen ist daher eine wichtige Aufgabe der Umweltanalytik. Klassische Verfahren wie Gas- und Flüssigkeitschromatographie, spektroskopische und massenspektrometrische Detektionsmethoden, sind jedoch kosten- und apparaturintensiv und erfordern eine zeitaufwendige Probenvorbereitung.
Daher wurden in den vergangenen Jahren so genannte Biosensoren auf Basis von Acetyl- und Butyryl-Cholinesterasen entwickelt. Unter einem Biosensor versteht man die direkte räumliche Verbindung eines biologischen Erkennungselementes mit einem physikalischen Signalumwandler (Transducer). Die biologische Komponente kann insbesondere ein Enzym sein. Als Transducer stehen elektrochemische, piezoelektrische, potentiometrische, amperometrische, spektrophotometrischen und fluorometrische Sensoren zur Verfügung. Durch Kopplung der biologischen Komponente mit einem amperometrischen Transducer kann die biochemische Aktivität beispielsweise in eine elektronische Aktivität umgewandelt werden, wobei die amperometrische Komponente des Biosensors als Messsignal eine Änderung der Stromstärke erzeugt. Biosensoren zeichnen sich durch eine hohe Selektivität und Sensitivität gepaart mit einem niedrigen apparativen und zeitlichen Aufwand für ihren Einsatz aus.
Den Acetyl- und Butyrylcholinesterase-basierten Biosensoren kommt ein besonderer Stellenwert im Screening für eine schnelle und einfache Bestimmung von Organophosphor- und Carbamatverbindungen zu. In der Regel wird die Cholinesteraseaktivität vor und nach einer Inkubation des Enzyms mit den Inhibitoren bestimmt. Für einen routinemäßigen Einsatz sind Biosensoren bislang jedoch noch wenig geeignet. So weisen Biosensoren zumeist nur eine kurze Lebensdauer auf. Um einen effektiven Sensor auf Basis von Enzymen herstellen zu können ist es weiter notwendig, diese an eine Matrix zu immobilisieren. An Immobilisierungstechniken sind adsorptive Anlagerung, die Einbindung in Polymerschichten, die Vernetzung der Enzymmoleküle untereinander sowie die kovalente Anbindung der Enzyme an den Sensor bekannt. Nachteilig ist jedoch, dass hierdurch vielfach die für eine enzymatische Aktivität notwendige natürliche Struktur der Enzyme beeinträchtigt wird.
Neue Methoden der Enzymimmobilisierung wie sie von Sigolaeva, L. V. et al. in Langmuir, 2015, 31, S. 13029–13039 offenbart wurden, zeigen eine Immobilisierung von Enzymen durch elektrostatische Bindungen in einem Mikrogel. Ein Biosensor, der für den Nachweis von phosphororganischer Verbindungen geeignet ist, oder ein Verfahren zur Verwendung des Materials zum Nachweis phosphororganischer Verbindungen wird jedoch nicht beschrieben. Biosensoren, die nicht-kovalent gebundene Enzyme verwenden, zeigen häufig unerwünschte Eigenschaften, wie enzymatische Instabilität, eine kurze Betriebsdauer oder mangelnde Sensitivität. Die für die Herstellung eines funktionalen Biosensors notwendigen Bedingungen zu erfüllen stellt weiterhin eine Herausforderung dar.
Es besteht daher weiter Bedarf an Biosensoren für den Nachweis von Organophosphorverbindungen. Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zu Grunde, einen Biosensor zur Verfügung zu stellen, der mindestens einen der vorgenannten Nachteile des Standes der Technik überwindet. Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, einen Biosensor bereit zu stellen, der für eine Lebensmittelüberwachung geeignet ist.
Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Biosensor zur Ermittlung des Vorliegens einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung, umfassend ein enzymatisches Reaktionssystem umfassend wenigstens ein Enzym und ein Substrat für das Enzym, wobei die Organophosphor- oder Carbamatverbindung das Enzym inhibiert, wobei das enzymatische Reaktionssystem wenigstens Butyrylcholinesterase umfasst, die aus einer Lösung mit einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–10 M bis ≤ 9 × 10^–7 M heraus in einem Mikrogel ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer immobilisiert ist, und wobei das enzymatische Reaktionssystem Butyrylcholinesterase und als Substrat Butyrylthiocholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–7 M bis ≤ 10 mM umfasst, oder Butyrylcholinesterase und Cholinoxidase und als Substrat Butyrylcholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–5 M bis ≤ 10 mM umfasst.
Überraschend wurde gefunden, dass der erfindungsgemäße Biosensor eine äußerst sensitive Detektion von Organophosphorverbindungen im picomolaren Bereich erlaubt. So wurden die Oxoverbindungen Diazinon(oxon) und Chlorpyrifos(oxon) der Organophosphor-Pestizide Diazinon und Chlorpyrifos in wässriger Lösung noch in Mengen von 6 × 10^–12 M und 8 × 10^–12 M nachgewiesen. Die hohe Sensitivität erlaubt präzise Messungen in stark verdünnten Realproben mit nur minimaler Interferenz durch störende Verbindungen wie Schwermetallionen. Damit ermöglichen die erfindungsgemäßen Biosensoren eine Verwendung in der Lebensmittelüberwachung und einen effizienten Nachweis von Spritzmittelrückständen.
In vorteilhafter Weise sind die Biosensoren einfach und mit zuverlässiger Reproduzierbarkeit herstellbar. Weiterhin zeigen die hergestellten Biosensoren eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Sensorantwort. Beispielsweise zeigten die Sensorantworten bei 15 unabhängigen Messungen für 1 mM Butyrylthiocholin nur 3% relative Standardabweichung (100% × [Standardabweichung]/[Mittelwert des Analysesignals]). Zudem zeigen die einzelnen Biosensoren eine hohe Messstabilität. So wurde in 15 aufeinander folgenden Messungen lediglich ein Absinken der Sensorantwort von 0,3% pro Einzelmessung festgestellt. Insbesondere zeigen die Biosensoren eine gute Langzeitstabilität. So blieben auch nach 45 Tagen Lagerung der Sensoren im trockenen Zustand bei 4°C noch 60% Sensoraktivität erhalten. Insgesamt sind die Biosensoren einfach aufgebaut und reproduzierbar, wodurch eine kostengünstige Herstellung und eine einfache Detektion ermöglicht wird. Diese können damit eine vielversprechende Option für Biosensoren auf der Basis von Cholinesterase-Inhibition bieten.
Der Begriff „Mikrogel” umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung intramolekular vernetzte Makromoleküle mit kolloidaler Dimension. Mikrogele bilden Partikel mit definierter Größe aber unscharfer Oberfläche aus. Ein Mikrogel ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer erlaubt eine einfache Art der Enzym-Immobilisierung. Hierbei ist die Lokalisation des Enzyms in bzw. an der Oberfläche des Mikrogels über Kontrolle von Temperatur und pH-Wert bei der Aufbringung des Mikrogels auf eine inerte Trägersubstanz, wie einen amperometrischen Transducer, wie auch der nachfolgenden Aufbringung des Enzyms gezielt einstellbar. Die Menge des an der Oberfläche des Mikrogels, und damit an der Sensoroberfläche, immobilisierten Enzyms ist über die Konzentration des Enzyms in der Lösung, aus der heraus das Enzym aufgebracht wird, einstellbar. Dies erlaubt Biosensoren zur Verfügung zu stellen, die eine hervorragende Zugänglichkeit des Enzyms für ihr Substrat wie auch inhibierende Organophosphor- und Carbamatverbindungen aufweisen.
Überraschend wurde festgestellt, dass durch eine gezielte Kontrolle der Menge an immobilisierter Butyrylcholinesterase und der Konzentration ihres Substrats, beispielsweise Butyrylthiocholin, bei der Messung Biosensoren zur Verfügung gestellt werden können, die einen Pestizidnachweis mit hoher Sensitivität und relative kurzer Standzeit erlauben. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass die Sensitivität des Biosensors insbesondere auf dem verwendeten Verhältnis von Enzym und Substrat beruht. In bevorzugten Ausführungsformen liegt die Konzentration der Butyrylcholinesterase in der Lösung, aus der heraus das Enzym immobilisiert wird, im Bereich von ≥ 1 × 10^–9 M bis ≤ 1 × 10^–7 M, vorzugsweise im Bereich von≥ 1 × 10^–8 M bis ≤ 2,5 × 10^–8 M. In diesen Bereichen kann Butyrylcholinesterase in einem Umfang immobilisiert werden, der eine sehr gute Sensorantwort des Biosensors erlaubt. In weiter bevorzugten Ausführungsformen liegt Butyrylthiocholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–6 M bis ≤ 3 mM, vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–4 M bis ≤ 1 mM, vor. Es wurde festgestellt, dass bei Konzentrationen des Substrats in diesem Bereichen der Biosensor eine sehr gute Sensorantwort zeigt. So wurde in einem Bereich von 0,1 μM bis 0,1 mM Butyrylthiocholin ein linearer Anstieg der Sensorantwort beobachtet. In besonders bevorzugten Ausführungsformen, liegt die Konzentration der Butyrylcholinesterase in der Lösung, aus der heraus diese immobilisiert wird, bei 2,5 × 10^–8 M und die Konzentration von Butyrylthiocholin bei 1 mM.
Das enzymatische Reaktionssystem des Biosensors umfasst wenigstens ein Enzym und dessen Substrat. Hierdurch wird das biologische Erkennungselement des Biosensors zur Verfügung gestellt. Der Biosensor bzw. dessen enzymatisches Reaktionssystem kann lediglich Butyrylcholinesterase und als Substrat Butyrylthiocholin umfassen. Die enzymatische Hydrolyse des Butyrylthiocholins durch die Butyrylcholinesterase führt in diesen Ausführungsformen zu Thiocholin als Reaktionsprodukt des enzymatischen Reaktionssystems. Das Reaktionsprodukt des enzymatischen Reaktionssystems reagiert anschließend seinerseits mit dem Transducer des Biosensors, wobei ein Messsignal erzeugt wird.
Das enzymatische Reaktionssystem des Biosensors kann auch Butyrylcholinesterase und Cholinoxidase umfasssen. In diesen bienzymatischen Ausführungsformen ist das Substrat Butyrylcholin. Die Butyrylcholinesterase verwendet ebenfalls Butyrylcholin als Substrat und hydrolysiert dieses zu Cholin. Die Cholinoxidase oxidiert das Cholin zu Betain, wobei gleichzeitig Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. In diesen Ausführungsformen reagiert die Cholinoxidase mit dem Hydrolyseprodukt der Butyrylcholinesterase und erzeugt hierdurch ihrerseits das Reaktionsprodukt des enzymatischen Reaktionssystems, mit dem der Transducer reagieren kann. In den Ausführungsformen, in denen das enzymatische Reaktionssystem Butyrylcholinesterase und Cholinoxidase umfasst, kann die Konzentration der Butyrylcholinesterase in der Lösung, aus der heraus das Enzym in dem Mikrogel immobilisiert wird, im Bereich von ≥ 1 × 10^–9 M bis ≤ 5 × 10^–7 M, vorzugsweise im Bereich von ≥ 5 × 10^–8 M bis ≤ 1 × 10^–7 M, bevorzugt im Bereich von ≥ 1 × 10^–8 M bis ≤ 5 × 10^–8 M, liegen. Die Konzentration der Cholinoxidase liegt in der Lösung, aus der heraus die Cholinoxidase in dem Mikrogel immobilisiert wird, vorzugsweise im Bereich von ≥ 1 × 10^–5 M bis ≤ 5 × 10^–5 M. In dieser Ausführungsform des Biosensors liegt Butyrylcholin als Substrat bevorzugt in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–4 M bis ≤ 5 mM, vorzugsweise einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 M bis ≤ 3 mM vor. Der Vorteil dieses Systems liegt in einer höheren Sensitivität der Wasserstoffperoxiddetektion auf Mangandioxid. So beträgt das Detektionslimit für Wasserstoffperoxid/Mangandioxid 10^–8 mol/L im Vergleich zu Thiocholin/Mangandioxid 10^–7 mol/L.
Der Biosensor umfasst ein wie oben beschriebenes enzymatisches Reaktionssystem umfassend wenigstens ein Enzym und ein Substrat für das Enzym, wobei die Organophosphor- oder Carbamatverbindung das Enzym inhibiert. Zur Herstellung eines messbaren Signals umfasst ein Biosensor weiterhin einen Transducer, der mit dem Reaktionsprodukt des enzymatischen Reaktionssystems reagiert und hierdurch eine nachweisbare Zustandsänderung erzeugt. Somit wandelt der Transducer die biochemische Aktivität des enzymatischen Reaktionssystems in ein Messsignal um. Die Butyrylcholinesterase wird durch Organophosphorverbindungen und Carbamate inhibiert und das Messsignal bzw. die Sensorantwort dadurch modifiziert.
Bevorzugt ist ein amperometrischer Transducer. Dieser kann die biochemische Aktivität des enzymatischen Reaktionssystems in eine elektronische Aktivität umwandeln. Ein Kontakt des Biosensors mit einer das Enzym inhibierenden Organophosphor- oder Carbamatverbindung erzeugt eine Veränderung der elektrochemischen Antwort. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Biosensor zur amperometrischen Bestimmung ausgebildet. Vorzugsweise umfasst der Biosensor als Transducer Mangandioxid, das auf eine Elektrode, beispielsweise eine Graphitelektrode, aufgebracht ist. Unter einer ”Graphitelektrode” wird hierbei eine auf Graphit als Stromleiter basierende Elektrode verstanden, insbesondere auch Graphitdünnschichten, die auf eine inerte Trägersubstanz aufgebracht sind. Beispielsweise kann Graphit in Form einer handelsüblichen Graphitpaste mittels Siebdruckverfahren aufgebracht werden. Derartige Siebdruckelektroden (screen printed electrodes, SPE) sind in großtechnischem Maßstab herstellbar. Mangandioxid kann in vorteilhafter Weise durch Butyrylcholinesterase erzeugtes Thiocholin zum Disulfid oder durch Cholinoxidase erzeugtes Wasserstoffperoxid zu Sauerstoff in Redox-Reaktionen umsetzen. Wird durch eine Referenzelektrode an die Graphitelektrode eine konstante Spannung angelegt, kann der durch diese Redoxreaktion erzeugter Stromfluss detektiert werden.
Inhibiert eine Probe die Butyrylcholinesterase, unterbleibt die Kaskade der Redoxreaktionen und die resultierende Änderung im Stromfluss erzeugt eine Änderung des Stromflusses als detektierbare Zustandsänderung des amperometrischen Transducers.
Bevorzugte Inhibitoren der Butyrylcholinesterase sind Organophosphor- und Carbamatverbindungen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe phosphororganische Verbindung und Organophosphorverbindung synonym verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Organophosphor- und Carbamatverbindungen Pestizide. Bevorzugte Organophosphorverbindungen bzw. -Pestizide sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Diazinon, Chlorpyrifos, Dicrotophos, Methamidophos, Mevinphos, Fenitrothion, Dichlorvos, Fenthion und/oder Demeton. Besonders bevorzugt sind Diazinon und Chlorpyrifos. Bevorzugte Carbamatverbindungen bzw. -Pestizide sind ausgewählt aus Carbaryl und Carbofuran. Der Biosensor ist insbesondere für den Nachweis dieser Organophosphor- und Carbamat-Pestizide in vorteilhafter Weise gut geeignet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung des Vorliegens einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung in einer Probe, wobei man die Probe mit einem erfindungsgemäßen Biosensor in Kontakt bringt. Für den Biosensor wird auf die vorstehende Beschreibung verwiesen. Der Biosensor umfasst ein enzymatisches Reaktionssystem umfassend wenigstens ein Enzym und ein Substrat für das Enzym, wobei die Organophosphor- oder Carbamatverbindung das Enzym inhibiert. Das enzymatische Reaktionssystem umfasst als Enzym wenigstens Butyrylcholinesterase, die aus einer Lösung mit einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–10 M bis ≤ 9 × 10^–7 M heraus in einem Mikrogel ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer immobilisiert ist. Das enzymatische Reaktionssystem kann Butyrylcholinesterase und als Substrat Butyrylthiocholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–7 M bis ≤ 10 mM umfassen, oder das Reaktionssystem kann Butyrylcholinesterase und Cholinoxidase und als Substrat Butyrylcholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–5 M bis ≤ 10 mM umfassen. Die Probe kann in Form einer wässrigen Lösung vorliegen, beispielsweise Trinkwasser-Proben oder andere Proben aus dem Bereich der Lebensmittelüberwachung und Umwelt.
Das Verfahren umfasst vorzugsweise zwei Schritte, wobei in einem ersten Schritt der Biosensor bzw. die Vorrichtung des Biosensors umfassend Transducer, Mikrogel und Enzym(e) mit der Probe in Kontakt gebracht wird. In Anwesenheit einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung inhibiert diese die Butyrylcholinesterase. In einem nachfolgenden Schritt wird die Vorrichtung des Biosensors umfassend Transducer, Mikrogel und Enzym mit dem Substrat des Enzyms in Kontakt gebracht, wobei das Substrat durch enzymatische Reaktion umgesetzt werden kann und der Transducer mit dem Reaktionsprodukt des enzymatischen Reaktionssystems reagiert und hierdurch eine nachweisbare Zustandsänderung erzeugt. Abhängig vom Ausmaß der Inhibition wird hierbei mehr oder weniger an Reaktionsprodukt gebildet und eine mehr oder weniger ausgeprägte Änderung über den Transducer detektiert. Das Sensorsignal kann hierbei invers proportional zu der Konzentration des Inhibitors im Analyten wie auch der Expositionsdauer sein.
Vorzugsweise ist das Verfahren ein Verfahren zur amperometrischen Ermittlung des Vorliegens einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung. In dieser Ausführungsform umfasst der Biosensor einen amperometrischer Transducer, vorzugsweise umfassend Mangandioxid, das auf eine Elektrode, beispielsweise eine Graphitelektrode, aufgebracht ist. Die enzymatische Hydrolyse des Substrats durch Butyrylcholinesterase führt in diesen Ausführungsformen des Verfahrens zu einem Reaktionsprodukt des enzymatischen Reaktionssystems, welches anschließend seinerseits mit dem Transducer des Biosensors reagiert, wobei ein Messsignal erzeugt wird. Im Falle eines amperometrischen Verfahrens kann bei konstanter an die Elektrode angelegten Spannung die hierdurch hervorgerufene Änderung des Stromflusses als analytische Antwort (A₀) des Sensors erhalten werden. In Anwesenheit einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung inhibiert diese die Butyrylcholinesterase und der verminderte Umsatz des Substrats führt zu einer Verringerung des Sensorsignals (A_i).
Das Verfahren kann unter Verwendung eines Biosensors durchgeführt werden, dessen enzymatisches Reaktionssystem Butyrylcholinesterase und als Substrat Butyrylthiocholin umfasst. Die enzymatische Hydrolyse des Butyrylthiocholins führt in diesen Ausführungsformen des Verfahrens zu Thiocholin als Reaktionsprodukt des enzymatischen Reaktionssystems. In dieser Ausführungsform des Verfahrens kann man Butyrylthiocholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–7 M bis ≤ 10 mM verwenden, bevorzugt im Bereich von ≥ 1 × 10^–6 M bis ≤ 3 mM, vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–4 M bis ≤ 1 mM. In dieser Ausführungsform liegt die Konzentration der Butyrylcholinesterase in der Lösung, aus der heraus das Enzym immobilisiert wird, bevorzugt im Bereich von ≥ 1 × 10^–9 M bis ≤ 1 × 10^–7 M, vorzugsweise im Bereich von ≥ 1 × 10^–8 M bis ≤ 2,5 × 10^–8 M.
Das Verfahren kann in anderen Ausführungsformen unter Verwendung eines Biosensors durchgeführt werden, dessen enzymatisches Reaktionssystem Butyrylcholinesterase und Cholinoxidase und als Substrat Butyrylcholin umfasst. Die Butyrylcholinesterase hydrolysiert Butyrylcholin zu Cholin, welches durch die Cholinoxidase enzymatisch oxidiert wird, wodurch die Cholinoxidase als Reaktionsprodukt des enzymatischen Reaktionssystems Wasserstoffperoxid erzeugt, das mit dem Transducer reagiert. In diesen Ausführungsformen des Verfahrens kann man Butyrylcholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–5 M bis ≤ 10 mM verwendet, bevorzugt im Bereich von ≥ 1 × 10^–4 M bis ≤ 5 mM, vorzugsweise einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 M bis ≤ 3 mM. In dieser Ausführungsform liegt die Konzentration der Butyrylcholinesterase in der Lösung, aus der heraus das Enzym immobilisiert wird, bevorzugt im Bereich von ≥ 1 × 10^–9 M bis ≤ 5 × 10^–7 M, vorzugsweise im Bereich von ≥ 5 × 10^–8 M bis ≤ 1 × 10^–7 M, bevorzugt im Bereich von ≥ 1 × 10^–8 M bis ≤ 5 × 10^–8 M. Die Konzentration der Cholinoxidase liegt in der Lösung, aus der heraus die Cholinoxidase in dem Mikrogel immobilisiert wird, vorzugsweise im Bereich von ≥ 1 × 10^–5 M bis ≤ 5 × 10^–5 M.
In bevorzugten Ausführungsformen bringt man die Probe mit dem Biosensor bzw. der Vorrichtung des Biosensors umfassend Transducer, Mikrogel und Enzym(e) während eines Zeitraums im Bereich von ≥ 2 Minuten bis ≤ 120 Minuten, vorzugsweise im Bereich von ≥ 5 Minuten bis ≤ 90 Minuten, bevorzugt im Bereich von ≥ 10 Minuten bis ≤ 20 Minuten, in Kontakt. Es konnte festgestellt werden, dass durch das Verfahren eine äußerst sensitive Detektion von Organophosphorverbindungen im picomolaren Bereich zur Verfügung gestellt werden kann. So konnten die Verbindungen Diazinon(oxon) und Chlorpyrifos(oxon) in wässriger Lösung noch in Mengen von 6 × 10^–12 M und 8 × 10^–12 M nachgewiesen werden. Die hohe Sensitivität des Verfahrens erlaubt präzise Messungen und einen effizienten Nachweis von Spritzmittelrückständen.
Vorzugsweise sind die Organophosphor- und Carbamatverbindungen Pestizide. Bevorzugte Organophosphorverbindungen bzw. -Pestizide sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Diazinon, Chlorpyrifos, Dicrotophos, Methamidophos, Mevinphos, Fenitrothion, Dichlorvos, Fenthion und/oder Demeton. Besonders bevorzugt sind Diazinon und Chlorpyrifos. Bevorzugte Carbamatverbindungen bzw. -Pestizide sind ausgewählt aus Carbaryl und Carbofuran.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen die Verwendung des erfindungsgemäßen Biosensors oder Verfahrens zur Ermittlung des Vorliegens einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung in einer Probe. Für den Biosensor sowie das Verfahren wird auf die vorstehende Beschreibung verwiesen. Insbesondere betrifft die Erfindung entsprechend die Verwendung eines Biosensors umfassend ein enzymatisches Reaktionssystem umfassend wenigstens ein Enzym und ein Substrat für das Enzym, wobei die Organophosphor- oder Carbamatverbindung das Enzym inhibiert, wobei das enzymatische Reaktionssystem Butyrylcholinesterase und als Substrat Butyrylthiocholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–7 M bis ≤ 10 mM umfasst, oder Butyrylcholinesterase und Cholinoxidase und als Substrat Butyrylcholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ ≥ 1 × 10^–5 M bis ≤ 10 mM umfasst, zur Ermittlung des Vorliegens einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung. Hierbei wird die Butyrylcholinesterase aus einer Lösung mit einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–10 M bis ≤ 9 × 10^–7 M heraus in einem Mikrogel ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer immobilisiert.
Ein noch weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Mikrogels ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer, in dem Butyrylcholinesterase immobilisiert ist, zur Herstellung eines Biosensors, wobei die Butyrylcholinesterase aus einer Lösung mit einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–10 M bis ≤ 9 × 10^–7 M heraus in dem Mikrogel immobilisiert wird.
In vorteilhafter Weise erlaubt ein Mikrogel ausgebildet aus einem Copolymer aus N-Isopropylacrylamid und 3-(N,N,-Dimethylamino)propylmethacrylamid eine einfache Art der Enzym-Immobilisierung, wobei die Lokalisation des Enzyms in bzw. an der Oberfläche des Mikrogels über die Einstellung von Temperatur und pH-Wert bei der Aufbringung des Mikrogels auf einer Transduceroberfläche wie auch der nachfolgenden Aufbringung des Enzyms gezielt einstellbar ist. In dem gewählten Mikrogel ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer kann die Butyrylcholinesterase, ein tetrameres Enzym aufgebaut aus vier Untereinheiten von jeweils 110 kDa, an der Oberfläche des Mikrogels, und damit an der Oberfläche des Biosensors Sensoroberfläche, immobilisiert sein. Die Verwendung eines derartigen Mikrogels erlaubt die Herstellung von Biosensoren, die eine hervorragende Zugänglichkeit der Butyrylcholinesterase für ihr Substrat wie auch Inhibitoren wie Organophosphor- und Carbamatverbindungen aufweisen.
Das Mikrogel ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer ist in vorteilhafter Weise ein Temperatur- und pH-responsives Mikrogel. Zur Herstellung eines Biosensors wird das Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer Mikrogel auf einen Transducer aufgebracht, vorzugsweise in einem pH-Bereich von ≥ pH 7 bis ≤ pH 10, bevorzugt im Bereich von ≥ pH 8 bis ≤ pH 9,9, weiter bevorzugt im Bereich von ≥ pH 9 bis ≤ pH 9,5. Weiter kann das Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer Mikrogel bei einer Temperatur, die höher als die VPTT ist, vorzugsweise mindestens 10 K höher als die VPTT ist, bevorzugt 20 K höher als die VPTT ist, aufgebracht werden. Die Volumen-Phasenübergangs-Temperatur (engl. volume phase transition temperature, VPTT) bezeichnet hierbei die Temperatur, die zu einem Kollabieren des Polymernetzwerkes führt. Unterhalb dieser Temperatur befinden sich das gelartige Polymer durch die Ausbildung von Wasserstoff-Bindungen zwischen Polymer und Lösemittel im gequollenen Zustand. Oberhalb der VPTT werden diese Bindungen gebrochen und intramolekulare Bindungen werden geknüpft, was zum Kollabieren des Polymernetzwerkes führt.
Weiter ist die Menge des immobilisierten Enzyms über die Konzentration des Enzyms in der Lösung, aus der heraus das Enzym aufgebracht wird, einstellbar. In Ausführungsformen, in denen der Biosensor lediglich Butyrylcholinesterase aufweisen soll, wird diese bevorzugt aus einer Lösung einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–9 M bis ≤ 1 × 10^–7 M, vorzugsweise im Bereich von ≥ 1 × 10^–8 M bis ≤ 2,5 × 10^–8 M Butyrylcholinesterase heraus auf dem Mikrogel immobilisiert.
In Ausführungsformen, in denen der Biosensor Butyrylcholinesterase und Cholinoxidase aufweisen soll, wird Butyrylcholinesterase bevorzugt aus einer Lösung einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–9 M bis ≤ 5 × 10^–7 M, vorzugsweise im Bereich von ≥ 5 × 10^–8 M bis ≤ 1 × 10^–7 M, bevorzugt im Bereich von ≥ 1 × 10^–8 M bis ≤ 5 × 10^–8 M, heraus immobilisiert. Die Konzentration der Cholinoxidase liegt in der Lösung, aus der heraus die Cholinoxidase in dem Mikrogel immobilisiert wird, vorzugsweise im Bereich von ≥ 1 × 10^–5 M bis ≤ 5 × 10^–5 M.
Es wurde festgestellt, dass Verwendung eines Mikrogels ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer, in dem Butyrylcholinesterase immobilisiert ist, die Herstellung von Biosensoren erlaubt, die eine äußerst sensitive Detektion von Organophosphor- und Carbamatverbindungen erlauben.
Beispiele und Figuren, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.
Hierbei zeigt:
1 schematisch die Herstellung eines amperometrischen Biosensors in einer monoenzymatischen Ausführungsform sowie dessen Aufbau und Funktionsweise.
2 eine Rasterkraftmikroskopie-Aufnahmen eines Poly(NIPAM-co-DMAPMA)-Mikrogelfilms in 2A, sowie des Mikrogelfilms mit immobilisierter Butyrylcholinesterase in 2B.
3 die Sensorantwort eines amperometrischen Biosensors als Funktion der Substrat-Konzentration in 3A, wobei die geringen Konzentrationen in 3B vergrößert dargestellt sind. Die Messpunkte entsprechend dem Mittelwert ± SD für n = 3 Messungen.
4 die Sensorantwort eines amperometrischen Biosensors als Funktion der Enzym-Konzentration, wobei die geringen Konzentrationen vergrößert dargestellt sind. Die Messpunkte entsprechend dem Mittelwert ± SD für n = 3 Messungen.
5 die Sensorantwort von 70 amperometrischen Biosensoren.
6 die Sensorantwort eines amperometrischen Biosensors aufgetragen gegen die Anzahl der mit diesem Biosensor durchgeführten Messungen.
7 die Sensorantwort amperometrischer Biosensoren aufgetragen gegen die Tage Aufbewahrung bei 4°C.
8 die Sensorantwort für verschiedene Diazinon(oxon)-Konzentrationen aufgetragen gegen die Inkubationszeit in 8A. 8B zeigt die Auftragung der relativen Sensorantwort gegen die Diazinon(oxon)-Konzentration für eine Inkubationszeit von 20 Minuten.
9 die Sensorantwort für verschiedene Chlorpyrifos(oxon)-Konzentrationen aufgetragen gegen die Inkubationzeit in 9A. 9B zeigt die Auftragung der relativen Sensorantwort gegen die Chlorpyrifos(oxon)-Konzentration für eine Inkubationszeit von 20 Minuten.
Die 1 zeigt schematisch die Herstellung eines amperometrischen Biosensors, dessen Aufbau sowie Funktionsweise.
Zur Herstellung eines amperometrischen Biosensors wurde auf eine Graphitelektrode 2, die mittels Siebdruckverfahren auf einer Polyvinylchlorid-Trägersubstanz hergestellt wurde (screen printed elecrode, SPE), zunächst mittels eines MnO₂-Sols eine peroxidsensitive MnO₂-Schicht 4 aufgebracht. Auf diese wurde ein mittels Fällungspolymerisation hergestelltes Mikrogel 6 ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer aufgebracht. Hierzu wurde die SPE/MnO₂ Elektrode in eine Dispersion des Mikrogels einer Konzentration 1 g/L und eines pH-Werts von 9, bei einer Temperatur 60°C getaucht und 40 Minuten inkubiert. Danach wurde die Elektrode mit einem Luftstrom getrocknet. Im Anschluss wurde das Enzym Butyrylcholinesterase 8, bei 25°C aus einer wässrigen Lösung mit pH 7,0 adsorbiert, wobei die Lösung insbesondere eine Konzentration von 2,5·10^–8 M Butyrylcholinesterase aufweisen kann. Die Butyrylcholinesterase 8 wird dabei an der Oberfläche des Mikrogels 6 immobilisiert.
Das Messprinzip des amperometrischen Biosensors 10 basiert auf der Verwendung von Butyrylthiocholin als Substrat für die Butyrylcholinesterase (BChE). Die enzymatische Hydrolyse des Butyrylthiocholins führt zu Thiocholin als Reaktionsprodukt des enzymatischen Reaktionssystems. Durch eine nachfolgende Reaktion des Thiocholins mit dem auf der Siebdruckelektrode aufgebrachten MnO₂ wird das Thiocholin zum Disulfid oxidiert, während das Mn(IV) zu Mn(II/III) reduziert wird. Wird an die Graphit-basierte Siebdruck-Elektrode eine Spannung von 450 mV gegen Ag/AgCl angelegt, führt die Redoxreaktion des Mangans zur Erzeugung eines Stroms, der amperometrisch gemessen werden kann. Somit wird durch die elektrochemische Reaktion mit MnO₂ eine elektronisch nachweisbare Zustandsänderung am Transducer erzeugt.
Materialien und Methoden:
Butyrylcholinesterase (BChE) (aus Pferdeserum; E.C. 3.1.1.8, Aktivität 1390 U/mg Protein), S-Butyrylthiocholinchlorid, Diazinon, Chlorpyrifos, HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure, Natriumsalz) und Brom wurden von Sigma-Aldrich, Deutschland, bezogen. Kaliumpermanganat (Merck, Germany) und Mangan(II)acetat Tetrahydrat (Acros, Belgium) wurden für die Herstellung der Mangandioxid Sol Dispersionen verwendet. Pufferlösungen (10 mM Tris; pH 7,0 oder 9,0) wurden durch Mischung von Stammlösungen aus 10 mM Tris und 10 mM Tris-HCl hergestellt. Alle anderen Chemikalien (Ascorbinsäure und anorganische Salze, p. a.) wurden ohne weitere Aufreinigung verwendet. Alle wässrigen Lösungen wurden mit entsalztem Wasser (18,2 MΩ cm) angesetzt, das aus einem Millipore Milli-Q Reinigungssystem gewonnen wurde.
Elektrochemische Messung der enzymatischen Antwort:
Elektrochemische Experimente wurden bei Raumtemperatur unter Rühren und unter Einsatz einer Zweielektrodenkonfiguration in einer Einkammerzelle (1 ml Volumen) durchgeführt. Dabei diente die Siebdruck-Elektrode (SPE) mit dem Mikrogel/Enzymfilm mit einer aktiven Fläche 0,049 cm² als Arbeitselektrode und eine Ag/AgCl Elektrode einer Länge von 1 cm, einem Durchmesser von 3 mm und 1,03 cm² Elektrodenoberfläche als Referenz- und Gegenelektrode. Ein Mikropotentiostat IPC-Micro (Kronas Ltd., Russland) wurde für die elektrochemischen Experimente mit einem Computer verbunden und die elektrochemischen Parameter wurden durch die Mikropotentiostatsoftware kontrolliert. Die Messungen wurden in Pufferlösungen (50 mM HEPES Puffer mit 30 mM KCl; pH 7,5) durchgeführt, in dem der Strom aufgrund des Umsatzes eines Standardsubstrats zu einem elektroaktiven Produkt detektiert wurde. Butyrylthiocholinchlorid (BTCh) wurde für die enzymatische Antwort des SPE/MnO₂/Mikrogel/BchE-Aufbaus bei einer Spannung von +450 mV gegen Ag/AgCl verwendet. Das analytische Signal der Elektrode wurde als Veränderung zum stationären Basislinienstroms, dem Unterschied zwischen dem Durchschnittswert des stationären Basislinienstroms vor und nach der Zugabe des Substrats, detektiert. Jedes elektrochemische Ergebnis wurde als Mittelwert ± SD aus mindestens drei Messungen von mindestens 3 verschiedenen Elektroden bestimmt.
Beispiel 1
Herstellung eines amperometrischen Biosensors
Zur Herstellung eines amperometrischen Biosensors wurde Butyrylcholinesterase in einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer ausgebildet als Mikrogel-Enzym-Dünnschichtsystem immobilisiert. Hierzu wurden Elektroden benutzt, die mittels Siebdruckverfahren (screen printed electrodes; SPE) auf einer inerten Trägersubstanz aus Poly(vinylchlorid) der Dicke 0,2 mm hergestellt wurden. Dazu wurde eine leitende Graphitpaste (Gwent, UK) mit einem semiautomatischen Drucker (Hersteller Winon, Model WSC-160B, China) und einer Siebdruckschablone (200 Maschen) aufgetragen. Jede Siebdruck-Elektrode umfasste einen runden Arbeitselektrodenbereich (2,5 mm Durchmesser), eine Leiterbahn (30 mm × 1,5 mm) und eine quadratische Kontaktfläche (3 mm × 7 mm) für die Verbindung zum Potentiostat. Vor der Adsorption von Mikrogel und Enzym, wurden die Siebdruck-Elektroden mit einer peroxidsensitiven MnO₂-Schicht modifiziert. Hierzu wurde ein MnO₂ Sol durch Mischung von gleichen Volumina an 0,25 mM KMnO₄ und 0,375 mM Mn(CH₃COO)₂ und anschließendem 5-minütigen Schütteln vorbereitet. Der Arbeitselektrodenbereich der Siebdruck-Elektrode wurde dann mit 10 μL des MnO₂ Sol versehen. Die Elektrode wurde für 2–2,5 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet, danach mit entsalztem Wasser gewaschen und bei 60°C für 1 Stunde nachgetrocknet. Die modifizierten Siebdruck-Elektroden (SPE) wurden bei Raumtemperatur trocken gelagert.
Ein Mikrogel ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer (Poly(NIPAM-co-DMAPMA)-Mikrogel) wurde mittels Fällungspolymerisation hergestellt wie in Sigolaeva, L. V. et al., Biomacromolecules, 2014, 15, Seiten 3735–3745 beschrieben. Hierzu wurde in einem 3-Halskolben (2L; ausgestattet mit Rührer, Stickstoffflutung und Rückflusskühler) 20 g N-Isopropylacrylamid (NIPAM), 1,6 g N,N'-Methylenbisacrylamid (BIS) und 0,06 g Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) in 1400 mL Wasser gelöst und mit Stickstoff von Sauerstoffbefreit. Nach Heizen auf 85°C und Zugabe von 3,6 g DMAPMA (N,N,-Dimethylamino)propylmethacrylamid), wurde durch Zugabe von NaOH/HCl der pH-Wert zwischen 8 und 9 eingestellt. Die Polymerisation wurde mittels Zugabe von 0,8 g V 50 Initiator (gelöst in 80 mL MilliQ) gestartet. Nach 6 h Reaktionszeit wurde das Produkt unter Rühren abgekühlt und durch Ultrazentrifugation und Aufnahme des Sediments in Wasser (3 × Wiederholung des Zyklus) aufgereinigt. Anschließende Gefriertrockung lieferte das reine Mikrogel.
Das Mikrogel wurde auf die SPE/MnO₂ Schicht bei 60°C adsorbiert, indem die SPE/MnO₂ Elektrode in eine vorgeheizte Mikrogel Dispersion einer Konzentration 1 g/L in 10 mM Tris-Puffer mit pH 9,0 getaucht und einer 40-minütigen Inkubation unterzogen wurde. Danach wurde die Oberfläche mit entsalztem Wasser einer Temperatur von 60°C gespült. Danach wurden die Elektroden kurz für 1–2 Sekunden mit einem Luftstrom getrocknet. Direkt im Anschluss wurde Butyrylcholinesterase (BChE) analog bei 25°C für 10 min aus wässriger Lösung (10 mM Tris, pH 7,0) mit einer Konzentration von 2,5·10^–8 M adsorbiert. Auch dieser Schritt wurde von einer Spülung und von einem Trockenblasen begleitet. Die modifizierten Siebdruck-Elektroden mit Enzymfilm wurden bei 4°C gelagert, um die Enzymaktivität zu bewahren.
Die Morphologie des Enzym-Mikrogel-Films wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht. Die Oberflächenmorphologie der Elektroden wurde hierbei mittels eines Zeiss Supra 35-VP Feldemissionsrastertunnelmikroskops (field-emission scanning electron microscope: FE-SEM) untersucht, das mit 5 kV Beschleunigungspannung betrieben wurde. Hierbei zeigte sich, dass das Aufbringen der MnO₂-Schicht die Morphologie der Dünnfilm-Beschichtung mit Graphit nicht wesentlich veränderte. Nach der Adsorption des Poly(NIPAM-co-DMAPMA)-Mikrogels wurden eine Vielzahl an kugelförmigen Objekten eines Durchmessers von etwa 70–90 nm festgestellt, von denen angenommen wird, dass sie getrocknete Mikrogel-Partikel entsprechen. Die weitere Adsorption des Enzyms führte zu einer leichten Glättung der reliefartigen Struktur.
Zur weiteren Untersuchung der Struktur des Enzym-Mikrogel-Films wurden ein reiner Poly(NIPAM-co-DMAPMA)-Mikrogelfilm wie auch ein Enzym-Mikrogel-Film unter den beschriebenen Bedingungen auf die Oberfläche des hochorientierten pyrolytischen Graphits (HOPG) aufgebracht und mittels Rasterkraftmikroskopie (atomic force microscopy, AFM) untersucht.
Die 2 zeigt die Rasterkraftmikroskopie-Aufnahmen des Poly(NIPAM-co-DMAPMA)-Mikrogelfilms in 2A, sowie des Enzym-Mikrogel-Film aus in dem Poly(NIPAM-co-DMAPMA)-Mikrogelfilm immobilisierter Butyrylcholinesterase in 2B. Wie man der 2A entnimmt, erscheint der Mikrogelfilm als Anzahl einzelner, zufällig verteilter, pfannkuchenförmiger Objekte, zwischen denen einzelne Polymerketten liegen. Die Oberfläche der Mikrogelpartikel zeigte sich als relativ glatt. Wie man der 2B entnimmt, führte die weitere Adsorption des Enzyms dazu, dass die Mikrogelpartikel wie auch die dazwischenliegenden einzelnen Polymerketten von einer Schicht kleiner kugeliger Objekte bedeckt waren.
Dies zeigt, dass die Butyrylcholinesterase erfolgreich in dem Mikrogel immobilisiert wurde. Insgesamt wurde ein einfacher amperometrischer Biosensor hergestellt, der eine MnO₂-modifizierte Graphit-basierte Siebdruck-Elektrode, auf der ein Dünnfilm aus in Poly(NIPAM-co-DMAPMA)-Mikrogelfilm immobilisierter Butyrylcholinesterase aufgebracht ist, umfasst. Die an der Oberfläche immobilisierte Butyrylcholinesterase ist hierdurch für ihr Substrat wie auch für Inhibitoren gut zugänglich.
Beispiel 2
Untersuchungen zur Substratkonzentration
Zur Ermittlung der für eine amperometrische Messung geeigneten Konzentration an Butyrylthiocholin als Substrat für Butyrylcholinesterase wurde die Sensorantwort der Biosensoren unter Verwendung verschiedener Substratkonzentrationen bestimmt. Die Herstellung der Sensoren erfolgt wie gemäß Beispiel 1 beschrieben, wobei das Enzym abweichend aus einer 1 μM-Lösung aufgebracht wurde. Die elektrochemische Messung der enzymatischen Antwort erfolgte dabei wie vorstehend beschrieben, wobei Konzentrationen im Bereich von 0,1 μM bis 1 mM Butyrylthiocholin (BTCh) verwendet wurden.
Die Änderung der Sensorantwort (sensor response) als Funktion der Substrat-Konzentration ist in 3 gezeigt. Wie man den 3A und 3B entnimmt, zeigte die Auftragung der Sensorantwort gegen die Substrat-Konzentration eine Linearität im Bereich 0,1 μM–0,1 mM Butyrylthiocholin, mit einem Regressionskoeffizienten von 0,996. Das Detektionslimit für Butyrylthiocholin wurde mit einem Signal/Rausch-Verhältnis (S/N) S/N = 3 zu 0,1 μM bestimmt. Weiter wurde die Sensitivität der Butyrylthiocholin-Detektion zu 84,5 A·M^–1·cm^–2 bestimmt. Die Sättigung der Kalibrierungskurve bei Butyrylthiocholin-Konzentrationen > 1 mM erlaubte es, den apparenten Km Wert für die enzymatische Hydrolyse von Butyrylthiocholin durch die Butyrylcholinesterase zu 0,27 ± 0,02 zu bestimmen. Basierend auf diesen Messungen wurde eine Substratkonzentration an Butyrylthiocholin von 1 mM für die weiteren Versuche gewählt.
Beispiel 3
Untersuchungen zur Enzymkonzentration
Weiterhin wurde ermittelt, welchen Effekt eine Änderung der Konzentration der Enzym-Lösung, aus der Butyrylcholinesterase während der Sensorherstellung immobilisert wird, auf die Sensorantwort hat. Die Herstellung der verwendeten Sensoren erfolgt hierbei wie unter Beispiel 1 beschrieben, wobei zur Immobiliserung des Enzyms im Mikrogel Enzym-Lösungen mit Konzentrationen im Bereich von 0,1 nM bis 0,5 μM Butyrylcholinesterase (BChE) verwendet wurden. Die elektrochemische Messung der enzymatischen Antwort erfolgte dabei wie vorstehend unter Material und Methoden beschrieben, wobei eine Substratkonzentration von 1 mM BTCh in 50 mM HEPES mit 30 mM KCl, pH 7,5, verwendet wurde.
Die Änderung der Sensorantwort (sensor response) als Funktion der Enzym-Konzentration der Aufbringungslösung ist in 4 gezeigt. Wie man der 4 entnimmt, zeigte die Auftragung der Sensorantwort gegen die Enzym-Konzentration eine Linearität im Bereich von 0,1 nM–0,1 μM Butyrylcholinesterase. Das Detektionslimit für Butyrylcholinesterase wurde mit einem Signal/Rausch-Verhältnis S/N = 3 zu 0,1 nM bestimmt.
Basierend auf diesen Messungen wurde eine Konzentration an Butyrylcholinesterase in der Aufbringungslösung von 2,5·10^–8 M, die im Bereich der Linearität der Sensorantwort auf die steigende Enzymkonzentration liegt, für die Herstellung der weiteren Biosensoren gewählt. Dies zeigt, dass unter Verwendung von geringen Konzentration an Enzym Biosensoren günstig und damit in großem Maßstab hergestellt werden können, beispielsweise zur Einzelverwendung.
Beispiel 4
Untersuchung der Reproduzierbarkeit der Sensorherstellung
Zur Bestimmung, ob die Herstellung des Biosensors stabile und reproduzierbare Ergebnisse ergibt, wurden 70 Sensoren wie unter Beispiel 1 beschrieben hergestellt, wobei Butyrylcholinesterase aus einer 2,5·10⁸ M Lösung aufgebracht wurde. Die elektrochemische Messung der enzymatischen Antwort erfolgte dabei wie vorstehend beschrieben, wobei eine Substratkonzentration von 1 mM BTCh in 50 mM HEPES mit 30 mM KCl, pH 7,5, verwendet wurde.
5 zeigt die Sensorantwort der 70 getesteten Biosensoren. Wie man der 5 entnimmt, zeigten die unter Verwendung einer Enzym-Konzentration von 2,5·10^–8 M in der Aufbringungslösung hergestellten Biosensoren eine gute und reproduzierbare Sensorantwort von etwa 300 nA. Die 70 Sensoren zeigten hierbei eine relative Standardabweichung (100% × [Standardabweichung]/[Mittelwert des Analysesignals]) von nur 12%.
Dies zeigt, dass die Biosensoren zuverlässig in großem Maßstab herstellbar sind.
Beispiel 5
Untersuchung der Wiederholbarkeit der Sensormessungen
Die Wiederholbarkeit der Messung und die operative Stabilität der Biosensoren wurde getestet, indem ein wie unter Beispiel 1 beschrieben hergestellter Sensor, wobei Butyrylcholinesterase aus einer 2,5·10^–8 M Lösung aufgebracht wurde, 15 Mal in Folge verwendet wurde. Die elektrochemische Messung der Sensorantwort erfolgte dabei wie vorstehend beschrieben unter Verwendung einer Substratkonzentration von 1 mM BTCh. Zwischen den Messungen vergingen 2 min, während die Sensorzelle mit HEPES-Puffer gewaschen wurde.
6 zeigt die Sensorantwort des getesteten Biosensors aufgetragen gegen die Anzahl der Messungen. Wie man der 6 entnimmt, zeigte der Biosensor über 15 Messungen hinweg eine stabile und reproduzierbare Antwort von etwa 300 nA. Die Wiederholbarheit der Sensorantwort wurde als die relative Standardabweichung (100% × [Standardabweichung]/[Mittelwert des Analysesignals]) für 15 wiederholte Messungen bei einer Substratkonzentration von 1 mM BTCh zu 3% berechnet. Die operative Stabilität des Biosensors kann quantitativ als prozentuale Änderung der Sensorantwort pro einzelne Messung gemäß der Formel ΔI = 100% × tgI/I₁ berechnet werden, wobei tgI der Steigung der Abhängigkeit des analytischen Signals in Bezug auf die Anzahl der wiederholten Messungen entspricht, normalisiert auf ein initiales analytisches Signal I₁. Derart berechnet ergab sich für den Biosensor eine Abweichung von –0.34 ± 0.02.
Dies zeigt, dass die Biosensoren auch für wiederholte Messungen verwendbar sind.
Beispiel 6
Untersuchung der Stabilität des Biosensors
Zur Untersuchung der Stabilität wurden mehrere gleich hergestellte Sensoren gemäß Beispiel 1 benutzt, wobei Butyrylcholinesterase aus einer 2,5·10^–8 M Lösung aufgebracht wurde, getrocknet und für 45 Tage bei 4°C aufbewahrt. Hierbei wurden bei der Einlagerung sowie an Tag 1, 2, 10, 20, 30 und 45 die enzymatischen Antwort von jeweils einem Biosensor durch elektrochemische Messung unter Verwendung von 1 mM BTCh als Substrat bestimmt.
7 zeigt die Sensorantwort der getesteten Biosensoren aufgetragen gegen die Tage der Aufbewahrung. Wie man der 7 entnimmt, zeigte sich, dass die Stärke der Sensorantwort mit der Aufbewahrungszeit graduell abnahm, nach 45 Tagen bei 4°C jedoch 65% der ursprünglichen Aktivität erhalten war.
Insgesamt zeigen die Untersuchungen der Beispiele 4, 5 und 6, dass die Biosensoren eine stabile und zuverlässige Sensorantwort und eine hohe operative Stabilität und recht gute Langzeitstabilität zur Verfügung stellen. Dies erlaubt, dass die hergestellten Biosensoren zum Nachweis von Inhibitoren der Butyrylcholinesterase geeignet sind.
Beispiel 7
Untersuchung störender Substanzen
Eine Verwendung der Biosensoren für die Beprobung von Lebensmitteln, Getränken sowie Umweltproben zieht unweigerlich die Anwesenheit von potentiell störenden Substanzen nach sich wie Ascorbinsäure, die häufig in Lebensmitteln verwendet wird und aufgrund ihrer leichten Oxidierbarkeit gleichzeitig eine der gängigsten elektrochemisch interferierenden Substanzen ist. Andere Beispiele für Substanzen, die die elektrochemische Messung stören, sind Schwermetallionen. Daher wurde der Einfluss dieser Verbindungen auf die Sensorantwort untersucht. Hierzu wurde die Sensorantwort von Kontrollproben I₀, die keine Störverbindung enthielten, mit Proben h_Int, die mit einer störenden Verbindung versetzt waren, verglichen.

Die elektrochemische Messung der enzymatischen Antwort erfolgte dabei wie vorstehend beschrieben unter Verwendung einer Substratkonzentration von 1 mM BTCh bei gemäß Beispiel 1 hergestellten Sensoren, wobei Butyrylcholinesterase aus einer 2,5·10^–8 M Lösung aufgebracht wurde. Gemessen wurden Proben I_Int, die Ascorbinsäure, Co²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺ oder Pb²⁺ in den in Tabelle 1 angegebenen Mengen enthielten. Der Störeffekt der jeweiligen Substanz wurde mittels folgender Formel berechnet:

wobei die Sensorantwort der 1 mM BTCh enthaltenden Kontrollprobe als 100% gesetzt wurde. Die folgende Tabelle 1 summiert die in tatsächlichen Proben relevanten Konzentrationen, die gemessenen Konzentrationen und den jeweiligen Störeffekt auf die Sensorantwort: Tabelle 1. Effekt der Störsubstanzen auf die Sensorantwort

Substanz	relevante Konzentration	gemessene Konzentrationen	Störeffekt, %
	maximale Konzentration in frischen Säften
Ascorbinsäure	50–70 μM	50 μM 5 μM 2 μM 0,5 μM 0,1 μM	+614,3 +250,0 +65,2 +15,4 +2,5
	erlaubte Höchstkonzentration in Frischwasser
Co²⁺	0,01 mg/L (170 nM)	1 mM 0,1 mM 10 μM	+53,8 +30,8 0,0
Cd²⁺	10 mg/L (90 nM)	1 mM 0,1 mM 10 μM	–70,3 –27,3 –2,6
Cu²⁺	2 mg/L (30 μM)	1 mM 0,1 mM 10 μM 1 μM	–61,9 –33,3 –13,2 0,0
Pb²⁺	0,03 mg/L (140 nM)	1 mM 0,1 mM 10 μM 1 μM	–50,0 –21,4 –16,7 –1,5

Wie man der Tabelle 1 entnimmt, wurde die ausgeprägteste Störung durch 50 μM Ascorbinsäure hervorgerufen, die die Sensorantwort um 614,3% verstärkte. Die Ergebnisse zeigen jedoch weiter, dass die Störung durch 100–500-faches verdünnen deutlich verringert werden kann. Weiter können Schwermetallionen bei Konzentrationen oberhalb 1 mM ebenfalls wie bei Co²⁺ deutliche aktivierende oder wie im Fall von Cd²⁺, Cu²⁺ und Pb²⁺ inhibierende Effekte zeigen. Störeffekte treten jedoch bereits bei Konzentration an Schwermetallionen unter 1 μM nicht mehr auf oder sind vernachlässigbar gering, wobei 1 μM immer noch weit über den erlaubten Konzentrationen liegt.
Insgesamt zeigen die Messungen der gängigen Störsubstanzen, dass die Biosensoren für die Bestimmung von Butyrylcholinesterase inhibierenden Organophosphorverbindungen in üblichen Proben wie Boden- oder Trinkwasserproben gut geeignet ist.
Beispiel 8
Untersuchung der Detektion von Organophosphor-Pestiziden
Die Inhibition der Cholinesterasen durch Organophosphor- und Carbamatverbindungen bildet die Basis des Nachweises dieser toxischen Substanzen durch Biosensoren. In Abwesenheit des Analyten wird das Substrat Butyrylthiocholin durch das Enzym Butyrylcholinesterase zu Thiocholin und Butyrylsäure umgewandelt. Im Falle eines amperometrischen Biosensors wird durch die nachfolgende Oxidation des Thiocholins zum Disulfid durch Teilnahme des Mangandioxids, bei konstanter an die Elektrode angelegten Spannung, die hierdurch hervorgerufene Änderung des Stromflusses als analytische Antwort (A₀) des Sensors erhalten. Eine Präinkubation des Biosensors bzw. des SPE/MnO₂/Mikrogel/BchE-Aufbaus des Biosensors mit dem Analyten führt durch den verminderten Umsatz des Substrats zu einer Verringerung des Sensorsignals (A_i). Das Sensorsignal ist hierbei vorzugsweise invers proportional zu der Konzentration des Inhibitors im Analyten wie auch der Expositionsdauer.
Das Potential des Biosensors für den Nachweis von Organophosphor-Inhibitoren wurden zwei Organophosphor-Pestizide, Diazinon und Chlorpyrifos, untersucht. Beide sind gängige Giftstoffe in Haushaltsinsektiziden. Nach Aufnahme in einen Organismus werden beide Pestizide zunächst metabolisch von einem Organophosphorthion (P = S) zu einem weitaus toxischeren Oxonderivat (P = O) umgewandelt, welches Cholinesterasen irreversibel inhibiert.
In den durchgeführten Versuchen wurden die Organophosphor-Verbindungen Diazinon und Chlorpyrifos vor der Durchführung der Sensortests daher zunächst mittels chemischer Oxidation durch Brom von der Organophosphorthionform (P = S) zu einem Oxonderivat (P = O) umgewandelt, wodurch die Inhibitionswirkung gesteigert wird. Dazu wurde Bromwasser durch Hinzufügen von 4 mL Brom zu 12,5 mL einer 0,5 M wässrigen KBr Lösung hergestellt. Die Lösungen, die Diazinon oder Chlorpyrifos enthalten, wurden für 3 min oxidiert und dann mit 50 mM HEPES Puffer, der auch 30 mM KCl (pH 7,5) enthielt, zur finalen Konzentration im Bereich von 0–10 nM verdünnt.
Der inhibierende Effekt des oxidierten Diazinons (Diazinon(oxon)) und Chlorpyrifos (Chlorpyrifos(oxon)) auf den Biosensor wurde anschließend wie vorstehend beschrieben unter Verwendung einer Substratkonzentration von 1 mM BTCh bei gemäß Beispiel 1 hergestellten Sensoren, wobei Butyrylcholinesterase aus einer 2,5·10^–8 M Lösung aufgebracht wurde, untersucht. Vor der Inkubation mit dem Substrat wurde der SPE/MnO₂/Mikrogel/BchE-Aufbau zunächst für 2, 4, 8, 12, 15, 20, 40 oder 60 Minuten mit 0,01 nM, 0,05 nM, 0,7 nM, 5 nM oder 10 nM Diazinon(oxon) oder Chlorpyrifos Chlorpyrifos(oxon) inkubiert. Kontrollversuche wurden durchgeführt, indem der SPE/MnO₂/Mikrogel/BchE-Aufbau für einen entsprechenden Zeitraum mit reinem HEPES-Puffer inkubiert wurde.
8 zeigt die Sensorantwort für die verschiedenen Diazinon(oxon)-Konzentrationen aufgetragen gegen die Inkubationzeit. Die relative Sensorantwort ist angegeben in Prozent, wobei die nicht inhibierte Kontrollprobe zu 100% gesetzt wurde (A_i/A₀·100%). Wie man der 8A entnimmt, sank die relative Sensorantwort mit steigender Diazinon(oxon)-Konzentration und Inkubationsdauer. Die Inhibition erfolgte sehr schnell und erreichte nach 20 Minuten ihre Plateauphase. Entsprechend erschien eine Inkubationsdauer von 20 Minuten als am besten geeignet, um eine Kalibrationskurve für die Quantifizierung von Diazinon(oxon) in einer Probe anzulegen. Die entsprechende Auftragung der relativen Sensorantwort gegen die Diazinon(oxon)-Konzentration ist in 8B ebenfalls gezeigt.
9A zeigt die relative Sensorantwort für die verschiedenen Chlorpyrifos(oxon)-Konzentrationen aufgetragen gegen die Inkubationzeit. 9B zeigt die Auftragung der relativen Sensorantwort gegen die Chlorpyrifos(oxon)-Konzentration für eine Inkubationsdauer von 20 Minuten. Wie man der 9 entnimmt, inhibiert Chlorpyrifos(oxon) den Biosensor in vergleichbarem Ausmaß.
Das Detektionslimit ist definiert als die Konzentration, die bei 20 minütiger Inkubationsdauer eine 10%ige Inhibition verursacht. Das Limit wurde für Diazinon(oxon) zu 6 × 10^–12 M und für Chlorpyrifos(oxon) zu 8 × 10^–12 M berechnet. Für amperometrische Messungen zählen die sehr geringen nachgewiesenen Konzentrationen zu den niedrigsten bekanntermaßen nachgewiesenen Werten. Insbesondere sind Nachweisgrenzen im picomolaren Bereich wesentlich niedriger als die erlaubten Konzentrationen von 10–50 nM dieser Pestizide im Trinkwasser.
Diese Versuche zeigen somit, dass die erfindungsgemäßen Biosensoren eine äußerst sensitive Detektion von Pestiziden im picomolaren Bereich erlauben und damit eine vielversprechende Option für Biosensoren auf der Basis von Cholinesterase-Inhibition bieten. Die hohe Sensitivität erlaubt präzise Messungen in stark verdünnten Realproben mit nur minimaler Interferenz. Damit ermöglichen die erfindungsgemäßen Biosensoren eine Verwendung in der Lebensmittelüberwachung, und eine effizienten Nachweis von Spritzmittelrückständen. Zudem sind die Biosensoren einfach aufgebaut und reproduzierbar, wodurch eine kostengünstige Herstellung und einfache Detektion ermöglicht wird.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Sigolaeva, L. V. et al. in Langmuir, 2015, 31, S. 13029–13039 [0005]
Sigolaeva, L. V. et al., Biomacromolecules, 2014, 15, Seiten 3735–3745 [0049]

Claims

Biosensor zur Ermittlung des Vorliegens einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung, umfassend ein enzymatisches Reaktionssystem umfassend wenigstens ein Enzym und ein Substrat für das Enzym, wobei die Organophosphor- oder Carbamatverbindung das Enzym inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass das enzymatische Reaktionssystem wenigstens Butyrylcholinesterase umfasst, die aus einer Lösung mit einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–10 M bis ≤ 9 × 10^–7 M heraus in einem Mikrogel ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer immobilisiert ist, und wobei das enzymatische Reaktionssystem Butyrylcholinesterase und als Substrat Butyrylthiocholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–7 M bis ≤ 10 mM umfasst, oder Butyrylcholinesterase und Cholinoxidase und als Substrat Butyrylcholin in einer Konzentration im Bereich von≥ 1 × 10^–5 M bis ≤ 10 mM umfasst.
Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Butyrylcholinesterase in der Lösung im Bereich von ≥ 1 × 10^–9 M bis ≤ 9 × 10^–7 M, vorzugsweise im Bereich von ≥ 1 × 10^–8 M bis ≤ 9 × 10^–8 M, liegt.
Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Butyrylthiocholin in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–6 M bis ≤ 3 mM, vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–4 M bis ≤ 1 mM, vorliegt.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das enzymatische Reaktionssystem Butyrylcholinesterase und Cholinoxidase umfasst.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor zur amperometrischen Bestimmung ausgebildet ist, wobei der Biosensor als Transducer vorzugsweise Mangandioxid umfasst, das auf eine Graphitelektrode aufgebracht ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Organophosphor- oder Carbamatverbindung ein Pestizid ist, wobei bevorzugte Organophosphorverbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Diazinon, Chlorpyrifos, Dicrotophos, Methamidophos, Mevinphos, Fenitrothion, Dichlorvos, Fenthion und/oder Demeton, und bevorzugte Carbamatverbindungen aus Carbaryl und Carbofuran.
Verfahren zur Ermittlung des Vorliegens einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit einem Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kontakt bringt.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit dem Biosensor während eines Zeitraums im Bereich von ≥ 2 Minuten bis ≤ 120 Minuten, vorzugsweise im Bereich von ≥ 5 Minuten bis ≤ 90 Minuten, bevorzugt im Bereich von ≥ 10 Minuten bis ≤ 20 Minuten, in Kontakt bringt.
Verwendung eines Biosensors nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder des Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 oder 8 zur Ermittlung des Vorliegens einer Organophosphor- oder Carbamatverbindung in einer Probe.
Verwendung eines Mikrogels ausgebildet aus einem Poly(N-isopropylacrylamid)-(3-(N,N,-dimethylamino)propylmethacrylamid-Copolymer, in dem Butyrylcholinesterase immobilisiert ist, zur Herstellung eines Biosensors, wobei die Butyrylcholinesterase aus einer Lösung mit einer Konzentration im Bereich von ≥ 1 × 10^–10 M bis ≤ 9 × 10^–7 M heraus in dem Mikrogel immobilisiert wird.